專利名稱：基因?qū)氲姆椒?br> 技術(shù)領域：
本項發(fā)明與一種方法學有關，該方法能增加基因?qū)氚屑毎男什⒛苁拱屑毎行У剞D(zhuǎn)導，并涉及一系列與醫(yī)學、細胞技術(shù)、遺傳工程、發(fā)育技術(shù)等領域相關的技術(shù)。
背景技術(shù)：
很多人類疾病的發(fā)病機理已經(jīng)闡明。重組DNA技術(shù)及將基因?qū)爰毎募夹g(shù)進展很快。在這種情況下，治療嚴重的遺傳性疾病的體細胞基因治療方法最近已經(jīng)建立。新近，人們試圖將基因治療的方法不但用于治療遺傳性疾病，而且用于治療病毒性感染(如AIDS)和癌癥。
至今，大多數(shù)已通過審查的對人的臨床應用的基因治療法，是通過用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將基因?qū)爰毎?。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能有效地將目的外源基因?qū)爰毎⒎€(wěn)定地將基因整合入它們的染色體DNA中。因此，這是一種優(yōu)先選用的基因?qū)敕椒?，特別是希望有長期基因表達的基因治療。為了消除被導入的基因?qū)C體的有害的影響，這種載體已經(jīng)過不同的改進。例如，消除所述載體的復制功能，這樣在重復無限制感染(基因?qū)?的同時，用于基因?qū)氲妮d體在細胞內(nèi)不復制。
由于這種載體(復制-缺陷性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)不能自主復制，因此通常通過應用逆轉(zhuǎn)錄病毒生成細胞(包裝細胞)制備包殼在病毒病毒顆粒內(nèi)的載體。最簡單的能將基因有效地導入靶細胞的方法包括將靶細胞與逆轉(zhuǎn)錄病毒生成細胞共同培養(yǎng)。然而在此方法中，逆轉(zhuǎn)錄病毒生成細胞可能污染將被移植入活體的已導入基因的靶細胞。
最近，有報道當有纖連蛋白(細胞外基質(zhì)成分)或其片段存在時，能夠增加用逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因?qū)爰毎男?J.Clin.Invest.，931451-1457(1994)；Blood，88855-862(1996))。并且已證明，用遺傳工程技術(shù)生產(chǎn)的纖連蛋白片段有相似的性質(zhì)并能夠用以有效地將外源基因?qū)朐煅杉毎?WO 95/26200)。因此提示由于纖連蛋白而增加的基因?qū)胄适桥c纖連蛋白的肝素-結(jié)合區(qū)域與逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)合有關。
此外，在WO 97/18318中公開的功能性物質(zhì)(而不是纖連蛋白，如成纖維細胞生長因子)能增加基因?qū)氲男省９嬷羞€公開，當應用一種具有與逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合活性的功能性物質(zhì)和另一種具有與細胞結(jié)合活性的功能性物質(zhì)的混合物時也觀察到相似的基因?qū)胄实脑黾印?br> 在沒有逆轉(zhuǎn)錄病毒生成細胞和靶細胞共同培養(yǎng)的情況下，應用功能性物質(zhì)的基因?qū)敕椒苡行У剡M行基因?qū)?。因此認為該方法中基因?qū)胄实脑黾邮怯捎谠诠δ苄晕镔|(zhì)的幫助下增加了緊密地共定位在一起的逆轉(zhuǎn)錄病毒和靶細胞之間相互作用的機率。
在用逆轉(zhuǎn)錄病毒進行的基因?qū)胫?，用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染靶細胞，導致基因按以上所述導入。然而用逆轉(zhuǎn)錄病毒進行基因?qū)氲男嗜圆荒軡M足實際的臨床應用。因此期望進一步增加感染效率。
增加感染效率或基因?qū)胄室部梢酝ㄟ^增加所用的病毒懸液(上清液)中逆轉(zhuǎn)錄病毒的濃度(滴度)來實現(xiàn)。然而，構(gòu)建和建立一種能生成高滴度病毒的病毒生成細胞通常需要大量的勞動。利用來自水泡性口炎病毒的包膜蛋白形成的假型病毒載體[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，908033-8037(1993)]可經(jīng)離心而濃縮。但由于該濃縮方法只能用于這種載體，因此該法不能被廣泛應用。
另外，即使靶細胞純度較低時，在基因?qū)霑r用逆轉(zhuǎn)錄病毒特異性感染靶細胞也能達到高的基因?qū)胄?。然而本領域現(xiàn)階段還沒有一個方便、高效的方法。
發(fā)明目的綜上所述，本發(fā)明的主要目的是提供一種改良的方法用于利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因?qū)氚屑毎摲椒ㄌ岣吡嘶驅(qū)胄?，并有效地轉(zhuǎn)導靶細胞。
在下文中，參照附圖將詳細解釋本發(fā)明的其它的目的及優(yōu)勢。
附圖簡述

圖1顯示分子中含有九個甘露糖殘基的高甘露糖型糖鏈的結(jié)構(gòu)。
圖2圖示在實施例3中應用化學修飾的CH-296所達到的基因?qū)胄?％)。
圖3圖示實施例13中在去除病毒感染抑制物質(zhì)的影響的研究中，相對基因?qū)胄?％)與接觸/結(jié)合時間之間的關系。
圖4圖示實施例15中，利用離心的方法將逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合到功能性物質(zhì)上的影響的研究中，相對基因?qū)胄?％)和各自病毒結(jié)合步驟之間的關系。
圖5圖示實施例15中，用離心法或離心感染法達到的基因?qū)胄?％)。
發(fā)明概述本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，通過將具有結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒活性并被固定在支持物上的功能性物質(zhì)與逆轉(zhuǎn)錄病毒接觸，然后在感染靶細胞之前洗滌支持物，能夠增加基因?qū)胄省?br> 本發(fā)明者也發(fā)現(xiàn)，當諸如能特異性結(jié)合到靶細胞的抗體、層粘連蛋白、來源于層粘連蛋白的糖鏈或高甘露糖型糖鏈等的功能性物質(zhì)存在時，通過用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染靶細胞能特異并有效地將基因?qū)肽康陌屑毎?br> 本發(fā)明者進一步發(fā)現(xiàn)進行基因?qū)肭斑m當?shù)仡A處理靶細胞能增加基因?qū)胄省?br> 此外，本發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)用化學方法修飾功能性物質(zhì)以增加其鹼性可改善具有結(jié)合病毒活性的功能性物質(zhì)對基因?qū)氲淖饔谩?br> 該項發(fā)明是本發(fā)明者基于這些新發(fā)現(xiàn)而完成的。
