專利名稱：編碼1rp基因的新核苷酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了編碼lrp基因的核苷酸序列，和用棒狀細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸、尤其是賴氨酸和異亮氨酸的方法，其中棒狀細(xì)菌中l(wèi)rp基因的表達(dá)被修飾。
L-氨基酸用于動(dòng)物營養(yǎng)、食品工業(yè)、人用藥物及制藥工業(yè)。
已知這些氨基酸可通過棒狀細(xì)菌菌株，尤其谷氨酸棒桿菌的發(fā)酵而生產(chǎn)。由于氨基酸的極其重要性，已持續(xù)進(jìn)行改良生產(chǎn)方法的嘗試。生產(chǎn)方法的改良可涉及發(fā)酵措施，如攪拌和供氧，或營養(yǎng)培養(yǎng)基的組分如發(fā)酵期間的糖濃度，或產(chǎn)物形式的加工方法，例如通過離子交換層析，或微生物本身的固有生產(chǎn)性質(zhì)。
為改良這些微生物的生產(chǎn)性質(zhì)，可使用誘變，選擇及突變體選擇等方法，以此方法可獲得對抗代謝物如賴氨酸類似物S-(2-氨乙基)-半胱氨酸有抗性或重要的調(diào)節(jié)氨基酸營養(yǎng)缺陷的并產(chǎn)生L-氨基酸的菌株。一段時(shí)間以來，重組DNA技術(shù)的方法也用于棒桿菌的生產(chǎn)L-氨基酸的菌株的改良。
LRP(亮氨酸效應(yīng)蛋白)是首先在大腸桿菌中描述的一全局調(diào)節(jié)子，其影響一系列基因的轉(zhuǎn)錄，其基因產(chǎn)物參與氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)、生物合成和降解(Calvo and Matthews，微生物學(xué)綜述58，466-490，1994)。
近年來，在其他生物體如Bradyrhizobium japonicum(King andO’Brian，細(xì)菌學(xué)雜志，179，1828-1831，1997)，產(chǎn)氣克雷伯氏桿菌(Janes and Bender，細(xì)菌學(xué)雜志，181，1054-1058，1999)、酸熱硫化熱菌(Charlier等，基因，201，63-68，1997)和革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌(Belitsky等，細(xì)菌學(xué)雜志，179，5448-5457，1997)中也已鑒定了類似的基因。
在大腸桿菌中，lrp蛋白調(diào)節(jié)其自身的表達(dá)。Lrp對大腸桿菌中的許多基因也有正和負(fù)性影響。通常是在生物合成途徑中有活性的基因產(chǎn)物的表達(dá)被刺激。具有分解代謝作用的基因產(chǎn)物通常被相應(yīng)地負(fù)控制。在某些情況下，lrp的作用通過加入L-亮氨酸而增強(qiáng)，但是加入L-亮氨酸也可具有負(fù)作用(Newman等，見Neidhardt等，大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞及分子生物學(xué)，美國微生物學(xué)會(huì)，華盛頓，1513-1525，1996)。在大腸桿菌中，lrp調(diào)節(jié)在氨基酸生物合成和氨基酸分解代謝中起中心作用的大量基因和操縱子。在大腸桿菌中的下列操縱子例如被負(fù)控制livJ，其編碼支鏈氨基酸的高度復(fù)雜攝入系統(tǒng)中的一結(jié)合蛋白(Haney等，細(xì)菌學(xué)雜志，174，108-115，1992)，lysU，其編碼賴氨酸t(yī)RNA合成酶(Gazeau等，F(xiàn)EBS通信，300，254-258，1994)。大腸桿菌中目前已知被正影響的基因包括ilvIH，gltBDF和leuABCD等(Lin等，細(xì)菌學(xué)雜志，174，1948-1955，1992)。
上述最后一個(gè)操縱子在谷氨酸棒桿菌的亮氨酸生物合成中令人非常感興趣，并且在賴氨酸生物合成中也特別令人感興趣。有懷疑在亮氨酸營養(yǎng)缺陷型和升高的賴氨酸產(chǎn)量之間有相關(guān)性(Schrumpf等，應(yīng)用微生物學(xué)及生物技術(shù)，37，566-571，1992)。Patek等(應(yīng)用及環(huán)境微生物學(xué)，60，133-140，1994)已證實(shí)在某些谷氨酸棒桿菌的賴氨酸生產(chǎn)菌中失活leuA導(dǎo)致賴氨酸產(chǎn)量增加。在乳發(fā)酵短桿菌的一突變株中，Tosaka等(農(nóng)業(yè)生物化學(xué)43，265-270，1979)通過加入L-亮氨酸已能實(shí)現(xiàn)賴氨酸形成的降低，以及同時(shí)蘇氨酸形成的增加。
本發(fā)明人目的在于為改良用棒狀細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸、特別是L-賴氨酸和L-異亮氨酸而提供新措施。
本發(fā)明提供了來自棒狀細(xì)菌的分離的多核苷酸，其包括選自如下一組的多核苷酸序列
a)與編碼含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)編碼含有與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)與a)或b)的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸，以及d)含有a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)堿基的多核苷酸。
