專(zhuān)利名稱(chēng)：絲狀體藍(lán)藻高效表達(dá)盒和含有該表達(dá)盒的載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種絲狀體藍(lán)藻高效表達(dá)盒和含有該表達(dá)盒的載體。
近幾年來(lái)，以藍(lán)藻為宿主的基因工程發(fā)展迅速。藍(lán)藻又名藍(lán)細(xì)菌，是一類(lèi)光合原核生物。藍(lán)藻的遺傳特性決定了藍(lán)藻基因工程的進(jìn)展。藍(lán)藻的結(jié)構(gòu)與大腸桿菌的分子遺傳背景十分相似。而且藍(lán)藻中除染色體DNA外，還含有質(zhì)粒DNA，也能發(fā)生接合和轉(zhuǎn)化。這使它們易于進(jìn)行分子操作，成為至今在藻類(lèi)中唯一能成功地轉(zhuǎn)入和表達(dá)外源基因的類(lèi)群。這些都使藍(lán)藻的分子生物學(xué)和基因工程近15年來(lái)得到了較快的發(fā)展，藍(lán)藻已經(jīng)成為基因工程的有效工具。
1981年Kuhlemeier等首次把抗生素基因?qū)胨{(lán)藻。1994年日本和我國(guó)學(xué)者同時(shí)把藥物基因轉(zhuǎn)入了藍(lán)藻。這以后，我們研究集體再把人腫瘤壞死因子-α、尿激酶原、人表皮生長(zhǎng)因子、人小腸三葉因子等基因轉(zhuǎn)入到藍(lán)藻并成功地表達(dá)，主要用于制藥和處理環(huán)境。
雖然轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻已有希望產(chǎn)業(yè)化制備藥物或處理環(huán)境，但存在一個(gè)極需解決的問(wèn)題就是提高表達(dá)效率以加速產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。迄今為止，國(guó)內(nèi)外所報(bào)導(dǎo)的藍(lán)藻表達(dá)外源基因的表達(dá)效率都不高。與大腸桿菌相比差1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。
我們研究集體近幾年也對(duì)轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻中外源基因的表達(dá)效率進(jìn)行了探索。從1993年起，我們先后通過(guò)改變載體質(zhì)粒(穿梭表達(dá)載體和整合表達(dá)載體)、啟動(dòng)子(PpsbA和金屬誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)、受體等因素，表達(dá)效率有所提高，但仍不理想。
由于藍(lán)藻是原核生物，其轉(zhuǎn)錄和翻譯幾乎同時(shí)進(jìn)行。近幾年對(duì)適用于藍(lán)藻基因工程的啟動(dòng)子研究較深入(如強(qiáng)啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的應(yīng)用)，但對(duì)翻譯水平的調(diào)控研究不多。外源基因的高效表達(dá)不僅和轉(zhuǎn)錄起始頻率有關(guān)，在很大程度上也與mRNA的翻譯起始頻率密切相關(guān)。在大腸桿菌中結(jié)構(gòu)不同的mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時(shí)可高達(dá)數(shù)百倍。翻譯水平調(diào)控的研究主要涉及SD序列和起始密碼子、偏愛(ài)密碼子。人工合成引入適用于藍(lán)藻的SD序列(6～8個(gè)堿基左右)，是一條有效可行的途徑。
mRNA的翻譯起始頻率主要由其5’-末端的結(jié)構(gòu)序列決定，稱(chēng)為核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)。RBS主要包括以下四個(gè)要素(1)位于mRNA上翻譯起始密碼上游的富含嘌呤結(jié)構(gòu)、可與核糖體16sRNA末端結(jié)合的SD序列(Schine-Delgarno)；(2)起始密碼子在E.coli和藍(lán)藻中，較常用的是AUG，也有少數(shù)使用GUG.；(3)SD與起始密碼子間的堿基組成和距離；(4)起始密碼子后的核苷酸序列對(duì)核糖體結(jié)合的影響。