因此，本發(fā)明的第一個方面是用逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因?qū)氚屑毎姆椒?，該方法特征包?1)將含有逆轉(zhuǎn)錄病毒的溶液與具有結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒活性并被固定于支持物的功能性物質(zhì)接觸；(2)洗滌該結(jié)合有逆轉(zhuǎn)錄病毒的支持物；和(3)將該結(jié)合有逆轉(zhuǎn)錄病毒的支持物與靶細胞接觸并一起孵育；進行上述第一步時沒有什么限制，如持續(xù)1小時或更長時間，最好是3小時或更長時間。另外，可經(jīng)物理的方法增加逆轉(zhuǎn)錄病毒與具有結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒活性的功能性物質(zhì)之間的接觸頻率。
能用于本發(fā)明的具有結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒活性的功能性物質(zhì)的例子包括但不限于纖連蛋白、成纖維細胞生長因子、V型膠原蛋白、聚賴氨酸和DEAE-葡聚糖和它們的片段以及其它具有相同的結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒活性的物質(zhì)。所述功能性物質(zhì)可具有結(jié)合靶細胞的活性。做為選擇，該功能性物質(zhì)也可以與另一具有結(jié)合靶細胞活性的功能性物質(zhì)結(jié)合使用?？墒褂玫木哂薪Y(jié)合靶細胞活性的功能性物質(zhì)的實例包括但不限于細胞-粘附蛋白、激素、細胞因子、抗體、糖鏈、碳水化合物和代謝物。
例如，本發(fā)明中可將逆轉(zhuǎn)錄病毒生成細胞的培養(yǎng)上清作為逆轉(zhuǎn)錄病毒用于基因?qū)搿？稍谟写龠M逆轉(zhuǎn)錄病毒生成的物質(zhì)如丁酸鈉存在下獲得所述培養(yǎng)上清。
本發(fā)明的第二個方面是一種利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因?qū)氚屑毎姆椒ǎ摲椒ǖ奶卣靼ㄔ谟幸韵聝蓚€功能性物質(zhì)存在下用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染靶細胞(1)具有結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒活性的功能性物質(zhì)；和
(2)能特異性結(jié)合靶細胞的抗體。
用于本發(fā)明的能特異性結(jié)合靶細胞的抗體的例子包括但不限于能識別靶細胞表面的生物性物質(zhì)的抗體。
本發(fā)明的第三個方面是一種利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因?qū)氚屑毎姆椒ǎ摲椒ǖ奶卣靼ㄔ谝韵聝蓚€功能性物質(zhì)存在下用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染靶細胞(1)具有結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒活性的功能性物質(zhì)；和(2)層粘連蛋白、層粘連蛋白片段、來源于層粘連蛋白的糖鏈或高甘露糖型糖鏈。
能用于本發(fā)明第二和第三方面的具有結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒活性的功能性物質(zhì)的例子包括，但不限于，纖連蛋白、成纖維細胞生長因子、V型膠原蛋白、多聚賴氨酸和DEAE-葡聚糖及其片段，以及其它具有相同的結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒活性的物質(zhì)。該功能性物質(zhì)可具有結(jié)合靶細胞的活性。此外，也可將該功能性物質(zhì)固定在適當?shù)闹С治锷鲜褂谩?br> 本發(fā)明的第四個方面是一種利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因?qū)氚屑毎姆椒?，該方法的特征包括在靶細胞接觸逆轉(zhuǎn)錄病毒前，先在含低濃度鐵的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)靶細胞?？捎糜诒景l(fā)明的培養(yǎng)基的例子包括，但不限于，含去鐵胺的培養(yǎng)基。最好在有功能性物質(zhì)存在下進行本方法。
本發(fā)明的第五個方面涉及增加肽鏈或蛋白質(zhì)與逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合的活性的方法，該方法的特征包括用化學法修飾肽鏈或蛋白質(zhì)。化學修飾的例子包括，但不限于，激活肽鏈或蛋白質(zhì)的氨基酸殘基和鹼性殘基的引入。例如，最好用水溶性的碳化二亞胺或用水溶性的碳化二亞胺和二氨基化合物處理肽鏈或蛋白質(zhì)進行所述氨基酸殘基的激活，沒有什么限制?？蓛?yōu)選將用這種方法獲得的經(jīng)化學修飾的肽鏈或蛋白質(zhì)用于用逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因?qū)氚屑毎小?br> 發(fā)明詳述在本發(fā)明的基因?qū)敕椒ㄖ型ǔＪ褂弥亟M的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。具體地說，優(yōu)選應用復制缺陷性重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。將這種載體的復制能力去除以使其不能在被感染的細胞內(nèi)自主復制，因此這種載體沒有致病性。所述載體可以進入如脊椎動物細胞的宿主細胞(特別是哺乳動物細胞)中，并穩(wěn)定地將插入載體內(nèi)的外源基因整合入所述染色體DNA中。
本發(fā)明中，通過將外源基因插入重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體并在適當?shù)膯幼尤缒孓D(zhuǎn)錄病毒載體的LTR啟動子或一外源啟動子的控制下，將外源基因?qū)氚屑毎４送?，為了使該外源基因有效地轉(zhuǎn)錄，載體中還可有與該啟動子和轉(zhuǎn)錄啟始位點協(xié)同作用的另一調(diào)節(jié)成分(如增強子序列或終止子序列)。該導入的外源基因可以是一天然的基因或者是一人工制備的基因。另外，外源基因也可以是不同來源的DNA分子經(jīng)連接或用本領域已知的其它方法結(jié)合在一起的一個基因。
人們可以選擇任何想要導入細胞的基因作為所述外源基因插入該逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。例如，與所治療疾病相關的酶或蛋白質(zhì)、細胞內(nèi)抗體(例如參見，WO 94/02610)、生長因子、反義核酸、核酶、假引物(例如參見，WO 90/13641)等的編碼基因可被用來作為所述外源基因。