本發(fā)明還提供了根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸，其優(yōu)選是能復(fù)制的DNA，包括(i)SEQ ID NO1的核苷酸序列，或(ii)在遺傳密碼簡并范圍內(nèi)相應(yīng)于序列(i)的至少一個(gè)序列，或(iii)與互補(bǔ)于序列(i)或(ii)的序列雜交的至少一個(gè)序列，和任選地，(iv)(i)中有功能的中義突變。
本發(fā)明還提供了權(quán)利要求2的多核苷酸，含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，權(quán)利要求2的多核苷酸，其編碼含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽。
本發(fā)明還提供了多核苷酸，其基本上由一個(gè)多核苷酸序列組成，其可通過用含有SEQ ID NO1所述多核苷酸的序列或其片段的探針雜交合適的基因文庫，并分離所述的DNA序列來篩選獲得，所述的文庫含有具有相應(yīng)于SEQ ID NO1的多核苷酸序列的完整基因。本發(fā)明的多核苷酸序列適用作RNA、cDNA和DNA的雜交探針，以分離編碼lrp蛋白的全長cDNA，以及分離與lrp基因具有高度序列相似性的cDNA或基因。
本發(fā)明的多核苷酸序列還適用作通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)制備編碼lrp蛋白的DNA或基因的引物。
作為探針或引物的這種寡核苷酸含有至少30個(gè)、優(yōu)選至少20個(gè)、特別優(yōu)選至少15個(gè)連續(xù)堿基。具有至少40或50個(gè)堿基對的寡核苷酸也是合適的。
“分離的”是指從其天然環(huán)境中分離出來。
“多核苷酸”一般地指多聚核糖核苷酸和多聚脫氧核糖核苷酸，其可以是非修飾的RNA或DNA，或修飾的RNA或DNA。
“多肽”應(yīng)理解為含有經(jīng)肽鍵結(jié)合的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的肽或蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的多肽包括SEQ ID NO2的多肽，特別是具有l(wèi)rp蛋白生物學(xué)活性的多肽，以及與SEQ ID NO2的多肽至少70％、優(yōu)選至少80％相同、特別是與SEQ ID NO2的多肽90-95％相同并具有所述活性的多肽。
本發(fā)明另外還提供了用尤其已生產(chǎn)L-氨基酸的棒狀細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸、尤其L-賴氨酸和L-異亮氨酸的方法，其通過擴(kuò)增或弱化作為靶物質(zhì)功能的新lrp基因。
文中術(shù)語“擴(kuò)增”是指微生物中由相應(yīng)DNA編碼的一或多種酶的胞內(nèi)活性的提高，例如通過提高基因的拷貝數(shù)，或用強(qiáng)啟動(dòng)子或編碼高活性相應(yīng)酶的基因，及如果需要組合使用這些方法。
文中術(shù)語“弱化”是指例如運(yùn)用一個(gè)弱啟動(dòng)子或編碼相應(yīng)的低活性酶或失活相應(yīng)的酶(蛋白質(zhì))的基因或等位基因或?qū)⑦@些措施任意組合而使某一微生物體內(nèi)一個(gè)或多個(gè)酶(蛋白質(zhì))胞內(nèi)活性降低或被抑制，其中酶由相應(yīng)的DNA編碼。
本發(fā)明的微生物可從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉、纖維素或從甘油和乙醇中生產(chǎn)L-賴氨酸，此微生物可以是棒狀細(xì)菌的代表菌，尤其是棒桿菌屬。在棒桿菌屬中尤其應(yīng)提及的是谷氨酸棒桿菌，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知其生產(chǎn)L-氨基酸的能力。
適當(dāng)?shù)陌魲U菌菌屬，尤其谷氨酸棒桿菌菌株，是例如已知的野生型菌株谷氨酸棒桿菌ATCC 13032醋谷棒桿菌ATCC 15806嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC 13870Corynebacterium melassecola ATCC17965嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌FERM BP-1539黃色短桿菌ATCC 14067乳發(fā)酵短桿菌ATCC 13869和擴(kuò)展短桿菌ATCC 14020和從中獲得的生產(chǎn)氨基酸的突變體或菌株如生產(chǎn)L-賴氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌FERM-P1709黃色短桿菌FERM-P1708乳發(fā)酵短桿菌FERM-P1712谷氨酸棒桿菌FERM-P6463谷氨酸棒桿菌FERM-P6464和谷氨酸棒桿菌DSM5715或生產(chǎn)L-異亮氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌ATCC14309谷氨酸棒桿菌ATCC14310谷氨酸棒桿菌ATCC14311谷氨酸棒桿菌ATCC15168和產(chǎn)氨棒桿菌ATCC6871。
本發(fā)明人已成功地分離谷氨酸棒桿菌的編碼lrp蛋白的新lrp基因。
