專利名稱：具有滅活的dna錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的真菌細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種利用新穎的克隆基因制備絲狀真菌細(xì)胞DNA文庫的方法，該基因參與絲狀真菌細(xì)胞的錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)識(shí)別新合成的雙鏈DNA序列中的錯(cuò)配的系統(tǒng)。
錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)然后可利用甲基化的“舊”株系作為模板糾正被察覺為錯(cuò)誤的錯(cuò)配，或者可以介導(dǎo)包含錯(cuò)配的雙鏈DNA序列的降解。
獨(dú)立于精確的機(jī)理之外，最終結(jié)果將是“錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)”將限制細(xì)胞內(nèi)的“多樣性”，多樣性表現(xiàn)為包含錯(cuò)配的雙鏈DNA序列。
例如，包含單一錯(cuò)配的雙鏈DNA序列代表細(xì)胞內(nèi)兩種不同的DNA序列的多樣性。如果錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)糾正錯(cuò)配，那么在細(xì)胞內(nèi)將只有一種DNA序列。
或者，如果錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)介導(dǎo)這樣一種雙鏈DNA序列的降解，那么多樣性將消失。參見圖1，其以圖解方式闡述錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)在細(xì)胞內(nèi)是如何工作的。
所以，如果包含錯(cuò)配的雙鏈DNA序列代表目的DNA文庫，那么當(dāng)轉(zhuǎn)化(放置)到具有活性錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)時(shí)，該文庫的多樣性可以受到限制。
本領(lǐng)域提供了一種該問題的解決方案，即制備其中錯(cuò)配系統(tǒng)已失活的細(xì)胞。
EP449923描述了其中錯(cuò)配系統(tǒng)被滅活的細(xì)菌細(xì)胞。
WO97/37011描述了其中錯(cuò)配系統(tǒng)被滅活的酵母細(xì)胞。參見該文獻(xiàn)的工作例。
WO97/05268描述了其中錯(cuò)配系統(tǒng)被滅活的小鼠細(xì)胞。參見該文獻(xiàn)的工作例。
發(fā)明概述本發(fā)明所要解決的問題是提供制備絲狀真菌細(xì)胞DNA文庫的改進(jìn)策略。包含這樣一種DNA文庫的絲狀真菌細(xì)胞群體因而可以用于選擇目的多肽。還可以選擇具有特定性質(zhì)的多核苷酸序列，例如具有改變/改進(jìn)性質(zhì)的啟動(dòng)子、終止子和其它調(diào)節(jié)元件。
解決方案的基礎(chǔ)是發(fā)明人已經(jīng)克隆了參與絲狀真菌細(xì)胞錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的新基因。此外，該基因是第一種被克隆的參與絲狀真菌細(xì)胞錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的基因。
通過滅活絲狀細(xì)胞中的這種基因，有可能獲得這樣的絲狀細(xì)胞，它在其錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)中有缺陷，并且對(duì)制備絲狀真菌細(xì)胞中的DNA文庫來說是非常有用的。
該基因包含非常有特性的編碼如SEQ ID NO 2之683-758位所示多肽序列的DNA序列。
該DNA已經(jīng)用于克隆編碼如SEQ ID NO 2之1-940位所示多肽序列的全長基因。參見本文的工作例(見下)。
如本文工作例所述被克隆的基因是從米曲霉絲狀真菌細(xì)胞克隆的基因。
不過，基于本文所提供的新序列信息，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說從其他絲狀真菌細(xì)胞克隆相似的同源基因是例行工作，例如使用標(biāo)準(zhǔn)的雜交或PCR技術(shù)，優(yōu)選地使用編碼SEQ ID NO 2之683-758位所示多肽序列的DNA序列作為制備雜交探針或PCR引物的基礎(chǔ)。
因此，本發(fā)明在第一方面涉及絲狀真菌細(xì)胞，其中參與錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的基因已經(jīng)被滅活，該參與錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的基因包含(a)編碼SEQ ID NO 2之683-758位所示多肽序列的DNA序列；或(b)編碼至少70％等同于SEQ ID NO 2之683-758位的多肽序列的DNA序列；本發(fā)明在第二方面涉及絲狀真菌細(xì)胞，其中參與錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的基因已經(jīng)被滅活，該參與錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的基因包含(a)編碼SEQ ID NO 2之1-940位所示多肽序列的DNA序列；或(b)編碼至少70％等同于SEQ ID NO 2之1-940位的多肽序列的DNA序列。
如上所述，本發(fā)明第一或第二方面的絲狀真菌細(xì)胞非常適合于制備絲狀真菌細(xì)胞中目的DNA文庫。
因此，本發(fā)明在第三方面涉及制備絲狀真菌細(xì)胞群體的方法，其中群體中的個(gè)體細(xì)胞分別包含代表目的DNA文庫的不同目的DNA序列，該方法包括下列步驟(a)分別將不同的目的DNA序列放置在包含本發(fā)明第一或第二方面絲狀真菌細(xì)胞的絲狀真菌細(xì)胞群體中；(b)將(a)群體生長一段時(shí)間，使群體中單個(gè)目的DNA序列在本發(fā)明第一或第二方面錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)基因已被滅活的條件下復(fù)制至少一次。
圖1闡述了如第三方面步驟(b)所述使單個(gè)錯(cuò)配修復(fù)滅活型絲狀真菌細(xì)胞復(fù)制目的DNA至少一次的優(yōu)點(diǎn)之一。圖1可以看到，如本文所述使用絲狀真菌錯(cuò)配修復(fù)滅活細(xì)胞的第三方面方法使其中最終異型雙鏈DNA錯(cuò)配未被糾正的DNA文庫的制備成為可行。所得DNA文庫比在不具有滅活的錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的絲狀真菌細(xì)胞中制得的DNA文庫具有更高多樣性(參見圖1)。目的DNA序列的復(fù)制意味著兩股都被復(fù)制，使得分別產(chǎn)生的兩套雙鏈DNA，每套均基于兩條原始股之一。
其中群體中的個(gè)體細(xì)胞包含上述目的DNA文庫的絲狀真菌細(xì)胞群體可以用于選擇目的多肽。
因此，本發(fā)明在第四方面涉及生產(chǎn)目的多肽的方法，其包括第三方面的步驟，且其中目的DNA序列編碼目的多肽，該方法進(jìn)一步包括下列步驟(c)從第三方面步驟(b)所得絲狀真菌細(xì)胞群體中選擇所需的目的多肽。
第四方面方法的優(yōu)點(diǎn)是，目的多肽是從表達(dá)該多肽的絲狀真菌細(xì)胞中選擇的。所以，可直接知道所述多肽可以從絲狀真菌細(xì)胞表達(dá)，如果隨后需要在絲狀真菌細(xì)胞內(nèi)大規(guī)模制備多肽，那么這是有用的。當(dāng)DNA文庫編碼從絲狀真菌細(xì)胞衍生的目的多肽時(shí)，這一點(diǎn)是特別值得關(guān)注的，因?yàn)橐阎诠I(yè)上，絲狀真菌多肽優(yōu)選地是在絲狀真菌細(xì)胞內(nèi)制備的，且產(chǎn)量高。
