專利名稱：細(xì)胞內(nèi)的基因分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明與用分子信標(biāo)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的基因的方法有關(guān)。
細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)狀況決定生命活動(dòng)的本質(zhì)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)水平監(jiān)測(cè)對(duì)于了解基因結(jié)構(gòu)功能、疾病發(fā)病原因以及理解與生命活動(dòng)相關(guān)的一切現(xiàn)象具有非常重要的意義。目前，還沒(méi)有一個(gè)準(zhǔn)確實(shí)用的細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)水平分析、監(jiān)測(cè)技術(shù)。已知的細(xì)胞基因分析技術(shù)、分析方法有Fisher技術(shù)采用簡(jiǎn)單的熒光標(biāo)記分子探針，通過(guò)直接滲透進(jìn)入細(xì)胞中，進(jìn)行簡(jiǎn)單的基因及定位分析。該方法必須把沒(méi)有雜交的分子探針洗出來(lái)，再進(jìn)行分析。其技術(shù)操作難度大，影響了該技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用。傳統(tǒng)基因分析及診斷方法采用PCR基因擴(kuò)增技術(shù)，由于基因片段極度擴(kuò)增使檢測(cè)結(jié)果容易出現(xiàn)假性結(jié)果即臨床診斷的假陽(yáng)性，且操作過(guò)程復(fù)雜、周期長(zhǎng)。由于在體外進(jìn)行分析，因此不能代表最真實(shí)的基因表達(dá)狀態(tài)。
分子信標(biāo)是九十年代末期發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)，它的發(fā)明單位是紐約市公共健康研究所(PHRI)，它主要用于PCR的定量分析。1998年D.L.Sokol等曾報(bào)道，將分子信標(biāo)用于證明互補(bǔ)寡核苷酸與細(xì)胞內(nèi)的mRNA雜交情況。分子信標(biāo)是在長(zhǎng)度為10-30mer寡核苷酸探針的5′-及3′-端分別加上5-10mer序列互補(bǔ)的莖桿區(qū)，然后再在5′-及3′-端分別連接一個(gè)發(fā)色基團(tuán)(F)、一個(gè)淬滅基團(tuán)(Q)。在自由狀態(tài)時(shí)由于莖桿區(qū)的互補(bǔ)序列的雜交結(jié)合使探針?lè)肿有纬砂l(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，連接兩端的(F)與(Q)互相靠近，能量傳遞效率達(dá)100％，熒光幾乎被全部淬滅，而當(dāng)分子信標(biāo)與靶基因的互補(bǔ)區(qū)雜交形成雙螺旋結(jié)構(gòu)時(shí)，5′-與3′-的莖桿區(qū)被拉開，(F)與(Q)距離增大，熒光恢復(fù)。具有天然寡核苷酸鏈的分子信標(biāo)進(jìn)入細(xì)胞后，很快被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶水解破壞。
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡(jiǎn)便、靈敏、精確，可同時(shí)檢測(cè)多種基因、點(diǎn)突變及缺失，可對(duì)不同活細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)水平狀態(tài)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，適用范圍廣的細(xì)胞內(nèi)基因的檢測(cè)方法。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的一種細(xì)胞內(nèi)基因分析方法，包括如下步驟1、選擇單個(gè)活體細(xì)胞作為檢測(cè)對(duì)象，2、選擇待測(cè)基因，3、分子信標(biāo)的設(shè)計(jì)采用結(jié)構(gòu)修飾的分子信標(biāo)以及不同發(fā)色基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記，4、采用顯微注射將分子信標(biāo)注入活體細(xì)胞，5、使分子信標(biāo)與待測(cè)基因進(jìn)行有效雜交，
6、采用激光共聚焦顯微技術(shù)進(jìn)行分析。