為了分離谷氨酸棒桿菌的lrp基因或其他基因，首先在大腸桿菌中建立這一微生物的基因文庫?？筛鶕?jù)通常已知的教材和手冊建立基因文庫。例如由Winnacker所著教材基因與克隆，基因工程入門(Verlag Chemie，Weinheim，德國，1990)，或由Sambrook等所著手冊分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。一非常熟知的基因文庫是已由Kohara等(細(xì)胞50，495-508(1987))在λ載體中建立的E．coli K-12菌株W3110的基因文庫。Bathe等(分子及普通遺傳學(xué)，252255-265，1996)闡述了借助于粘粒載體SuperCos I(Wahl等，1987，Proceeding of the NationalAcademy of Sciences USA，842160-2164)，在E．coli K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)中建立的谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的基因文庫。Bormann等(分子微生物學(xué)6(3)，317-326)描述了用粘粒pHC79(Hohm和Collins，基因11，291-298(1980))制備谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因文庫。為在大腸桿菌中制備谷氨酸棒桿菌的基因文庫，也可使用質(zhì)粒如pBR322(Bolivar，生命科學(xué)25，807-818(1979))或pUC9(Viera等，1982，基因19259-268)。合適的宿主尤其是限制和重組缺陷的大腸桿菌菌株，一個(gè)例子是菌株DH5αmcr，如Grant等(美國科學(xué)院院報(bào)7(1990)4645-4649)所述。借助于粘粒克隆的長DNA片段隨后可亞克隆并用適于測序的通用載體測序，如Sanger等(美國科學(xué)院院報(bào)745463-5467，1977)所述。
以此方式可獲得編碼lrp基因的谷氨酸棒桿菌的新DNA序列，示作SEQ ID NO1，用前述方法從此DNA序列中也已衍生出相應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列。所得lrp基因產(chǎn)物的氨基酸序列以SEQ IDNO2表示。
通過遺傳密碼的簡并性產(chǎn)生的編碼DNA序列也是本發(fā)明的一部分。同樣，與SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的部分雜交的DNA序列也是本發(fā)明的一部分。另外，蛋白質(zhì)中的保守氨基酸置換，如用丙氨酸置換甘氨酸，或用谷氨酸置換天冬氨酸，本領(lǐng)域已知是“有義突變”，其不引起蛋白質(zhì)活性的基本改變，即是功能中性的。另外已知蛋白質(zhì)N和／或C-末端的改變基本不影響其功能，或者甚至可以穩(wěn)定其功能，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在以下文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)對此的論述，參見Ben-Bassat等(細(xì)菌學(xué)雜志169751-757(1987))O’Regan等(基因77237-251．(1989))，Sahin-Toth等(蛋白質(zhì)科學(xué)3240-247(1994))，Hochuli等(生物／技術(shù)61321-1325(1988))，及已知關(guān)于遺傳和分子生物學(xué)的教材。以相應(yīng)方式產(chǎn)生自SEQ IDNO2的氨基酸序列也是本發(fā)明的一部分。
同樣，與SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的部分雜交的DNA序列也是本發(fā)明的組成部分。最后，用產(chǎn)生自SEQ ID NO1的引物經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)制備的DNA序列也是本發(fā)明的組成部分。這種寡核苷酸典型地具有至少15bp的長度。
通過雜交鑒別DNA序列的指導(dǎo)可參見寶靈格曼海姆有限公司的手冊“用于濾膜雜交的DIG系統(tǒng)用戶指南”(曼海姆，德國，1993)以及Liebl等(系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)國際雜志(1991)41255-260)。用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增DNA序列的指導(dǎo)參見Gait的手冊寡核苷酸合成實(shí)用方法(IRL出版社，英國牛津，1984)及Newton和GrahamPCR(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，德國，1994)。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，lrp基因?qū)τ诎被崽貏e是L-賴氨酸和L-異亮氨酸的生產(chǎn)特別重要。
本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，特定生物合成途徑、糖酵解、檸檬酸循環(huán)、回補(bǔ)代謝或氨基酸輸出單獨(dú)或組合的一或多種酶的額外過表達(dá)，對氨基酸特別是L-賴氨酸和L-異亮氨酸的生產(chǎn)是有益的。
因此，例如，當(dāng)生產(chǎn)L-賴氨酸時(shí)，