本發(fā)明中應用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體還含有適當?shù)臉酥净颍軌蜻x擇已導入基因的細胞。例如，將賦予細胞抗生素抗性的藥物抗性基因或可將通過酶活性的檢測區(qū)別已導入基因的細胞的報道基因作為標志基因。
能用于本發(fā)明的載體包括，例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體如MFG載體(ATCC第68754號)、α-SGC載體(ATCC第68755號)和LXSN載體[Bio Techniques，7980-990(1989)]。在下文實施例中使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(包括PM5neo載體)包括含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因作為標志基因[Exp.Hematol.，23630-638(1995)]，因此根據(jù)細胞對G418的抗性作為一種指標能夠證明，利用該載體已將基因?qū)爰毎麅?nèi)。
可用已知的包裝細胞系如PG13(ATCC CRL-10686)、PG13/LNc8(ATCC CRL-10685)、PA317(ATCC CRL-9078)、GP+E-86(ATCCCRL-9642)、GP+envAm12(ATCC CRL-9641)和CRIP[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，856460-6464(1988)]包裝所述載體制備成的病毒顆粒。
可將已知的培養(yǎng)基如DMEM(Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基)和IscoveS改良的Dulbecco培養(yǎng)基用于培養(yǎng)將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導入包裝細胞而產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒生成細胞或用于培養(yǎng)靶細胞。這些培養(yǎng)基均已商品化，如可從Gibco公司買到。根據(jù)基因?qū)氲陌屑毎念愋突蚱渌康?，可向這些培養(yǎng)基內(nèi)加入不同的組分。如為促進或抑制所述靶細胞的生長或分化，可加入血清或不同的細胞因子。例如，可將小牛血清(CS)或胎牛血清(FCS)作為血清使用。所述細胞因子包括白細胞介素(IL-3、IL-6等)、集落刺激因子(G-CSF、GM-CSF等)、干細胞因子(SCF)、促紅細胞生成素和各種細胞生長因子。許多人源性的細胞因子已經(jīng)商品化。從所述細胞因子中按所需目的選擇有適當活性的細胞因子。此外，可聯(lián)合應用所述細胞因子。
將含有逆轉(zhuǎn)錄病毒的樣品如病毒生成細胞的培養(yǎng)上清應用于本發(fā)明的基因?qū)敕椒ㄖ?。制備該上清的方法并不限于某種特殊類型。例如，已知在培養(yǎng)病毒生成細胞時加入丁酸鈉可增加培養(yǎng)上清內(nèi)病毒顆粒產(chǎn)生的量[Human Gene Therapy 61195-1202(1995)]。毫無問題，可將這樣制備的高滴度的病毒上清用于本發(fā)明的基因?qū)敕椒ā?br> 本發(fā)明的方法的特征在于，在具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合位點的功能性物質(zhì)存在下，用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染靶細胞。在有效量的這種功能性物質(zhì)存在下，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細胞可以有效地獲得基因?qū)氲募毎４送?，使用功能性物質(zhì)還能容易地去除病毒上清內(nèi)的病毒感染抑制物質(zhì)。此外，具有結(jié)合靶細胞活性的功能性物質(zhì)的共同存在，會使基因?qū)胩禺愋院?或效率更高。
本文所用的有效量是指通過用逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因?qū)氚屑毎行У厥拱屑毎D(zhuǎn)導的量。根據(jù)應用的所述功能性物質(zhì)和靶細胞的類型選擇適當?shù)牧?。例如，可通過用此處所描述的方法測定基因?qū)胄蕘泶_定該有效量。本文所指的結(jié)合到靶細胞的活性不但包括與靶細胞充分地結(jié)合的活性，而且還包括在溶液中保持與靶細胞接觸的活性?？苫谌缟纤龅膶?qū)胄实淖饔脺y定所述活性。此外，基因?qū)胄室馕吨D(zhuǎn)導效率。
可將上述提到的功能性物質(zhì)溶解于溶液中或固定于適當?shù)闹С治锷虾笫褂?。用于固定功能性物質(zhì)的支持物也不限于某一特殊類型。通常使用細胞培養(yǎng)容器(Vessel)或珠狀支持物。
當使用具有結(jié)合病毒的活性并被固定于支持物上的功能性物質(zhì)時，使用以下例舉的步驟會進一步增加基因?qū)胄省?br> 首先，使含有逆轉(zhuǎn)錄病毒的液體樣品(如病毒上清)與固定有具有結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒活性的功能性物質(zhì)的支持物接觸。洗滌該支持物。然后使該支持物直接與靶細胞接觸。做為選擇，可將用適當?shù)姆椒◤闹С治锷舷疵撓聛淼牟《绢w粒加入靶細胞。因此，可有效地導入基因。所述應用的具有結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒活性的功能性物質(zhì)可具有結(jié)合靶細胞的活性。做為選擇，還可將具有結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒活性的和結(jié)合靶細胞活性的功能性物質(zhì)結(jié)合起來應用。
例如，進行含有逆轉(zhuǎn)錄病毒的液體樣品與固定有具有結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒活性的功能性物質(zhì)的支持物相互接觸這一步驟時，可持續(xù)1小時或更長，最好3小時或更長，沒有什么限制。同樣，其它條件包括溫度也沒有特別限制。例如，可在室溫或37℃下進行該步驟。根據(jù)所述病毒的穩(wěn)定性或其它性質(zhì)，也可以用4℃左右的低溫。根據(jù)所述目的，可適當?shù)剡x擇固定功能性物質(zhì)的支持物。如果使用細胞培養(yǎng)的容器，只要加入了靶細胞，就可開始基因?qū)氲牟襟E。例如，可將磷酸鹽緩沖溶液或Hanks’鹽溶液、用于培養(yǎng)靶細胞的液體培養(yǎng)基等用于洗滌支持物。