針對(duì)目前存在的表達(dá)效率不高的問(wèn)題和調(diào)控的可能性，本發(fā)明在原來(lái)我們實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的pDC-TNF載體基礎(chǔ)工作上作了如下三方面改進(jìn)(1)通過(guò)PCR方法在目的基因TNF-α之前連上適用于藍(lán)藻的SD序列，(2)縮短了啟動(dòng)子PpsbA與目的基因之間的距離；(3)調(diào)整SD序列與目的基因TNF-α之間的距離來(lái)提高TNF-α的表達(dá)效率。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于在絲狀體藍(lán)藻中高效表達(dá)外源基因的表達(dá)盒。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種絲狀體藍(lán)藻高效表達(dá)載體。
因而，本發(fā)明提供了一種用于在絲狀體藍(lán)藻中高效表達(dá)外源基因的表達(dá)盒，包括啟動(dòng)子，SD序列和目的基因，其中所述的SD序列為5’-GGAGAG-3’。所述的啟動(dòng)子可以是可以在絲狀體藍(lán)藻中表達(dá)外源基因的任何一種啟動(dòng)子，例如PpsbA。
本發(fā)明的表達(dá)盒中，所述的外源基因可以為人腫瘤壞死因子-α(TNF-α)基因，也可以為其它的外源基因。
在本發(fā)明的表達(dá)盒中，SD序列與目的基因起始密碼子之間的距離為4bp。
在本發(fā)明的表達(dá)盒中，啟動(dòng)子與目的基因之間的距離為19bp。
本發(fā)明還提供了一種絲狀體藍(lán)藻表達(dá)載體，其特征在于，該載體含有本發(fā)明的表達(dá)盒。所述的載體可以是任何一種已知的在絲狀體藍(lán)藻中表達(dá)外源基因的質(zhì)粒載體，例如pKT-210，pDC-08，pRL-489。
本發(fā)明利用質(zhì)粒pIB-Tc構(gòu)建了一種絲狀藍(lán)藻的高效表達(dá)載體pIB-TNFα，并將這種表達(dá)載體在中國(guó)菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行了保藏，保藏中心地址中國(guó)，北京，中關(guān)村。保藏號(hào)為CGMCCNo.0508。
在本發(fā)明的表達(dá)盒中，從SD序列到起始密碼子的序列最好是GGAGAGTCATATG。
用新的SD序列構(gòu)建成pIB-TNF的表達(dá)效率提高了7倍，如表2所示表1
2.宿主菌E.coli DH5α來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室。
3.質(zhì)粒(1)pRL439，RP4+pRL542 in DH5α由美國(guó)國(guó)家植物學(xué)實(shí)驗(yàn)室C.P.Wolk教授贈(zèng)送；(2)質(zhì)粒pRL439上帶有PpsbA啟動(dòng)子、氨芐青霉素抗性基因、以及非受損的bom區(qū)(轉(zhuǎn)移必需區(qū))；穿梭質(zhì)粒pDC-8的大小為11kb，含有pDUI片段，有在藍(lán)藻中的復(fù)制位點(diǎn)、接合轉(zhuǎn)移驅(qū)動(dòng)識(shí)別位點(diǎn)bom，以及新霉素(NPT)基因，可表達(dá)卡那霉素抗性。
2.PCR法改變SD序列(1)引物通過(guò)引物設(shè)計(jì)在TNF基因的5’-端添加SD序列，在3’-端引入EcoRI的酶切位點(diǎn)。
引物1 含SD1 5’-CCTGGAGAGTCATATGG-3’引物2 含EcoRI酶切位點(diǎn)5’-AGAATTCCCCGGGGATC-3’(2)模板 以TNFα基因?yàn)槟０?3)PCR反應(yīng)及產(chǎn)物的純化反應(yīng)條件94℃變性1min；56℃退火1min；72℃延伸1min。共30個(gè)循環(huán)。
純化用4M的乙酸銨和無(wú)水乙醇純化。
3.穿梭表達(dá)載體pIB-TNF-α的構(gòu)建如


圖1所示，高效表達(dá)TNF-α基因的穿梭表達(dá)載體pIB-TNF-α的構(gòu)建過(guò)程可分為2步(1)把上述PCR產(chǎn)物的約600bp的DNA片段連在質(zhì)粒pRL-439啟動(dòng)子PpsbA下游的BamH1位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒pIB-Tc；
(2)用EcoRI/SalI雙酶切分別消化重組質(zhì)粒pIB-Tc和穿梭質(zhì)粒pDC-08；回收pIB-Tc的700bp左右的含啟動(dòng)子PpsbA，SD序列，TNF-α基因的片斷，以及pDC-08的9.0Kb片斷；連接后得到穿梭表達(dá)載體pIB-TNFα。
