一種免疫復(fù)合物吸附細(xì)胞的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種免疫復(fù)合物吸附細(xì)胞的制作方法，步驟包括載體構(gòu)建、病毒包裝制作、永生化B淋巴細(xì)胞制作和基因轉(zhuǎn)染，本發(fā)明制作出了一套分別攜帶有特定基因的永生化的細(xì)胞，具有永生化(無(wú)限增殖分裂能力)和表達(dá)某一種免疫復(fù)合物受體于細(xì)胞表面的能力，通過(guò)擴(kuò)增培養(yǎng)的細(xì)胞，建立免疫復(fù)合物分析組合，一次可以對(duì)血液或者身體組織的各種免疫復(fù)合物進(jìn)行識(shí)別、分類(lèi)、定量。還具有低成本無(wú)限增殖、檢測(cè)速度快，操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。本發(fā)明的目的是為了得到永生化的B淋巴細(xì)胞，該B淋巴細(xì)胞是能穩(wěn)定表達(dá)一種免疫復(fù)合物受體基因，并且該受體能在細(xì)胞膜上存在，并能結(jié)合細(xì)胞外的對(duì)應(yīng)的一種免疫復(fù)合物，并不局限于永生化B細(xì)胞。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種免疫復(fù)合物吸附細(xì)胞的制作方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種細(xì)胞制作的方法，具體是一種免疫復(fù)合物吸附細(xì)胞的制作方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 免疫復(fù)合物：抗體與抗原結(jié)合所得到的一種復(fù)合物稱(chēng)為免疫復(fù)合物，是由各種免 疫細(xì)胞吞噬細(xì)菌，病毒，致敏物質(zhì)共同死亡后結(jié)合而形成的，所以又稱(chēng)抗原一抗體復(fù)合物。 它在正常情況下，小分子可溶性免疫復(fù)合物被腎小球?yàn)V過(guò)排出，大分子不溶免疫復(fù)合物被 巨噬細(xì)胞吞噬消滅，這是機(jī)體防御機(jī)制的一部分。但在某些情況下，抗原與抗體在體內(nèi)形成 的免疫復(fù)合物，沉積于血管壁基底部，從而激活補(bǔ)體，被激活的補(bǔ)體，發(fā)揮溶解細(xì)菌、病毒、 腫瘤細(xì)胞等作用。
[0003] 永生化細(xì)胞：一種細(xì)胞生物學(xué)術(shù)語(yǔ)。指動(dòng)物細(xì)胞脫分化失敗，受到病毒感染，外源 惡意代碼轉(zhuǎn)染，輻射或藥劑作用后，細(xì)胞分裂次數(shù)限制機(jī)制和DNA檢查-自毀機(jī)制失靈，導(dǎo) 致具有無(wú)限分裂生長(zhǎng)的能力的過(guò)程。細(xì)胞永生化是癌變的必經(jīng)途徑。
[0004] 抗原和相應(yīng)抗體結(jié)合形成的物質(zhì)稱(chēng)為免疫復(fù)合物。由于免疫復(fù)合物能在循環(huán)血液 中檢測(cè)到，故亦稱(chēng)之為循環(huán)免疫復(fù)合物。它和補(bǔ)體、其他免疫活性物質(zhì)結(jié)合，沉積在血管壁， 可導(dǎo)致組織損傷及血管炎，引起一系列的疾病，如紅斑狼瘡。免疫復(fù)合物在體內(nèi)存在有兩種 方式，一是存在于血液中的循環(huán)免疫復(fù)合物（CIC)，一是組織中固定的免疫復(fù)合物。免疫復(fù) 合物的檢測(cè)技術(shù)可分為抗原特異性方法和非抗原特異性方法。在大多數(shù)情況下，免疫復(fù)合 物中的抗原性質(zhì)不太清楚或非常復(fù)雜，所以抗原特異性方法并不常用。
[0005] 根據(jù)形成免疫復(fù)合物的抗原-抗體的已知或未知的將CIC分為兩大類(lèi)，前者為特 異性免疫復(fù)合物（如乙型肝炎的HBsAg-抗-HBs，甲狀腺蛋白抗原-甲狀腺球蛋白抗體形成 的免疫復(fù)合物）；后者為非特異性免疫復(fù)合物（如腎小球腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等）。
[0006] 抗原與抗體在體內(nèi)形成的免疫復(fù)合物，沉積于血管壁基底部，從而激活補(bǔ)體，被激 活的補(bǔ)體，發(fā)揮溶解細(xì)菌、病毒、腫瘤細(xì)胞等作用。
[0007] 免疫復(fù)合物的疾病有：
[0008] 1)血清?。菏怯纱笮∶庖邚?fù)合物沉積在毛細(xì)血管壁，補(bǔ)體、吞噬細(xì)胞參與反應(yīng)所 致。
[0009] 2)免疫復(fù)合物型腎小球炎：是由鏈球菌可溶性抗原與抗體結(jié)合，沉積于腎小球基 底膜，激活補(bǔ)體，吸引中性粒細(xì)胞，釋放各種酶類(lèi)損傷腎小球所致。
[0010] 3)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎：是由類(lèi)風(fēng)濕因子與免疫球蛋白IgG結(jié)合形成的免疫復(fù)合物， 沉積于關(guān)節(jié)骨膜、皮下組織等處引起類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等。
[0011] 4)系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE):是自身免疫疾病的一種，其病理機(jī)制還未明確，但 患者血清中常含有多種自身抗體和大量致病性循環(huán)免疫復(fù)合物（circ μ Lating immune complexes，CIC)，CIC的出現(xiàn)會(huì)激活補(bǔ)體，并沉積于毛細(xì)血管壁、腎小球基底膜以及其他血 管外組織中，造成炎癥反應(yīng)和免疫病理?yè)p傷。
[0012] 免疫復(fù)合物的檢測(cè)技術(shù)可分為抗原特異性方法和非抗原特異性方法。在大多數(shù)情 況下，免疫復(fù)合物中的抗原性質(zhì)不太清楚或非常復(fù)雜，所以抗原特異性方法并不常用。根據(jù) 免疫復(fù)合物的物理學(xué)、免疫學(xué)和生物學(xué)特性，已經(jīng)設(shè)計(jì)出很多檢測(cè)CIC的方法。
[0013] (一）物理測(cè)定法
[0014] L聚乙二醇法
[0015] 聚乙二醇（PEG)是乙二醇聚合而成的無(wú)電荷形多糖分子，分子量變化范圍較大， 常用的分子量是6000。用3%?4%濃度的PEG可以選擇性地將大分子免疫復(fù)合物沉淀下 來(lái)，其作用機(jī)制尚不甚清楚。將PEG溶液與待檢血清混合，置4°C冰箱過(guò)夜后離心，將沉淀物 用PEG溶液充分洗滌，重新溶解于0. Olmol/L的NaOH中，在波長(zhǎng)280nm下測(cè)量溶液的吸光 度；也可利用散射比濁法直接測(cè)定PEG沉淀的免疫復(fù)合物；以不同濃度的熱聚合IgG作為 參考標(biāo)準(zhǔn)來(lái)計(jì)算CIC的含量。
[0016] 聚乙二醇法簡(jiǎn)單易行，可在臨床工作中推廣。但此法易受多種大分子蛋白和溫度 的干擾，特異性稍差。PEG法還特別適用于沉淀獲得CIC，再進(jìn)行解離分析其中的抗原與抗 體。
[0017] 2.冷球蛋白測(cè)定在某些病理情況下，血清中的免疫復(fù)合物具有可逆性冷沉淀的特 性，于4°C冰箱中放置1?3天可自發(fā)地沉淀下來(lái)（參見(jiàn)第二十六章）；此種情況多見(jiàn)于冷 球蛋白血癥，所涉及的抗原包括自身的IgG、IgM、核苷酸、腫瘤相關(guān)抗原、腎小管上皮、甲狀 腺球蛋白、紅細(xì)胞基質(zhì)等，還有外源性抗原如乙肝病毒、EB病毒、巨細(xì)胞病毒、牛白蛋白和馬 蛋白等。