通過物理的方法增加所述逆轉(zhuǎn)錄病毒和所述功能性物質(zhì)之間的接觸頻率，可以使逆轉(zhuǎn)錄病毒更有效地與具有結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒活性的功能性物質(zhì)相結(jié)合。這種物理方法實例包括，但不限于，振蕩、過濾和離心力的應用。以下方法是一種使用離心力的具體實例將有逆轉(zhuǎn)錄病毒的液體樣品放入一個管底固定了具有結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒活性的功能性物質(zhì)的離心管內(nèi)，然后離心。該離心管在離心過程中由于離心力的作用，使所述逆轉(zhuǎn)錄病毒沉淀到該離心管底部。相應地，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒與具有結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒活性的功能性物質(zhì)的接觸頻率增加，導致所述結(jié)合的頻率增加。上述提及的方法不是將細胞置于物理應力下不象通過離心力將病毒沉淀到細胞上進行感染的方法(WO 95/10619)，因此，本發(fā)明的方法導致較高的基因?qū)胄省?br> 可以用上述提及的方法去除含逆轉(zhuǎn)錄病毒的樣品內(nèi)的不利于基因?qū)氲奈镔|(zhì)以后再進行基因?qū)搿＠?，用本發(fā)明的方法去除的物質(zhì)包括包含于病毒上清內(nèi)的來自包裝細胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染抑制物質(zhì)[Human Gene Therapy 81459-1467(1997)；J Virol.，706468-6473(1996)]，為促進病毒產(chǎn)生而在培養(yǎng)逆轉(zhuǎn)錄病毒生成細胞時加入的物質(zhì)，如12-肉豆蔻酸13-醋酸佛波醇酯(TPA)(Phorbol 12-myristate13-acetate)和地塞米松[Gene therapy，2547-551(1995)]以及上述的丁酸鈉。
能用于本發(fā)明的具有結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒活性的功能性物質(zhì)的例子包括，但并不限于，纖連蛋白的肝素-II的域、成纖維細胞生長因子、V型膠原蛋白、多聚賴氨酸和DEAE-葡聚糖以及與這些功能性物質(zhì)有相同功能的物質(zhì)(如具有肝素結(jié)合位點的功能性物質(zhì))。此外，可應用所述功能性物質(zhì)的混合物、含有該功能性物質(zhì)的多肽、該功能性物質(zhì)的聚合物和該功能性物質(zhì)的衍生物等。
用化學方法修飾功能性物質(zhì)可以增強其結(jié)合病毒的活性?；瘜W修飾的例子包括激活所應用的功能性物質(zhì)的氨基酸殘基，或向功能性物質(zhì)內(nèi)導入鹼性殘基。例如，用水溶性的碳化二亞胺如1-乙基-3-二甲氨基丙基碳化二亞胺鹽酸鹽激活羧基基團來修飾肽或蛋白質(zhì)組成的功能性物質(zhì)的游離羧基基團以增加對逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)合活性。此外，通過應用這類激活的羧基將鹼性殘基如氨基導入到所述功能性物質(zhì)中可增加所述結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒的活性。
本發(fā)明中使用的具有結(jié)合靶細胞活性的功能性物質(zhì)的例子包括，但不限于，具有結(jié)合靶細胞的配體的物質(zhì)。所述配體包括細胞粘附蛋白、激素或細胞因子、抗細胞表面抗原的抗體、多糖、糖蛋白、糖脂、來源于糖蛋白或糖脂的糖鏈以及靶細胞的代謝物。此外，還可以用含有所述功能性物質(zhì)的多肽、所述功能性物質(zhì)的聚合物、所述功能性物質(zhì)的衍生物、所述功能性物質(zhì)的功能相同的物質(zhì)等。
能特異性結(jié)合到靶細胞的抗體特別有助于將基因特異而有效地導入特異性細胞。能用于本發(fā)明的抗體并不限于某一特異類型?？蛇m當?shù)剡x用抗導入基因的靶細胞上表達的抗原的抗體。可用已知的方法產(chǎn)生這樣的抗體。此外，也可以用目前已商品化的許多的抗體。所述抗體可以是多克隆抗體也可以是單克隆抗體，只要其具有所需的諸如細胞特異性的特性。另外也可應用經(jīng)已知的技術(shù)修飾的抗體或抗體的衍生物如人源化抗體、Fab片段或單鏈抗體。
不同細胞各自的白細胞抗原(也被稱為CD抗原)的表達已有詳細的研究。因此，在本發(fā)明的基因?qū)敕椒ㄖ校ㄟ^選擇并應用能識別目的靶細胞表達的CD抗原的抗體可高度特異地將基因?qū)氚屑毎?。例如，用抗CD4抗體將基因直接導入輔助性T細胞，或用抗CD34抗體將基因?qū)朐煅杉毎?br> 此外，可以使用糖蛋白、層粘連蛋白作為具有結(jié)合靶細胞活性的功能性物質(zhì)將基因有效地導入不同的靶細胞，例如，造血干細胞?？捎糜诒景l(fā)明的層粘連蛋白可來源于小鼠或人，或者是其片段，只要其具有結(jié)合靶細胞的活性。在下面所述的實施例中，層粘連蛋白的糖鏈在用層粘連蛋白進行基因?qū)霑r起重要作用。因此，本發(fā)明的方法中也使用了根據(jù)已知的方法從層粘連蛋白釋放出的糖鏈。此外，本發(fā)明中還可使用象層粘連蛋白一樣的高甘露糖型N-聯(lián)糖鏈的糖蛋白或從糖蛋白釋放的或化學合成的糖鏈。另外，可以應用連接有上述糖鏈和蛋白質(zhì)或相似物。例如可優(yōu)先選用具有結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒活性以及與其連接的所述糖鏈的功能性物質(zhì)進行基因?qū)搿?br> 上面提到的高甘露糖型糖鏈并不限于某一特殊類型，只要分子內(nèi)有1到20個甘露糖殘基即可。在本發(fā)明方法中優(yōu)先選用在其非還原末端有甘露糖殘基的糖鏈?？梢詰眠B接于另一適當?shù)姆肿尤缟锓肿?例如，單糖、寡糖、多糖、氨基酸、肽、蛋白質(zhì)或脂質(zhì))或人工合成物質(zhì)如合成的大分子的所述糖鏈。
以具有(甘露糖)n-(GlucNAc)2為代表的結(jié)構(gòu)舉例說明來源于有機體的典型的高甘露糖型糖鏈[Protein，Nucleic Acid and Enzyme，432631-2639(1998)]。例如，在本發(fā)明基因?qū)敕椒ㄖ袃?yōu)先選用(但不限于)的具有上述結(jié)構(gòu)的糖鏈(甘露糖)9-(GIucNAc)2，其分子中含有9個甘露糖殘基(，該糖鏈的結(jié)構(gòu)示于圖1)。