這與類似的選擇方法相反，所述類似方法例如使用酵母細(xì)胞的方法。這里唯一已知的是所選擇的多肽能夠在酵母中被表達(dá)，以后在絲狀真菌細(xì)胞中的表達(dá)可能產(chǎn)生問題，尤其當(dāng)需要高產(chǎn)量時(shí)。
定義
下面提供上述本發(fā)明各方面技術(shù)特征的定義。
術(shù)語“基因”此處表示基因(DNA序列)能夠在所述細(xì)胞內(nèi)被表達(dá)為多肽。因此，所述基因序列將被定義為開始于起始密碼子(通常為“ATG”、“GTG”或“TTG”)，結(jié)束于終止密碼子(通常為“TAA”、“TAG”或“TGA”)的開發(fā)讀碼框。
如本領(lǐng)域已知，為了表達(dá)所述基因，必須有與該基因相連的元件，它們是該基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所必需的。這樣的標(biāo)準(zhǔn)元件可以包括啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、末端序列，還可以是本領(lǐng)域已知的其他元件。
按照本領(lǐng)域，術(shù)語“錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)”此處應(yīng)當(dāng)被理解為細(xì)胞內(nèi)識(shí)別雙鏈DNA序列錯(cuò)配的系統(tǒng)。例如參見WO97/37011第1頁第21-28行。錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)要么糾正被發(fā)現(xiàn)為錯(cuò)誤的錯(cuò)配，例如通過使用甲基化“舊”鏈作為模板，要么它可以介導(dǎo)包含錯(cuò)配的雙鏈DNA序列的降解。
獨(dú)立于精確的機(jī)理之外，最終結(jié)果將是“錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)”將限制細(xì)胞內(nèi)的“多樣性”，多樣性表現(xiàn)為包含錯(cuò)配的雙鏈DNA序列。
例如，包含單一錯(cuò)配的雙鏈DNA序列代表細(xì)胞內(nèi)兩種不同的DNA序列的多樣性。如果錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)糾正該錯(cuò)配，那么在細(xì)胞內(nèi)將只有一種DNA序列?；蛘撸绻e(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)介導(dǎo)這樣一種雙鏈DNA序列的降解，那么多樣性將消失。
被參與錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的基因編碼的多肽通過與錯(cuò)配目的的機(jī)理識(shí)別該錯(cuò)配。
因此，檢驗(yàn)如本文所述絲狀真菌細(xì)胞的錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)是否已滅活的測(cè)定法采用“凝膠移動(dòng)(shift)試驗(yàn)”，或稱“凝膠推遲試驗(yàn)”。這是本領(lǐng)域所用的一種標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)。參見WO97/05268第16、17和25頁。
這類試驗(yàn)的原理是細(xì)胞提取物從下列制成(a)絲狀真菌細(xì)胞，其中如本文所述參與錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的基因是滅活的；和(b)相應(yīng)的絲狀真菌細(xì)胞，其中的基因不是滅活的。這些提取物然后與含有堿基對(duì)錯(cuò)配的G∶T、G∶A、G∶G、A∶C的寡核苷酸和超螺旋TG二核苷酸結(jié)合/混合，在非變性凝膠上進(jìn)行測(cè)定。
如果凝膠移動(dòng)(shift)試驗(yàn)證明所含基因未滅活的對(duì)照絲狀真菌細(xì)胞包含與任意上述寡核苷酸結(jié)合的任意蛋白質(zhì)，并且這些結(jié)合蛋白在所含如本文所述參與錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的基因是滅活的絲狀真菌細(xì)胞中沒有見到，那么確認(rèn)后者錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)是滅活的。
本文工作例1提供了適合的凝膠移動(dòng)(shift)試驗(yàn)的詳細(xì)說明。
涉及術(shù)語“編碼至少70％等同于SEQ ID NO 2之683-758位所示多肽序列的多肽序列的DNA序列”和“編碼至少70％等同于SEQ ID NO 2之1-940位所示多肽序列的多肽序列的DNA序列”的序列同一性被確定為兩種序列之間的等同程度，其說明第一種序列從第二種衍化而來。同一性可以適當(dāng)借助本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序加以測(cè)定，例如GCG程序包中的GAP(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1994，GeneticsComputer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)《分子生物學(xué)雜志》48，443453)。GAP采用下列多肽序列比較設(shè)置GAP生成罰分3.0，GAP延長罰分0.1，結(jié)果，按照發(fā)明的第一方面，針對(duì)SEQ ID NO 2之683-758位所示氨基酸序列，或者按照發(fā)明的第一方面，針對(duì)SEQ ID NO 2之1-940位所示氨基酸序列，被本發(fā)明相似DNA序列編碼的多肽所表現(xiàn)的等同程度優(yōu)選為至少70％，更優(yōu)選為至少80％，更優(yōu)選為至少90％，更優(yōu)選為至少95％，尤其為至少97％。
術(shù)語“DNA文庫”此處表示至少兩種不同DNA序列的文庫。出于多數(shù)實(shí)用目的，文庫必須是更大的。因此，DNA文庫優(yōu)選地包含至少1000種不同的DNA序列，更優(yōu)選為至少10000種不同的DNA序列，進(jìn)而更優(yōu)選為至少100000種不同的DNA序列。
涉及本發(fā)明第三方面方法步驟(a)的術(shù)語“分別將不同的目的DNA序列放置在絲狀真菌細(xì)胞群體中”此處應(yīng)當(dāng)在“它不是等同于放置在絲狀真菌細(xì)胞群體中的目的DNA序列”這一意義上加以廣泛理解。在本文的上下文中，涉及使用錯(cuò)配修復(fù)缺陷型細(xì)胞制備DNA文庫的方法時(shí)，該術(shù)語應(yīng)當(dāng)優(yōu)選地表示這樣一種情形，其中絲狀真菌細(xì)胞群體內(nèi)的細(xì)胞包含至少兩種不同的目的DNA序列，它們是部分同源的，以致它們能夠在細(xì)胞內(nèi)彼此雜交/重組。測(cè)定這類序列如何部分同源以獲得所述細(xì)胞內(nèi)的重組是本領(lǐng)域技術(shù)人員的常識(shí)。
實(shí)例可以是將與染色體DNA序列部分同源的單股寡核苷酸序列放置在細(xì)胞內(nèi)，或者將包含錯(cuò)配(例如包含在載體內(nèi))的雙鏈DNA序列放置在細(xì)胞內(nèi)。見下關(guān)于這些例子的進(jìn)一步說明。
將這些DNA序列放置在絲狀細(xì)胞內(nèi)的具體實(shí)驗(yàn)方法可以按照多種適當(dāng)技術(shù)中的任一種進(jìn)行，例如轉(zhuǎn)化技術(shù)。