[0018] (二）補(bǔ)體相關(guān)測(cè)定法
[0019] IgG和IgM類(lèi)抗體與抗原結(jié)合后，重鏈CH2區(qū)的補(bǔ)體結(jié)合點(diǎn)暴露，可以固定Clq并 激活補(bǔ)體的系列反應(yīng)，這是利用補(bǔ)體有關(guān)技術(shù)檢測(cè)免疫復(fù)合物的基礎(chǔ)。
[0020] I. Clq結(jié)合試驗(yàn)將待檢血清先行加熱56°C 30min，以滅活其中的補(bǔ)體和破壞已與 CIC結(jié)合的Clq，空出補(bǔ)體結(jié)合點(diǎn)。CIC與Clq的結(jié)合可用多種方法進(jìn)行檢測(cè)，常用的有以下 3種。
[0021] (1)液相法：先將同位素標(biāo)記的Clq與滅活過(guò)的血清標(biāo)本混合作用，再加入0. 5% (終濃度）的PEG將結(jié)合了 Clq的CIC沉淀下來(lái)，通過(guò)檢測(cè)沉淀物中的放射活性來(lái)計(jì)算CIC 的含量。
[0022] (2)固相法：先將Clq吸附于固相載體表面，加入待檢血清使CIC與Clq結(jié)合，再 加入同位標(biāo)記的或酶標(biāo)記的抗人IgG或SPA，最后檢測(cè)其放射活性或酶活性。
[0023] (3) Clq偏離試驗(yàn)：先將同位素標(biāo)記的Clq與滅活的血清標(biāo)本混合，再加抗體致敏 的綿羊紅細(xì)胞，溫育后離心，檢測(cè)紅細(xì)胞上的放射活性。紅細(xì)胞的放射活性與免疫復(fù)合物的 量呈負(fù)相關(guān)。
[0024] 2.補(bǔ)體試驗(yàn)本法的原理類(lèi)似補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)。將一定量的補(bǔ)體（多為混合豚鼠血 清）與滅活的待檢血清混合溫育，反應(yīng)后加入致敏綿羊紅細(xì)胞。如出現(xiàn)溶血表示血清中沒(méi) 有CIC存在；不溶血說(shuō)明標(biāo)本中有CIC存在。將血清標(biāo)本做不同稀釋?zhuān)⑴c已知的熱聚合 IgG作對(duì)照，可以計(jì)算出CIC的含量。本方法的靈敏度較高，且易于在一般實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展，不足 之處是特異性較差。
[0025] 3.膠固素結(jié)合試驗(yàn)?zāi)z固素（conglutinin)是牛血清中的一種正常蛋白，能與C3d 特異性結(jié)合；體內(nèi)與補(bǔ)體結(jié)合的CIC都帶有C3d，因此膠固素可與CIC結(jié)合。用一定量的膠 固素包被塑料管，往管中加入稀釋的血清標(biāo)本，溫育后再加入同位素標(biāo)記或酶標(biāo)記的抗人 IgG抗體，最后檢測(cè)各管的放射活性或酶活性，計(jì)算CIC的含量。
[0026] 膠固素性質(zhì)穩(wěn)定、容易保存、來(lái)源方便、價(jià)格便宜，檢測(cè)方法也不復(fù)雜，便于推廣。 本法的不足是只能檢出已結(jié)合補(bǔ)體的CIC，但不論何種激活途徑都一樣檢出，并可用作CIC 分離。
[0027](三）抗球蛋白測(cè)定法
[0028] 類(lèi)風(fēng)濕因子（RF)為抗IgG的自身抗體，與變性IgG、熱聚合IgG和IC都有較強(qiáng)的 親和力。單克隆RF(mRF)可從待發(fā)性冷球蛋白血癥的血清中提取，多克隆RF(pRF)可從類(lèi) 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的血清中提取。用mRF比pRF的敏感性更高一些。
[0029] I. mRF固相抑制試驗(yàn)將mRF吸附于固相載體上，隨后加入血清標(biāo)本，再加入同位素 標(biāo)記的可溶性熱聚合IgG。如果標(biāo)本中含有1C，固相mRF已與IC結(jié)合，熱聚合IgG與mRF 的結(jié)合使被抑制，所以固相中的放射活性與CIC的含量呈負(fù)相關(guān)。
[0030] 也可用同位素標(biāo)記的mRF先與血清標(biāo)本反應(yīng)，再加入熱聚合IgG附著的瓊脂糖珠， 溫育并離心洗滌后測(cè)量沉淀物的放射強(qiáng)度，測(cè)定值與CIC的含量呈負(fù)相關(guān)。此法的敏感性 比前法更高一些。
[0031] 2. pRF膠乳凝集抑制試驗(yàn)將pRF與血清標(biāo)本混合，再加入IgG致敏的膠乳懸液。如 果標(biāo)本中有CIC存在，則pRF先與之結(jié)合，凝集反應(yīng)呈陰性。
[0032] 3.抗抗體法抗抗體可存在于極個(gè)別的健康人血清中，是一種抗IgGF(ab'）2的IgM 類(lèi)抗體，能與已結(jié)合抗原的IgG反應(yīng)，但不與游離的IgG或熱聚合IgG反應(yīng)，因而特異性較 高。先將抗抗體與待檢血清混合，再加入IgG致敏的人0型Rh+紅細(xì)胞；如標(biāo)本中有CIC存 在，抗抗體被中和，致敏紅細(xì)胞不出現(xiàn)凝集。
[0033] 以上各種抗球蛋白試驗(yàn)以mRF法敏感性最高，但是mRF較難尋找。這類(lèi)方法易受 內(nèi)源性RF的干擾，最好先行檢查并除去標(biāo)本中的內(nèi)源性RF后再行試驗(yàn)。若遇標(biāo)本中有聚 合Ig，RF法也易出現(xiàn)假陰性；改用抗抗體法可避免這種現(xiàn)象，但是抗抗體的來(lái)源困難。 [0034](四）細(xì)胞技術(shù)測(cè)定
[0035] 有些細(xì)胞表面具有Fc受體和（或）補(bǔ)體受體，可與免疫復(fù)合物相應(yīng)成分特異性結(jié) 合，因而可用來(lái)對(duì)免疫復(fù)合物進(jìn)行檢測(cè)。
[0036] I. Raji細(xì)胞試驗(yàn)
[0037] Raji細(xì)胞是從Burkin淋巴瘤患者分離的一種B細(xì)胞株，表面有大量Clq、C3b和 C3d受體，但無(wú)表面免疫球蛋白；因此Raji細(xì)胞能與帶有補(bǔ)體的免疫復(fù)合物結(jié)合。先在塑 料管中加處一定量的Raji，再加入待檢血清，充分作用后離心洗滌；最后加入熒光素標(biāo)記 的抗人IgG，洗滌后細(xì)胞表面顯現(xiàn)熒光為試驗(yàn)陽(yáng)性；但熒光法只能做定性檢測(cè)?；蚣尤胪?素標(biāo)記的抗人IgG，離心洗滌后檢測(cè)沉淀細(xì)胞的放射活性；以熱聚合IgG作參考標(biāo)準(zhǔn)，可繪 制出CIC含量與放射活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而求得待測(cè)標(biāo)本中CIC的含量。
[0038] Raji細(xì)胞法敏感性高、特異性強(qiáng)、方法簡(jiǎn)單、不受DNA與內(nèi)毒素的影響；但Raji細(xì) 胞表面還有Fc受體，因此被檢血清中的游離IgG通過(guò)Fc段與Raji細(xì)胞結(jié)合，造成假陽(yáng)性。 在待檢標(biāo)本中有抗淋巴細(xì)胞抗體時(shí)也可導(dǎo)致假陽(yáng)性。再則，維持Raji細(xì)胞的培養(yǎng)較困難， 培養(yǎng)條件的變化可改變Raji細(xì)胞表面受體的數(shù)目及親和性，影響檢測(cè)敏感性。