本發(fā)明的分子信標(biāo)是在長(zhǎng)度為10-30mer寡核苷酸探針的5′-及3′-端分別加上5-10mer序列互補(bǔ)的莖桿區(qū)，然后再在5′-及3′-端分別連接兩個(gè)發(fā)色基團(tuán)(F)或一個(gè)發(fā)色基團(tuán)(F)、一個(gè)淬滅基團(tuán)(Q)，分子信標(biāo)可采用不同的發(fā)色基團(tuán)。
本發(fā)明的發(fā)色基團(tuán)可為目前廣泛應(yīng)用于基因及蛋白質(zhì)標(biāo)記的熒光發(fā)色基團(tuán)，包括1-氨基萘-8-羧酸或6-羥基熒光黃或四氯熒光黃或吲哚二羧菁俄勒岡綠488X或得克薩斯紅-X或熒光素或羅丹明或得克薩斯紅或芘等。
本發(fā)明對(duì)分子信標(biāo)的核糖及三磷酸骨架的結(jié)構(gòu)修飾如下 X=O或S或CH2R1=H、R2=H或OCH3或OCH2CH3或OCH(CH3)2或O(CH2)nCH3(n=0,1,2,3,---30)OCH2-CH=CH2或OCH2-CH=CH-CH3或OCH2-CH=CH-(CH2)nCH3(n=0,1,---30)OCH2-C6H5或F或Cl或Br或IR2=H、R1=H或OCH3或OCH2CH3或OCH(CH3)2或O(CH2)nCH3(n=0,1,2,3,---30)OCH2-CH=CH2或OCH2-CH=CH-CH3或OCH2-CH=CH-(CH2)nCH3(n=0,1,---30)OCH2-C6H5或F或Cl或Br或IR3=OH或O-M+，其中M+為各種有機(jī)及無(wú)機(jī)陽(yáng)離子，SH或S-M+，其中，M+為各種有機(jī)及無(wú)機(jī)陽(yáng)離子或CH3或OCH3或OCH2C6H5B=DNA或RNA中天然存在的嘌呤類及嘧啶類堿基或腺嘌呤或鳥嘌呤或胞嘧啶或尿嘧啶或胸腺嘧啶或結(jié)構(gòu)修飾的堿基。
本發(fā)明可在同一細(xì)胞內(nèi)顯微注射采用不同發(fā)色基團(tuán)的多種分子信標(biāo)，同時(shí)分析多種基因、點(diǎn)突變及缺失。
一種細(xì)胞內(nèi)基因分析方法，包括如下步驟1、將組織培養(yǎng)液或新鮮組織進(jìn)行消化、剪碎、離心得細(xì)胞懸液，2、設(shè)計(jì)合成分子信標(biāo)，3、將分子信標(biāo)加入細(xì)胞懸液雜交染色，4、將細(xì)胞懸液上流式細(xì)胞儀分選，5、對(duì)分選液進(jìn)行單細(xì)胞共聚焦分析。
分子信標(biāo)是在長(zhǎng)度為10-30mer寡核苷酸探針的5′-及3′-端分別加上5-10mer序列互補(bǔ)的莖桿區(qū)，然后再在5′-及3′-端分別連接兩個(gè)發(fā)色基團(tuán)(F)或一個(gè)發(fā)色基團(tuán)(F)、一個(gè)淬滅基團(tuán)(Q)，分子信標(biāo)可采用不同的發(fā)色基團(tuán)。
發(fā)色基團(tuán)可為目前廣泛應(yīng)用于基因及蛋白質(zhì)標(biāo)記的熒光發(fā)色基團(tuán)，包括1-氨基萘-8-羧酸或6-羥基熒光黃或四氯熒光黃或吲哚二羧菁俄勒岡綠488X或得克薩斯紅-X或熒光素或羅丹明或得克薩斯紅或芘等。
對(duì)分子信標(biāo)的核糖及三磷酸骨架的結(jié)構(gòu)修飾如下 X=O或S或CH2R1=H、R2=H或OCH3或OCH2CH3或OCH(CH3)2或O(CH2)nCH3(n=0,1,2,3,---30)OCH2-CH=CH2或OCH2-CH=CH-CH3或OCH2-CH=CH-(CH2)nCH3(n=0,1,---30)OCH2-C6H5或F或Cl或Br或IR2=H、R1=H或OCH3或OCH2CH3或OCH(CH3)2或O(CH2)nCH3(n=0,1,2,3,---30)OCH2-CH=CH2或OCH2-CH=CH-CH3或OCH2-CH=CH-(CH2)nCH3(n=0,1,---30)OCH2-C6H5或F或Cl或Br或IR3=OH或O-M+，其中，M+為各種有機(jī)及無(wú)機(jī)陽(yáng)離子或SH或S-M+，其中M+為各種有機(jī)及無(wú)機(jī)陽(yáng)離子或CH3或OCH3或OCH2C6H5B=DNA或RNA中天然存在的嘌呤類及嘧啶類堿基或腺嘌呤或鳥嘌呤或胞嘧啶或尿嘧啶或胸腺嘧啶或結(jié)構(gòu)修飾的堿基。與已知方法比較本發(fā)明有以下特點(diǎn)1、采用顯微注射將分子信標(biāo)注入活細(xì)胞，直接進(jìn)行原位雜交，不需將未雜交的樣品洗滌出細(xì)胞，簡(jiǎn)化了操作的難度。