·編碼二氫-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B0197335)可以同時(shí)超量表達(dá)，或·編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因(Schwinde等，細(xì)菌學(xué)雜志1753905-3908(1993))可以同時(shí)超量表達(dá)，或·編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因(Molenaar等，歐洲生物化學(xué)雜志254，395-403(1998))可以同時(shí)超量表達(dá)，或·編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因(DE-A-19831609)可以同時(shí)超量表達(dá)，或·編碼賴氨酸輸出的lysE基因(DE-A-19548222)可以同時(shí)超量表達(dá)。
因此，例如，當(dāng)生產(chǎn)L-異亮氨酸時(shí)，·編碼蘇氨酸脫水酶的ilvA基因(Mockel等，細(xì)菌學(xué)雜志(1992)8065-8072)或“反饋抗性”ilvA(Fbr)等位基因(Mockel等，(1994)分子微生物學(xué)13833-842)可以同時(shí)超量表達(dá)，或·編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因(Schwinde等，細(xì)菌學(xué)雜志1753905-3908(1993))可以同時(shí)超量表達(dá)，或·編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因(Molenaar等，歐洲生物化學(xué)雜志254，395-403(1998))可以同時(shí)超量表達(dá)，或·編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因(DE-A-19831609)可以同時(shí)超量表達(dá)。
另外，抑制非所需的二級反應(yīng)對氨基酸特別是L-賴氨酸和L-異亮氨酸的生產(chǎn)也是有益的(Nakayama“生產(chǎn)氨基酸的微生物的育種”，微生物產(chǎn)物的過量產(chǎn)生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(編輯)，學(xué)術(shù)出版社，倫敦，英國，1982)。
為生產(chǎn)氨基酸，特別是L-賴氨酸和L-異亮氨酸，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的微生物可連續(xù)培養(yǎng)或用分批方法，或補(bǔ)料分批方法或重復(fù)補(bǔ)料分批方法分批培養(yǎng)。已知的培養(yǎng)法由Chmiel(Bioprozesstechnikl．Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991)所著教材，或由Storhas(Bioreaktoren und periphereEinrichtungen(Vieweg Verlag，Brunswick／Wiesbaden，1994))所著教材中提供。
所用培養(yǎng)基必須以適當(dāng)方式符合各菌株的需求，關(guān)于各種微生物培養(yǎng)基的闡述見于，美國細(xì)菌學(xué)會(huì)的“細(xì)菌學(xué)通用方法手冊”(華盛頓D．C．，USA，1981)?？墒褂玫奶荚窗ㄌ羌疤妓衔铮缙咸烟牵崽?，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉和纖維素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸，醇如甘油和乙醇，及有機(jī)酸如乙酸，這些物質(zhì)可單獨(dú)或混合使用，可使用的氮源包括含氮的有機(jī)化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麥芽提取物，玉米浸液、大豆粉和尿素，或無機(jī)化合物如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。氮源可單獨(dú)或混合使用，可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀，或相應(yīng)鈉鹽培養(yǎng)基另外還必須含有為生長所需的金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除了上述物質(zhì)之外，也可使用促進(jìn)生長必需物質(zhì)如氨基酸和維生素，此外，可將適當(dāng)前體加入培養(yǎng)基中。上述物質(zhì)可以單批形式或在培養(yǎng)期間以適當(dāng)方式加入培養(yǎng)物中。
可以適當(dāng)方式加入堿性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的pH值，抗泡沫劑例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫產(chǎn)生。適當(dāng)?shù)倪x擇性作用物質(zhì)例如抗生素，可加入培養(yǎng)基中以保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。氧氣或含氧混合氣，例如空氣，可充入培養(yǎng)物中以保持有氧條件。培養(yǎng)溫度通常在20℃～45℃，優(yōu)選25℃～40℃，持續(xù)培養(yǎng)直至氨基酸形成最大量。此目的通常在10～160小時(shí)范圍達(dá)到。
氨基酸的分析可通過陰離子交換層析，隨后經(jīng)茚三酮衍生化作用進(jìn)行，如Speckman等(分析化學(xué)，30，(1958)，1190)所述，或用反向HPLC進(jìn)行，如Lindroth等(分析化學(xué)(1979)511167-1174)所述。