4.穿梭表達(dá)載體在大腸桿菌中的表達(dá)檢測(cè)圖2為大腸桿菌蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結(jié)果。含有pIB-TNF和pDC-TNF(未改變SD序列)的細(xì)菌裂解物中均出現(xiàn)了一條分子量約為17kD的蛋白帶。該蛋白帶分子量大小和TNF-α蛋白的理論值相符。與TNF-α蛋白的標(biāo)準(zhǔn)樣品也一致。而且含pIB-TNF的17kD的蛋白帶明顯比pDC-TNF的濃。經(jīng)CS-910薄層掃描儀檢測(cè)，TNF-α蛋白在分別含pIB-TNF和pDC-TNF的菌中的表達(dá)量分別是14.2％和6.9％(見(jiàn)圖3)。則改變SD序列后TNF在菌中的表達(dá)量提高了1.1倍。
5.三親接合轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)基因藻的篩選三親接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化7120后，在新霉素選擇壓力下平板篩選2周左右有轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)，而野生藻對(duì)照在新霉素選擇壓力下不能生長(zhǎng)(如圖3)。挑單菌落接種于含新霉素25的BG-11培養(yǎng)液中培養(yǎng)2周后變綠。進(jìn)一步提高新霉素的濃度，將轉(zhuǎn)基因藻接種于含新霉素35、45、55、65、75、85、100ug/ml的BG-11培養(yǎng)液中，培養(yǎng)并觀察。發(fā)現(xiàn)野生型魚(yú)腥藻即使在Neo25的培養(yǎng)液中也不能存活，而轉(zhuǎn)基因藻在新霉素100ug/ml的BG-11培養(yǎng)液中仍生長(zhǎng)良好。這說(shuō)明了pIB-TNF已轉(zhuǎn)入魚(yú)腥藻7120中，并且可穩(wěn)定維持新霉素抗性。
6.轉(zhuǎn)基因藻的DNA水平檢測(cè)分別提取野生藻、正對(duì)照(含空載體pDC-08的轉(zhuǎn)基因藻)和轉(zhuǎn)基因藻中的質(zhì)粒DNA，并以其為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)只有含pIB-TNF的轉(zhuǎn)基因藻有大小約600bp的PCR產(chǎn)物。證實(shí)了TNF基因確實(shí)已以質(zhì)粒形式穩(wěn)定存在于藍(lán)藻中。
7.TNF-α基因在魚(yú)腥藻7120中的表達(dá)及活性將藍(lán)藻細(xì)胞提取液用放射免疫法定量測(cè)量，結(jié)果如表2所示。發(fā)現(xiàn)含pIB-TNF的轉(zhuǎn)基因藻中TNFα的表達(dá)量比含pDC-TNF(未改變SD序列)的轉(zhuǎn)基因藻提高11倍。
權(quán)利要求
1.一種用于在絲狀體藍(lán)藻中高效表達(dá)外源基因的表達(dá)盒，包括啟動(dòng)子，SD序列和目的基因，其中所述的SD序列為5’-GGAGAG-3’。
2.按照權(quán)利要求1所述的表達(dá)盒，其中，所述的外源基因?yàn)槿四[瘤壞死因子-α(TNF-α)基因。
3.按照權(quán)利要求1所述的表達(dá)盒，其中，SD序列與目的基因起始密碼子之間的距離為4bp。
4.按照權(quán)利要求1所述的表達(dá)盒，其中，啟動(dòng)子與目的基因之間的距離為19bp。
5.按照權(quán)利要求1所述的表達(dá)盒，其中，所述的啟動(dòng)子是PpsbA。
6.按照權(quán)利要求1所述的表達(dá)盒，其中，從SD序列到起始密碼子的序列是GGAGAGTCATATG。
7.一種絲狀體藍(lán)藻表達(dá)載體，其特征在于，該載體含有權(quán)利要求1至6之一所述的表達(dá)盒。
8.按照權(quán)利要求7所述的表達(dá)載體pIB-TNFα，其保藏號(hào)為CGMCCNo.0508。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于在絲狀體藍(lán)藻中高效表達(dá)外源基因的表達(dá)盒,包括啟動(dòng)子,SD序列和目的基因,其中所述的SD序列為5’－GGAGAG－3’。本發(fā)明還提供了含有所述的表達(dá)盒的絲狀體藍(lán)藻表達(dá)載體。
文檔編號(hào)C12N15/70GK1353189SQ00132268
公開(kāi)日2002年6月12日 申請(qǐng)日期2000年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月14日
發(fā)明者施定基, 冉亮, 李艷, 鐘暉, 劉鳳龍, 彭國(guó)宏 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院植物研究所