国产精品1024永久观看,大尺度欧美暖暖视频在线观看,亚洲宅男精品一区在线观看,欧美日韩一区二区三区视频,2021中文字幕在线观看

  • <option id="fbvk0"></option>
    1. <rt id="fbvk0"><tr id="fbvk0"></tr></rt>
      <center id="fbvk0"><optgroup id="fbvk0"></optgroup></center>
      <center id="fbvk0"></center>

      <li id="fbvk0"><abbr id="fbvk0"><dl id="fbvk0"></dl></abbr></li>

      電聚合膜、其制備方法及用途的制作方法

      文檔序號:439096閱讀:361來源:國知局
      專利名稱:電聚合膜、其制備方法及用途的制作方法
      互相參照的相關(guān)申請本申請是共同未決申請系列號08/667,338(1996年6月20日提交)的部分繼續(xù);它也是申請系列號08/495,817(1995年6月27日提交現(xiàn)已放棄)的部分繼續(xù),并且是共同未決申請系列號08/950,503(1997年10月14日提交)的部分繼續(xù),此共同未決申請也是共同未決申請系列號08/667,338(1996年6月20日提交)的部分繼續(xù);此申請是申請系列號08/495,817(1995年6月27日提交,現(xiàn)已放棄)的部分繼續(xù),在此將這些申請的公開內(nèi)容全部完整地引入作為參考。
      背景技術(shù)
      對相關(guān)技術(shù)的論述表面修飾技術(shù)的最新進(jìn)展已促使形成了生物檢測技術(shù)的許多新方法,特別是與先進(jìn)的熒光檢測技術(shù)相結(jié)合,例如,基因表達(dá)分析(Schena,M等,科學(xué)1995,270,467),在高密度陣列上對基因組DNA的測序(Chee,M.等,科學(xué),1996,274,610),以及檢測核酸以便鑒定感染的微生物(Spargo,C.A.等分子和細(xì)胞探針1993,7,395;Martin,W.J.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),Mullis,K.B.,F(xiàn)erre,F(xiàn).,Gibbs,R.A,編著,1994,406-417,Berkhauser,Boston),它們同基于預(yù)先培養(yǎng)或免疫測定的方法相比較具有優(yōu)越的選擇性和靈敏度。在此所涉及的每個(gè)專利和出版物,其公開內(nèi)容均被引入作為參考。盡管這些系統(tǒng)表現(xiàn)出顯著的進(jìn)步,但它們?nèi)园ǚ倍嗟奶幚聿襟E,并需要使用昂貴的熒光顯微鏡。
      核酸的電化學(xué)檢測法提供了代替熒光生物檢測術(shù)的另一種選擇,它有可能不需要作標(biāo)記(Johnston,D.H.等,金屬離子生物系統(tǒng),1996,33,297;Johnston,D.H.,Cheng,C.C.等,無機(jī)化學(xué),1994,33,6388;Steenken,S.等,美國化學(xué)學(xué)會雜志1997,119,617;Johnston,D.H.等,美國化學(xué)學(xué)會雜志1995,117,8933;和Johnston,D.H.等,物理化學(xué)雜志1996,100,13837)。
      在此本發(fā)明是利用如下發(fā)現(xiàn)聚合DNA的鳥嘌呤核堿基可產(chǎn)生一個(gè)適合于超靈敏檢測的氧化還原活性標(biāo)記陣列,與超微電極法相結(jié)合可提供一種方法,用于在PCR擴(kuò)增之前檢測許多生理學(xué)相關(guān)的核酸。對陣列引入單個(gè)微電極使之能夠形成具有高密度、多重傳感器陣列的低費(fèi)用快速檢測裝置。
      在溶液中通過使用Ru(bpy)32+作介體催化氧化鳥嘌呤堿基可以檢測核酸(Johnston,D.H.等,金屬離子生物系統(tǒng),1996,33,297;Johnston,D.H.等,美國化學(xué)學(xué)會雜志1995,117,8933;和Johnston,D.H.等,物理化學(xué)雜志,1996,100,13837)。在溶液中Ru(bpy)32+表現(xiàn)為具有1.05V的可逆性氧化還原對狀態(tài),此電位與對鳥嘌呤觀察的氧化電位相似。將會有鳥嘌呤的DNA加入到Ru(bpy)32+溶液中,導(dǎo)致按照二步驟機(jī)制催化增加氧化電流在此DNAox代表其中的鳥嘌呤已經(jīng)歷過一個(gè)電子氧化的DNA分子。
      如在共同未決專利母案申請(系列號08/667,338)中所述,可將雜交的DNA固定化在固體支持物上,然后通過將氧化劑固定化在同一固體支持物上,并在足以使此氧化劑與預(yù)定的堿基發(fā)生氧化-還原反應(yīng)的條件下將此固體支持物浸入溶液中,使此氧化劑與雜交的DNA發(fā)生反應(yīng)。
      如在共同未決申請系列號08/950,503(聚合體電極的應(yīng)用)中所述,其中DNA被固定化在聚(對苯二酸-乙二醇)或PET膜上、DNA探針直接附著于氧化銦-錫電極的補(bǔ)充方案被用于檢測互補(bǔ)DNA,具有作為PCR amplicon生物檢測法的用途(Napier,M.E.等,Lahgmuir1997,13,6342;Napier,M.E.等,H.H.生物共軛化學(xué)1997,8,906)。以前的許多探索大體上主要集中在二方面1)含有DNA溶液的溶解介體和2)含有固定化DNA的溶解介體。
      電化學(xué)共聚合已被用于制備基體。例如,借助于對吡咯和帶有吡咯基團(tuán)的寡核苷酸的定向電化學(xué)共聚合使用,已將DNA基體制備在電極表面,與對寡核苷酸的放射性標(biāo)記一道用于雜交檢測(Livache,T.等,核酸研究1994,22,2915;Roget,A.等核苷和核苷酸1995,14,943)。還應(yīng)用帶有寡核苷酸探針的功能化的電活性聚吡咯設(shè)計(jì)了生物傳感器(Korri-Youssoufi,H.等美國化學(xué)學(xué)會雜志1997,119,7388)。