本發(fā)明方法用于發(fā)酵制備氨基酸，尤其是L-賴氨酸和L-異亮氨酸。
本發(fā)明借助于以下提供的實(shí)施例得以更詳述闡述。
實(shí)施例1制備谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組粘?；蛭膸烊鏣auch等(1995，質(zhì)粒33168-179)所述分離谷氨酸棒桿菌ATCC13032的染色體DNA并用限制性內(nèi)切酶Sau3AI(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述Sau3AI，編碼27-0913-02)部分酶切。用蝦堿性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德國曼海姆，產(chǎn)品描述SAP，編碼1758250)將DNA片段去磷酸化。購自Stratagene公司(La Jolla，USA，產(chǎn)品描述SuperCosl粘粒載體試劑盒，編碼251301)的粘粒載體SuperCosl(Wahl等(1987)美國科學(xué)院院報(bào)842160-2164)的DNA用限制性內(nèi)切酶XbaI(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述XbaI，編碼27-0948-02)酶切并類似地用蝦堿性磷酸酶去磷酸化。粘粒DNA然后用限制性內(nèi)切酶BamHI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述BamHI，編碼27-0868-04)酶切。以此方式處理的粘粒DNA與處理的ATCC13032 DNA片段混合并用T4 DNA連接酶(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述T4-DNA-連接酶，編碼27-0870-04)處理。連接混合物然后用Gigapack II XL包裝提取物(Stratagene，La Jolla，USA，產(chǎn)品描述Gigapack II XL包裝提取物，編碼200217)包裝進(jìn)噬菌體中。為感染大腸桿菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)，將細(xì)胞懸浮于10mM MgSO4并與噬菌體懸液混合。如Sambrook等(1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，冷泉港)所述進(jìn)行粘粒文庫的感染和滴定，細(xì)胞在含100微克／毫升氨芐青霉素的LB瓊脂(Lennox，1955，病毒學(xué)，1190)上鋪板。在37℃保溫過夜后，選擇重組克隆。
實(shí)施例2 lrp基因的分離和測序用Qiaprep Spin微量制備試劑盒(產(chǎn)品號27106，Qiagen，Hilden，德國)根據(jù)廠商指導(dǎo)分離各個(gè)菌落的粘粒DNA，并用限制性內(nèi)切酶Sau3AI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述Sau3AI，編碼27-0913-02)部分酶切。用蝦堿性磷酸酶(Roche MolecularBiochemicals，德國曼海姆，產(chǎn)品描述SAP，編碼1758250)將DNA片段去磷酸化。凝膠電泳分離后，用QiaExII凝膠提取試劑盒(產(chǎn)品號20021，Qiagen，Hilden，德國)分離大小范圍為1500-2000bp的粘粒片段。得自Invitrogen公司(Groningen，荷蘭，產(chǎn)品描述Zero背景克隆試劑盒，產(chǎn)品號K2500-01)的測序載體pZero-1的DNA用限制性內(nèi)切酶BamHI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述BamHI，產(chǎn)品號27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，冷泉港)所述進(jìn)行粘粒片段在測序載體pZero-1中的連接，其中DNA混合物與T4連接酶(Pharmacia Biotech，F(xiàn)reiburg，德國)保溫過夜。然后將連接混合物電穿孔(Tauch等，1994，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通信，123343-7)進(jìn)大腸桿菌菌株DH5αMCR(Grant，1990，美國科學(xué)院院報(bào)874645-4649)并在含有50微克／毫升zeocin的LB瓊脂(Lennox，1955，病毒學(xué)，1190)上鋪板。重組克隆的質(zhì)粒制備用Biorobot 9600(產(chǎn)品號900200，Qiagen，Hilden，德國)進(jìn)行。測序用Zimmermann等(1990，核酸研究181067)改良的Sanger等(1977，美國科學(xué)院院報(bào)745463-5467)的雙脫氧鏈終止法進(jìn)行。使用得自PE應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(產(chǎn)品號403044，Weiterstadt，德國)的“RR羅丹明終止循環(huán)測序試劑盒”。用購自PE應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Weiterstadt，德國)的“ABI Prism 377”測序儀在“RotiphoresisNF丙烯酰胺／雙丙烯酰胺”凝膠(291)(產(chǎn)品號A124．1，Roth，Karlsruhe，德國)中進(jìn)行凝膠電泳分離和序列分析。