[0039] 2.人紅細(xì)胞法人紅細(xì)胞表面具有C3b受體，可與帶有補(bǔ)體成分的CIC相結(jié)合。將 待檢血清與4%的人O型紅細(xì)胞懸液等量混合，37°C溫育后離心洗滌；加入同位素標(biāo)記的抗 人IgG抗體，再溫育洗滌后測(cè)定紅細(xì)胞的放射活性；以熱聚合IgG作參考標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算出標(biāo)本中 CIC含量。但該法只能檢測(cè)已結(jié)合補(bǔ)體的CIC。
[0040] 其他細(xì)胞法如血小板凝集試驗(yàn)、玫瑰花環(huán)形成抑制試驗(yàn)、ADCC抑制試驗(yàn)、巨噬細(xì) 胞吞噬抑制試驗(yàn)和中性粒細(xì)胞游走抑制試驗(yàn)等，也都可用來(lái)檢測(cè)CIC，方法的敏感性也都很 高，但這些方法的影響因素多，可重復(fù)性差，所以實(shí)際中工作并不多用。
[0041] (五）免疫復(fù)合物的成分檢測(cè)
[0042] 免疫復(fù)合物中抗原和抗體的性質(zhì)及各類(lèi)的檢測(cè)對(duì)臨床診治疾病及深入研究疾病 的免疫病理機(jī)制有一定價(jià)值。但是由于所涉及的抗原種類(lèi)很多，例如病原微生物、自身物 質(zhì)、各類(lèi)同種抗原等，檢測(cè)方法可分別參見(jiàn)各種抗原的檢測(cè)技術(shù)。免疫復(fù)合物中的抗體主要 涉及IgG及其亞類(lèi)、IgM和IgA ;方法是將血清中免疫復(fù)合物分離出來(lái)，再用雙抗體ELISA夾 心法等方法分析抗體的類(lèi)別。
[0043] 循環(huán)免疫復(fù)合物的理想檢測(cè)方法應(yīng)具備以下特點(diǎn)：①敏感性高，②特異性強(qiáng)，可重 復(fù)性好，④操作簡(jiǎn)便，⑤適用面廣。目前檢測(cè)免疫復(fù)合物的方法雖發(fā)展到幾十種，但還沒(méi)有 一種方法具備上述所有的特點(diǎn)，綜合相比之下，Clq結(jié)合試驗(yàn)、膠固素結(jié)合試驗(yàn)、Raji細(xì)胞 試驗(yàn)和RF抑制試驗(yàn)等方法比較好些。如果方法得當(dāng)、試劑合格、標(biāo)本新鮮、操作小心、分析 謹(jǐn)慎、CIC測(cè)定就會(huì)有較大的參考價(jià)值。
[0044] 二、組織固定免疫復(fù)合物的檢測(cè)
[0045] 確定免疫復(fù)合物病的直接證據(jù)不是檢出CIC，而是在病變部位查到固定的IC沉 積。在一些自身免疫病和免疫復(fù)合物病，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、部分腎小球腎炎、類(lèi)風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎和尋常型天皰瘡等，組織沉積免疫復(fù)合物的檢出對(duì)疾病的診斷和 發(fā)病機(jī)制的研究都比CIC的檢出更有意義。
[0046] 檢測(cè)組織沉淀免疫復(fù)合物常用免疫組織化學(xué)技術(shù)，首先從適當(dāng)?shù)牟±聿课徊扇〗M 織標(biāo)本做冰凍切片，用熒光標(biāo)記物的抗人IgG或抗人C3染色，在熒光顯微鏡下見(jiàn)到相應(yīng)部 位顯示熒光為陽(yáng)性反應(yīng)；也可用酶標(biāo)抗人IgG或抗人C3與標(biāo)本切片反應(yīng)，再用酶的底物溶 液顯色，用普通生物顯微鏡即可觀察到相應(yīng)部位被染色。
[0047] 三、免疫復(fù)合物檢測(cè)的意義及應(yīng)用
[0048] 判定免疫復(fù)合物為發(fā)病機(jī)制的證據(jù)有三：①病變局部有IC沉積；②CIC水平顯著 升高；③明確IC中的抗原性質(zhì)。第三條證據(jù)有時(shí)很難查到，但至少要具備前兩條，單獨(dú)CIC 的測(cè)定不足為憑。人體在健康狀態(tài)下也存在少量的CIC (大約10?20 μ g/mL)，其生理與病 理的界限不易區(qū)分。另外，CIC檢測(cè)的方法太多，其原理各不相同，用一種方法測(cè)定為陽(yáng)性， 另一種方法檢測(cè)可能為陰性；但與免疫組化法一起檢測(cè)，其意義就大得多。
[0049]目前已經(jīng)明確系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、部分腎小球腎炎和血管炎等疾 病為免疫復(fù)合物病，CIC檢測(cè)對(duì)這些疾病仍是一種輔助診斷指標(biāo)，對(duì)判斷疾病活動(dòng)和治療效 果也有一定意義。在發(fā)現(xiàn)紫癜、關(guān)節(jié)痛、蛋白尿、血管炎和漿膜炎等情況時(shí)，可考慮免疫復(fù)合 物病的可能性，進(jìn)行CIC和組織沉積IC的檢測(cè)。另外，患有惡性腫瘤時(shí)CIC檢出率也增高， 但不出現(xiàn)III型變態(tài)反應(yīng)的損傷癥狀，稱(chēng)之為臨床隱匿的IC病，然而這種狀態(tài)常與腫瘤的 病情和預(yù)后相關(guān)。
[0050] 現(xiàn)有的多種技術(shù)存在各種不足，無(wú)法快速有效的對(duì)各種不同的免疫復(fù)合物進(jìn)行分 離，現(xiàn)有的細(xì)胞吸附分離技術(shù)主要使用的是已有的攜帶多種或者單一補(bǔ)體或免疫球蛋白受 體的細(xì)胞，這些擴(kuò)展功能有限，能結(jié)合的類(lèi)型有限。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0051] 本發(fā)明的目的在于提供一種免疫復(fù)合物吸附細(xì)胞的制作方法，本發(fā)明使用B細(xì)胞 株構(gòu)建技術(shù)，構(gòu)建出永生化的B細(xì)胞，再分別使用質(zhì)粒轉(zhuǎn)入不同補(bǔ)體和球蛋白受體基因，攜 帶有不同受體的B細(xì)胞，可以分別用來(lái)篩選各種免疫復(fù)合物；并達(dá)到分離、篩選、定量不同 免疫復(fù)合物的目的。
[0052] 免疫復(fù)合物是現(xiàn)有的多種自身免疫疾?。ㄈ缛硇约t斑狼瘡、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎等）的致病關(guān)鍵物，對(duì)其檢測(cè)分析的關(guān)鍵是從血液中快速分離、區(qū)分不同 類(lèi)型并對(duì)個(gè)不同類(lèi)型的免疫復(fù)合物進(jìn)行定量分析，現(xiàn)有的基礎(chǔ)都存在這缺陷，無(wú)法有效解 決以上問(wèn)題，本發(fā)明利用攜帶有不同免疫復(fù)合物受體基因的永生化B細(xì)胞作為吸附細(xì)胞， 分別使用細(xì)胞吸附不同的免疫復(fù)合物，并進(jìn)行流式分析，從而快速解決以上3個(gè)問(wèn)題，同 時(shí)，隨著對(duì)個(gè)免疫復(fù)合物受體的研究，可以往永生化B淋巴細(xì)胞基因中插入不同的受體基 因，制造出吸附不同免疫受體的永生化B淋巴細(xì)胞，具有很強(qiáng)的功能擴(kuò)增能力。
[0053] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0054] -種免疫復(fù)合物吸附細(xì)胞的制作方法，步驟包括載體構(gòu)建、病毒包裝制作、永生化 B淋巴細(xì)胞制作和基因轉(zhuǎn)染，
[0055] 所述載體構(gòu)建的步驟為：