      雖然Livache和Roget使用了放射活性標(biāo)記物以使檢測附著于電聚合膜上的DNA,而Korri-Youssoufi監(jiān)測該膜本身的電位以便間接地檢測DNA雜交作用,但是,在此本發(fā)明通過來自鳥嘌呤的法拉第感應(yīng)電流,能夠直接檢測附著于電聚合膜上的DNA。因此,Korri-Youssoufi的方法是電位測定法,而本方法是電流測定法。在此所述的聚合物,為電子從核酸向用于檢測法拉第感應(yīng)電流的電極轉(zhuǎn)移提供了一個(gè)催化劑,這種電流太緩慢,如果沒有固相化的介體則不能提供實(shí)用的信號。此外,本發(fā)明的膜在0-0.9V的范圍內(nèi)是電化學(xué)惰性的,而以前的聚吡咯膜在此范圍內(nèi)是活性的。
      Yachynych的專利(美國專利號5,540,828)提供了一種方法,通過氧化電聚合制備蛋白質(zhì)識別電極。與Yachynych不同,在此本發(fā)明是用于核酸,本發(fā)明在聚合過程中是通過還原而不是氧化來形成聚合物,本發(fā)明在此應(yīng)用含乙烯基的聚合物,使用的金屬復(fù)合物既是電聚合的起始物又是固相化的介體。
      因此本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供表面修飾電極,用于檢測在接近對DNA或RNA中鳥嘌呤或其它預(yù)定堿基所觀察到的電位下發(fā)生的電子轉(zhuǎn)移事件。
      本發(fā)明的另一目標(biāo)是固定化一個(gè)介體即Ru2+中心,用于電化學(xué)檢測存在于溶液中和固相化物質(zhì)表面的鳥嘌呤堿基。
      本發(fā)明的再一個(gè)目標(biāo)是應(yīng)用電聚合作用產(chǎn)生以探針修飾的電極,這種探針當(dāng)與含有較大量預(yù)定堿基的靶標(biāo)雜交時(shí)可給出較大的氧化電流。
      本發(fā)明還有一個(gè)目標(biāo)是提供一種作用劑,它既作為電聚合的起始物又作為氧化預(yù)定堿基的介體。
      從下面的公開內(nèi)容和所附權(quán)利要求將更充分地明了本發(fā)明的其它目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)。
      發(fā)明概述本發(fā)明在此應(yīng)用一種被修飾的金屬復(fù)合物,以致可在規(guī)定的環(huán)境條件下發(fā)生聚合作用,并且本發(fā)明包括一種電極以及在電極導(dǎo)電的工作表面通過電聚合一種膜而制備電極的方法。通過還原性電聚合聚[Ru(vbpy)32+]或聚[Ru(vbpy)32+/vba]薄膜而對電極進(jìn)行修飾(vbpy=4-乙烯基-4’甲基-2,2’-二吡啶,vba=對-乙烯基苯甲酸),此電極被用于電化學(xué)檢測GMP、聚[G]水溶液表面固定化的單鏈DNA探針,以及雜交的DNA或RNA靶標(biāo)。從介體如Ru(vbpy)32+與具有羧化物基團(tuán)如對-乙烯苯甲酸的功能化部分的共聚物形成這種膜。借助于碳化二亞胺反應(yīng)并隨后酰胺化氨基連接的單鏈DNA,使DNA探針共價(jià)地附著于羧化物基團(tuán)。在有這些含鳥嘌呤的部分存在的情況下,由于催化氧化鳥嘌呤,觀察到Ru3+/2+偶連物(存在于聚合物薄膜中)的氧化電流驚人地增加。
      從下面的公開內(nèi)容和所附權(quán)利要求,將能更充分地明了本發(fā)明的其它目標(biāo)和特征。
      附圖簡述


      圖1A和1B是顯示(A)聚[Ru(vbpy)32+]和(B)5∶1聚[Ru(vbpy)32+/vba],從含有0.1M TBAH的乙腈溶液中電聚合在玻璃碳電極(GCE)上的循環(huán)伏安曲線(掃描速度,100mV/s,Ag/AgNO3參比電極)。溶液中Ru(vbpy)32+的溶液是0.2mM。
      圖2是顯示鳥苷-磷酸(GMP)氧化過程的循環(huán)伏安曲線,使用(A)未修飾的GCE以及在(B)不存在和(C)存在GMP的情況下使用聚[Ru(vbpy)32+]膜修飾的GCE(掃描速度50mV/s,Ag/AgCl參比電極,50mM,pH7.0的磷酸緩沖液)。
      圖3A顯示對聚[Ru(vbpy)32+]膜修飾GCE的第一次和第二次氧化掃描,圖3B顯示在有GMP存在時(shí)對聚[Ru(vbpy)32+]膜修飾GCE的第一次和第二次氧化掃描(掃描速度50mV/s,Ag/AgCl參比電極,50mM,pH7.0的磷酸緩沖液)。
      圖4是顯示聚[G]氧化過程的循環(huán)伏安曲線,使用(A)未修飾的GCE以及在(B)不存在和(C)存在聚[G]的情況下使用聚[Ru(vbpy)32+]修飾的GCE(掃描速度50mV/s,Ag/AgCl參比電極,50mM,pH7.0的磷酸緩沖液)。
      圖5是帶有固定化CpFe(C5H4-NH2)的5∶1聚[Ru(vbpy)32+]膜修飾GCE的循環(huán)伏安曲線(掃描速度50mV/s,Ag/AgNO3參比電極,0.2mMRu2+,0.1M TBAH溶液)。
      圖6顯示(A)帶有在pH6.5固定化的20-聚體聚[dG]的5∶1聚[Ru(vbpy)32+/vba]膜修飾GCE的循環(huán)伏安曲線,以及(B)帶有在pH9.0固定化的20-聚體聚[dG]的5∶1聚[Ru(vbpy)32+/vba]膜修飾GCE的循環(huán)伏安曲線,(掃描速度50mV/s,Ag/AgCl參比電極,50mM,pH7.0磷酸緩沖液)。
      圖7為示意
      圖1,顯示在電聚合時(shí)共聚物的形成。
      圖8為示意圖2,顯示出將氨基連接的DNA探針固定化在電極的表面。
      發(fā)明詳述及優(yōu)選實(shí)施方案在此本發(fā)明是關(guān)于一種制備電聚合膜的方法以及所形成的膜和它的用途。
      概括地說,制備在其上面具有本發(fā)明電聚膜的電極的方法包括(a)將一種膜電聚合在電極上,該膜包含一種金屬復(fù)合物與具有羧化物基團(tuán)的功能化部分的共聚合物,此金屬復(fù)合物既作為電聚合的起始物又作為電子轉(zhuǎn)移的介體;(b)借助于碳化二亞胺反應(yīng)并隨后酰胺化氨基連接的單鏈DNA,使DNA探針共價(jià)地附著于該羧化物基團(tuán)。