按照本發(fā)明第三方面步驟(b)，術(shù)語“將(a)群體生長一段時(shí)間，使群體中單個(gè)目的DNA序列在錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)基因已被滅活的條件下復(fù)制至少一次”表示，在個(gè)體細(xì)胞已經(jīng)自我復(fù)制至少一次之后，錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)可以被重新激活，而不喪失該方法的優(yōu)點(diǎn)。圖1闡述了其中的技術(shù)原因。本例中，將包含單一錯(cuò)配的雙鏈DNA序列放置在絲狀細(xì)胞中。當(dāng)細(xì)胞已經(jīng)在錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)基因已被滅活的條件下復(fù)制一次之后，雙鏈DNA內(nèi)兩種不同的單股DNA序列分別被復(fù)制，得到兩種不同的雙鏈序列，每個(gè)復(fù)制細(xì)胞中含有其一，沒有任何錯(cuò)配。因此，由于這樣的細(xì)胞不包含具有錯(cuò)配的目的雙鏈DNA序列，因此不存在維持錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)滅活的技術(shù)需要。
下面描述本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，僅供例證。


圖1本圖闡述將包含單一錯(cuò)配的雙鏈DNA序列放置在絲狀細(xì)胞中的實(shí)例。當(dāng)細(xì)胞已經(jīng)在錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)基因已被滅活的條件下復(fù)制一次之后，雙鏈DNA內(nèi)兩種不同的單股DNA序列分別被復(fù)制，得到兩種不同的雙鏈序列，每個(gè)復(fù)制細(xì)胞中含有其一，沒有任何錯(cuò)配。相反，在錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)是活性的細(xì)胞中，雙鏈內(nèi)的錯(cuò)配被糾正了。
圖2本圖顯示從所克隆的PCR片段衍生的三種不完全米曲霉多肽序列‘msh2’Ao-co110/13/15。將這三種不完全多肽序列與其他兩種已知錯(cuò)配修復(fù)蛋白人錯(cuò)配修復(fù)蛋白，即msh2-human.p；和釀酒酵母錯(cuò)配修復(fù)蛋白，即S.c.msh2的不完全多肽序列對(duì)比排列。圖中帶下劃線的序列衍生自PCR片段的構(gòu)建。
圖3本圖顯示公認(rèn)的(putative)米曲霉錯(cuò)配修復(fù)蛋白(Ao.MSH2)的推定(proposed)多肽序列與三種已知的錯(cuò)配修復(fù)蛋白人類來源(msh2-human.p)、鼠類來源(msh2-mus.p)和酵母來源(S.c.msh2)多肽序列的排列。
發(fā)明的詳細(xì)說明如本文所述的絲狀真菌細(xì)胞，其中如本文所述參與錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的基因已被滅活。
參與錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的基因的滅活如本文所述參與錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的新型基因可以通過技術(shù)人員已知的多種已知技術(shù)之一加以滅活。
本發(fā)明的實(shí)施方案涉及如本文所述的絲狀真菌細(xì)胞，其中參與錯(cuò)配修復(fù)的基因是有缺陷的。
當(dāng)DNA序列已知時(shí)，大量使基因缺陷的方法都是技術(shù)人員已知的。這些方法包括刪除基因的一部分DNA序列；通過刪除或插入核苷酸引入移碼突變；引入終止密碼子等。
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案涉及如本文所述的絲狀真菌細(xì)胞，其中參與錯(cuò)配修復(fù)的基因已被暫時(shí)滅活。
與上述類似，可做到這一點(diǎn)的大量方法都是技術(shù)人員已知的，包括在基因上游插入可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子，或者例如永久刪除染色體上該基因的一部分，然后將載體(例如質(zhì)粒)插入到包含該基因的細(xì)胞中。質(zhì)粒可以在基因上游包含可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子，或者當(dāng)錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)需被暫時(shí)滅活時(shí)，質(zhì)?？梢詮募?xì)胞中除去，然后當(dāng)錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)需被重新激活時(shí)，可以重新插入到細(xì)胞中。
出于具體技術(shù)目的而選擇適當(dāng)?shù)牟呗允羌夹g(shù)人員的常識(shí)。
制備如本文所述能夠暫時(shí)滅活錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的絲狀真菌細(xì)胞的優(yōu)選方法是，首先如本文所述永久滅活細(xì)胞染色體上的錯(cuò)配修復(fù)基因，然后將質(zhì)粒插入到包含該基因的細(xì)胞中，其中該質(zhì)粒的特征在于它包含適合的復(fù)制起始序列和適合的選擇性標(biāo)記。
優(yōu)選地，適合的復(fù)制起始序列是AMA1(Gems，D.等(1991)《基因》9861-67)。
下面立即提供適合的復(fù)制起始序列和適合的選擇性標(biāo)記的更詳細(xì)說明，本文工作例4提供了這種策略的實(shí)例，使用包含AMA1的質(zhì)粒作為復(fù)制起始序列，使用AmdS作為選擇性標(biāo)記。
復(fù)制起始序列本文所用的術(shù)語“真菌的復(fù)制起始序列”被定義為這樣一種核酸序列，它能夠支持真菌宿主細(xì)胞中的染色體外分子、例如質(zhì)?；駾NA載體的自我復(fù)制，通常不發(fā)生質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)重排或向宿主細(xì)胞基因組的整合。復(fù)制起始序列可以是任意來源的，只要它能夠介導(dǎo)真菌細(xì)胞中的復(fù)制引發(fā)活性即可。
優(yōu)選地，復(fù)制起始序列來自絲狀真菌細(xì)胞，更優(yōu)選為曲霉屬、鐮孢屬或鏈格孢屬的菌株，進(jìn)而更優(yōu)選為構(gòu)巢曲霉、米曲霉、黑曲霉、尖孢鐮孢或互格鏈格孢。
復(fù)制起始序列可以通過本領(lǐng)域熟知的方法加以鑒定。例如，可以從選定生物衍生的基因組片段中鑒定出能夠在酵母中的持續(xù)自我復(fù)制的序列(Ballance和Turner《基因》36(1985)，321-331)，其預(yù)示絲狀真菌細(xì)胞中的自我復(fù)制能力。指定序列的真菌復(fù)制引發(fā)活性還可以這樣測(cè)定，用所選質(zhì)粒復(fù)制子轉(zhuǎn)化真菌，選擇具有不規(guī)則形態(tài)的菌落，其指示分段質(zhì)粒的喪失，該分段質(zhì)粒會(huì)引起在選擇性培養(yǎng)基上篩選質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)的基因時(shí)的生長缺乏(Gems等《基因》98(1991)61-67)。AMA1是以這種方式分析的。分析復(fù)制起始序列的另一種方式是分析天然存在的質(zhì)粒(例如Tusge等所公開的，《遺傳學(xué)》146(1997)111-120，關(guān)于互格鏈格孢)。
復(fù)制起始序列的實(shí)例包括但不限于構(gòu)巢曲霉的ANS1和AMA1序列，例如分別描述于Cullen，D.等(1987《核酸研究》159163-9175)和Gems，D.等(1991《基因》9861-67)。
術(shù)語“復(fù)制引發(fā)活性”在本文中使用其常規(guī)含義，也就是表示序列能夠支持真菌細(xì)胞中的染色體外分子、例如質(zhì)?；駾NA載體的自我復(fù)制。