2、在長(zhǎng)度為10-30mer寡核苷酸探針的5′-及3′-端分別加上5-10mer序列互補(bǔ)的莖桿區(qū)，然后再在5′-及3′-端分別連接兩個(gè)發(fā)色基團(tuán)(F)或一個(gè)發(fā)色基團(tuán)(F)、一個(gè)淬滅基團(tuán)(Q)。在自由狀態(tài)時(shí)由于莖桿區(qū)的互補(bǔ)序列的雜交結(jié)合使探針?lè)肿有纬砂l(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，連接兩端的(F)與(F)或(F)與(Q)互相靠近，由于共振能量轉(zhuǎn)移，熒光分子與熒光分子間能量轉(zhuǎn)移，發(fā)射光波長(zhǎng)發(fā)生變化，如芘與芘靠近，發(fā)射波長(zhǎng)由398nm→490nm，熒光分子與淬滅分子靠近時(shí)，能量傳遞效率達(dá)100％，熒光幾乎被全部淬滅，而當(dāng)分子信標(biāo)與靶基因或DNA或RNA的互補(bǔ)區(qū)雜交形成雙螺旋結(jié)構(gòu)時(shí)，5′-與3′-的莖桿區(qū)被拉開，(F)與(F)或(F)與(Q)距離增大，熒光恢復(fù)。
3、對(duì)脫氧核糖及三磷酸骨架進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾后，分子信標(biāo)能耐核酸酶的水解，避免了分子信標(biāo)進(jìn)入細(xì)胞后被核酸酶水解而自行發(fā)出熒光，使檢測(cè)方法靈敏，背景噪音小，延長(zhǎng)了分析時(shí)間，可實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞內(nèi)的基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及表達(dá)的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)分析。
4、采用不同的發(fā)色基團(tuán)同時(shí)分析多種基因、點(diǎn)突變及缺失。
5、可在同一細(xì)胞內(nèi)同時(shí)進(jìn)行多種基因、點(diǎn)突變及缺失分析，消除了在不同細(xì)胞內(nèi)分析所帶來(lái)的誤差。
6、可對(duì)活細(xì)胞內(nèi)的mRNA進(jìn)行定性、定量分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同活細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)水平、狀態(tài)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。
7、應(yīng)用于分子生物學(xué)研究、臨床診斷及藥物篩選。
如下是本發(fā)明的附圖


圖1為分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)圖，自由狀態(tài)下的發(fā)夾型結(jié)構(gòu)。
圖2為分子信標(biāo)工作原理圖。
圖3、4、5為分子信標(biāo)的骨架結(jié)構(gòu)圖。
圖6為細(xì)胞內(nèi)DNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯示意圖。
圖7分子信標(biāo)用于基因表達(dá)水平及瞬間存在的mRNA的分析流程圖。
圖8為分子信標(biāo)用于基因點(diǎn)突變分析流程圖。
圖9為分子信標(biāo)用于正常組織細(xì)胞和病變組織細(xì)胞的檢測(cè)圖。
圖10為細(xì)胞群染色及分離解析圖。
如下是
具體實(shí)施例方式1．分子信標(biāo)用于基因表達(dá)水平及瞬間存在的mRNA的分析分子信標(biāo)的合成在長(zhǎng)度為10-30mer寡核苷酸探針的5′-及3′-端分別加上5-10mer序列互補(bǔ)的莖桿區(qū)，然后再在5′-及3′-端分別連接兩個(gè)熒光基團(tuán)(F)或一個(gè)熒光基團(tuán)(F)、一個(gè)淬滅基團(tuán)(Q)。發(fā)色基團(tuán)有熒光素或羅丹明或[5-(2｀-氨乙基)氨基萘烯-1-磺酸]等，熒光淬滅基團(tuán)有[4-(4｀-二甲氨基苯偶氮基)苯甲酸]等。熒光分子與淬滅分子靠近時(shí)，能量傳遞效率達(dá)100％，熒光幾乎被全部淬滅。而當(dāng)分子信標(biāo)與靶基因(DNA及RNA)的互補(bǔ)區(qū)雜交形成雙螺旋結(jié)構(gòu)時(shí)，5′-與3′-的莖桿區(qū)被拉開，(F)與(F)或(F)與(Q)距離增大，熒光恢復(fù)。
顯微注射細(xì)胞高速離心5-40min后，移到載物片上，加入細(xì)胞介質(zhì)確保細(xì)胞的存活。將分子信標(biāo)經(jīng)顯微注射入細(xì)胞內(nèi)。每個(gè)細(xì)胞顯微注射大約2-200pl的分子信標(biāo)。
記錄熒光光譜用熒光計(jì)在不同發(fā)光基團(tuán)的特定激發(fā)波長(zhǎng)處激發(fā)發(fā)色基團(tuán)后，記錄發(fā)射光光譜，結(jié)果能與細(xì)胞內(nèi)存在的DNA或RNA發(fā)生雜交的分子信標(biāo)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，使熒光發(fā)色團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)之間的距離加大，產(chǎn)生熒光。而不能發(fā)生雜交的分子信標(biāo)則不產(chǎn)生熒光。