[0056] (I. 1)設(shè)計(jì)三個(gè)基因，分別是CRl、CR2和⑶93 ;這三個(gè)基因是補(bǔ)體系統(tǒng)的膜上信號(hào) 蛋白受體，且分別結(jié)合血液中的C3b、C3d和Clq補(bǔ)體蛋白，起到捕獲作用；
[0057] 設(shè)計(jì)引物為：
[0058] CRl 上游引物序列：5' -CTCGAGCGGAGCACAATGATTGGTCA-3'
[0059] CRl 下游引物序列：5' -CCTAGG TGGCTCCTTTCCCACCAAAA-3'
[0060] CR2 上游引物序列：5' -CTCGAGGGGTCTCGGAACGCATCC-3'
[0061] CR2 下游引物序列：5' -CCTAGGTCCAAGCAATGAGGCACACA-3'
[0062] CD93 上游引物序列：5' -CTCGAGGCCACACAGAGACCGGG-3'
[0063] CD93 下游引物序列：5' -CCTAGGTGTCTCTAGGGCCACCTCAC-3'。
[0064] (1.2) DNA 提取
[0065] 為了克隆出全長(zhǎng)的CRl、CR2和⑶93序列，使用DNA抽屜試劑盒從海拉細(xì)胞中抽提 出DNA，再以上述引物為模板，通過(guò)PCR反應(yīng)分別克隆出三個(gè)基因的基因片段；
[0066] (1.3)質(zhì)粒構(gòu)建和擴(kuò)增、獲取
[0067] 根據(jù)現(xiàn)代生物分子技術(shù)，通過(guò)酶切酶連技術(shù)，將pLVX-IRES-Neo從XhoI和 BamHI酶切位點(diǎn)切開(kāi)，再使用連接酶將之前獲得的基因片段連接到pLVX-IRES-Neo中；將 pLVX-IRES-Neo轉(zhuǎn)入感受態(tài)菌株中，擴(kuò)增培養(yǎng)，最后抽提感受態(tài)菌株的質(zhì)粒；所述XhoI酶切 位點(diǎn)序列為：CTCGAG ;BamHI酶切位點(diǎn)序列為：GGATCC。
[0068] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：步驟（1. 2)中所述的PCR反應(yīng)的體系為：2 μ I PCR緩 沖液，2μ IlOmM dNTP 和 0.25U exTaq 聚合酶；PCR 擴(kuò)增程序：先 94°C、30s，58°C、30s，74°C、 50s，35 個(gè)循環(huán)；然后 72°C，lOmin。
[0069] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述Clq、C3b和C3d受體基因，分別在基因上游引物序 列的5'端加入了 XhoI酶切位點(diǎn)，在下游引物序列5'端加入了 BamHI酶切位點(diǎn)。
[0070] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述XhoI酶切位點(diǎn)和BamHI酶切位點(diǎn)分別對(duì)應(yīng)載體 pLVX-IRES-Neo的兩個(gè)相同的酶切位點(diǎn)。
[0071] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述病毒包裝制作的步驟為：
[0072] (2. I) 293FT 細(xì)胞培養(yǎng)
[0073] 293FT細(xì)胞用含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37°C飽和濕度、含5% CO2的 孵箱中培養(yǎng)；
[0074] 用0. 25%胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293FT細(xì)胞，以含10%血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì) 胞密度為I. O7個(gè)細(xì)胞，重新接種于IOcm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞 匯合度達(dá)90%時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染；
[0075] (2· 2)轉(zhuǎn)染 293FT 細(xì)胞
[0076] (2. 2. 1)轉(zhuǎn)染前2小時(shí)，更換新鮮不含雙抗的含10% FBS的完全培養(yǎng)基；
[0077] (2.2.2)向一滅菌離心管中加入所制備的三種DNA溶液，按照10yg，6.5yg， 3. 5 μ g，2. 5 μ g 的分別把 pLVX-IRES-Neo 加入到 1500 μ L OPTI-MEM 內(nèi)混勻；
[0078] (2.2.3)將1^口〇2000試劑輕輕搖勻，取35以1^1^口〇2000加入到150(^1^0?1'1-]\^]\1 內(nèi)混勻，兩者迅速混合；
[0079] (2. 2. 4)混合后，室溫靜止15分鐘，以便形成以DNA與Lip〇2000稀釋液的轉(zhuǎn)染復(fù) 合物；
[0080] (2. 2. 5)將DNA與Lipo2000稀釋液的轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到培養(yǎng)皿內(nèi)，在37°C飽 和濕度、含5% CO2的孵箱中培養(yǎng)；
[0081] (2. 2. 6)培養(yǎng)12小時(shí)后更換不含雙抗的含2% FBS的病毒收獲培養(yǎng)基，繼續(xù)37°C 飽和濕度、含5% CO2的孵箱中培養(yǎng)48小時(shí)；
[0082] (2. 3)病毒的收集及濃縮
[0083] (2. 3. 1)收集轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的293FT細(xì)胞上清液，冰上預(yù)冷；1500g，4攝氏度，離 心30分鐘；
[0084] (2. 3. 2)用0· 45 μ m濾器過(guò)濾病毒上清液；
[0085] (2. 3. 3)過(guò)濾后，按照優(yōu)化條件加入病毒濃縮液；4攝氏度靜置過(guò)夜；
[0086] (2.3.4)過(guò)夜后，1500g，4攝氏度，離心45分鐘；去上清，加入一毫升無(wú)血清培養(yǎng)基 重懸病毒聚集團(tuán)塊。
[0087] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述永生化B淋巴細(xì)胞制作的步驟為：
[0088] (3. 1)試劑
[0089] (3. I. 1)淋巴細(xì)胞分離液：避光4°C保存，用前在37°C水浴中加溫；整個(gè)分離過(guò)程 中，溫度應(yīng)控制在8-28°C，溫度過(guò)高或過(guò)低均影響分離質(zhì)量；
[0090] (3. 1.2)全培養(yǎng)基：RPM1640培養(yǎng)基，內(nèi)含20 %胎牛血清，56 °C滅活30分鐘， 1. 6-1. 8% IM的HEPES，I. 2%、0. 2mol/L谷氨酰胺，1%青霉素和鏈霉素；
[0091] (3. 1. 3)環(huán)胞酶素 A :250mg/瓶的5mL，用1640培養(yǎng)基稀釋成0. 2mg/mL，使用時(shí)終 濃度為2 μ g/mL
[0092] (3. I. 4) EBV液：購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院遺傳所，儲(chǔ)存于零下80°C ;使用時(shí)從冰箱中取出， 37°C迅速融化，用0. 22 μ m的濾膜過(guò)濾，不要超過(guò)0. 5-1小時(shí)；
[0093] (3. 2)建株方法