以上所述的功能性物質(zhì)可獲自天然形成的、人工制備的(如通過重組DNA技術(shù)或化學合成技術(shù))、或者將天然形成的和人工制備的物質(zhì)的結(jié)合起來制備的物質(zhì)。另外，可將具有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合位點的功能性物質(zhì)和另一具有靶細胞結(jié)合位點的功能性物質(zhì)的混合物用于基因?qū)耄蓱肳O 97/18318所述的功能性物質(zhì)。作為選擇，還可應用在單一分子中既有逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合位點又有靶細胞結(jié)合位點的功能性物質(zhì)?？蓱没静缓c其天然相關的其它蛋白質(zhì)的功能性物質(zhì)。另外，可將所述功能性物質(zhì)或所述功能性物質(zhì)的組合物與用于培養(yǎng)靶細胞的培養(yǎng)基、細胞生長因子等一起組合制備成基因?qū)朐噭┖小?br> 根據(jù)已在如J Biol Chem.，2567277(1981)；J Cell Biol.，102449(1986)或J Cell Biol.，105489(1987)中所述的方法，可從天然材料中制備大致純的用于本發(fā)明的方法中的纖連蛋白或其片段。還可按照美國專利第5,198,423號所述的用重組DNA技術(shù)制備所述纖連蛋白或其片段。具體地說，在上述專利的公告中詳細地描述了，含肝素-II域即逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合位點的纖連蛋白片段，如包括在下述實施例中應用的CH-296，H-271，H-296和CH-271的重組多肽，以及獲得這些片段的方法。這些片段可經(jīng)培養(yǎng)以下大腸桿菌株獲得，如在公告中描述的以如下保藏號保藏在國立生命科學與人體技術(shù)研究所、工業(yè)科學和技術(shù)局、國際貿(mào)易與工業(yè)部，1-3，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken的大腸桿菌株FERM P-10721(H-296)(原保藏日期1989年5月12日)；FERM BP-2799(CH-271)(原保藏日期1989年5月12日)；FERM BP-2800(CH-296)(原保藏日期1989年5月12日)和FERM BP-2264(H-271)(原保藏日期1989年1月30日)。另外，還可用已知的重組DNA技術(shù)修飾大腸桿菌株內(nèi)的質(zhì)粒制備有代表性的來源于這些片段的片段。在以上描述的纖連蛋白片段中，H-296具有VLA-4結(jié)合區(qū)多肽、CH-271具有VLA-5結(jié)合區(qū)肽、而CH-296具有所述兩個結(jié)合區(qū)[Nature Medicine，2876-882(1996)]。
在所述功能性物質(zhì)存在下，用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染靶細胞可有效地獲得基因?qū)爰毎??？筛鶕?jù)傳統(tǒng)的方法進行所述逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染，如在37℃，5％CO2中培養(yǎng)。根據(jù)所述靶細胞或?qū)嶒瀸ο罂蛇m當改變這些條件和培養(yǎng)時間。
在G0期時，靶細胞不會被逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。因此，最好經(jīng)預刺激靶細胞誘導所述細胞進入細胞周期。為此，在用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染所述靶細胞前，先將靶細胞培養(yǎng)于有適于靶細胞的生長因子存在的培養(yǎng)基中。例如，將不同的細胞因子如白細胞介素-3、白細胞介素-6和干細胞因子用于預刺激骨髓細胞或造血干細胞以進行基因?qū)搿?br> 已知在逆轉(zhuǎn)錄病毒感染中涉及細胞表面的受體。已知鹼性氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白和磷酸轉(zhuǎn)運蛋白分別作為親嗜性病毒和雙嗜性病毒的受體而起作用[Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9311407-11413(1996)]。通過在鹼性氨基酸或磷酸鹽、或鹽或其前體濃度降低的培養(yǎng)基中預處理所述靶細胞來激活所述轉(zhuǎn)運蛋白的表達或代謝，使靶細胞對病毒感染敏感是可能的。
使人驚奇的是，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)激活鐵傳遞蛋白受體(目前還不知其是否與病毒感染相關)也能增加逆轉(zhuǎn)錄病毒感染或基因?qū)胄省？赏ㄟ^但不限于在含濃度限制的鐵的培養(yǎng)基中處理靶細胞來激活鐵傳遞蛋白受體。例如可應用加入去鐵胺螯合了鐵的培養(yǎng)基。
應用鐵傳遞蛋白激活的基因?qū)胱詈靡苍谏鲜龉δ苄晕镔|(zhì)存在下進行。
本發(fā)明的方法中用作基因?qū)氲陌屑毎募毎麑嵗ǖ幌抻诟杉毎⒃煅毎?、非粘附的低密度的單核細胞、粘附細胞、骨髓細胞、造血干細胞、外周血干細胞、臍帶血細胞、胎兒造血干細胞、胚原性干細胞、胚胎細胞、原生殖細胞、卵母細胞、卵原細胞、卵細胞、精母細胞、精子，CD34陽性細胞、c-kit陽性細胞、多能造血祖細胞、單潛能造血祖細胞、紅細胞樣的前體細胞、淋巴樣母細胞、成熟血細胞、淋巴細胞、B細胞、T細胞、成纖維細胞、成神經(jīng)細胞、神經(jīng)細胞、內(nèi)皮細胞、血管內(nèi)皮細胞、肝細胞、成肌細胞、骨骼肌細胞、平滑肌細胞、癌細胞、骨髓瘤細胞、白血病細胞等。對于可從血液或骨髓獲得的造血細胞優(yōu)先使用本發(fā)明的方法，因為這些細胞相對較易得到，并且培養(yǎng)和維持這些細胞的技術(shù)也已建立。特別是，如果想要導入的基因長期表達，血液祖細胞如造血干細胞、CD34陽性細胞、c-kit-陽性細胞和多能造血祖細胞是合適的靶細胞。
例如，通過以下的步驟可進行用造血干細胞作為靶細胞的基因治療。
首先，從供體處收集含有造血干細胞的原料，如骨髓組織、外周血和臍帶血?？蓪⑦@些組織直接用于基因?qū)脒^程。然而，通常用密度梯度離心法等制備含有造血干細胞的單核細胞部分，或用細胞表面的標志分子如CD34和/或c-kit進一步純化造血干細胞。用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染所述含有造血干細胞的原料，可按本發(fā)明的方法將目的基因插入所述載體中，如果需要，可用適當?shù)募毎L因子進行預刺激后進行。可將這樣獲得的已導入基因的細胞通過如靜脈內(nèi)給予而移植入接受者體內(nèi)。雖然所述受者優(yōu)選為供體自身，但也可以進行同種異體移植。例如，如果將臍帶血用作原材料進行的即是所述同種異體移植。
一些用造血干細胞作為靶細胞的基因治療是補充患者的缺陷或異常的基因(如ADA缺陷或Gaucher’s病的基因治療)。此外，將抗藥基因?qū)朐煅杉毎詼p輕例如由于用于治療癌癥或白血病的化療藥物而對造血細胞的損傷。