2待測(cè)基因點(diǎn)突變分析分子信標(biāo)的合成在長(zhǎng)度為10-30mer寡核苷酸探針的5′-及3′-端分別加上5-10mer序列互補(bǔ)的莖桿區(qū)，然后再在5′-及3′-端分別連接兩個(gè)熒光發(fā)色基團(tuán)(F)或一個(gè)熒光發(fā)色基團(tuán)(F)、一個(gè)淬滅基團(tuán)(Q)。發(fā)色基團(tuán)有熒光素、羅丹明、[5-(2｀-氨乙基)氨基萘烯-1-磺酸等，熒光淬滅基團(tuán)有[4-(4｀-二甲氨基苯偶氮基)苯甲酸等。熒光分子與淬滅分子靠近時(shí)，能量傳遞效率達(dá)100％，熒光幾乎被全部淬滅。而當(dāng)分子信標(biāo)與靶基因(DNA及RNA)的互補(bǔ)區(qū)雜交形成雙螺旋結(jié)構(gòu)時(shí)，5′-與3′-的莖桿區(qū)被拉開，(F)與(F)或(F)與(Q)距離增大，熒光恢復(fù)。每個(gè)分子信標(biāo)的探針區(qū)中的一個(gè)堿基分別用A、T、G、C取代，其余的堿基序列全部相同，并使用四種不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記四個(gè)分子信標(biāo)，淬滅基團(tuán)相同。
顯微注射細(xì)胞高速離心5-40min后，移到載物片上，加入細(xì)胞介質(zhì)確保細(xì)胞的存活。將分子信標(biāo)經(jīng)顯微注射入細(xì)胞內(nèi)。每個(gè)細(xì)胞顯微注射大約20-200pl的分子信標(biāo)，記錄熒光光譜用熒光計(jì)在不同發(fā)色基團(tuán)的特定激發(fā)波長(zhǎng)處激發(fā)發(fā)色基團(tuán)后，記錄發(fā)射光光譜，結(jié)果，與細(xì)胞內(nèi)存在的DNA或RNA的堿基序列完全互補(bǔ)發(fā)生雜交的分子信標(biāo)發(fā)出的熒光強(qiáng)度最大，而其中有一個(gè)堿基不能互補(bǔ)的分子信標(biāo)由于發(fā)色基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的距離相對(duì)較近，熒光強(qiáng)度相對(duì)較弱。從而可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的點(diǎn)突變。升高溫度，再觀察熒光光譜，發(fā)現(xiàn)只有完全互補(bǔ)的一條分子信標(biāo)可觀察到熒光光譜，與溫度升高前相比，熒光強(qiáng)度更強(qiáng)，而不能完全互補(bǔ)的分子信標(biāo)的熒光消失。
3．分子信標(biāo)用于正常組織細(xì)胞和病變組織細(xì)胞的檢測(cè)分子信標(biāo)的合成在長(zhǎng)度為10-30mer寡核苷酸探針的5′-及3′-端分別加上5-10mer序列互補(bǔ)的莖桿區(qū)，然后再在5′-及3′-端分別連接一個(gè)發(fā)光基團(tuán)(F)和一個(gè)淬滅基團(tuán)(Q)。在自由狀態(tài)時(shí)由于莖桿區(qū)的互補(bǔ)序列的雜交結(jié)合使探針?lè)肿有纬砂l(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，連接兩端的(F)與(Q)互相靠近，由于共振能量轉(zhuǎn)移，能量傳遞效率達(dá)100％，熒光幾乎被全部淬滅，而當(dāng)分子信標(biāo)與靶基因(DNA及RNA)的互補(bǔ)區(qū)雜交形成雙螺旋結(jié)構(gòu)時(shí)，5′-與3′-的莖桿區(qū)被拉開，(F)與(Q)距離增大，熒光恢復(fù)。
顯微注射細(xì)胞高速離心5-40min后，載物片上，加入細(xì)胞介質(zhì)確保細(xì)胞的存活。將分子信標(biāo)經(jīng)顯微注射入細(xì)胞內(nèi)。每個(gè)細(xì)胞顯微注射大約10-100pl的分子信標(biāo)，并在10分鐘內(nèi)完成100-200次的顯微注射，載物片于紫外燈光下迅速暴露50秒。
記錄熒光光譜用熒光計(jì)激發(fā)不同的發(fā)色基團(tuán)后，記錄熒光光譜。分子信標(biāo)由于能與正常細(xì)胞完全互補(bǔ)而發(fā)出熒光，病變細(xì)胞由于不能與分子信標(biāo)完全互補(bǔ)，發(fā)出的熒光強(qiáng)度要弱，而且隨著時(shí)間的推移，其強(qiáng)度越來(lái)越弱，最后直至消失。
4．細(xì)胞株TK-ts13、K562人體leukemia cell內(nèi)的基因檢測(cè)分子信標(biāo)的設(shè)計(jì)