[0094] (3. 2. 1)取外周血3-4mL，肝素抗凝，應(yīng)用液濃度5 μ g/mL，加入5-10mL外周血；
[0095] (3. 2. 2)將血液與等量1640培養(yǎng)液混勻后，沿管壁漸漸加入到含有4mL淋巴細(xì)胞 分離液的離心管中，混合血：淋巴細(xì)胞分離液=6 : 4, 3000轉(zhuǎn)離心10分鐘；
[0096] (3. 2. 3)吸取白細(xì)胞層，移入另一支離心管中，加入不含血清的1640培養(yǎng)液6mL， 輕輕混勻，進(jìn)行第一次洗滌；1500轉(zhuǎn)離心15分鐘；
[0097] (3. 2. 4)棄上清液，再加 6mL1640全培養(yǎng)液進(jìn)行第二次洗滌，離心1500轉(zhuǎn)15分鐘；
[0098] (3. 2. 5)棄上清液，加入2mL1640全培養(yǎng)基，全培養(yǎng)基加入前，置37°C水浴10分 鐘，然后加入環(huán)胞霉素 A和I. 2mL EBV液/份，充分混勻后移入到25平方厘米的培養(yǎng)瓶，置 37°C，CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中；
[0099] (3. 2. 6)每2-3天加入3mL新鮮配制的培養(yǎng)基，所述新鮮配制的培養(yǎng)基為I. 6% IM HEPES緩沖液；15%胎牛血清；1%青霉素和鏈霉素；PRMI 1640補(bǔ)足到100%;7天左右鏡下 觀察，可見(jiàn)淋巴細(xì)胞明顯增大，出現(xiàn)聚集現(xiàn)象；
[0100] (3. 2. 7)如果細(xì)胞增長(zhǎng)慢，或細(xì)胞密度低，或培養(yǎng)液pH值呈酸性，吸出半量培養(yǎng) 液，進(jìn)行等量換液；
[0101] (3. 2. 8)當(dāng)總量達(dá)到HmL時(shí)轉(zhuǎn)移到75mL培養(yǎng)瓶中，每2-3周加入5-10mL新鮮培 養(yǎng)基；
[0102] (3. 2. 9)約6-8周，當(dāng)總量達(dá)到45mL時(shí)，置50mL離心管中，離心1500轉(zhuǎn)，10分鐘； 棄上清，加入3mL凍存培養(yǎng)基，所述凍存培養(yǎng)基為5%二甲基亞楓，95% FBS混勻，成細(xì)胞懸 浮液；凍存管分裝，ImL/管，立即置零下80度，1-2小時(shí)后移入液氮罐中；制備的淋巴細(xì)胞 即為EBV永生化B淋巴細(xì)胞。
[0103] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述基因轉(zhuǎn)染的步驟為：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀 態(tài)良好的永生化B淋巴細(xì)胞IO5個(gè)接種至T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶；待永生化B淋巴細(xì)胞貼壁12h 后，將永生化B淋巴細(xì)胞在37°C，CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；在轉(zhuǎn)染后的第72h收 集細(xì)胞用于WB檢測(cè)；最后收集到含目的基因的細(xì)胞即為目的免疫復(fù)合物吸附細(xì)胞，免疫復(fù) 合物吸附細(xì)胞根據(jù)所轉(zhuǎn)入基因的不同而不同，分別對(duì)應(yīng)用于C3b、C3d和Clq三個(gè)基因。
[0104] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明制作出了一套分別攜帶有特定基 因的永生化的細(xì)胞，具有永生化（無(wú)限增殖分裂能力）和表達(dá)某一種免疫復(fù)合物受體于細(xì) 胞表面的能力，通過(guò)擴(kuò)增培養(yǎng)的細(xì)胞，建立免疫復(fù)合物分析組合，一次可以對(duì)血液或者身體 組織的各種免疫復(fù)合物進(jìn)行識(shí)別、分類(lèi)、定量。還具有低成本無(wú)限增殖、檢測(cè)速度快，操作簡(jiǎn) 單等特點(diǎn)。另外，制作永生化B淋巴細(xì)胞所用的病毒是EBV病毒，又稱(chēng)人類(lèi)皰疹病毒（Human herpesvirus4(HHV-4))，本發(fā)明的目的是為了得到永生化的B淋巴細(xì)胞，不限于采用該病 毒；所用永生化的B淋巴細(xì)胞來(lái)源于人體的外周血中的單核細(xì)胞；其中所述受體基因分別 分開(kāi)制作成不同的病毒，而不是連接在一起；本發(fā)明最終的細(xì)胞是指具有永生化和表達(dá)某 一種免疫復(fù)合物受體基因的B淋巴細(xì)胞，該B淋巴細(xì)胞是能穩(wěn)定表達(dá)一種免疫復(fù)合物受體 基因，并且該受體能在細(xì)胞膜上存在，并能結(jié)合細(xì)胞外的對(duì)應(yīng)的一種免疫復(fù)合物，并不局限 于永生化B細(xì)胞。

【具體實(shí)施方式】
[0105] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的 實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都 屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0106] -種免疫復(fù)合物吸附細(xì)胞的制作方法，包括載體構(gòu)建、病毒包裝制作、EBV永生化 B淋巴細(xì)胞制作和基因轉(zhuǎn)染，具體步驟如下：
[0107] (1)載體構(gòu)建的步驟為：
[0108] (I. 1)設(shè)計(jì)三個(gè)基因，分別是CRl (NCBI Gene ID :1378)、CR2 (NCBI Gene ID :1380) 和⑶93(NCBI Gene ID :22918);這三個(gè)基因是補(bǔ)體系統(tǒng)的膜上信號(hào)蛋白受體，且分別結(jié)合 血液中的C3b、C3d和Clq補(bǔ)體蛋白，起到捕獲作用；
[0109] 設(shè)計(jì)引物為：
[0110] CRl 上游引物序列：5' -CTCGAGCGGAGCACAATGATTGGTCA-3'
[0111] CRl 下游引物序列：5' -CCTAGG TGGCTCCTTTCCCACCAAAA-3'
[0112] CR2 上游引物序列：5' -CTCGAGGGGTCTCGGAACGCATCC-3'
[0113] CR2 下游引物序列：5' -CCTAGGTCCAAGCAATGAGGCACACA-3'
[0114] CD93 上游引物序列：5' -CTCGAGGCCACACAGAGACCGGG-3'
[0115] CD93 下游引物序列：5' -CCTAGGTGTCTCTAGGGCCACCTCAC-3'。
[0116] (1.2) DNA 提取
[0117] 為了克隆出全長(zhǎng)的CR1、CR2和⑶93序列，使用DNA抽屜試劑盒從海拉細(xì)胞中抽 提出DNA，再以上述引物為模板，通過(guò)PCR反應(yīng)分別克隆出三個(gè)基因的基因片段；其中，三個(gè) 基因片段的 PCR 反應(yīng)體系為：2μ1 PCR 緩沖液（IOOmM Tris-HCl，pH8.3,500mM KCI，15mM MgCl2,0· 01 % (0· 01g/100mL) gelatin ;Takara 公司，大連），2 μ IlOmM dNTP (Takara 公司， 大連）和0· 25U exTaq聚合酶（Takara公司，大連）；PCR擴(kuò)增程序：先94°C、30s，58°C、30s， 74°C、50s，35個(gè)循環(huán)；然后72°C，IOmin ;將得到的基因克隆到pLVX-IRES-Neo載體中。