      本發(fā)明的電極可用于電化學(xué)檢測水溶解的GMP、聚[G],以及含有預(yù)定堿基的表面固定化核酸。此電極包含具有導(dǎo)電工作表面的基體,并在此工作表面通過還原性電聚合修飾了一層薄膜。此薄膜是選自聚[Ru(vbpy)32+]和聚[Ru(vbpy)32+/vba],其中vbpy是4-乙烯基-4’甲基-2,2’-二吡啶,vba是對-乙烯基苯甲酸。
      特別是本發(fā)明提供了包含聚吡啶基Ru11復(fù)合體的聚合物薄膜,一般是以Ru(vbpy)32+為基礎(chǔ),優(yōu)選地是從乙腈稀溶液中通過還原電聚合制備在Pt和玻璃碳電極的表面(vbpy=4-乙烯基-4’-甲基-2,2’-二吡啶)。在1.1V(所有的電位都以Ag/AgCl作參照)這種膜表現(xiàn)出氧化性氧化還原對,此電位稍微高于對水溶液中鳥嘌呤所觀察到的電位(1.05V,與Ag/AgCl對比)(Abruna,H.D.等美國化學(xué)學(xué)會雜志1981,103,1;Denisevich.P.等,無機(jī)化學(xué)1982,21,2153)。因此,這種膜對于鳥嘌呤和含有鳥嘌呤或其它預(yù)定堿基的聚合物如DNA或RNA的電氧化作用將是活性催化劑。
      更進(jìn)一步地說,對Ru(vbpy)32+和對-乙烯基苯甲本(vba)混合物的電聚合使用被用于產(chǎn)生含有釕催化劑的薄膜,借助于標(biāo)記vba的碳化二亞胺反應(yīng)可使帶有氨基的寡核苷酸附著在此膜上。作為本發(fā)明的一部分,以Ru(vbpy)32+膜修飾的電極被用于催化DNA氧化,而Ru(vbpy)32+與vba的共聚合物被用于產(chǎn)生位點(diǎn)特異性組合的DNA檢測部位。
      擴(kuò)增。因?yàn)榘凑毡景l(fā)明使用具有電聚合膜電極的步驟包括使核酸樣品與寡核苷酸探針接觸以便產(chǎn)生雜交的DNA或RNA,因此,在某些應(yīng)用中理想地是在與探針接觸之前先擴(kuò)增此DNA或RNA樣品??赏ㄟ^任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄈ缭诠餐礇Q申請中所公開的和論述的方法,對選定的或作為目標(biāo)的核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增。
      核酸的檢測。如上面所述,本發(fā)明包括一種在其表面已形成了電聚合膜的電極,以及使用這種電極使之能夠檢測雜交核酸的方法。在此方法中,是使核酸樣品與寡核苷酸探針接觸而形成雜交的核酸。用于本發(fā)明方法中的寡核苷酸探針可以是含有大約4或6個(gè)堿基直至大約80或100個(gè)或者更多堿基的任何一種探針,較優(yōu)選的是大約8-30個(gè)堿基。按照本領(lǐng)域熟知的技術(shù),可以制備具有廣泛多樣性堿基序列的寡核苷酸探針。適合于制備這種寡核苷酸探針的堿基可以選自天然存在的核苷酸堿基如腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶和腺嘧啶;還可以選自非天然存在的或“合成的”核苷酸堿基如8-氧代-鳥吩咐,6-巰基鳥嘌呤、4-乙酰胞苷、5-(羧基羥乙基)尿苷、2’-鄰-甲基胞苷、5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷,5-羧甲基氨甲基尿苷、二氫尿苷、2’-鄰-甲基偽尿苷,D-半乳糖基queosine,2’-鄰-甲基鳥苷、肌苷、7-去氮雜鳥嘌呤、N6-異戊烯基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基偽尿苷、1-甲基鳥苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥苷、2-甲基腺苷、2-甲基鳥苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鳥苷、5-甲基氨甲基尿苷、5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿苷、D-甘露糖基queosine、5-甲氧基羧甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲基硫代-N6-異戊烯基腺苷、N-((9-D-呋喃核糖基-2-甲基硫代嘌呤-6-)氨基甲?;?蘇氨酸,N-((9-D-呋喃核糖基嘌呤-6-)N-甲基-氨基甲?;?蘇氨酸、尿苷-5-羥基乙酸甲酯、尿苷-5-羥基乙酸、Wybutoxosine,偽尿苷、queosine,2-硫代胞苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-D-呋喃核糖基嘌呤-6-)氨基甲?;?蘇氨酸、2’-鄰-甲基-5-甲基尿苷、2’-鄰-甲基尿苷、Wybutosine、和3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷??梢圆捎萌魏我环N寡核苷酸骨架,包括糖基修飾的DNA,RNA(雖然RNA比DNA稍差點(diǎn)),此糖基可以是碳環(huán),以及含有2’取代如氟代和甲氧基加糖基。該寡核苷酸可以是其中至少一個(gè)或全部核苷酸間橋接的磷酸殘基是被修飾的磷酸酯,例如甲基膦酸酯、甲基硫代膦酸酯、嗎啉磷酸酯、哌嗪磷酸酯和氨基磷酸酯(例如可以是核苷酸間橋接的磷酸殘基每隔一個(gè)如所述被修飾)。該寡核苷酸還可以是一種“肽核酸”,例如在P.Nielsen等1001,科學(xué)254,1497-1500中所描述的。唯一的要求是該寡核苷酸探針應(yīng)該具有一個(gè)序列,至少此序列的一部分是與靶標(biāo)核酸已知的部分序列互補(bǔ)的。在某些應(yīng)用中理想的是使核酸樣品與具有不同堿基序列的若干個(gè)寡核苷酸探針接觸(例如當(dāng)樣品中存在二個(gè)或幾個(gè)靶標(biāo)核酸時(shí),或者在使單個(gè)靶標(biāo)核酸的“夾心”檢測法同二個(gè)或幾個(gè)探針雜交的情況下)。