用熒光素作為5′一熒光發(fā)色團(tuán)，[4-(4｀-二甲氨基苯偶氮基)苯甲酸[4-(4′-二甲氨基苯偶氮基)苯甲酸]作為3′-熒光淬滅基團(tuán)?！爸鞲伞苯Y(jié)構(gòu)用互補(bǔ)的5′(GCGAG)和5′(CTCGC)寡核苷酸組成。發(fā)夾序列如下vav互補(bǔ)分子信標(biāo)序列，5′-GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGA-3′；β-actin互補(bǔ)分子信標(biāo)序列，5′-CGCGGCGATATCATCACATCCATAAC-3′；vav同序寡核苷酸對(duì)照，5′-TCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAAC-3′；β-actin同序寡核苷酸對(duì)照，5′-GTTATGGATGATGATATCGCCGCG-3′；vav不匹配寡核苷酸對(duì)照，5′-GTTCTTAAGGGTGTCGAACTGGGA-3′；β-actin不匹配寡核苷酸對(duì)照，5′-CGCGGCGATACCTACATCCATAAC-3′。其中，所有序列的核苷分為兩類，一類完全由天然的脫氧核苷構(gòu)成，另一類的脫氧核苷的脫氧核糖上2-位的H由OCH3取代，進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，使其耐核酸酶的水解。
分子信標(biāo)的合成采用DNA合成儀和市售的亞磷酰胺；dA-CE亞磷酰胺，dG-CE亞磷酰胺，dC-CE亞磷酰胺，T-CE亞磷酰胺，rA 2｀-氧甲基亞磷酰胺，rG 2｀-氧甲基亞磷酰胺，rC 2｀-氧甲基亞磷酰胺，rU 2｀-氧甲基亞磷酰胺，熒光素-CE亞磷酰胺，[4-(4｀-二甲氨基苯偶氮基)苯甲酸CPG，合成的分子信標(biāo)采用高壓液相色譜或聚丙烯酰胺凝膠電泳純化。
雜交形成的熒光檢測(cè)互補(bǔ)或?qū)φ辗肿有艠?biāo)(最終濃度150-200nM)溶于分子信標(biāo)緩沖液(100nMTris,HCl,pH8/1mM MgCl2)中，加入過(guò)量的互補(bǔ)靶寡脫氧核苷(20-30μM)。用Hitachi/perkin-Elmer MPF4熒光檢測(cè)器檢測(cè)熒光，對(duì)照組由不互補(bǔ)的2個(gè)堿基對(duì)，同序發(fā)夾序列組成。熒光素的激發(fā)波長(zhǎng)為494nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為525nm。用熒光計(jì)在494nm處激發(fā)后，記錄500nm-570nm處的光譜。加入互補(bǔ)靶脫氧核苷序列后測(cè)定每個(gè)分子信標(biāo)的熒光強(qiáng)度而分子信標(biāo)緩沖液作為對(duì)照的背景熒光密度忽略不計(jì)。結(jié)果vav互補(bǔ)分子信標(biāo)與vav同序寡核苷酸對(duì)照、β-actin互補(bǔ)分子信標(biāo)與β-actin同序寡核苷酸雜交，產(chǎn)生了熒光。對(duì)于vav靶寡脫氧核苷/分子信標(biāo)雜交后產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度是背景熒光強(qiáng)度的30倍，而β-actin/分子信標(biāo)形成雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)出的熒光強(qiáng)度是背景熒光強(qiáng)度的15倍。這種熒光強(qiáng)度的差異可能與具體序列及分子內(nèi)的重疊方式和/或分子信標(biāo)雜交順序的性質(zhì)而造成的。但是對(duì)于同一序列的分子信標(biāo)，由結(jié)構(gòu)修飾的核苷構(gòu)成的比用天然核苷構(gòu)成的分子信標(biāo)發(fā)生雜交時(shí)發(fā)出的熒光強(qiáng)度更強(qiáng)。
電泳分析含有互補(bǔ)分子信標(biāo)/同序寡核苷酸雙螺旋體和對(duì)照分子信標(biāo)的樣品在濃度為8％的變性的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分析，在70V的電子透入樣品1.5小時(shí)后，凝膠浸入50μg/ml的溴化乙錠溶液中，在紫外光盒中檢查，與凝膠上未雙螺旋的物質(zhì)相比，這些形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的物質(zhì)的流動(dòng)性減慢。