腫瘤疫苗接種治療已開始作為腫瘤基因治療的方法而被研究。在這種療法中，將細胞因子的基因?qū)氚┘毎?，使該腫瘤細胞的增殖能力消失，然后將該細胞再輸回病人體內(nèi)以促進腫瘤免疫[HumanGene Therapy，5153-164(1994)]。此外，還試圖用基因治療法治療艾滋病。即使這樣，仍需考慮以下步驟。在此過程中，將編碼能干擾HIV(人類免疫缺陷性病毒)復制或基因表達的核酸分子的基因(例如反義核酸或核酶)導入感染了HIV的T細胞(艾滋病的病因)中[如J.Virol.，694045-4052(1995)]。
如上述詳細說明，應用本發(fā)明可將基因高效率和高特異性地導入靶細胞。此外，本發(fā)明的所述方法不需要特殊的設備或儀器且對不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和靶細胞均有效。
實施例以下實施例更詳細地闡明了本發(fā)明，但是不能解釋為限制本發(fā)明的范圍。
實施例1從纖連蛋白制備多肽根據(jù)美國專利第5,198,423號所述方法，從含有重組質(zhì)粒pHD101的大腸桿菌HB 101/pHD101(FERM BP-2264)中制備來源于人的纖連蛋白的一種多肽H-271，所述重組質(zhì)粒含有編碼所述多肽的DNA。
根據(jù)以上提及的公開專利描述的方法，從含有pHD102重組質(zhì)粒的大腸桿菌HB101/pHD102(FERM P-10721)中制備來源于人的纖連蛋白的一種多肽H-296，所述重組質(zhì)粒含有編碼所述多肽的DNA。
按以下方法制備多肽CH-271。
簡而言之，根據(jù)以上提及的公開專利描述的方法培養(yǎng)大腸桿菌HB101/pCH10l(FERM BP-2799)，從該培養(yǎng)物中獲得CH-271。
按以下方法制備多肽CH-296。
簡而言之，根據(jù)以上提及的公開專利描述的方法培養(yǎng)大腸桿菌HB101/pCH102(FERM BP-2800)。從該培養(yǎng)物中獲得CH-296。
按以下方法制備多肽C-274。
簡單地說，根據(jù)美國專利號5,102,988所述方法培養(yǎng)大腸桿菌JM109/pTF7221(FERM BP-1915)，從該培養(yǎng)物中獲得C-274。
按照WO 97/18318描述的方法制備自V型膠原蛋白、ColV衍化的具有結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒活性的多肽。
實施例2逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建和逆轉(zhuǎn)錄病毒上清的制備將逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒，即含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的PM5neo載體[Exp.Hematol.，23630-638(1995)]，導入GP+E-86細胞(ATCCCRL-9642)。將細胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清(FCS；Gibco)、50IU/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素(兩者均得自Gibco)的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM；Bio Whittaker)中。所有在以下過程中使用的DMEM均含有上述提到的抗菌素。含PM5neo病毒的上清按下述過程制備當上述病毒生成細胞在10-cm的包被有明膠的培養(yǎng)皿(IwackiGlass)中長到半融合時，加4ml含10％FCS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜，收集上清。將這樣收集的培養(yǎng)上清用0.45微米的濾膜(Millipore)過濾以制備病毒上清的貯存液，將其于-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 根據(jù)上述步驟，從以下細胞中制備病毒上清。將含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和增強的綠色熒光蛋白(EGFP)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒pLEIN(Clontech)導入其中的親嗜性包裝細胞BOSC23[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，908392-8396(1993)]和雙嗜性包裝細胞CRIP[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，856460-6464(1988)]。在下文中，分別將從BOSC23細胞中制備的病毒稱為Eco-EGFP，從CRIP細胞中制備的病毒稱為Ampho-EGFP。
此外，根據(jù)上述步驟，從含有逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒TKNeo載體[J.Exp.Med.，178529-536(1993)](該載體含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)的GP+Env Am12(ATCC CRL-9641)細胞制備病毒上清。應用含10％的小牛血清(CS，購自Gibco)替代10％FCS的DMEM培養(yǎng)基。
根據(jù)標準的方法測定病毒上清的滴度[J.Virol.，621120-1124(1988)]，該方法應用新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因?qū)隢IH/3T3細胞(ATCCCRL-1658)的效率作為指標。計算每毫升上清中含有的感染病毒顆粒的數(shù)目(cfu/ml)。在該計算值即所述上清滴度的基礎上，決定下文實驗中需加的病毒上清的量。
實施例3具有結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒活性的功能性物質(zhì)的制備及其活性測定在未經(jīng)任何處理的96孔微量細胞培養(yǎng)板(Falcon)的每個孔內(nèi)加入50μl含有80μg/ml H-271、H-296、C-274、CH-271、CH-296、CoIV、人鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF；Progen)、肌腱蛋白(Gibco)或表皮生長因子(EGF；Takara Shuzo)的溶液或50μl的2％小牛血清白蛋白(BSA，Sigma)。將所述培養(yǎng)板置于4℃過夜，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS，Roman Kogyo)洗滌兩次。作為選擇，將所述板按上述方法處理后，每孔加入0.1ml用無菌純水配制的4mg/ml的1-乙基-3-二甲氨基丙基碳化二亞胺鹽酸鹽(Sigma)溶液。使其在37℃反應2小時。將所述板用純水徹底洗滌以制備成經(jīng)碳化二亞胺處理的板。將這些板置于4℃，直到進行病毒感染實驗。