      預(yù)定的堿基。雜交之后,使附著于電聚合膜上的雜交核酸與適當(dāng)?shù)慕轶w發(fā)生反應(yīng),此介體被固定在膜上并且能夠在氧化-還原反應(yīng)中氧化預(yù)定的堿基。預(yù)定的堿基可以是在與所選擇介體反應(yīng)時(shí)受到氧化的任何天然存在的或合成的核苷酸堿基。當(dāng)與四個(gè)天然存在的堿基中的每一個(gè)配對時(shí)該預(yù)定的堿基應(yīng)該表現(xiàn)出獨(dú)特的氧化速率。通??蓱?yīng)用此催化反應(yīng)檢測其5’-單核苷酸(例如5’-脫氧核糖核苷酸或5’-核糖核苷酸)表現(xiàn)出速率常數(shù)大于104M-1S-1的堿基。適合的預(yù)定堿基包括但不局限于鳥嘌呤、腺嘌呤、8-氧代-鳥嘌呤和8-氧代-腺嘌呤、8-溴代-鳥嘌呤、黃嘌呤、偽尿苷、6-巰基鳥嘌呤、8-巰基鳥嘌呤,2-硫代黃嘌呤、6-硫代黃嘌呤、6-巰基嘌呤、2-氨基-6-羧甲基-巰基嘌呤、2-巰基嘌呤,6-甲氧基嘌呤、2-乙酰氨基-6-羥基嘌呤、6-甲硫基-2-羥基嘌呤、2-二甲氨基-6-羥基嘌呤、2-羥基嘌呤、2-氨基嘌呤、6-氨基-2-二甲代烯丙基-嘌呤、2-硫代腺嘌呤、8-羥基腺嘌呤、8-甲氧基腺嘌呤。此預(yù)定的堿基典型地是選自鳥嘌呤、腺嘌呤、6-巰基鳥嘌呤、8-氧代-鳥嘌呤、和8-氧代-腺嘌呤,而鳥嘌呤是目前優(yōu)選的天然存在的預(yù)定堿基,8-氧代-鳥嘌呤是目前優(yōu)選的合成預(yù)定堿基。
      介體??捎糜趩?dòng)電子轉(zhuǎn)移并引發(fā)電聚合作用的介體是具有如下特點(diǎn)的介體(a)具有可逆的氧化性氧-還原偶聯(lián),并能夠氧化預(yù)定的堿基,(b)具有能夠在與其氧化性氧化-還原偶聯(lián)電位不同的電位經(jīng)受電聚合作用的取代基、以及(c)表現(xiàn)出可以被用于啟動(dòng)電聚合作用的不同的氧化-還原偶聯(lián)。例如,釕2+(2,2’-二吡啶)3(Ru(vbpy)32+,在此vbpy=4-乙烯基-4’甲基-2,2’-二吡啶)復(fù)合體在大約1.0V表現(xiàn)出氧化性氧化-還原偶聯(lián),這可以介導(dǎo)氧化鳥嘌呤,bpy配體上的乙烯基可被用于電聚合作用,并且該復(fù)合體在-1.1V表現(xiàn)出還原性氧化-還原偶聯(lián),可用于啟動(dòng)電聚合使用。滿足這些標(biāo)準(zhǔn)的介體包括含有乙烯基取代的聚吡啶基配體的金屬復(fù)合體,它既表現(xiàn)出氧化性氧化-還原偶聯(lián),又表現(xiàn)出還原性氧化-還原偶聯(lián)。
      氧化-還原反應(yīng)的檢測。應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明電極上的電聚合膜觀察指示氧化-還原反應(yīng)發(fā)生的電子信號改變,可以檢測氧化-還原反應(yīng)的發(fā)生。典型的方法是使以含有介體的電聚合膜修飾的電極以及被固定化在此膜上的核酸與溶液接觸,此溶液還與一個(gè)參比輔助電極接觸(大部分電流通過此輔助電極)。同樣,適合的參比電極也是本領(lǐng)域熟知的,包括例如銀/氯化銀電極。
      通過對與氧化-還原反應(yīng)相關(guān)的電子信號的檢測,使之能夠測定是否存在雜交的核酸。測定雜交核酸是否存在的步驟典型地包括(i)測定氧化-還原反應(yīng)的反應(yīng)速率,(ii)將所測定的反應(yīng)速率與單鏈核酸的過渡態(tài)金屬復(fù)合體的氧化-還原反應(yīng)速率相比較,然后(iii)確定此所測定的反應(yīng)速率是否與帶有單鏈核酸的過渡態(tài)金屬復(fù)合體的氧化-還原反應(yīng)速率基本相同。可以通過任何適當(dāng)?shù)姆椒▽?shí)施對反應(yīng)速率的測定步驟。例如通過在相同的掃描速度,相同的探針濃度、靶標(biāo)濃度,相同的介體、緩沖液、溫度和/或相同的電化學(xué)方法的情況下,對電流進(jìn)行比較而確定其相對的反應(yīng)速率。
      按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的適當(dāng)方法可測定氧化-還原反應(yīng)速率。一般是通過測定與氧化-還原反應(yīng)發(fā)生有關(guān)的電子信號來測定氧化-還原反應(yīng)速率。例如,通過提供一種適當(dāng)?shù)碾娮觽鬟f檢測儀來測定與氧化-還原反應(yīng)有關(guān)的電子信號,這種檢測儀帶有以在此所述的電聚合膜包涂的電極。適當(dāng)?shù)膬x器是一種恒電位器,它能夠測定所產(chǎn)生的電子信號以致可對雜交核酸與介體之間的反應(yīng)提供一個(gè)氧化-還原反應(yīng)速率測定結(jié)果。
      電子輸出是任何一種電化學(xué)測量法的特征,電化學(xué)測量法包括循環(huán)伏安法、正態(tài)脈沖伏安法、計(jì)時(shí)安培分析法和方波伏安法,而循環(huán)伏安法是當(dāng)前優(yōu)選的形式。如本領(lǐng)域所熟知的,可應(yīng)用計(jì)算機(jī)控制電極的使用以及記錄電極的測量結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明最常用于ITO電極上電聚合膜的方法是循環(huán)伏安法。在循環(huán)伏安測量法中,其電化學(xué)系統(tǒng)的電位從起始電位(0-800mV)至最終電位(1300-1800mV)是呈線性地改變。當(dāng)達(dá)到最終電位時(shí)掃描方向被反轉(zhuǎn),并按相反方向掃描相同的電位幅度。電位以恒定的掃描速度改變(25mv/s-50V/s)。對于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)起始電位設(shè)定在0mV,而最終電位足以引起介體的氧化。當(dāng)前優(yōu)選的掃描速度是50mV/s,以1.4V的轉(zhuǎn)換電位。測量每個(gè)電位點(diǎn)的電流,以此數(shù)據(jù)作圖,形成電流對電壓范圍的關(guān)系曲線。