DNase反應(yīng)含有未雜交的分子信標(biāo)的樣品在37℃下平衡，然后在DNase Ⅰ緩沖液(400mMTris-HCl pH7.4/100nM；NaCl/60nM；MgCl2/100mM；CaCl2)中加入5μl的DNaseⅠ，用上述的熒光計(jì)通過(guò)熒光掃描記錄溶液中熒光的發(fā)射。由天然脫氧核苷酸組成的vav互補(bǔ)分子信標(biāo)和β-actin互補(bǔ)分子信標(biāo)分別與vav同序寡核苷酸對(duì)照、β-actin同序寡核苷酸雜交，產(chǎn)生了熒光。而vav互補(bǔ)分子信標(biāo)和β-actin互補(bǔ)分子信標(biāo)分別由于不能與vav不匹配寡核苷酸對(duì)照和β-actin不匹配寡核苷酸對(duì)照發(fā)生雜交，而沒(méi)有熒光產(chǎn)生。45分鐘后，在核酸酶的作用下，由天然脫氧核苷酸組成的分子信標(biāo)全部發(fā)生水解，所有的由天然脫氧核苷酸組成的分子信標(biāo)全部發(fā)出熒光。但是由經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾的脫氧核苷組成的vav互補(bǔ)分子信標(biāo)和β-actin互補(bǔ)分子信標(biāo)分別與vav同序寡核苷酸對(duì)照、β-actin同序寡核苷酸雜交，產(chǎn)生了熒光。而vav互補(bǔ)分子信標(biāo)和β-actin互補(bǔ)分子信標(biāo)分別由于不能與vav不匹配寡核苷酸對(duì)照和β-actin寡核苷酸不匹配對(duì)照發(fā)生雜交，而沒(méi)有熒光產(chǎn)生。在45分鐘-10小時(shí)后，由于經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾的核苷耐核酸酶的水解，這一結(jié)果仍沒(méi)改變。
分子信標(biāo)的顯微注射和雙螺旋的形成K562leukemia細(xì)胞以300rpm的速度離心10min，移到載物片上。有10％牛肉朊的PRMI1640介質(zhì)加入環(huán)中以確保細(xì)胞的存活。每個(gè)細(xì)胞顯微注射大約10-100pl的信標(biāo)，并在10分鐘內(nèi)完成100-200次顯微注射，載物片于紫外光下迅速暴露50秒，捕捉圖象，用系列圖象分析軟件測(cè)熒光水平。
共聚焦掃描顯微鏡用帶有共聚焦掃描儀的顯微鏡檢測(cè)熒光發(fā)射，這種顯微鏡配有寬范圍的UV棱鏡，能激發(fā)351nm波長(zhǎng)的光，為了優(yōu)化UV熒光發(fā)射，440-40長(zhǎng)范圍的過(guò)濾器安裝于通道1，超過(guò)450的過(guò)濾器安裝于通道2。觀察熒光強(qiáng)度。
結(jié)論當(dāng)分子信標(biāo)置于靶寡脫氧核苷中時(shí)，它們發(fā)生雜交，分子信標(biāo)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，使熒光發(fā)色團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)之間的距離加大，產(chǎn)生熒光。而不能發(fā)生雜交的分子信標(biāo)則不產(chǎn)生熒光。由經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾的核苷構(gòu)成的分子信標(biāo)的熒光發(fā)光強(qiáng)度比天然核苷構(gòu)成的分子信標(biāo)的發(fā)光強(qiáng)度大。從電泳分析上可發(fā)現(xiàn)分子信標(biāo)與靶寡核苷酸發(fā)生雜交形成雙螺旋結(jié)構(gòu)后在凝膠上的流動(dòng)性相對(duì)于沒(méi)形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的寡核苷酸鏈的流動(dòng)性減慢。天然核苷構(gòu)成的分子信標(biāo)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)45分鐘后由于被核酸酶水解成片段，使分子信標(biāo)的熒光發(fā)色團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)之間的距離加大而全部發(fā)出熒光，而經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾的核苷由于耐核酸酶的水解作用，不能發(fā)生雜交的分子信標(biāo)由于發(fā)色基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的距離仍保持很近，不能發(fā)出熒光。能發(fā)生雜交的分子信標(biāo)由于發(fā)色基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的距離增加，分子信標(biāo)的發(fā)夾型打開，使熒光發(fā)色團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)之間的距離加大，產(chǎn)生熒光，從而檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)的待測(cè)基因。