術(shù)語“不發(fā)生質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)重排”在本文中用于表示既沒有刪除質(zhì)粒的一部分或插入該質(zhì)粒的另一部分，也沒有任何宿主基因組DNA插入到質(zhì)粒中。
絲狀真菌選擇性標(biāo)記術(shù)語“選擇性壓力”在本文中被定義為在有或沒有有效量的適當(dāng)選擇劑的存在下，培養(yǎng)含有DNA載體的絲狀真菌細(xì)胞，該載體含有可操縱連接在目的多核苷酸序列上的真菌選擇性標(biāo)記基因。有效量的選擇劑在本文中被定義為足以從不含選擇性標(biāo)記的細(xì)胞中選擇出含有選擇性標(biāo)記的細(xì)胞的量。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，真菌選擇性標(biāo)記選自，編碼能夠提供對(duì)殺生物劑或病毒毒性的抗性、對(duì)重金屬毒性的抗性或原養(yǎng)型變?yōu)闋I養(yǎng)缺陷型的產(chǎn)物的基因。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，原養(yǎng)型是從選自這樣一組代謝途徑的酶獲得的，這些代謝途徑是由核苷酸合成、輔因子合成、氨基酸合成、乙酰胺代謝、脯氨酸代謝、硫酸代謝和硝酸代謝組成的。
在進(jìn)而更優(yōu)選的實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法中，真菌選擇性標(biāo)記是這樣一種基因，其選自argB(鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、amdS(乙酰胺酶)、bar(膦絲菌素乙酰基轉(zhuǎn)移酶)、hemA(5-氨基乙酰丙酸合成酶)、hemB(膽色素原合成酶)、hygB(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸鹽還原酶)、prn(脯氨酸通透酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶)、pyroA、riboB、sC(硫酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合成酶)。
將真菌細(xì)胞在適合的培養(yǎng)基中、在適合篩選或選擇攜有變異的目的多核苷酸序列的轉(zhuǎn)化體的條件下培養(yǎng)，該序列具有或編碼所需的特征。培養(yǎng)可以按照本領(lǐng)域熟知的用于篩選多核苷酸變體文庫的方法進(jìn)行。
絲狀真菌細(xì)胞如本文所述的絲狀真菌細(xì)胞包括真菌亞門(Eumycota)和卵菌亞門(Oomycota)的所有絲狀形式。絲狀真菌的特征是菌絲壁由殼多糖、纖維素、葡聚糖、脫乙酰殼多糖、甘露聚糖和其他復(fù)雜的多糖組成。營養(yǎng)生長借助于菌絲的伸長，碳的分解代謝為專性需氧型。相反，釀酒酵母等酵母的營養(yǎng)生長借助于單細(xì)胞原植體的芽殖，碳的代謝可以是厭氧發(fā)酵的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌細(xì)胞是下列物種的細(xì)胞，支頂孢屬、曲霉屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、毛霉屬、毀絲霉屬、鏈孢霉屬、青霉屬、小柱孢霉屬(Scytalidium)、草根霉屬、Tolypocladium和木霉屬，但不限于此。
用在本發(fā)明中的絲狀真菌細(xì)胞實(shí)例包括曲霉屬細(xì)胞、支頂孢屬細(xì)胞、鐮孢屬細(xì)胞、腐質(zhì)霉屬細(xì)胞、毛霉屬細(xì)胞、毀絲霉屬細(xì)胞、鏈孢霉屬細(xì)胞、青霉屬細(xì)胞、草根霉屬細(xì)胞、Tolypocladium細(xì)胞和木霉屬細(xì)胞。
更具體地，絲狀真菌細(xì)胞是泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細(xì)胞；桿孢狀鐮孢、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、大刀鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖孢鐮孢、多枝鐮孢、玫瑰色鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、Fusariumvenenatum的細(xì)胞或Fusarium venenatum細(xì)胞(Nirenberg sp.nov)；Humicolainsolens細(xì)胞或Humicola lanuginosa細(xì)胞；米赫毛霉細(xì)胞；嗜熱毀絲霉細(xì)胞；粗糙鏈孢霉細(xì)胞；產(chǎn)紫青霉細(xì)胞；Thielavia terrestris細(xì)胞；Trichodermaharzianum、康寧氏木霉、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei或綠色木霉細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明第三方面制備包含DNA文庫的絲狀真菌細(xì)胞群體的方法按照本發(fā)明第三方面方法的步驟(a)，分別將不同的目的DNA序列放置在絲狀真菌細(xì)胞群體中如上所述，將這些DNA序列放置在絲狀真菌細(xì)胞內(nèi)的具體實(shí)驗(yàn)方法可以按照多種適當(dāng)技術(shù)之一進(jìn)行，例如轉(zhuǎn)化技術(shù)。參見普通的真菌教科書《真菌遺傳》(1996，ISBN 0-8247-9544-X)關(guān)于這些標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)的進(jìn)一步說明。
實(shí)例可以是將與染色體DNA序列部分同源的單股寡核苷酸序列放置在細(xì)胞內(nèi)。參見Calissano等《真菌遺傳通訊(Fungal genetic newsletter)》4315-16(1995)關(guān)于這一點(diǎn)的進(jìn)一步說明。
另一種實(shí)例可以是將包含錯(cuò)配的雙鏈DNA序列(例如圖1所示，包含在載體內(nèi))放置在細(xì)胞內(nèi)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將不同的目的DNA序列包含在質(zhì)粒中，其中該質(zhì)粒的特征在于，它包含如上所述的適當(dāng)復(fù)制起始序列和適合的選擇性標(biāo)記。
優(yōu)選地，適合的復(fù)制起始序列是AMA1(Gems，D.等(1991)《基因》9861-67)。
按照本發(fā)明第三方面的步驟(b)，將步驟(a)的群體生長一段時(shí)間使群體中的單個(gè)目的DNA序列在錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)基因已如本文所述被滅活的條件下復(fù)制至少一次。
群體的生長可以在多種適合的已知用于生長絲狀真菌細(xì)胞的培養(yǎng)基之任一中進(jìn)行。選擇這樣一種適合的培養(yǎng)基是技術(shù)人員的常識(shí)。
上文已經(jīng)解釋過，群體中的單個(gè)細(xì)胞必須能在錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)基因已如本文所述被滅活的條件下復(fù)制至少一次。
所述細(xì)胞當(dāng)然可以在錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)基因已被滅活的條件下復(fù)制一次以上。
由于錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的滅活通常將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)染色體DNA上突變的累積，由此可能成為細(xì)胞的致死突變，因此實(shí)際優(yōu)選的上述復(fù)制周期次數(shù)將取決于這些潛在的致死突變出現(xiàn)得有多快。