將生長于含10％FCS、50IU/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基(Bio Whittaker)中的104的小鼠白血病L1210細胞(ATCCCCL-219)和50μl PM5neo病毒上清(104cfu/ml)加入所述微量培養(yǎng)板的孔中。培養(yǎng)24小時后，將培養(yǎng)基換成含有終濃度為0.75mg/ml的G418(Gibco)的相同培養(yǎng)基，然后將該板再培養(yǎng)48小時。按照部分修改的S.Kim等[Gene Therapy，31018-1020(1996)]描述的方法測定G418抗性細胞，所述方法中用Premix WST-1試劑(Takara Shuzo)顯色后測定450nm的吸光度。培養(yǎng)后，將按10μl/100μl培養(yǎng)液將WST-1試劑加入到孔內(nèi)，將該板在37℃繼續(xù)培養(yǎng)4小時。用微量板閱讀儀測定450nm和650nm的吸光度，并計算所述吸光度間(450nm-650nm)的差值。將獲自用2％BSA包被但未經(jīng)碳化二亞胺處理的板的值作為本底。表1是三次實驗結(jié)果的總結(jié)。
表1

(均數(shù)±標準差)
如表1所示，觀察到已知的具有結(jié)合病毒活性的功能性物質(zhì)能增加基因?qū)胄?，例如H-271、H-296、CH-271、CH-296、ColV和bFGF。此外，當應用無結(jié)合病毒活性的物質(zhì)，如C-274、肌腱蛋白、EGF和BSA，以及用碳化二亞胺處理時，G418抗性細胞的出現(xiàn)增加。
下一步，將CH-296作為功能性物質(zhì)按下述方法進行實驗將0.5ml的40μg/ml CH-296加入到未經(jīng)處理的用于細胞培養(yǎng)的24孔板(Falcon)的每個孔內(nèi)。將所述板置于4℃過夜，然后用PBS(pH5.8)洗滌。在每孔中加入用PBS(pH5.8)配制并含有不同濃度的1，2-乙二胺[(NH2(CH2)2NH2；Nacalai Tesque]、1，3-丙二胺[(NH2(CH2)3NH2；Nacalai Tesque]、腐胺[(NH2(CH2)4NH2；NacalaiTesque]的10mg/ml的1-乙基-3-二甲氨基丙基碳化二亞胺鹽酸鹽(Sigma)625μl。將所述板于37℃孵育2小時。在此過程中，經(jīng)碳化二亞胺的介導，將氨基導入CH-296分子的羧基中。用PBS洗滌該板3遍，然后用2％的甘氨酸/PBS、再用2％BSA/PBS進行封閉。
將導入有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒pLEIN的GP+E86細胞培養(yǎng)于含有10％CS的DMEM培養(yǎng)基中。然后從培養(yǎng)物中收集上清。將該上清稀釋制備成1×105cfu/ml的濃度的上清，取0.5ml該病毒上清加入到所述板的各孔中。將該板孵育4小時。然后向孔中加入1×104NIH/3T3細胞。將該板再培養(yǎng)2天。培養(yǎng)后，用細胞分離(detachment)緩沖液(Bio Whittaker)收集細胞并洗滌。用FACSVantage(BectonDickinson)流式細胞儀在激發(fā)光波長為488nm，發(fā)射光波長為515-545nm時測定EGFP-表達細胞。用基因?qū)胄时硎静《窘Y(jié)合到培養(yǎng)板上的能力。結(jié)果示于圖2。
如圖2所示，隨著用于導入氨基的二氨基化合物的濃度增加，結(jié)合病毒的能力也增加。與用未經(jīng)處理的CH-296觀察到的結(jié)合力比較，當腐胺、1，3-丙二胺或1，2-乙二胺在反應中的應用濃度為2mM時，可觀察到所述病毒結(jié)合力增加了2倍。
實施例4層粘連蛋白對促進基因?qū)胄实挠绊憣⑿∈蟮膶诱尺B蛋白(Gibco)或人層粘連蛋白(Takara Shuzo)與具有結(jié)合病毒活性的功能性物質(zhì)聯(lián)合應用以進行基因?qū)雽嶒?。用于實驗的未?jīng)處理的24孔細胞培養(yǎng)板(Falcon)按以下兩種方法包被這些功能性物質(zhì)。
雞尾酒法將兩種功能性物質(zhì)的混合物加入所述板中。將該板置于4℃過夜。用2％BSA在37℃孵育20分鐘封閉該板，然后用PBS洗滌。
預先包被法在所述板內(nèi)加入具有結(jié)合病毒活性的功能性物質(zhì)的溶液，將該板置于4℃過夜。去除溶液。在該板中再加入層粘連蛋白溶液。將該板在37℃孵育2小時，用2％BSA封閉，然后用PBS洗滌。
用0.5ml所述功能性物質(zhì)溶液包被各孔。
向各孔中加入105L1210細胞和0.5ml的Eco-EGFP病毒上清(105cfu/ml)。將該板孵育24小時。孵育后，用細胞分離緩沖液(BioWhittaker)收集并洗滌細胞。用FACSVantage(Becton Dickinson)流式細胞儀在激發(fā)光波長為488nm，發(fā)射光波長為515-545nm時分析EGFP-表達細胞。計算基因?qū)胄?EGFP-表達細胞與總細胞的比例)。實驗結(jié)果示于表2-5。
表2

基因?qū)胄室裕ケ硎尽?br> 表3

根據(jù)雞尾酒法包被培養(yǎng)板?；?qū)胄室裕ケ硎尽?br> 表4

根據(jù)雞尾酒法包被培養(yǎng)板。基因?qū)胄室裕ケ硎尽?br> 表5

根據(jù)雞尾酒法包被培養(yǎng)板?；?qū)胄室裕ケ硎尽?br> 如表2和表3所示，本實驗證明，將人或小鼠的層粘連蛋白與具有結(jié)合病毒活性的功能性物質(zhì)聯(lián)合應用于用逆轉(zhuǎn)錄病毒進行的基因?qū)霑r，不管是否用固定法，均能非常有效地將基因?qū)氚屑毎?。已測定了用CH-296或CH-271和層粘連蛋白按雞尾酒法包被的培養(yǎng)板的基因?qū)胄?。?和表5顯示，當CH-296/小鼠層粘連蛋白或CH-271/小鼠層粘連蛋白聯(lián)合應用時，其最佳比例分別是8∶1(例如80μg/ml∶10μg/ml)和16∶1(例如80μg/ml∶5μg/ml)。與未加層粘連蛋白的基因?qū)胄氏啾?，CH-296和CH-271的基因?qū)胄史謩e增加了2.6倍和5.1倍。
實施例5應用層粘連蛋白將基因?qū)胄∈骳-kit陽性的骨髓細胞中小鼠c-kit陽性的骨髓細胞按下述方法制備。取6-8周齡C3H/He雌性小鼠(Japan SLC)，將從股骨收集的骨髓細胞用Ficoll-Hypaque(1.0875g/ml，Pharmacia)進行密度梯度離心以制備含有低密度的單核細胞的部分。用PBS洗滌該細胞，用紅細胞裂解緩沖液(155mMNH4Cl，10mM KHCO3，0.1mM EDTA，pH7.4)溶解紅細胞，再用PBS洗滌該細胞。按1μg/107細胞將抗鼠CD117抗體(Pharmingen)加入獲得的骨髓細胞內(nèi)。將該混合物在冰上反應30分鐘。用含5mM EDTA和0.5％BSA的PBS洗滌所述細胞，然后懸浮在相同的緩沖液中。按20μl/107細胞將結(jié)合在微珠上的第二抗體(Miltenyi Biotec)加入該細胞內(nèi)。將所述混合物于4℃反應30分鐘。用上述提到的緩沖液進行洗滌并懸浮所述細胞。用MACS系統(tǒng)(Miltenyi Biotec)收集結(jié)合到所述微珠上的細胞以獲取c-kit-陽性細胞。
