高危型人乳頭狀瘤病毒檢測(cè)方法及其采用的寡核苷酸序列和寡核苷酸探針的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高危型人乳頭狀瘤病毒檢測(cè)方法及其采用的寡核苷酸序列和寡核苷酸探針。
【背景技術(shù)】
[0002]人乳頭狀瘤病毒(Human Papilloma Virus，HPV)是一種嗜上皮性病毒，具有高度的特異性，屬于雙鏈閉環(huán)的小DNA病毒，包含約8000個(gè)堿基對(duì)。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的HPV有100多個(gè)型別，各型別與體內(nèi)特定感染部位和病變有關(guān)，其中有40多個(gè)型別與人類生殖道疾病有關(guān)。HPV感染主要是通過(guò)性生活傳播，感染后通常沒(méi)有明顯的臨床癥狀，感染的高峰年齡在18?28歲。然而大部分婦女的HPV感染為一過(guò)性，經(jīng)2?3年內(nèi)一般可自行消失，大約只有10%?15%的35歲以上的婦女有持續(xù)感染的情況，HPV持續(xù)感染將有患宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)。
[0003]在臨床上，根據(jù)HPV亞型致病力大小或致癌危險(xiǎn)性大小不同，將HPV分為低危型和高危型兩大類。低危型主要導(dǎo)致尖銳濕疣和低度宮頸上皮內(nèi)瘤變CIN IjnHPV6、HPVll、HPV30、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44亞型。高危型除可引起生殖器疣病外，更重要的是引起外生殖器癌、宮頸癌和CIN Π、CIN ΙΠ，如HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV51、即￥52、即￥53、即￥56、!^￥58、!^￥66等。有報(bào)道稱99.8%的子宮頸癌活檢標(biāo)本中可以檢測(cè)到HPV-DNA，其中，HPV16和HPV18型致病率最強(qiáng)，約占709LHPV16型感染多見于宮頸鱗癌，而HPV18型感染多見于宮頸腺癌。在婦女的一生中，可反復(fù)感染HPV，也可同時(shí)感染多種不同型別的HPV。隨著年齡的增長(zhǎng)，宮頸HPV的感染率明顯下降，這可能與機(jī)體免疫功能增強(qiáng)以及對(duì)病毒的限制或清除有關(guān)。
[0004]HPV檢測(cè)已成為宮頸癌的常用篩查方法，通過(guò)HPV的篩查可發(fā)現(xiàn)宮頸癌的早期患者，或者具有患宮頸癌的高危人群，有利于宮頸癌的早期發(fā)現(xiàn)和早期治療，對(duì)于宮頸癌的預(yù)防及治療，以及降低宮頸癌的發(fā)病率和死亡率具有非常重要的意義。
[0005]目前已存在的HPV檢測(cè)方法主要有細(xì)胞學(xué)檢查(主要包括薄層液基制片技術(shù)、巴氏涂片法等)、核酸雜交技術(shù)(如熒光原位雜交法、斑點(diǎn)雜交法、s ou then雜交法等)、PCR技術(shù)(如實(shí)時(shí)焚光定量PCR等)、HPV-DNA分型檢測(cè)、雜交捕獲二代、基因芯片技術(shù)和SP法。而目前臨床上常用的檢測(cè)方法主要是HPV分型檢測(cè)、雜交捕獲二代(HCn)以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR。然而這些方法都存在一定的不足，比如，HPV分型檢測(cè)操作較為繁瑣；而HC Π雖然特異性和靈敏性均較好，也已廣泛認(rèn)可，但是試劑較昂貴，成本較高，而且發(fā)光信號(hào)不穩(wěn)定;而PCR技術(shù)也存在標(biāo)本易污染、假陽(yáng)性率高等問(wèn)題。因此，探索一種操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高、成本低并且適合臨床大規(guī)模篩查的新方法就顯得很有意義。
[0006]隨著生命科學(xué)的不斷發(fā)展，近年來(lái)的研究也越來(lái)越關(guān)注納米技術(shù)在生物技術(shù)方面的應(yīng)用，目前納米生物技術(shù)已成為國(guó)際生物領(lǐng)域最前沿的研究熱點(diǎn)。雖然我國(guó)在這方面已取得了一些成果，但由于研究時(shí)間較短，今后還要在納米醫(yī)用材料、納米農(nóng)藥、納米生物傳感器等方面進(jìn)行深入研究，這些納米技術(shù)主要應(yīng)用的就是納米粒子。近年來(lái)，四種類型的納米粒子已經(jīng)得到了廣泛的研究和應(yīng)用:(I)納米金顆粒；(2)量子點(diǎn)；(3)核殼型熒光納米顆粒;(4)高分子納米微球。其中以金納米顆粒、量子點(diǎn)、核殼型熒光納米顆粒為代表的納米粒子在生物芯片、免疫檢測(cè)分析、基因突變檢測(cè)、遺傳病和腫瘤診斷、藥物研究、食品及環(huán)境中的檢測(cè)等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，這方面的研究進(jìn)展和研究成果引人注目，尤其是新型發(fā)光納米材料--量子點(diǎn)。