確定優(yōu)選的復(fù)制周期有多少是技術(shù)人員的常識(shí)。
由于這些潛在的致死突變，優(yōu)選步驟(b)下的錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)已經(jīng)被暫時(shí)滅活。
在根據(jù)第三方面步驟(b)的適合的復(fù)制周期之后，重新激活暫時(shí)滅活的錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)，目的是避免絲狀真菌細(xì)胞本身中的這些致死突變。這種暫時(shí)滅活的策略可以是任意上述策略。
另一種限制突變引入到染色體上的策略是在錯(cuò)配修復(fù)缺陷的條件下暫時(shí)停止染色體的復(fù)制，而復(fù)制染色體外元件。這可以通過在僅為染色體復(fù)制所必需的元件中引入突變加以實(shí)現(xiàn)。
優(yōu)選的策略是使用這樣的絲狀真菌細(xì)胞，其中如本文所述參與錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的基因在細(xì)胞染色體上被永久滅活，然后插入質(zhì)粒到包含該基因的細(xì)胞中，其中該質(zhì)粒的特征在于它包含適合的復(fù)制起始序列和適合的選擇性標(biāo)記。見上關(guān)于這種策略的進(jìn)一步解釋。
優(yōu)選地，適合的復(fù)制起始序列是AMA1(Gems，D.等(1991)《基因》9861-67)。
進(jìn)一步的實(shí)施方案涉及本發(fā)明第三方面的方法，其中步驟(b)下的錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)是有缺陷的。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如本文所述的方法，其中在本發(fā)明第三方面的步驟(b)下，存在部分同源的目的DNA序列的體內(nèi)基因間重組。
由于本發(fā)明的總體概念是提供涉及錯(cuò)配系統(tǒng)滅活的方法，當(dāng)然優(yōu)選所述部分同源的DNA序列能夠體內(nèi)形成包含錯(cuò)配的雙鏈DNA序列。
按照本發(fā)明的第四方面制備目的多肽的方法，其包括本發(fā)明第三方面的步驟且其中目的DNA序列編碼目的多肽按照第四方面的步驟(c)，從第三方面步驟(b)所得絲狀真菌細(xì)胞群體中選擇所需的目的多肽。
所需的目的多肽可以是包含所需技術(shù)特征的任意多肽，所述技術(shù)特征例如提高了的穩(wěn)定性；所需的特異性活性；所需的最佳pH；在洗滌劑中的改進(jìn)的洗滌性能；等。
用于選擇這種所需的目的多肽的特殊策略可以是技術(shù)人員已知的大量選擇策略之任一，例如平板篩選試驗(yàn)、基于微滴板的試驗(yàn)等。
本發(fā)明的實(shí)施方案涉及本發(fā)明第四方面的方法，進(jìn)一步包括下列步驟(d)可選的步驟，其包括根據(jù)進(jìn)一步的特定需要修飾按需要選擇的目的多肽的氨基酸序列；(e)將編碼第四方面步驟(c)的目的多肽或步驟(d)的修飾型目的多肽的DNA序列放置到適合于大規(guī)模制備該目的多肽的絲狀真菌細(xì)胞中；(f)在允許目的多肽表達(dá)的條件下，在至少10000m3的發(fā)酵罐中培養(yǎng)步驟(e)的絲狀真菌細(xì)胞；(g)分析目的多肽。
該實(shí)施方案涉及與工業(yè)化密切相關(guān)的方法，其中所選擇的目的多肽是大規(guī)模制備的。
可選的步驟(d)涉及這樣一種情形，其中選擇例如所需的目的多肽，目的例如是鑒定根據(jù)本發(fā)明第三方面步驟(c)的、在洗滌劑中具有改良的洗滌性能的多肽。這種多肽盡管在洗滌劑中具有改進(jìn)的洗滌性能，但作為商業(yè)產(chǎn)品可能不夠穩(wěn)定。因此，可能需要該選定的多肽中進(jìn)行一些進(jìn)一步的氨基酸取代，例如適合的脯氨酸取代，目的是獲得足夠的穩(wěn)定性，以使這種多肽商品化。
進(jìn)一步的實(shí)施方案涉及剛才的實(shí)施方案的方法，其中適合于大規(guī)模制備所述實(shí)施方案步驟(e)的目的多肽的絲狀真菌細(xì)胞是不同于本發(fā)明第三方面步驟(a)的絲狀真菌細(xì)胞的另一種絲狀真菌細(xì)胞。
該實(shí)施方案涉及這樣一種情形，其中用于選擇目的多肽的絲狀真菌細(xì)胞不同于用于大規(guī)模制備的絲狀真菌細(xì)胞。
進(jìn)一步的實(shí)施方案涉及如本文所述的方法，其中目的多肽是從絲狀真菌細(xì)胞衍生的多肽。
術(shù)語“從絲狀真菌細(xì)胞衍生”應(yīng)當(dāng)被理解為目的多肽的氨基酸序列信息是從得自絲狀真菌細(xì)胞的多肽衍生的。
所以，它可以是野生型絲狀真菌多肽的變體和/或可以是兩種或更多不同的絲狀真菌多肽的重組/改組產(chǎn)物。
在進(jìn)而進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如本文所述的方法，其中目的多肽是一種酶，例如淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶、木聚糖酶、磷脂酶。
實(shí)施例材料用作緩沖劑和底物的化學(xué)品是至少為試劑級(jí)的商業(yè)產(chǎn)品。
實(shí)施例1適合于測(cè)定如本文所述的絲狀真菌細(xì)胞是否在錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)中被滅活的凝膠這種凝膠移動(dòng)(shift)試驗(yàn)的原理是，細(xì)胞提取物從下列制成(a)絲狀真菌細(xì)胞，其中如本文所述參與錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的基因是滅活的；和(b)相應(yīng)的絲狀真菌細(xì)胞，其中的基因不是滅活的。
這些提取物然后與含有堿基對(duì)錯(cuò)配的G∶T、G∶A、G∶G、A∶C的寡核苷酸和超螺旋的TG的二核苷酸結(jié)合/混合，在非變性凝膠上進(jìn)行測(cè)定。
如果凝膠移動(dòng)(shift)試驗(yàn)證明所含基因未滅活的對(duì)照絲狀真菌細(xì)胞包含與任意上述寡核苷酸結(jié)合的任意蛋白質(zhì)，并且這些結(jié)合蛋白在所含如本文所述參與錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的基因已滅活的絲狀真菌細(xì)胞中沒有見到，那么確認(rèn)后者錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)是滅活的。
實(shí)驗(yàn)方案細(xì)胞提取物的制備如Nagata等所述進(jìn)行(Mol.Gen Genet(1993)237251-260；見材料和方法)。
基本上如文獻(xiàn)所述進(jìn)行寡核苷酸的退火、細(xì)胞提取物與含有錯(cuò)配的雙鏈寡核苷酸的結(jié)合、以及非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Stephenson和Karran；來自人類細(xì)胞的蛋白質(zhì)與DNA堿基對(duì)錯(cuò)配的選擇性結(jié)合；《生物化學(xué)雜志》2642177-21182(1989))。
不過，凝膠電泳是在TAE緩沖液、而不是TBE緩沖液中進(jìn)行的。為了獲得雙鏈寡核苷酸，使寡核苷酸U被放射性標(biāo)記，并與任意未標(biāo)記的寡核苷酸L-G.T、L-G.A、L-G.C、L-A.C、L-T.G或L-HOM退火。寡核苷酸序列是從Aquilina等《美國國家科學(xué)院院報(bào)》918905-8909(1994)獲得的。
U5′-GGGAAGCTGCCAGGCCCCAGTGTCAGCCTCCTATGCTC-3′(SEQ ID NO 3)；L-G.T5′-GAGCATAGGAGGCTGACATTGGGGCCTGGCAGCTTCCC-3′(SEQ ID NO 4)(導(dǎo)致G.T錯(cuò)配)；