得到的原始序列數(shù)據(jù)然后用Staden軟件包(1986，核酸研究，14217-231)版本97-0處理。pZero-1衍生物的各個(gè)序列組裝成連續(xù)重疊群。用XNIP軟件(Staden，1986，核酸研究，14217-231)進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助編碼區(qū)分析。進(jìn)一步的分析用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，253389-3402)對“國家生物技術(shù)信息中心”(NCBI，Bethesda，MD，USA)的非冗余NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行。
獲得的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。對該核苷酸序列的分析顯示-462堿基對的開放讀框，其被稱為lrp基因。lrp基因編碼154個(gè)氨基酸的多肽。
序列表<110>德古薩-于爾斯股份公司<120>編碼lrp基因的新核苷酸序列<130>990126 BT<140><141><160>2<170>PatentIn Ver．2．1<210>1<211>715<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220><221>-35_信號<222>(62)．．(67)<220><221>-10_信號<222>(88)．．(93)<220><221>CDS<222>(151)．．(612)<400>1gccgataacc tttatcatct ggttccaggg ctgccttgga tggcgacacc tccaggcttg 60aatgaatctc ttgcgttttt tgcacactac aatcatcaca caattgccgg gtagttttgt 120tgccagtttg cgcacctcaa ctaggctatt gtg caa tat atg aag cta gat tcc 174Val Gln Tyr Met Lys Leu Asp Ser1 5att gat cgc gca att att gcg gag ctt agc gcg aat gcg cgc atc tca 222Ile Asp Arg Ala Ile Ile Ala Glu Leu Ser Ala Asn Ala Arg Ile Ser10 15 20aat ctc gca ctg gct gac aag gtg cat ctc act ccg gga cct tgc ttg 270Asn Leu Ala Leu Ala Asp Lys Val His Leu Thr Pro Gly Pro Cys Leu25 30 35 40agg agg gtg cag cgt ttg gaa gcc gaa gga atc att ttg ggc tac agc 318Arg Arg Val Gln Arg Leu Glu Ala Glu Gly Ile Ile Leu Gly Tyr Ser45 50 55gcg gac att cac cct gcg gtg atg aat cgt gga ttt gag gtg acc gtg 366Ala Asp Ile His Pro Ala Val Met Asn Arg Gly Phe Glu Val Thr Val60 65 70gat gtc act ctc agc aac ttc gac cgc tcc act gta gac aat ttt gaa 414Asp Val Thr Leu Ser Asn Phe Asp Arg Ser Thr Val Asp Asn Phe Glu75 80 85agc tcc gtt gcg cag cat gat gaa gta ctg gag ttg cac agg ctt ttt 462Ser Ser Val Ala Gln His Asp Glu Val Leu Glu Leu His Arg Leu Phe90 95 100ggt tcg cca gat tat ttt gtc cgc atc ggc gtt gct gat ttg gag gcg 510Gly Ser Pro Asp Tyr Phe Val Arg Ile Gly Val Ala Asp Leu Glu Ala105 110 115 120tat gag caa ttt tta tcc agt cac att caa acc gtg cca gga att gca 558Tyr Glu Gln Phe Leu Ser Ser His Ile Gln Thr Val Pro Gly Ile Ala125 130 135aag atc tca tca cgt ttt gct atg aaa gtg gtg aaa cca gct cgc ccc 606Lys Ile Ser Ser Arg Phe Ala Met Lys Val Val Lys Pro Ala Arg Pro140 145 150cag gtg tgaagcatgc attttgaagc atgaatcttt ttcatctagt gaaggactga662Gln Valtcccatgcgt atgaaatcaa tcgcagcaat tgcaatcgct accgccgccc tgg715<210>2<211>154<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌<400>2Val Gln Tyr Met Lys Leu Asp Ser Ile Asp Arg Ala