[0118] (1.3)質(zhì)粒構(gòu)建和擴(kuò)增、獲取
[0119] 根據(jù)現(xiàn)代生物分子技術(shù)，通過(guò)酶切酶連技術(shù)，將pLVX-IRES-Neo從XhoI (Forward primer處引入）和BamHI (Reverse primer處引入）酶切位點(diǎn)切開(kāi)，再使用連接酶將之前獲 得的基因片段連接到pLVX-IRES-Neo中；將pLVX-IRES-Neo轉(zhuǎn)入感受態(tài)菌株中，擴(kuò)增培養(yǎng)， 最后抽提感受態(tài)菌株的質(zhì)粒；所述XhoI酶切位點(diǎn)序列為：CTCGAG ;BamHI酶切位點(diǎn)序列為： GGATCC。
[0120] (2)病毒包裝制作的步驟為：
[0121] (2. 1)293FT 細(xì)胞培養(yǎng)
[0122] 293FT細(xì)胞用含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37°C飽和濕度、含5% CO2的 孵箱中培養(yǎng)；
[0123] 用0. 25%胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293FT細(xì)胞，以含10%血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì) 胞密度為I. O7個(gè)細(xì)胞，重新接種于IOcm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞 匯合度達(dá)90%時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染。
[0124] (2. 2)轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞（三種基因的DNA分開(kāi)操作）
[0125] (2. 2. 1)轉(zhuǎn)染前2小時(shí)，更換新鮮不含雙抗的含10% FBS的完全培養(yǎng)基；
[0126] (2. 2. 2)向一滅菌離心管中加入所制備的三種DNA溶液，按照IOygJ. 5yg， 3. 5 μ g，2. 5 μ g 的分別把 pLVX-IRES-Neo 加入到 1500 μ L OPTI-MEM 內(nèi)混勻；
[0127] (2.2.3)將1^口〇2000試劑輕輕搖勻，取35以1^1^口〇2000加入到150(^1^0?1'1-]\^]\1 內(nèi)混勻，兩者迅速混合；
[0128] (2. 2. 4)混合后，室溫靜止15分鐘，以便形成以DNA與Lip〇2000稀釋液的轉(zhuǎn)染復(fù) 合物；
[0129] (2. 2. 5)將DNA與Lipo2000稀釋液的轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到培養(yǎng)皿內(nèi)，在37°C飽 和濕度、含5% CO2的孵箱中培養(yǎng)；
[0130] (2. 2. 6)培養(yǎng)12小時(shí)后更換不含雙抗的含2% FBS的病毒收獲培養(yǎng)基，繼續(xù)37°C 飽和濕度、含5% CO2的孵箱中培養(yǎng)48小時(shí)。
[0131] (2. 3)病毒的收集及濃縮
[0132] (2. 3. 1)收集轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的293FT細(xì)胞上清液，冰上預(yù)冷；1500g，4攝氏度，離 心30分鐘；
[0133] (2. 3. 2)用0· 45 μ m濾器過(guò)濾病毒上清液；
[0134] (2. 3. 3)過(guò)濾后，按照優(yōu)化條件加入病毒濃縮液；4攝氏度靜置過(guò)夜；
[0135] (2. 3.4)過(guò)夜后，1500g，4攝氏度，離心45分鐘；去上清，加入一毫升無(wú)血清培養(yǎng)基 重懸病毒聚集團(tuán)塊。
[0136] (3) EBV永生化B淋巴細(xì)胞制作的步驟為：
[0137] (3. 1)試劑
[0138] (3. I. 1)淋巴細(xì)胞分離液：避光4°C保存，用前在37°C水浴中加溫；整個(gè)分離過(guò)程 中，溫度應(yīng)控制在8-28°C，溫度過(guò)高或過(guò)低均影響分離質(zhì)量；
[0139] (3. 1.2)全培養(yǎng)基（用前配置）：RPM1640培養(yǎng)基，內(nèi)含20 %胎牛血清（Gibco) {56°C滅活30分鐘}，1. 6-1. 8% IM的HEPES，I. 2%、0. 2mol/L谷氨酰胺，1%青霉素和鏈霉 素；
[0140] (3.1.3)環(huán)胞酶素八辦4):51^(25〇11^)/瓶，用1640培養(yǎng)基稀釋成0.211^/1^，使用 時(shí)終濃度為);
[0141] (3. I. 4) EBV液：購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院遺傳所，儲(chǔ)存于零下80°C ;使用時(shí)從冰箱中取出， 37°C迅速融化，用0. 22 μ m的濾膜過(guò)濾，不要超過(guò)0. 5-1小時(shí)。
[0142] (3. 2)建株方法
[0143] (3. 2. 1)取外周血3_4mL,肝素抗凝（血液室溫可放置48小時(shí)），應(yīng)用液濃度5 μ g/ mL,可加入5-10mL外周血；
[0144] (3. 2. 2)將血液與等量1640培養(yǎng)液混勻后，沿管壁漸漸加入到含有4mL淋巴細(xì)胞 分離液的離心管中（混合血：淋巴細(xì)胞分離液=6 : 4)，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘；
[0145] (3. 2. 3)吸取白細(xì)胞層，移入另一支離心管中，加入不含血清的1640培養(yǎng)液6mL， 輕輕混勻，進(jìn)行第一次洗滌；1500轉(zhuǎn)離心15分鐘；
[0146] (3. 2. 4)棄上清液，再加 6mL1640全培養(yǎng)液進(jìn)行第二次洗滌，離心1500轉(zhuǎn)15分鐘；
[0147] (3. 2. 5)棄上清液，加入2mL1640全培養(yǎng)基（全培養(yǎng)基加入前，置37°C水浴10分 鐘），然后加入環(huán)胞霉素 A (4% )和I. 2mL EBV液/份，充分混勻后移入到25平方厘米的培 養(yǎng)瓶，置37°C，CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中；
[0148] (3. 2. 6)每2-3天加入3mL新鮮配制的培養(yǎng)基（L 6% IM HEPES緩沖液；15 %胎牛 血清（FBS) ;1%青霉素和鏈霉素；PRMI1640補(bǔ)足到100%) ;7天左右鏡下觀察，可見(jiàn)淋巴細(xì) 胞明顯增大，出現(xiàn)聚集現(xiàn)象；
[0149] (3. 2. 7)如果細(xì)胞增長(zhǎng)慢，或細(xì)胞密度低，或培養(yǎng)液pH值呈酸性，吸出半量培養(yǎng) 液，進(jìn)行等量換液；
[0150] (3. 2. 8)當(dāng)總量達(dá)到HmL時(shí)轉(zhuǎn)移到75mL培養(yǎng)瓶中，每2-3周加入5-10mL新鮮培 養(yǎng)基；