L-G.A.5′-GAGCATAGGAGGCTGACAATGGGGCCTGGCAGCTTCCC-3′(SEQ ID NO 5)(導(dǎo)致G.A錯(cuò)配)；L-G.G.5′-AGCATAGGAGGCTGACAGTGGGGCCTGGCAGCTTCCC-3′(SEQ ID NO 6)(導(dǎo)致G.G錯(cuò)配)；L-A.C.5′-GAGCATAGGAGGCTGACACCGGGGCCTGGCAGCTTCCC-3′(SEQ ID NO 7)(導(dǎo)致A.C錯(cuò)配)；L-TG5′-GAGCATAGGAGGCTGACACTGTGGGGCCTGGCAGCTTCCC-3′(SEQ ID NO 8)(導(dǎo)致超螺旋的TG二核苷酸)；L-HOM5′-GAGCATAGGAGGCTGACACCGGGGCCTGGCAGCTTCCC-3′(SEQ ID NO 9)(導(dǎo)致同源雙鏈)。
所有實(shí)驗(yàn)均包括兩倍過量的未標(biāo)記的同型雙鏈競爭性寡核苷酸。
實(shí)施例2參與米曲霉細(xì)胞錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的基因的克隆如本例所述被克隆的基因顯示在SEQ ID NO 1(DNA序列)和SEQ IDNO 2(翻譯的氨基酸序列)中。
來自不同生物的錯(cuò)配修復(fù)蛋白的若干序列是已知的，下面僅用到其中的三種釀酒酵母(M84170)、H.sapiens(L47580)和小鼠(U21011)。
所示數(shù)字是公眾可以獲得的GenBank數(shù)據(jù)庫的查詢數(shù)。
基于已知錯(cuò)配修復(fù)蛋白之間的C-端同源性，設(shè)計(jì)了一組簡異引物，目的是擴(kuò)增米曲霉同系物的不完全序列Pr117858(SEQ ID NO 10)P-GGCNCARATHGGNTGYTTYGTNCCPr117859(SEQ ID NO 11)P-GCCCANGCNARNCCRAANCC利用來自米曲霉菌株JaL142(WO96/29391)的染色體DNA作為模板以及上述引物，在八種MgSO4濃度(0.5mM至4.0mM，按照制造商的建議；Boehringer M.)下進(jìn)行下列基于50μl PWO聚合酶的PCR反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)1mMMgSO4是最優(yōu)的，得到約230bp的單一帶，是預(yù)計(jì)序列中不含內(nèi)含子的結(jié)果。
PCR循環(huán)為[96℃2min-(94℃15s；50℃15s；72℃30s)循環(huán)30次-72℃7min-4℃維持]。
230bp PCR片段經(jīng)鈍端連接在pUC19的BamH1位點(diǎn)。pUC19在牛小腸堿性磷酸酶的存在下經(jīng)BamH1裂解，然后通過klenow聚合酶和dNTP補(bǔ)平粘性末端。從上述連接反應(yīng)的大腸桿菌XL1轉(zhuǎn)化體中分析攜有插入片段的三個(gè)質(zhì)粒，并測(cè)序。對(duì)克隆的PCR片段翻譯的多肽進(jìn)行排列揭示了它與已知的錯(cuò)配修復(fù)蛋白序列具有較高同源性(見圖2)。
圖2中帶下劃線的序列是從上述共有PCR引物衍生的序列。
圖2的三種曲霉屬序列等于SEQ ID NO 2之683-758位所示序列，但其中685位在最終所克隆的序列中是Thr(T)，而不是所示的Ile(I)。這是由上述共有引物中的序列引起的。
圖2所示排列清楚地證明，所克隆的片段來自錯(cuò)配修復(fù)蛋白的米曲霉同系物。
為了克隆完整的基因，通過PCR生成所克隆片段的放射性標(biāo)記探針，即，使用0.5mg pUC19′msh2′-13(見上)作為模板，在100ml中與Taq聚合酶、30pmol pUC正向與反向引物、0.2mM dG-、dC-、dTTP和0.2mM dATP+32P-dATP反應(yīng)。所生成的放射性標(biāo)記探針通過EcoR1-Hind3消化作用從pUC19序列中釋放出來，然后進(jìn)行所得293bp片段的凝膠純化。
使探針與來自米曲霉菌株A1560(JaL142的父代)(WO96/29391)基因組DNA的膜格點(diǎn)(gridded)粘粒文庫雜交。通磷酸成像僅(Phosphoimager)中分析而鑒定濾膜上的陽性克隆為λ31A2。
繁殖λ31A2粘粒DNA，使用上述相同的放射性標(biāo)記引物進(jìn)行Southern分析。鑒定了大約9Kb Pst片段，其被BstX(以前在所克隆的PCR片段中發(fā)現(xiàn))分裂為5.8和3.2kb片段，均因攜有探針而發(fā)出信號(hào)，將該9kb片段克隆至已用Pst切割的pUC19，得到名為pUC19msh2P的質(zhì)粒。從表明以前測(cè)定過的序列的引物開始按順序?qū)Σ迦肫螠y(cè)序，以下是基于最后一輪所測(cè)序列的引物130740(SEQ ID NO 12)GCTCGAAACATCCAACATCC130741(SEQ ID NO 13)GCTGTGAATCACTTGCACC131928(SEQ ID NO 14)CTTCATAAACTGCGACAAATCATGC131929(SEQ ID NO 15)GGAGGAGCATCTTCGC131930(SEQ ID NO 16)GGAACTTGAAGACTTTACTTCATCC134608(SEQ ID NO 17)CCAGAAACTCGCTAACACC134609(SEQ ID NO 18)GTGCTTTGCGGACGC134610(SEQ ID NO 19)CAGGACAGTAGGACGC
135320(SEQ ID NO 20)CGAGCGATGAACTCTGC135321(SEQ ID NO 21)GCGTTGGTGGATTATCC136105(SEQ ID NO 22)CGTTGCATCTATCATATACC136106(SEQ ID NO 23)GGTATATGATAGATGCAACGC據(jù)此測(cè)定的3825bp序列(SEQ ID NO 1)在以前在PCR片段中測(cè)定的框架中翻譯。所得蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 2)被稱為Ao.MSH2，將其與圖3中已知錯(cuò)配修復(fù)蛋白的蛋白質(zhì)序列排列。從圖3所示排列可以看出，所克隆和測(cè)序的DNA清楚地涵蓋了酵母、人和小鼠錯(cuò)配修復(fù)蛋白的同源物的編碼序列，其在N-端部分有一個(gè)內(nèi)含子。按照標(biāo)準(zhǔn)的剪接規(guī)則推斷內(nèi)含子的位置，并且構(gòu)成唯一的可能性。
實(shí)施例3破壞米曲霉細(xì)胞染色體上實(shí)施例1所克隆的基因關(guān)于破壞實(shí)驗(yàn)，通過PCR從pUC19msh2P(見實(shí)施例2)中刪除msh2CDS，引入NotI位點(diǎn)以代之。進(jìn)行該反應(yīng)的引物是137208(SEQ ID NO 24)5′P-CCGCGTCTCCAACAAGATGAATGG137207(SEQ ID NO 25)5′P-CCGCTTTCTCGGGGTCATAGC在與2.5mM MgSO4和50pg pUC19msh2P所進(jìn)行的基于Pwo聚合酶的PCR反應(yīng)(按照制造商建議的條件)中PCR循環(huán)為[96℃2min-(94℃30s；52℃30s；72℃3min)循環(huán)4次-(94℃30s；59℃30s；72℃3min)循環(huán)25次-72℃10min]。
分析所得約8.9Kb的PCR產(chǎn)物，將其連接至pUC19，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1。從所得轉(zhuǎn)化體分析pMsh2Δ，通過測(cè)序[引物138149(SEQ ID NO26)CCTTTCCACTTTAATCCTAAGC](X11/pMsh2ΔLac3073)驗(yàn)證新接合及其周圍點(diǎn)的正確性。