Ile Ile Ala Glu1 5 10 15Leu Ser Ala Asn Ala Arg Ile Ser Asn Leu Ala Leu Ala Asp Lys Val20 25 30His Leu Thr Pro Gly pro Cys Leu Arg Arg Val Gln Arg Leu Glu Ala35 40 45Glu Gly Ile Ile Leu Gly Tyr Ser Ala Asp Ile His Pro Ala Val Met50 55 60Asn Arg Gly Phe Glu Val Thr Val Asp Val Thr Leu Ser Asn Phe Asp65 70 75 80Arg Ser Thr Val Asp Asn Phe Glu Ser Ser Val Ala Gln His Asp Glu85 90 95Val Leu Glu Leu His Arg Leu Phe Gly Ser Pro Asp Tyr Phe Val Arg100 105 110Ile Gly Val Ala Asp Leu Glu Ala Tyr Glu Gln Phe Leu Ser Ser His115 120 125Ile Gln Thr val Pro Gly Ile Ala Lys Ile Ser Ser Arg Phe Ala Met130 135 140Lys Val Val Lys Pro Ala Arg Pro Gln Val145 150
權(quán)利要求
1.來自棒狀細(xì)菌的分離的多核苷酸，其包括選自如下一組的多核苷酸序列a)與編碼含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)編碼含有與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)與a)或b)的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸，以及d)含有a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)堿基的多核苷酸。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸是能在棒狀細(xì)菌中復(fù)制的優(yōu)選地為重組的DNA。
3.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸是RNA。
4.權(quán)利要求2的多核苷酸，含有如SEQ ID NO1所示的核酸序列。
5.權(quán)利要求2的能復(fù)制的DNA，含有(i)如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，或(ii)在遺傳密碼簡并范圍內(nèi)相應(yīng)于的序列(i)的至少一個(gè)序列，或(iii)與互補(bǔ)于序列(i)或(ii)的序列雜交的至少一個(gè)序列，和任選地(iv) (i)中有功能的中義突變。
6.權(quán)利要求2的多核苷酸序列，其編碼含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽。
7.生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其特征在于進(jìn)行以下步驟(a)發(fā)酵產(chǎn)生所需L-氨基酸的細(xì)菌，該細(xì)菌中至少lrp基因是弱化的或擴(kuò)增的，(b)富集培養(yǎng)基或細(xì)菌細(xì)胞中的所需產(chǎn)物，及(c)分離L-氨基酸。
8.權(quán)利要求7的方法，其特征在于所用細(xì)菌中所需的L-氨基酸生物合成途徑的其它基因被額外擴(kuò)增。
9.權(quán)利要求7的方法，其特征在于所用細(xì)菌中，降低所需氨基酸生成的代謝途徑至少被部分抑制。
10.權(quán)利要求7的方法，其特征在于使用經(jīng)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的菌株，且此質(zhì)粒載體攜帶編碼lrp基因的核苷酸序列。
11.權(quán)利要求7的方法，其特征在于在該細(xì)菌的lrp基因中產(chǎn)生缺失或插入以進(jìn)行弱化。
12.權(quán)利要求8-11任一項(xiàng)的方法，其特征在于使用產(chǎn)生L-氨基酸的棒狀細(xì)菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離的多核苷酸,其含有選自如下一組的多核苷酸序列:a)與編碼包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70%相同的多核苷酸,b)編碼含有與SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸,c)與a)或b)的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸,以及d)包括a),b)或c)的多核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)堿基的多核苷酸。本發(fā)明還涉及用lrp基因的擴(kuò)增或弱化而發(fā)酵制備L－氨基酸的方法。
文檔編號C12R1/15GK1290746SQ0012464
公開日2001年4月11日 申請日期2000年9月26日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月5日
發(fā)明者布里吉特·巴特, 約恩·卡利諾夫斯基, 阿爾弗雷德·普爾勒, 貝蒂娜·默克爾, 瓦爾特·普費(fèi)弗勒 申請人:德古薩－于爾斯股份公司