5、細(xì)胞群染色及分離解析細(xì)胞懸液將組織培養(yǎng)液或新鮮組織進(jìn)行消化、剪碎、離心。
分子信標(biāo)的合成在長(zhǎng)度為10-30mer寡核苷酸探針的5′-及3′-端分別加上5-10mer序列互補(bǔ)的莖桿區(qū)，然后再在5′-及3′-端分別連接兩個(gè)熒光基團(tuán)(F)或一個(gè)熒光基團(tuán)(F)、一個(gè)淬滅基團(tuán)(Q)。發(fā)色基團(tuán)有熒光素、羅丹明、[5-(2｀-氨乙基)氨基萘烯-1-磺酸等，熒光淬滅基團(tuán)有[4-(4｀-二甲氨基苯偶氮基)苯甲酸等。熒光分子與淬滅分子靠近時(shí)，能量傳遞效率達(dá)100％，熒光幾乎被全部淬滅。而當(dāng)分子信標(biāo)與靶基因或DNA或RNA的互補(bǔ)區(qū)雜交形成雙螺旋結(jié)構(gòu)時(shí)，5′-與3′-的莖桿區(qū)被拉開，(F)與(F)或(F)與(Q)距離增大，熒光恢復(fù)。將分子信標(biāo)加入細(xì)胞懸液中進(jìn)行染色，離心洗滌后上流式細(xì)胞液進(jìn)行分選。
最后進(jìn)行單細(xì)胞激光共聚焦顯微技術(shù)分析。
權(quán)利要求
1．一種細(xì)胞內(nèi)基因分析方法，包括如下步驟(1)、采用天然或結(jié)構(gòu)修飾的分子信標(biāo)或?qū)⑻烊换蚪Y(jié)構(gòu)修飾的分子信標(biāo)用不同發(fā)色基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記，(2)、采用顯微注射將設(shè)計(jì)的分子信標(biāo)注入活體細(xì)胞或?qū)⒎肿有艠?biāo)加入細(xì)胞懸浮液雜交染色，(3)、使分子信標(biāo)與待測(cè)基因進(jìn)行有效雜交，(4)、采用激光共聚焦顯微技術(shù)進(jìn)行分析。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，包括如下步驟(1)、選擇單個(gè)活體細(xì)胞作為檢測(cè)對(duì)象，(2)、選擇待測(cè)基因，(3)、分子信標(biāo)的設(shè)計(jì)采用天然或結(jié)構(gòu)修飾的分子信標(biāo)或?qū)⑻烊换蚪Y(jié)構(gòu)修飾的分子信標(biāo)用不同發(fā)色基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記，(4)、采用顯微注射將設(shè)計(jì)的分子信標(biāo)注入活體細(xì)胞，(5)、使分子信標(biāo)與待測(cè)基因進(jìn)行有效雜交，(6)、采用激光共聚焦顯微技術(shù)進(jìn)行分析。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于分子信標(biāo)的設(shè)計(jì)是將結(jié)構(gòu)修飾的分子信標(biāo)用不同發(fā)色基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記。
4．根據(jù)權(quán)利要求1或者所述的方法，其特征在于分子信標(biāo)是在長(zhǎng)度為10-30mer寡核苷酸探針的5′-及3′-端分別加上5-10mer序列互補(bǔ)的莖桿區(qū)，然后再在5′-及3′-端分別連接兩個(gè)發(fā)色基團(tuán)(F)或一個(gè)發(fā)色基團(tuán)(F)、一個(gè)淬滅基團(tuán)(Q)，分子信標(biāo)可采用不同的發(fā)色基團(tuán)。
5．根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于發(fā)色基團(tuán)可為目前廣泛應(yīng)用于基因及蛋白質(zhì)標(biāo)記的熒光發(fā)色基團(tuán)，包括1-氨基萘-8-羧酸或6-羥基熒光黃或四氯熒光黃或吲哚二羧菁俄勒岡綠488X或得克薩斯紅-X或熒光素或羅丹明或得克薩斯紅或芘等。
6．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于對(duì)分子信標(biāo)的核糖及三磷酸骨架的結(jié)構(gòu)修飾如下 X=O或S或CH2R1=H、R2=H或OCH3或OCH2CH3或OCH(CH3)2或O(CH2)nCH3(n=0,1,2,3,---30)OCH2-CH=CH2或OCH2-CH=CH-CH3或OCH2-CH=CH-(CH2)nCH3(n=0,1,---30)OCH2-C6H5或F或Cl或Br或IR2=H、R1=H或OCH3或OCH2CH3或OCH(CH3)2或O(CH2)nCH3(n=0,1,2,3,---30)OCH2-CH=CH2或OCH2-CH=CH-CH3或OCH2-CH=CH-(CH2)nCH3(n=0,1,---30)OCH2-C6H5或F或Cl或Br或IR3=OH或O-M+，其中M+為各種有機(jī)及無(wú)機(jī)陽(yáng)離子，SH或S-M+，其中，M+為各種有機(jī)及無(wú)機(jī)陽(yáng)離子或CH3或OCH3或OCH2C6H5B=DNA或RNA中天然存在的嘌呤類及嘧啶類堿基或腺嘌呤或鳥嘌呤或胞嘧啶或尿嘧啶或胸腺嘧啶或結(jié)構(gòu)修飾的堿基。