將米曲霉pyrG(WO96/29391)插入該構(gòu)建體的NotI位點(diǎn)。
通過利用這種構(gòu)建體，可按本領(lǐng)域已知的關(guān)于通過同源重組在染色體上使這類刪除基因交叉(crossing)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在米曲霉細(xì)胞中刪除所述染色體基因(Miller，B.L.等，1985《分子與細(xì)胞生物學(xué)》51714-1721)。
實(shí)施例4包含如SEQ ID NO 1所示錯(cuò)配修復(fù)基因、AMA1復(fù)制起始序列及AmdS選擇性標(biāo)記的質(zhì)粒的構(gòu)建
如下所述構(gòu)建的質(zhì)粒非常適合于制備所含錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)已暫時(shí)滅活的絲狀真菌細(xì)胞，其中當(dāng)錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)被激活時(shí)，可將這種質(zhì)粒插入到實(shí)施例3的已錯(cuò)配破壞的菌株中，當(dāng)錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)被滅活時(shí)，可將這種質(zhì)粒從菌株中刪除。
錯(cuò)配修復(fù)基因的破壞可以導(dǎo)致新染色體突變的蓄積，因此這樣的菌株可能是遺傳上不穩(wěn)定的。所以，決定在下述菌株中進(jìn)行染色體破壞，所述菌株中錯(cuò)配修復(fù)基因由染色體外元件表達(dá)，當(dāng)需要錯(cuò)配修復(fù)缺失型表型時(shí)該元件能很輕易地丟失。
這里，染色體外元件是包含AMA1作為復(fù)制起始序列和AmdS作為選擇性標(biāo)記的質(zhì)粒。
為此，將錯(cuò)配修復(fù)基因(SEQ ID NO 1)克隆到攜有一個(gè)AMA1重復(fù)序列的自我復(fù)制型構(gòu)建體中。
從pMT1505(見下實(shí)施例5關(guān)于pMT1505的說明)中分離下列片段，并將它們連接在一起5.16kb NotI-[Hind3]*＋3.515kb[Sal]*－BamH1＋757bp BamH1-NotI[]*表示該位點(diǎn)已用klenow-聚合酶和dNTP補(bǔ)平通過該連接反應(yīng)分析出pMT1505DHS(LaC 3212)，將錯(cuò)配修復(fù)表達(dá)盒作為BamH1-Mun1片段引入pMT1505DHS的相應(yīng)位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pAma-msh2(LaC3216)。
將米曲霉JaL250(見實(shí)施例5)用pAma-msh2轉(zhuǎn)化為AmdS+，檢查未被選擇的轉(zhuǎn)化體(轉(zhuǎn)化體的50％)丟失amdS性狀的能力，說明這種質(zhì)粒是作為染色體元件維持的。(LaC3244保持在乙酰胺＋尿苷上)。
實(shí)施例5實(shí)施例4所用質(zhì)粒pMT1505的構(gòu)建質(zhì)粒pMT1505如下實(shí)施例5所述構(gòu)建pHelpl含有米曲霉pyrG基因作為選擇性標(biāo)記，還含有能在構(gòu)巢曲霉中自我復(fù)制的AMA1序列，如Gems，D.等(1991.《基因》9861-67)所述pToC68如EP0 531 372(Novo Nordisk A/S)所述菌株JaL250米曲霉A1560的衍生物，其中pyrG基因已滅活，如WO98/01470所述DH5a大腸桿菌宿主細(xì)胞，購自GIBCO BRL(Life Technologies，Inc.，Rockville MD)pMT1466通過將來自pHelpl的SphI/NarI片段插入到pToC68中而構(gòu)建。pMT1489通過用SphI和StuI消化pMT1466，然后重新連接而構(gòu)建。pMT1500通過用AatII和NarI消化pMT1489，再連接一個(gè)接頭而構(gòu)建。pMT1504通過用NheI消化pMT1500，然后重新連接而構(gòu)建。
pMT1505通過將含有構(gòu)巢曲霉基因組DNA中amdS編碼基因的2.7kbXbaI片段(Corrick，C.M.等1987《基因》5363-71)插入已用NheI切割的pMT1504中而構(gòu)建。
實(shí)施例6染色體上一部分mshII基因的刪除將質(zhì)粒p418MsHII(來自lac3159)用SalI和XhoI切割，再用牛小腸磷酸酶處理。以這種方式剪出msHII基因的一部分。從1％瓊脂糖凝膠中分析含有載體和大部分msHII基因的大帶(6400bp)。
質(zhì)粒pJal554通過將pS02的SpeI/SspBI切割片段(5330bp)與pS02的Asp718/NheI切割片段(316bp)連接而構(gòu)建。將質(zhì)粒pJal554用SalI切割，在1％瓊脂糖凝膠上分析含有pyrG基因的2350bp帶。將含有pyrG的2350bp帶與切割的p418MsHII質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。通過限制性分析鑒定正確的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體，從該轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒制劑。
將所制備的質(zhì)粒用EcoRI切割，目的是使質(zhì)粒在轉(zhuǎn)化到例如米曲霉Jal250之前線性化。在基本平板上選擇轉(zhuǎn)化體。
發(fā)生雙遺傳交換的轉(zhuǎn)化體是這樣鑒定的，制備曲霉屬染色體DNA制劑，然后利用適當(dāng)引物對(duì)全長mshII基因進(jìn)行PCR篩選。利用被適當(dāng)?shù)拿鸽S機(jī)片段化的染色體DNA以及適當(dāng)?shù)尼槍?duì)被刪除之msHII片段(不復(fù)存在)的探針以及陽性對(duì)照探針進(jìn)行Southern印跡分析。
為了測(cè)定具有滅活的msHII基因的菌株中所增加的突變頻率，篩選niaD基因中的突變。這一點(diǎn)是通過在平板上培養(yǎng)母體菌株曲霉Jal250和msHII滅活型菌株來實(shí)現(xiàn)的。
制備孢子懸液，將孢子試樣接種在含有氯酸鹽的平板上，如Unkles等所述(S.E.Unkles，E.C.Campbell.Y.M.J.T.de Ruite Jacobs，M.Broekhuisen，J.A.Macro，D.Carrez，R.Contreras，C.A.M.J.J.van den Hondel J.R.Kinghorn.基于硝酸鹽同化途徑的米曲霉同源轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的開發(fā)用于絲狀真菌轉(zhuǎn)化的方便和通用的選擇系統(tǒng)，《分子與普通遺傳學(xué)》V218 p 99-104(1989))。
沒有MsHII蛋白表達(dá)的菌株將比對(duì)照菌株具有更高頻率的niaD突變(更多的氯酸鹽抗性克隆)。
實(shí)施例7使用TAKA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)反義mRNA的轉(zhuǎn)錄從而制備抑制msHII mRNA翻譯的體內(nèi)反義msHII RNA反義RNA表達(dá)是已知體內(nèi)下調(diào)任意基因表達(dá)的方式(反義RNA的設(shè)計(jì)，Georg Sczakiel，反義與核酸藥物開發(fā)V.7P.439-444(1997))。