      作為循環(huán)伏安法的另一種選擇,還可應(yīng)用電位步進(jìn)法如計(jì)時(shí)庫侖分析法或計(jì)時(shí)安培分析法來分析本發(fā)明的電聚合膜。在計(jì)時(shí)庫侖分析法中是應(yīng)用步進(jìn)式電位。以起始電位(0mV-800mV)開始,使電化學(xué)系統(tǒng)直接跨入最終電位(1100mV-1600mV)。使電化學(xué)系統(tǒng)在此最終電位保持一段特定的時(shí)間(50μs-10s),并作為時(shí)間的函數(shù)收集其電荷。雖然通常不這樣做,但是如果需要可使電位逐步反回至起始電位,并可在起始電位作為時(shí)間的函數(shù)收集其電荷。在計(jì)時(shí)伏安分析法中,使電化學(xué)系統(tǒng)從起始電位(0mV-800mV)直接跨入最終電位(1000-1500mV)維持一段特定的時(shí)間(50μs-10s),并作為時(shí)間的函數(shù)收集其電流。如果需要可使電位逐步反回至起始電位,并可在起始電位作為時(shí)間的函數(shù)收集其電流。
      在共同未決申請系列號08/667,337所述的方法中,使用金屬復(fù)合體是為了從單鏈和雙鏈核酸獲得電化學(xué)電流。預(yù)定的堿基如鳥嘌呤可給出電化學(xué)信號,但是對于雙鏈DNA這種信號要弱得多。這種方法有益地顯示出高度結(jié)構(gòu)性靈敏度,并可以分辨出單個(gè)堿基錯(cuò)配。因此這種方法用于DNA測序特別優(yōu)越。但是,這種方法有二個(gè)缺點(diǎn)(a)從探針單鏈變成雜交體時(shí)出現(xiàn)負(fù)信號,以及(b)一些限制信號的預(yù)定堿基受到限制。在此所述的技術(shù)對這些問題提供了解決辦法。此外,這些技術(shù)對于診斷性檢測特別有用,對于核酸的定量檢測也特別有用。
      鑒于前述的以及在此和在系列號08/667,337中所公開的,是一種檢測懷疑含有靶標(biāo)核酸的待測樣品中是否存在此核酸的方法,因此其中的靶標(biāo)核酸含有至少一個(gè)預(yù)定的堿基。此方法中,預(yù)定的堿基是定位于靶標(biāo)核酸而不是在寡核苷酸探針中。
      待測樣品??蓪邪袠?biāo)核酸的待測樣品實(shí)施本方法??墒褂脩岩珊邪袠?biāo)核酸的任何待測樣品,包括但不局限于組織樣品如活組織檢查樣品,以及生物液體如血液、唾液、尿液和精液樣品,還包括細(xì)菌培養(yǎng)物,土壤樣品和食物樣品等。靶標(biāo)核酸可以是任何來源的,取決于特定的檢測目的包括動(dòng)物、植物或微生物(例如病毒、原核生物和直核生物,包括細(xì)菌、原生動(dòng)物和真菌等)。實(shí)例包括外科手術(shù)樣品,用于醫(yī)學(xué)診斷的樣品、用于遺傳檢查的樣品、環(huán)境樣品、食物樣品、牙齒樣品和獸醫(yī)樣品。在實(shí)施本方法之前可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知或明了的技術(shù)對樣品作處理或純化,如果需要,可在實(shí)施本方法之前將其中的核酸消化、作成片段和/或擴(kuò)增(見上面)。
      檢測方法。按照本發(fā)明應(yīng)用帶有電聚合膜的電極對靶標(biāo)核酸上預(yù)定堿基的檢測包括(a)使待測樣品與特異性結(jié)合靶標(biāo)核酸而形成雜交核酸的寡核苷酸探針接觸;(b)檢測是否存在與雜交核酸有關(guān)的氧化-還原反應(yīng);以及(c)根據(jù)對預(yù)定堿基所檢測的氧化-還原反應(yīng)確定待測樣品中是否存在靶標(biāo)核酸??梢詫⒐押塑账崽结樄潭ɑ诠滔噍d體(電聚合膜)上,以便于在進(jìn)行檢測步驟之前(例如步驟(a)和(b)之間或步驟(b)和(c)之間)用分離步驟使待測樣品與雜交核酸分離。按另一種方法,可將寡核苷酸探針游離在溶液中,并提供其它一些方法使雜交核酸與樣品分離(例如借助于可結(jié)合于此寡核苷酸探針的介體核酸,或者借助于生物素-親合素結(jié)合性相互作用,在此可將生物素結(jié)合于寡核苷酸探針,將親合素固定化在固相載體上)。在使電聚合膜與基體的導(dǎo)電工作表面接觸之前或之后,氧化-還原反應(yīng)以及直至檢測步驟的任何步驟都可以在此膜上進(jìn)行。
      靶標(biāo)核酸優(yōu)選地至少比寡核苷酸探針多含有10個(gè)預(yù)定的堿基?;蛘吒鼉?yōu)選地至少比寡核苷酸探針多含有50或100個(gè)預(yù)定的堿基。當(dāng)靶標(biāo)核酸比寡核苷酸探針多含有許多預(yù)定的堿基時(shí),可有益地獲得較大的電流增加。
      任選地但比較優(yōu)選的情況是,該寡核苷酸沒有預(yù)定的堿基,或者至少基本上沒有預(yù)定的堿基(即含有足夠少的預(yù)定堿基以致來自探針的信號不會干擾或者被誤解為來自靶標(biāo)核酸的信號)。當(dāng)不能獲得可與靶標(biāo)核酸方便地雜交的天然存在的堿基序列時(shí),可采取使用氧化-還原惰性的替代堿基(將在下面論述)。
      優(yōu)選地是靶標(biāo)核酸比寡核苷酸探針長,至少有一個(gè)預(yù)定堿基“伸出”在外,即在雜交核酸中沒有與寡核苷酸探針雜交的。優(yōu)選地至少10、50或100個(gè)預(yù)定堿基是“伸出的”堿基,從而有顯著放大的電化學(xué)信號提供檢測。
      例如,可選擇不含有任何鳥嘌呤殘基(例如只含有A.T和C)的寡核苷酸探針。存在這種鏈時(shí)Ru(bpy)32-的循環(huán)伏安曲線非常類似于沒有此寡聚體時(shí)的曲線。然后使此探針與含有鳥嘌呤的靶標(biāo)鏈在重疊的堿基對區(qū)雜交和/或如果靶標(biāo)鏈比寡核苷酸探針長,則在伸出的區(qū)域雜交。因?yàn)槎鄠€(gè)鳥嘌呤被檢測,所以信號放大與雜交體形成的數(shù)量成比例。在基因組DNA或RNA是靶標(biāo)鏈的情況下,將遇到給予巨大的信號放大作用的大量伸出的鳥嘌呤。