[0151] (3. 2. 9)約6-8周，當(dāng)總量達(dá)到45mL時(shí)，置50mL離心管中，離心1500轉(zhuǎn)，10分鐘； 棄上清，加入3mL凍存培養(yǎng)基（5%二甲基亞楓（dimethyl sufoxide)，95%FBS)混勻，成細(xì) 胞懸浮液；凍存管分裝，ImL/管，立即置零下80度，1-2小時(shí)后移入液氮罐中；制備的淋巴 細(xì)胞即為EBV永生化B淋巴細(xì)胞。
[0152] (4)基因轉(zhuǎn)染：
[0153] 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的永生化B淋巴細(xì)胞IO5個(gè)接種至T25細(xì)胞培 養(yǎng)瓶；待永生化B淋巴細(xì)胞貼壁ia后，將永生化B淋巴細(xì)胞在37°C，CO 2濃度為5%的培 養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；在轉(zhuǎn)染后的第72h收集細(xì)胞用于WB檢測(cè)；最后收集到含目的基因的細(xì)胞 即為目的免疫復(fù)合物吸附細(xì)胞，免疫復(fù)合物吸附細(xì)胞根據(jù)所轉(zhuǎn)入基因的不同而不同，分別 對(duì)應(yīng)用于C3b、C3d和Clq三個(gè)基因。
[0154] 本發(fā)明制作出了一套分別攜帶有特定基因的永生化的細(xì)胞，具有永生化（無(wú)限增 殖分裂能力）和表達(dá)某一種免疫復(fù)合物受體于細(xì)胞表面的能力，通過(guò)擴(kuò)增培養(yǎng)的細(xì)胞，建 立免疫復(fù)合物分析組合，一次可以對(duì)血液或者身體組織的各種免疫復(fù)合物進(jìn)行識(shí)別、分類(lèi)、 定量。還具有低成本無(wú)限增殖、檢測(cè)速度快，操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。
[0155] 對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在 不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無(wú)論 從哪一點(diǎn)來(lái)看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán) 利要求而不是上述說(shuō)明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有 變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。
[0156] 此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說(shuō)明書(shū)按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包 含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說(shuō)明書(shū)的這種敘述方式僅僅是為清楚起見(jiàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng) 將說(shuō)明書(shū)作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員 可以理解的其他實(shí)施方式。
【權(quán)利要求】
1. 一種免疫復(fù)合物吸附細(xì)胞的制作方法，其特征在于，步驟包括載體構(gòu)建、病毒包裝制 作、永生化B淋巴細(xì)胞制作和基因轉(zhuǎn)染， 所述載體構(gòu)建的步驟為： (1. 1)設(shè)計(jì)三個(gè)基因，分別是CR1、CR2和⑶93 ;這三個(gè)基因是補(bǔ)體系統(tǒng)的膜上信號(hào)蛋白 受體，且分別結(jié)合血液中的C3b、C3d和Clq補(bǔ)體蛋白，起到捕獲作用； 設(shè)計(jì)引物為： CR1 上游引物序列：5' -CTCGAGCGGAGCACAATGATTGGTCA-3' CR1 下游引物序列：5' -CCTAGG TGGCTCCTTTCCCACCAAAA-3' CR2 上游引物序列：5' -CTCGAGGGGTCTCGGAACGCATCC-3' CR2 下游引物序列：5' -CCTAGGTCCAAGCAATGAGGCACACA-3' CD93 上游引物序列：5' -CTCGAGGCCACACAGAGACCGGG-3' CD93 下游引物序列：5' -CCTAGGTGTCTCTAGGGCCACCTCAC-3'。 (1. 2)DNA 提取 為了克隆出全長(zhǎng)的CR1、CR2和CD93序列，使用DNA抽屜試劑盒從海拉細(xì)胞中抽提出 DNA，再以上述引物為模板，通過(guò)PCR反應(yīng)分別克隆出三個(gè)基因的基因片段； (1.3)質(zhì)粒構(gòu)建和擴(kuò)增、獲取 根據(jù)現(xiàn)代生物分子技術(shù)，通過(guò)酶切酶連技術(shù)，將pLVX-IRES-Neo從Xhol和BamHI 酶切位點(diǎn)切開(kāi)，再使用連接酶將之前獲得的基因片段連接到pLVX-IRES-Neo中；將 pLVX-IRES-Neo轉(zhuǎn)入感受態(tài)菌株中，擴(kuò)增培養(yǎng)，最后抽提感受態(tài)菌株的質(zhì)粒；所述Xhol酶切 位點(diǎn)序列為：CTCGAG ;BamHI酶切位點(diǎn)序列為：GGATCC。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫復(fù)合物吸附細(xì)胞及其制作方法，其特征在于，步驟（1.2) 中所述的PCR反應(yīng)的體系為：2μ 1 PCR緩沖液，2μ llOmM dNTP和0. 25U exTaq聚合酶；PCR 擴(kuò)增程序：先941：、3〇8,581：、3〇8,741：、5〇8,35個(gè)循環(huán)；然后721：，1〇1^11。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫復(fù)合物吸附細(xì)胞及其制作方法，其特征在于，所述Clq、 C3b和C3d受體基因，分別在基因上游引物序列的5'端加入了 Xhol酶切位點(diǎn)，在下游引物 序列5'端加入了 BamHI酶切位點(diǎn)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫復(fù)合物吸附細(xì)胞及其制作方法，其特征在于，所述Xhol 酶切位點(diǎn)和BamHI酶切位點(diǎn)分別對(duì)應(yīng)載體pLVX-IRES-Neo的兩個(gè)相同的酶切位點(diǎn)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫復(fù)合物吸附細(xì)胞及其制作方法，其特征在于，所述病毒 包裝制作的步驟為： (2. 1)293FT細(xì)胞培養(yǎng) 293?1'細(xì)胞用含10%滅活胎牛血清的01^11培養(yǎng)基，在371：飽和濕度、含5%〇)2的孵 箱中培養(yǎng)； 用0. 25%胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293FT細(xì)胞，以含10%血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密 度為1. 