使用下列oligo000120j2(SEQ ID NO 27)TCTGCGAATCGCTTGGATCCCGAACGCGACAACAC、000120j4(SEQ ID NO 28)GAGCTCAGATCTCTTAGGTTCTGGACGAGAAGA并以pUC19msh2P作為模板制備PCR片段。該P(yáng)CR片段含有msHII基因的5’末端，包括5’msHII mRNA的假定部分。使用下列oligo000120j3(SEQ ID NO 29)GTTGTCGCGTTCGGGATCCAAGCGATTCGCAGAAG、1298-TAKA(SEQ ID NO 30)GCAAGCGCGCGCAATACATGGTGTTTTGATCAT并以pENI1298作為模板(PCTDK99/00552)制備另一種PCR片段。兩次PCR反應(yīng)都是按照制造商手冊(cè)(Boehringer-Mannheim)并使用PWO聚合酶進(jìn)行的。
PCR片段用Qiagen PCR純化試劑盒(Qiagen)加以純化。將兩種PCR片段混合，利用引物1298-TAKA和000120j4進(jìn)行第三次PCR反應(yīng)。以這種方式裝配所述兩種PCR片段。
裝配后的PCR片段用BssHII和BglII切割，從1.5％瓊脂糖凝膠上純化，再與pENI1298連接，后者已用BssHII和BglII切割(從1％瓊脂糖凝膠上純化)。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。制備所得每種大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的DNA制劑。對(duì)裝配后的PCR片段進(jìn)行測(cè)序，以確認(rèn)在操作期間沒有引入所不需要的突變。正確的構(gòu)建體含有TAKA啟動(dòng)子，它驅(qū)動(dòng)msHII反義mRNA的轉(zhuǎn)錄。
以pENI1298作為對(duì)照，將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到例如米曲霉Jal250，在基本平板上選擇轉(zhuǎn)化體。在基本平板上分析所得轉(zhuǎn)化體，在37℃下培養(yǎng)，直到它們形成孢子。
為了測(cè)定菌株(其中msHII mRNA的翻譯因msHII反義RNA的表達(dá)而受到阻抗)中所增加的突變頻率，進(jìn)行niaD基因中突變的篩選。制備對(duì)照轉(zhuǎn)化體(pENil298)和msHII反義RNA轉(zhuǎn)化體的孢子懸浮液，將等量孢子接種在含有氯酸鹽的平板上，如Unkles等所述(S.E.Unkles，E.C.Campbell.Y.M.J.T.de Ruite Jacobs，M.Broekhuisen，J.A.Macro，D.Carrez，R.Contreras，C.A.M.J.J.van den Hondel J.R.Kinghorn.基于硝酸鹽同化途徑的米曲霉同源轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的開發(fā)用于絲狀真菌轉(zhuǎn)化的方便和通用的選擇系統(tǒng)，《分子與普通遺傳學(xué)》V218 p 99-104(1989))。
無或低MsHII蛋白表達(dá)的菌株將比對(duì)照菌株具有更高頻率的niaD突變(更多的氯酸鹽抗性克隆)。
權(quán)利要求
1.絲狀真菌細(xì)胞，其中參與錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的基因已經(jīng)被滅活，該參與錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的基因包含(a)編碼SEQ ID NO 2之683-758位所示多肽序列的DNA序列；或(b)編碼至少70％等同于SEQ ID NO 2之683-758位的多肽序列的DNA序列。
2.絲狀真菌細(xì)胞，其中參與錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的基因已經(jīng)被滅活，該參與錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的基因包含(a)編碼SEQ ID NO 2之1-940位所示多肽序列的DNA序列；或(b)編碼至少70％等同于SEQ ID NO 2之1-940位的多肽序列的DNA序列。
3.權(quán)利要求1或2的絲狀真菌細(xì)胞，其中該參與錯(cuò)配修復(fù)的基因是有缺陷的。
4.權(quán)利要求1或2的絲狀真菌細(xì)胞，其中該參與錯(cuò)配修復(fù)的基因已經(jīng)被暫時(shí)滅活。
5.在先權(quán)利要求中任一項(xiàng)的絲狀真菌細(xì)胞，其中該絲狀真菌細(xì)胞是鐮孢屬菌株，或者更優(yōu)選為曲霉屬菌株。
6.制備絲狀真菌細(xì)胞群體的方法，其中群體中的個(gè)體細(xì)胞分別包含代表目的DNA文庫的不同目的DNA序列，該方法包括下列步驟(a)分別將不同的目的DNA序列放置在包含權(quán)利要求1或2的絲狀真菌細(xì)胞的絲狀真菌細(xì)胞群體中；(b)將(a)群體生長一段時(shí)間，使群體中單個(gè)目的DNA序列在 1或2的錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)基因已被滅活的條件下復(fù)制至少一次。
7.權(quán)利要求6的方法，其中步驟(b)下的該錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)是有缺陷的。
8.權(quán)利要求6的方法，其中步驟(b)下的該錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)已經(jīng)被暫時(shí)滅活。
9.權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)的方法，其中該絲狀真菌細(xì)胞是鐮孢屬菌株，或者更優(yōu)選為曲霉屬菌株。
10.權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)的方法，其中在權(quán)利要求6的步驟(b)下，存在部分同源的目的DNA序列的體內(nèi)基因間重組。
11.生產(chǎn)目的多肽的方法，其包括權(quán)利要求6的步驟，且其中所述目的DNA序列編碼目的多肽，該方法進(jìn)一步包括下列步驟(c)從權(quán)利要求6步驟(b)所得絲狀真菌細(xì)胞群體中選擇所需的目的多肽。
12.權(quán)利要求11的方法，其進(jìn)一步包括下列步驟(d)可選的步驟，包括根據(jù)進(jìn)一步的特定需要修飾所需的所選擇的目的多肽的氨基酸序列；(e)將編碼權(quán)利要求11步驟(c)的目的多肽或步驟(d)的修飾型目的多肽的DNA序列放置到適合于大規(guī)模制備目的多肽的絲狀真菌細(xì)胞中；(f)在允許目的多肽表達(dá)的條件下，在至少10000m3的發(fā)酵罐中培養(yǎng)步驟(e)的絲狀真菌細(xì)胞；(g)分離目的多肽。
13.權(quán)利要求12的方法，其中適合于大規(guī)模制備權(quán)利要求12步驟(e)的目的多肽的絲狀真菌細(xì)胞是不同于權(quán)利要求6步驟(a)的絲狀真菌細(xì)胞的另一種絲狀真菌細(xì)胞。
14.權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)的方法，其中所述目的多肽是從絲狀真菌細(xì)胞衍生的多肽。
15.權(quán)利要求11-14中任一項(xiàng)的方法，其中所述目的多肽是一種酶，例如淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶、木聚糖酶、磷脂酶。
全文摘要
使用參與絲狀真菌細(xì)胞錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的新穎的克隆基因制備絲狀真菌細(xì)胞DNA文庫的方法。
文檔編號(hào)C12N15/80GK1341146SQ00804283
公開日2002年3月20日 申請(qǐng)日期2000年2月17日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月24日
發(fā)明者托本·V·博徹特, 拉斯·克里斯琴森 申請(qǐng)人:諾維信公司