      例如,在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,對靶標(biāo)鏈上預(yù)定堿基的測定包括將(優(yōu)選地是氧化-還原沉默的)探針鏈固定化在緊密貼近電極表面的膜上,這樣掃描時(shí)將提供較低的背景信號。然后使此電聚合膜與含有預(yù)定堿基的靶標(biāo)鏈的溶液接觸。如果發(fā)生雜交,此時(shí)靶標(biāo)鏈將緊密地靠近電極,并將檢測出電流增加。這種方法特別適合于核酸的定量檢測,因?yàn)殡s交的程度越高,在電極表面預(yù)定堿基的數(shù)量越多,電化學(xué)信號越強(qiáng)。
      氧化-還原惰性的替代堿基。在此探針鏈中可使用替代堿基來代替鳥嘌呤(即一種類似于鳥嘌呤的堿基,與核酸雙螺旋中其它堿基相比較它對胞嘧啶具有較大的結(jié)合親和性),但是在適合的反應(yīng)條件下這種替代堿基不會被介體氧化。當(dāng)靶標(biāo)核酸中預(yù)定的堿基是鳥嘌呤,并且此靶標(biāo)核酸還含有胞嘧啶(它通常與探針中的鳥嘌呤結(jié)合),那么此探針可含有在雜交核酸中結(jié)合于胞嘧啶的替代堿基。例如此替代堿基可以是肌苷,肌苷的活性比鳥嘌呤小3個(gè)數(shù)量級。典型的反應(yīng)步驟包括在足以引起選擇性氧化預(yù)定堿基而不氧化替代堿基的條件下,使過渡態(tài)金屬復(fù)合體與此核酸反應(yīng)。
      因此,在靶標(biāo)核酸含有至少一個(gè)預(yù)定堿基,并且此探針或捕獲核酸含有氧化-還原惰性的替代堿基的情況下,檢測此靶標(biāo)核酸的方法包括(a)使此靶標(biāo)核酸與可特異性結(jié)合于此靶標(biāo)核酸而形成雜交核酸的互補(bǔ)核酸相接觸;(b)檢測其氧化-還原反應(yīng);以及(c)根據(jù)對預(yù)定堿基檢測的氧化-還原反應(yīng)確定是否存在此靶標(biāo)核酸。
      通過參照下面的實(shí)施例將會對本發(fā)明的特征有更明確的理解,而不要認(rèn)為這些實(shí)施例是對本發(fā)明的限制。
      實(shí)施例實(shí)施例1.試劑和DNA用于這些實(shí)驗(yàn)的無機(jī)試劑都是分析級或更高的純度。應(yīng)用文獻(xiàn)中的標(biāo)準(zhǔn)程序制備無機(jī)復(fù)合體[Ru(vbpy)3](PF6)2(Abruna,H.D等,美國化學(xué)學(xué)會雜志,1981,103,1)。借助于標(biāo)準(zhǔn)的LiAlH4還原法還原氰基取代的二茂鐵CpFe(C5H4-CH2CN)隨后從二乙醚中活化加工制成了傳感探頭CpFe(C5H4-C2H4NH2)。從A1drich(Milwaukee,WI)購買了水溶性碳化二亞胺(WSC,1-(3-二甲基氨丙基)3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽),DCC(二環(huán)己基碳化二亞胺),TBAH(四丁基銨六氟硫酸鹽),NHS(N-羥基琥珀酰亞胺),GMP(鳥苷一磷酸,二鈉鹽),聚鳥苷(poly[G])和vba,按普遍接受的方法使用。在電化學(xué)實(shí)驗(yàn)之前從50%乙醇中對vba作了二次重結(jié)晶以確保純度。MES(2-嗎啉代乙基磺酸鈉鹽和2-嗎啉代乙基磺酸-水合物)購自Fluka(New Ulm,瑞士)。NaHPO4,NaH2PO4,NaCl,和乙腈是從Mallinekrodt(Phillipsburg,NJ)購得。在用于電聚合實(shí)驗(yàn)之前對活化分子篩使乙腈干燥。人工合成的寡核苷酸是由位于Chapel Hill的北卡羅來納大學(xué)病理系合成的,并使用3000截止分子量的Amicon 3微米濃縮器純化。從Milli-Q Plus純化系統(tǒng)(Millipore,Bedford,MA)獲得實(shí)驗(yàn)用水。從BAS(West Lafayette,IN)購得玻璃碳電極(GCE,直徑3mm),使用前拋光。
      實(shí)施例2.電化學(xué)分析。
      使用PAR 273A恒電位器/恒電流器獲得循環(huán)伏安曲線。使用二隔室的伏安測量小室在乙腈中進(jìn)行實(shí)驗(yàn),小室內(nèi)裝配有玻璃碳工作電極,鉑網(wǎng)反電極和Ag/AgNO3參比電極。使用單室的伏安測量小室進(jìn)行水介質(zhì)實(shí)驗(yàn),小室內(nèi)裝配有玻璃碳工作電極、鉑絲反電極和Ag/AgCl參比電極。使用之前在氈制拋光臺上用METADI金剛石拋光化合物(Buehler,Lake Bluff,IL)和Al2O3(0.5μm在水中)將所有的GCE徹底地拋光。然后在臨使用之前用Milli-Q水和無水乙腈漂洗電極幾次。通過以3.5ml 0.2mM[Ru(vbpy)3](PF6)2,0.1M TBAH乙腈溶液充滿工作電極隔室,并以100mV/s掃描速度在-0.9與-0.2V之間還原掃描10次而進(jìn)行電聚合反應(yīng)。在還原掃描之前這些溶液必須被徹底干燥并除去氣體,并且必須對參比電極隔室注滿0.1M TBAH的乙腈溶液。為了形成vba涂膜,發(fā)現(xiàn)[Ru(vbpy)3](PF6)2對vba溶液5∶1的比例可產(chǎn)生具有最高可再現(xiàn)性的膜。通過以50mV/s掃描速度,從0.0至1.4V作正相掃描而對含水GMP,聚[G]和附著的DNA探針進(jìn)行電化學(xué)氧化。
      實(shí)施例3.使DNA附著于膜修飾的電極。
      應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的酰胺化程序?qū)崿F(xiàn)DNA探針的附著,其中是應(yīng)用熟知的碳化二亞胺化學(xué)活化其表面羧基(作為vba間隔基而存在于膜中的),隨后與氨基連接的單鏈DNA進(jìn)行酰胺化反應(yīng)(Millan,K.M.等,分析化學(xué)1993,65,2317;Sehgal,D.等,分析生物化學(xué)1994,218,87)。在將聚[Ru(vbpy)32+/vba]電聚合在GCF表面之后,用乙腈仔細(xì)漂洗電極,除去殘余的[Ru(vbpy)3](PF6)2,vba和TBAH。然后倒置電極,并將50μl EDC/NHS溶液(通過將10mg EDC和1mg NHS溶解于1.0ml Milli-Q水中配制的)小心地滴加在電極表面。以倒扣的燒杯覆蓋此電極30分鐘。然后用水漂洗此被處理的GCE多次并用濾紙小心吸干。再次倒置電極,將25μl緩沖pH的5μM DNA探針溶液(20聚體,具有3’-(CH2)6NH2連接基團(tuán)的聚[脫氧鳥苷])滴加于電極表面。使此電極覆蓋靜置90分鐘不受干擾,然后以800mM NaCl,50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)漂洗。為了瓦解聚合體表面與非共價(jià)結(jié)合DNA之間任何形式的靜電相互作用,在此漂洗步驟中的高濃度鹽溶液是必需的。