7．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于在同一細(xì)胞內(nèi)顯微注射采用不同發(fā)色基團(tuán)的多種分子信標(biāo)，同時(shí)分析多種基因、點(diǎn)突變及缺失。
8．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，包括如下步驟1、將組織培養(yǎng)液或新鮮組織進(jìn)行消化、剪碎、離心得細(xì)胞懸液，2、設(shè)計(jì)合成分子信標(biāo)，3、將分子信標(biāo)加入細(xì)胞懸液雜交染色，4、將細(xì)胞懸液上流式細(xì)胞儀分選，5、對(duì)分選液進(jìn)行單細(xì)胞共聚焦分析。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于分子信標(biāo)是在長(zhǎng)度為10-30mer寡核苷酸探針的5′-及3′-端分別加上5-10mer序列互補(bǔ)的莖桿區(qū)，然后再在5′-及3′-端分別連接兩個(gè)發(fā)色基團(tuán)(F)或一個(gè)發(fā)色基團(tuán)(F)、一個(gè)淬滅基團(tuán)(Q)，分子信標(biāo)可采用不同的發(fā)色基團(tuán)。
10．根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于發(fā)色基團(tuán)可為目前廣泛應(yīng)用于基因及蛋白質(zhì)標(biāo)記的熒光發(fā)色基團(tuán)，包括1-氨基萘-8-羧酸或6-羥基熒光黃或四氯熒光黃或吲哚二羧菁俄勒岡綠488X或得克薩斯紅-X或熒光素或羅丹明或得克薩斯紅或芘等。
11．根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于對(duì)分子信標(biāo)的三磷酸骨架的結(jié)構(gòu)修飾 X=O或S或CH2R1=H、R2=H或OCH3或OCH2CH3或OCH(CH3)2或O(CH2)nCH3(n=0,1,2,3,---30)OCH2-CH=CH2或OCH2-CH=CH-CH3或OCH2-CH=CH-(CH2)nCH3(n=0,1,---30)OCH2-C6H5或F或Cl或Br或IR2=H、R1=H或OCH3或OCH2CH3或OCH(CH3)2或O(CH2)nCH3(n=0,1,2,3,---30)OCH2-CH=CH2或OCH2-CH=CH-CH3或OCH2-CH=CH-(CH2)nCH3(n=0,1,---30)OCH2-C6H5或F或Cl或Br或IR3=OH或O-M+，其中，M+為各種有機(jī)及無(wú)機(jī)陽(yáng)離子或SH或S-M+，其中M+為各種有機(jī)及無(wú)機(jī)陽(yáng)離子或CH3或OCH3或OCH2C6H5B=DNA或RNA中天然存在的嘌呤類及嘧啶類堿基或腺嘌呤或鳥嘌呤或胞嘧啶或尿嘧啶或胸腺嘧啶或結(jié)構(gòu)修飾的堿基。
全文摘要
本發(fā)明為一種細(xì)胞內(nèi)基因分析方法,包括如下步驟:(1)、采用天然或結(jié)構(gòu)修飾的分子信標(biāo)或?qū)⑻烊换蚪Y(jié)構(gòu)修飾的分子信標(biāo)用不同發(fā)色基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記,(2)、采用顯微注射將設(shè)計(jì)的分子信標(biāo)注入活體細(xì)胞或?qū)⒎肿有艠?biāo)加入細(xì)胞懸浮液雜交染色,(3)、使分子信標(biāo)與待測(cè)基因進(jìn)行有效雜交,(4)、采用激光共聚焦顯微技術(shù)進(jìn)行分析。操作簡(jiǎn)便、靈敏、精確,可同時(shí)檢測(cè)多種基因、點(diǎn)突變及缺失,可對(duì)不同活細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)水平狀態(tài)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),適用范圍廣。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1308135SQ01107109
公開日2001年8月15日 申請(qǐng)日期2001年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月12日
發(fā)明者陳耀明, 江云, 明新, 許京軍 申請(qǐng)人:成都國(guó)嘉制藥有限責(zé)任公司