[0007]半導(dǎo)體量子點(diǎn)，簡(jiǎn)稱量子點(diǎn)(QuantumDots，QDs)，是一種在空間三維尺度均屬于納米尺度的零維材料，由于尺寸達(dá)到了臨界值，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)槲⒂^層次而表現(xiàn)出量子特性。半導(dǎo)體量子點(diǎn)通常是由兩種或兩種以上的ι-νπ、π-νι族或m-v族元素組成，而目前較成熟的量子點(diǎn)是由π-VI或m-V族元素組成，如CdSe、CdS、ZnS等。量子點(diǎn)的研究粒徑范圍一般在2?20nm，與傳統(tǒng)的有機(jī)熒光染料相比，量子點(diǎn)主要具備以下優(yōu)點(diǎn):①可以較易地通過(guò)控制反應(yīng)的時(shí)間來(lái)制得不同發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)；②量子點(diǎn)光穩(wěn)定性更高，不易發(fā)生光漂白現(xiàn)象，且較易地對(duì)其進(jìn)行表面修飾和連接，而不易發(fā)生熒光猝滅;③量子點(diǎn)的生物相容性更好，且對(duì)生物體危害小;④量子點(diǎn)可以用小于其發(fā)射波長(zhǎng)1nm的任意波長(zhǎng)的激發(fā)光進(jìn)行激發(fā)，從而可以同時(shí)標(biāo)記檢測(cè)多種物質(zhì)。鑒于量子點(diǎn)的上述優(yōu)點(diǎn)，將其運(yùn)用到生命科學(xué)領(lǐng)域吸引了很多科學(xué)家的關(guān)注，因此對(duì)量子點(diǎn)的合成制備、修飾以及在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用研究都取得了突破性進(jìn)展。目前已報(bào)道的應(yīng)用領(lǐng)域有:量子點(diǎn)在生物分子標(biāo)記方面的應(yīng)用(如乳腺癌細(xì)胞、抗體和DNA等);量子點(diǎn)在生物成像方面的應(yīng)用(如肝癌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、Hela細(xì)胞的標(biāo)記成像、胚胎干細(xì)胞、淋巴管等的成像);量子點(diǎn)在生物檢測(cè)方面的應(yīng)用(如癌胚抗原、免疫球蛋白、大腸桿菌、蛋白質(zhì)、DNA等)。
[0008]磁性納米粒子是一種具有磁導(dǎo)向性、低毒性、生物相容性好等特性的納米級(jí)材料。由于磁性納米材料的優(yōu)良特性，在磁性材料的制備和應(yīng)用上也做了較多的研究，尤其是在應(yīng)用方面，受到了廣大研究者的普遍關(guān)注。已報(bào)道的磁性納米粒子在生物領(lǐng)域的應(yīng)用主要有:細(xì)胞分離和免疫分析、醫(yī)學(xué)檢測(cè)和診斷、藥物載體等，但今后的重點(diǎn)仍然是將磁性納米材料用于醫(yī)學(xué)方面的檢測(cè)治療，尤其是對(duì)各種腫瘤的診療?；?0世紀(jì)70年代提出的“基因治療”的概念，對(duì)在基因水平上用磁性納米材料治療腫瘤的研究也將不斷得到發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的之一在于解決上述問(wèn)題，提供一種操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高、成本低、適合臨床大規(guī)模篩查的高危型人乳頭狀瘤病毒檢測(cè)方法。
[0010]本發(fā)明的目的之二在于提供一種上述檢測(cè)方法采用的寡核苷酸序列。
[0011 ]本發(fā)明的目的之三在于提供一種上述檢測(cè)方法采用的寡核苷酸探針。
[0012]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明上述目的之一的技術(shù)方案是:一種高危型人乳頭狀瘤病毒檢測(cè)方法，具有以下步驟:
Si:設(shè)計(jì)并合成特異性寡核苷酸序列；
所述特異性寡核苷酸序列為下述Seql和Seq3、或者為下述Seq2和Seq4;
Seql:5 ’-CATCTGCAAAAAAATA-B1tin-3 ’；
Seq2:5 ’-TCAACATCCCAAAA-B1tin-3 ’；
Seq3: 5 ’-NH2-GTCACTAGGCCGCCA-B1tin-3 ’ ；
Seq4: 5 ’-NH2-AAAACTTTTCCTTTA-B1tin-3 ’ ； 上述Seql和Seq2為捕獲DNA序列;上述Seq3和Seq4為顯示DNA序列；
52:分別制備CdTe量子點(diǎn)、硅納米粒子以及磁性納米粒子；
53:將步驟SI中的顯示DNA序列分別與CdTe量子點(diǎn)和硅納米粒子結(jié)合得到顯示探針;將步驟SI中的捕獲DNA序列與磁性納米粒子結(jié)合得到捕獲探針;將待測(cè)樣品先后與捕獲探針以及顯示探針混合，根據(jù)混合液的熒光強(qiáng)度判斷待測(cè)樣品中是否含有高危型人乳頭狀瘤病毒。
[0013]上述步驟S2中所述的CdTe量子點(diǎn)為親和素化的CdTe量子點(diǎn)。
[0014]上述步驟S2中所述的CdTe量子點(diǎn)的平均粒徑為3?5nm。
[0015]上述步驟S2中所述的娃納米粒子為戊二醛交聯(lián)的氨基化娃納米粒子。
[0016]上述步驟S3中所述的娃納米粒子的平均粒徑為90?110nm。
[0017]上述步驟S2中所述的磁性納米粒子為親和素化的氨基化Fe304磁性納米粒子。
[0018]上述步驟S2中所述的磁性納米粒子的平均粒徑為45?50nm。
[0019]上述步驟S3中顯示DNA序列的生物素化端與CdTe量子點(diǎn)結(jié)合，氨基化端通過(guò)戊二醛交聯(lián)劑與娃納米粒子結(jié)合。
[0020]上述步驟S3中娃納米粒子的濃度為0.lmg/mL?0.]^/1111^，優(yōu)選111^/1111^?1011^/1111^，更優(yōu)選4mg/mL。
[OO21 ] 上述步驟S3中捕獲探針的濃度為1yg/mL?1mg/mL，優(yōu)選0.lmg/mL?lmg/mL，更優(yōu)選 0.5mg/mL0
[0022]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明上述目