      實(shí)施例4.對固定化探針的定量。
      按照標(biāo)準(zhǔn)的程序(Maniatis,T.等,分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊,1989,冷泉港出版社)使用T4聚核苷酸激酶和γ-32P-ATP(6000Ci/mmol)對此20聚體探針作5’-32P標(biāo)記。借助于標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù),使用Stratagene NucTrap柱除去此標(biāo)記探針上未反應(yīng)的ATP。在pH6.5 MES中或者在pH9.0碳酸鹽緩沖液中,使用含有5pmol標(biāo)記探針而被混入未標(biāo)記探針至5μM的DNA貯備液(總體積270μl),通過對未標(biāo)記探針?biāo)龅南嗤绦蚴箻?biāo)記的探針附著。固定化之后,從電極表面機(jī)械地取下探針修飾的膜,使聚合物擦拭在濾紙片上。以除去EDC/NHS酰胺化反應(yīng)步驟的相同方法獲得對照膜。然后應(yīng)用液體閃爍法和磷光成像技術(shù)一式三份地測定這些樣品的放射活性。
      實(shí)施例5.制備聚合物修飾的電極。
      對電聚合在電極表面的聚[Ru(vbpy)32+]膜已作了明確的特征鑒定,并且如在此所述,應(yīng)用不同掃描次數(shù)和掃描速度可容易地制作可重復(fù)厚度的膜。
      圖1A和1B顯示對于簡單的含釕膜聚[Ru(vbpy)32+],以及對于以含羧基vba基團(tuán)涂布的膜聚[Ru(vbpy)32+/vba]其聚合物的生長。圖7中顯示的示意圖表明電聚合時(shí)共聚合體的形成。如以前已證明,在使Ru3+穩(wěn)定形成的介質(zhì)中(即無水乙腈和強(qiáng)酸溶液)聚[Ru(vbpy)32+]膜可以被可逆地氧化(Abruna,H.D.等,美國化學(xué)學(xué)會雜志1981,103,1;Denisevich,P.等,無機(jī)化學(xué)1982,21,2153)在對聚[Ru(vbpy)32+/vba]涂布膜的這些研究中也觀察到同樣的行為。
      實(shí)施例6.對GMP和聚[G]的檢測。
      在pH7.0磷酸鹽緩沖液中存在和不存在GMP和聚[G]的情況下氧化掃描以聚[Ru(vbpy)32+]膜修飾的GCE(圖2、3和4)。圖2中,使未修飾的GCE暴露于1.0mM GMP溶液產(chǎn)生的氧化曲線明顯地小于聚合物修飾的電極產(chǎn)生的曲線。即使扣除由聚合物本身氧化產(chǎn)生的背景電流仍顯示出表明催化電子轉(zhuǎn)移過程的正電流。圖3A和3B中顯示出對所提議催化機(jī)制的進(jìn)一步支持。圖3中的伏安曲線證明存在電子供體GMP時(shí)該膜的穩(wěn)定性。在不存在適當(dāng)濃度的電子供體時(shí),觀察到該膜中釕核心的完全分解(圖3A)。但是,當(dāng)溶液中存在GMP時(shí),存在于剛性膜中的氧化Ru3+有時(shí)能夠在迅速分解之前從鄰近的GMP分子抽取電子。在GMP溶液中完成第二次氧化掃描時(shí)存在GMP氧化波動(dòng)證明了這種作用(圖3B)。GMP分子太大而不能擴(kuò)散通過該膜分解喪失Ru3+時(shí)產(chǎn)生的孔道。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)不存在GMP溶液時(shí)聚[Ru(vbpy)32+]膜被氧化,隨之在含有GMP的溶液中作第二次氧化掃描時(shí),觀察到與圖3A中第二次掃描相同的伏安曲線。單獨(dú)的觀察表明,將GMP溶液稀釋二個(gè)數(shù)量級(0.01mM)對第一次氧化掃描過程中產(chǎn)生的電流量只有很小一點(diǎn)作用。這種作用可以是由于帶正電荷的聚合物表面與陰離子GMP之間的靜電吸引所致。這樣可推測在電極表面形成了一個(gè)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于大量溶液的局部濃度。
      圖4中顯示使用擦去修飾的和聚[Ru(vbpy)32+]修飾的電極聚[G]氧化的循環(huán)伏安曲線曲,證明了二個(gè)可確定的特征。第一,在沒有聚[Ru(vbpy)32+]膜時(shí)不發(fā)生聚[G]的電化學(xué)氧化作用。由于這樣一種大聚合物對膜的緩慢擴(kuò)散(相對于循環(huán)伏安測量時(shí)標(biāo)),聚[G]的氧化作用不可檢測。但是,在存在聚[Ru(vbpy)32+]處理的電極時(shí),觀察到高于對聚[Ru(vbpy)32+]單獨(dú)氧化所看到的電流增加。同樣,陽離子聚合物表面的靜電吸引作用很可能促進(jìn)大聚[G]分子向電極表面擴(kuò)散,在此可發(fā)生Ru-介導(dǎo)的催化氧化作用。
      實(shí)施例7.對固定化探針的檢測。
      以溶于二氯甲烷的DCC取代EDC,應(yīng)用與含水酰胺化作用相同的方案,使氨基修飾的二茂鐵探針(CpFe(C5H4-C2H4NH2))附著于10次掃描的聚[Ru(vbpy)32+/vba]修飾電極(
      圖1B)。在此活化步驟之后隨之酰胺化此二茂鐵氨基基團(tuán)(圖5)。致使此二茂鐵分子固定化在電極表面。在0.1M TBAH乙腈溶液中,在0.2V觀察到可測量的電流,表示在此修飾電極表面存在Fe2+/Fe3+二茂鐵偶聯(lián)。