07個(gè)細(xì)胞，重新接種于10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，37°C、5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合 度達(dá)90%時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染； (2. 2)轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞 (2. 2. 1)轉(zhuǎn)染前2小時(shí)，更換新鮮不含雙抗的含10% FBS的完全培養(yǎng)基； (2. 2. 2)向一滅菌離心管中加入所制備的三種DNA溶液，按照10 μ g，6. 5 μ g，3. 5 μ g， 2· 5 μ g 的分別把 pLVX-IRES-Neo 加入到 1500 μ L OPTI-MEM 內(nèi)混勻； (2· 2· 3)將 Lipo2000 試劑輕輕搖勻，取 35 μ L Lipo2000 加入到 1500 μ L OPTI-MEM 內(nèi) 混勻，兩者迅速混合； (2. 2. 4)混合后，室溫靜止15分鐘，以便形成以DNA與Lip〇2000稀釋液的轉(zhuǎn)染復(fù)合物； (2. 2. 5)將DNA與Lipo2000稀釋液的轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到培養(yǎng)皿內(nèi)，在37°C飽和濕 度、含5%0)2的孵箱中培養(yǎng)； (2. 2. 6)培養(yǎng)12小時(shí)后更換不含雙抗的含2% FBS的病毒收獲培養(yǎng)基，繼續(xù)37°C飽和 濕度、含5% C02的孵箱中培養(yǎng)48小時(shí)； (2. 3)病毒的收集及濃縮 (2. 3. 1)收集轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的293FT細(xì)胞上清液，冰上預(yù)冷；1500g，4攝氏度，離心30 分鐘； (2. 3. 2)用0· 45 μ m濾器過(guò)濾病毒上清液； (2. 3. 3)過(guò)濾后，按照優(yōu)化條件加入病毒濃縮液；4攝氏度靜置過(guò)夜； (2. 3.4)過(guò)夜后，1500g，4攝氏度，離心45分鐘；去上清，加入一毫升無(wú)血清培養(yǎng)基重懸 病毒聚集團(tuán)塊。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫復(fù)合物吸附細(xì)胞及其制作方法，其特征在于，所述永生 化B淋巴細(xì)胞制作的步驟為： (3· 1)試劑 (3. 1. 1)淋巴細(xì)胞分離液：避光4°C保存，用前在37°C水浴中加溫；整個(gè)分離過(guò)程中，溫 度應(yīng)控制在8-28°C，溫度過(guò)高或過(guò)低均影響分離質(zhì)量； (3. 1. 2)全培養(yǎng)基：RPM1640培養(yǎng)基，內(nèi)含20%胎牛血清，56°C滅活30分鐘，1. 6-1. 8% 1M的HEPES，1. 2%、0. 2mol/L谷氨酰胺，1%青霉素和鏈霉素； (3. 1. 3)環(huán)胞酶素 A :250mg/瓶的5mL，用1640培養(yǎng)基稀釋成0. 2mg/mL，使用時(shí)終濃度 為 2 μ g/mL (3. 1. 4)EBV液：購(gòu)白中國(guó)科學(xué)院遺傳所，儲(chǔ)存于零下80°C ;使用時(shí)從冰箱中取出，37°C 迅速融化，用〇. 22 μ m的濾膜過(guò)濾，不要超過(guò)0. 5-1小時(shí)； (3. 2)建株方法 (3. 2. 1)取外周血3-4mL，肝素抗凝，應(yīng)用液濃度5 μ g/mL，加入5-10mL外周血； (3. 2. 2)將血液與等量1640培養(yǎng)液混勻后，沿管壁漸漸加入到含有4mL淋巴細(xì)胞分離 液的離心管中，混合血：淋巴細(xì)胞分離液=6 : 4, 3000轉(zhuǎn)離心10分鐘； (3. 2. 3)吸取白細(xì)胞層，移入另一支離心管中，加入不含血清的1640培養(yǎng)液6mL，輕輕 混勻，進(jìn)行第一次洗滌；1500轉(zhuǎn)離心15分鐘； (3. 2. 4)棄上清液，再加 6mL1640全培養(yǎng)液進(jìn)行第二次洗滌，離心1500轉(zhuǎn)15分鐘； (3. 2. 5)棄上清液，加入2mL1640全培養(yǎng)基，全培養(yǎng)基加入前，置37°C水浴10分鐘，然 后加入環(huán)胞霉素 A和1. 2mL EBV液/份，充分混勻后移入到25平方厘米的培養(yǎng)瓶，置37°C， C〇2濃度為5%的培養(yǎng)箱中； (3.2.6)每2-3天加入3mL新鮮配制的培養(yǎng)基，所述新鮮配制的培養(yǎng)基為1.6% 1M HEPES緩沖液；15%胎牛血清；1%青霉素和鏈霉素；PRMI1640補(bǔ)足到100% ;7天左右鏡下 觀察，可見(jiàn)淋巴細(xì)胞明顯增大，出現(xiàn)聚集現(xiàn)象； (3. 2. 7)如果細(xì)胞增長(zhǎng)慢，或細(xì)胞密度低，或培養(yǎng)液pH值呈酸性，吸出半量培養(yǎng)液，進(jìn) 行等量換液； (3. 2. 8)當(dāng)總量達(dá)到14mL時(shí)轉(zhuǎn)移到75mL培養(yǎng)瓶中，每2-3周加入5-10mL新鮮培養(yǎng)基； (3. 2. 9)約6-8周，當(dāng)總量達(dá)到45mL時(shí)，置50mL離心管中，離心1500轉(zhuǎn)，10分鐘；棄 上清，加入3mL凍存培養(yǎng)基，所述凍存培養(yǎng)基為5%二甲基亞楓，95% FBS混勻，成細(xì)胞懸浮 液；凍存管分裝，lmL/管，立即置零下80度，1-2小時(shí)后移入液氮罐中；制備的淋巴細(xì)胞即 為EBV永生化B淋巴細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫復(fù)合物吸附細(xì)胞及其制作方法，其特征在于，所述基因 轉(zhuǎn)染的步驟為：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的永生化B淋巴細(xì)胞105個(gè)接種至T25細(xì) 胞培養(yǎng)瓶；待永生化B淋巴細(xì)胞貼壁ia后，將永生化B淋巴細(xì)胞在37°C，C0 2濃度為5% 的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；在轉(zhuǎn)染后的第72h收集細(xì)胞用于WB檢測(cè)；最后收集到含目的基因的 細(xì)胞即為目的免疫復(fù)合物吸附細(xì)胞，免疫復(fù)合物吸附細(xì)胞根據(jù)所轉(zhuǎn)入基因的不同而不同， 分別對(duì)應(yīng)用于C3b、C3d和Clq三個(gè)基因。
【文檔編號(hào)】C12N15/869GK104293836SQ201410300880
【公開(kāi)日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年6月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月24日
【發(fā)明者】易銀沙, 張萬(wàn)明, 朱海強(qiáng), 鄒義洲, 許澎, 劉彩云, 袁炳秋, 吳小寧 申請(qǐng)人:長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司