      將氨基連接的DNA探針固定化在電極表面(圖8中顯示的示意圖2)。在二個(gè)不同的pH值(6.5和9.0)進(jìn)行固定化反應(yīng),以便以二種明顯不同的方式化學(xué)吸附探針。在較高的pH,優(yōu)先在與DNA嘌呤和嘧啶環(huán)上任何天然內(nèi)源性胺基團(tuán)不同的,所附著的(CH2)6NH2基團(tuán)的一級胺發(fā)生酰胺化作用。對這些天然胺基團(tuán)的酰胺化將產(chǎn)生附著DNA的電極表面,不但附著在氨基連接的基團(tuán),而且附著在若干天然胺基團(tuán),也產(chǎn)生具有較少探針分子被“釘住”的表面(示意圖3)。應(yīng)用這種假設(shè),設(shè)想在pH9.0酰胺化將產(chǎn)生含有較大量固定化DNA探針鏈的膜,因?yàn)橹丿B將被最大化,并且天然胺基團(tuán)的酰胺化(或固定)將是最小。
      然后在二種pH氧化以DNA探針處理的膜,與僅僅膜氧化所產(chǎn)生的電流相比較。
      圖6中明顯可見,只是那些在pH6.5以DNA探針處理的膜產(chǎn)生了具有可測定催化增加量的電流。只有這些在pH6.5處理其中DNA探針的膜顯示出催化電流的增加(典型地觀察到8-13μA的增加量)。
      實(shí)施例8.對固定化探針的定量。
      根據(jù)電化學(xué)資料當(dāng)與僅僅氧化聚合物相比較,存在20聚體G探針時(shí)由聚[Ru(vbpy)32+/vba]膜產(chǎn)生的氧化電流催化增加量表明大約有10μl以上的電荷或10-10以上摩爾的電子(由伏安曲線積分值確定的)被轉(zhuǎn)移了。還應(yīng)用放射標(biāo)記的探針作為一種方法,定量測定在pH6.5和9.0化學(xué)吸附于GCE表面的DNA探針量。對在pH6.5和9.0以探針處理的表面作閃爍計(jì)數(shù)表明,分別已固定化了7.4×10-12摩爾和3.0×10-14摩爾的探針。通過將磷光成像屏用于檢測而進(jìn)行的單獨(dú)的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)支持了這些資料。應(yīng)用這種替代性的和更靈敏的技術(shù),在pH6.5和9.0對固定化DNA探針?biāo)玫降臄?shù)值是8.0×10-12和8.0×10-13mol。根據(jù)電化學(xué)測定,為了獲得10μC的催化增加量將需要氧化10-10摩爾鳥嘌呤。與放射標(biāo)記的資料相一致,這相當(dāng)于氧化固定化在表面的接近50%的鳥嘌呤堿基。
      實(shí)施例9.對雜交核酸的檢測。
      如在上面的實(shí)施例中,通過聚合Ru(bpy)32+和vba制備電聚合膜。借助于碳化二亞胺反應(yīng)使含有代替鳥嘌呤替代堿基的寡核苷酸探針附著于此膜。然后使此電極與含有靶標(biāo)核酸的溶液接觸,此靶標(biāo)核酸含有鳥嘌呤并與該固相化探針互補(bǔ)。雜交發(fā)生之后,以50mV/s的掃描速度從0至1.4V掃描,以循環(huán)伏安測量法對此電極進(jìn)行分析。其電化學(xué)電流明顯地大于沒有與互補(bǔ)的含鳥嘌呤序列雜交的電極電流。
      雖然參照特定的實(shí)施方案對本發(fā)明作了描述,但是應(yīng)該認(rèn)識到,還可能有許多變異形式和修改的實(shí)施方案,因此,所有的這些變異形式和修改的實(shí)施方案都將被認(rèn)為是屬于本發(fā)明的精髓和范圍之內(nèi)。
      權(quán)利要求
      1.一種用于電化學(xué)檢測核酸的電極,它包括一層薄膜,此薄膜含有能夠既起電聚合起始物作用又作為該核酸中預(yù)定堿基氧化介體的金屬復(fù)合體,以及該核酸可附著于它的功能化部分。
      2.權(quán)利要求1的電極,其中的金屬復(fù)合體選自聚[Ru(vbpy)32+]和聚[Ru(vbpy)32+/vba],其中vbpy是4-乙烯基-4’甲基-2,2’-二吡啶,vba是對-乙烯基苯甲酸。
      3.一種制備用于電化學(xué)檢測核酸的電極的方法,包括(a)在電極上電聚合一種膜,該膜包含介體與具有羧化物基團(tuán)的功能化部分的共聚合物;以及(b)使一種寡核苷酸探針共價(jià)地附著于此膜上。
      4.權(quán)利要求3的方法,其中是通過碳化二亞胺反應(yīng),并隨后酰胺化氨基連接的單鏈DNA而使該寡核苷酸探針附著。
      5.權(quán)利要求3的方法,其中的介體是Ru(vbpy)32+,而功能化部分是對-乙烯基苯甲酸。
      6.一種用于電化學(xué)檢測核酸中預(yù)定堿基的電極,該電極包括(a)一種具有導(dǎo)電工作表面的基體;以及(b)一種在該導(dǎo)電工作表面的電聚合膜,該電聚合膜包含一種介體與具有羧化物基團(tuán)的功能化部分的共聚合物。
      7.權(quán)利要求6的電極,其中的介體是Ru(vbpy)32+,而功能化部分是對-乙烯基苯甲酸。
      8.一種測定樣品中存在某一靶標(biāo)核酸的方法,包括(a)使包含介體與具有羧化物基團(tuán)的功能化部分的共聚合物的電聚合膜同樣品和寡核苷酸探針接觸,此樣品懷疑含有靶標(biāo)核酸,以致使此核酸與此寡核苷酸探針在膜上形成雜交的核酸;(b)檢測其氧化-還原反應(yīng);以及(c)根據(jù)所檢測的氧化-還原反應(yīng)確定是否存在這種核酸。
      全文摘要
      一種電極和通過在電極的導(dǎo)電工作表面電聚合一種膜而制備這種電極的方法。通過還原性電聚合聚[Ru(vbpy)
      文檔編號C12Q1/68GK1343260SQ00804705
      公開日2002年4月3日 申請日期2000年2月4日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月12日
      發(fā)明者H·H·托普, A·C·安特科 申請人:教堂山北卡羅萊納州大學(xué)
      網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
      • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點(diǎn)贊!
      1