在病毒感染前，按照Luskey等所述方法[Blood，80396-402(1992)]預刺激所述小鼠c-kit-陽性骨髓細胞。簡要地說，將細胞培養(yǎng)于含有20％FCS、20ng/ml重組小鼠白介素-3(Genzyme)、50ng/ml重組人白介素-6(Genzyme)、100ng/ml重組小鼠于細胞因子(Genzyme)、50單位/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的α-MEM(BioWhittaker)中，在5％CO2存在下，于37℃培養(yǎng)2天。
將不同濃度的小鼠層粘連蛋白和80μg/ml的CH-271的混合物按雞尾酒法包被未經(jīng)處理的24孔微量細胞培養(yǎng)板。將該板用2％BSA封閉30分鐘，然后用PBS洗滌。用2％BSA代替CH-271制備對照板。在該微量板的各孔中加入105的c-kit陽性的骨髓細胞和0.5ml的Eco-EGFP病毒上清(105cfu/ml)進行病毒感染。孵育48小時后，在各孔中加入0.5ml新鮮培養(yǎng)基，將該板再孵育24小時。培養(yǎng)后，用細胞分離緩沖液收集并洗滌該細胞。按實施例4所述方法計算基因?qū)胄?。兩次實驗結(jié)果示于表6和表7。
表6

基因?qū)胄室裕ワ@示。
表7

基因?qū)胄室裕ワ@示。
如表6和表7所示，本實驗證明根據(jù)雞尾酒法在用小鼠層粘連蛋白和具將有結(jié)合病毒活性的功能性物質(zhì)CH-271包被的培養(yǎng)板上，用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染c-kit-陽性的骨髓細胞時，也觀察到非常強的促進基因?qū)胄实淖饔?。與單獨使用CH-271比較，CH-271與層粘連蛋白聯(lián)合應用可增加基因?qū)胄首疃噙_5.7倍。
此外，按上述方法用滴度為107cfu/ml的Eco-EGFP病毒上清進行相同的步驟。三次實驗的基因?qū)胄实木凳居诒?。結(jié)果也證明，當將具有結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒活性的功能性物質(zhì)與層粘連蛋白聯(lián)合應用時，也增加所述基因?qū)胄省?br> 表8

基因?qū)胄室裕ワ@示。
實施例6用層粘連蛋白將基因?qū)氆@自小鼠脾細胞的CD-3陽性T細胞按下述方法制備獲自小鼠脾細胞的CD-3陽性T細胞。從6-8周齡的C3H/He雌性小鼠的脾收集細胞。將該細胞通過100-μm的篩目(Falcon)去除殘渣。用含10％FCS的Hanks’平衡鹽溶液(HBSS，BjoWhittaker)洗滌所得的細胞，并用紅細胞溶解緩沖液溶解紅細胞，用HBSS再次洗滌所述細胞。將獲得的細胞通過30-μm的篩目(MiltenyiBiotec)去除殘渣，再用柱子純化濃縮CD3-陽性T細胞(R&D系統(tǒng))。按下述方法預刺激用于病毒感染實驗的小鼠CD3-陽性T細胞。將用于預刺激的細胞培養(yǎng)于固定有抗鼠CD3抗體和抗鼠CD28抗體(兩種均為1μg/ml，Pbarmingen)的Petri培養(yǎng)皿中。該Petri培養(yǎng)皿中含添加有10％FCS、50單位/ml的青霉素和50μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基(Bio Whittaker)。將所述細胞于37℃、5％CO2下培養(yǎng)2天。
如實施例5所述，用含有20μg/ml的小鼠層粘連蛋白和80μg/ml的CH-296的混合物包被24孔培養(yǎng)板。在該微量培養(yǎng)板的各孔中加入105CD3-陽性T細胞和0.5ml的Eco-EGFP病毒上清(105cfu/ml)進行病毒感染3小時。另外再加入含10％FCS、500單位/ml的重組小鼠的白細胞介素-1α(Genzyme)、10ng/ml的重組小鼠白細胞介素-2(Genzyme)、50單位/ml的青霉素和50μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)后，用細胞分離緩沖液收集并洗滌細胞。按實施例4所述方法計算基因?qū)胄?。結(jié)果示于表9。
表9

基因?qū)胄室裕ワ@示。
如表9所示，本實驗證明由于層粘連蛋白的共同存在，基因?qū)氲叫∈驝D3-陽性T細胞的效率增加。
實施例7基因?qū)胫袑诱尺B蛋白分子的糖鏈的參與如實施例5所述，按50μl/孔用含有5μg/ml的小鼠層粘連蛋白和80μg/ml的CH-271的混合物包被96孔微量細胞培養(yǎng)板。用不同的具有切割糖鏈的活性酶處理培養(yǎng)板，觀察對基因?qū)胄实挠绊憽?br> 用以下的酶處理培養(yǎng)板配制在50mM的檸檬酸磷酸緩沖液(pH5.0)中含有500mU/ml O-聚糖酶(內(nèi)切-α-N-乙酰半乳糖胺酶，Seikagaku Corp.)、500mU/ml的內(nèi)切糖苷酶H(內(nèi)切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶H，Seikagaku Corp.)、250mU/ml內(nèi)切-β-半乳糖苷酶(Seikagaku Corp.)和2mU/ml的α-甘露糖苷酶(Seikagaku Corp.)的酶溶液。配制在100mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.6)中含有250mU/ml糖肽酶F(肽N-糖苷酶F，Takara Shuzo)的酶溶液。在各孔中加入酶溶液各50μl，于37℃反應20小時。然后用PBS洗滌所述培養(yǎng)板三次并將其用于病毒感染實驗。
在所述微量板的各孔中加入104生長于含10％FCS、50單位/ml的青霉素和50μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中的小鼠白血病細胞L1210以及50μl PM5neo病毒上清(104cfu/ml)。將該板培養(yǎng)24小時。將培養(yǎng)基換成含終濃度為0.75mg/ml G418(Gibco)的相同的培養(yǎng)基。將該板再培養(yǎng)48小時。按實施例3所述方法評價G418抗性細胞。結(jié)果示于表10。表10是3組實驗結(jié)果的總結(jié)。
表10


如表10所示，與單獨使用CH-271比較，當聯(lián)合使用CH-271與層粘連蛋白時，G418抗性細胞的出現(xiàn)增多。用內(nèi)切糖苷酶H處理用層粘連蛋白包被的培養(yǎng)板，可完全去除層粘連蛋白的促進基因?qū)氲淖饔谩４送?，用?甘露糖苷酶或糖肽酶F處理所述培養(yǎng)板，也一定程度地減低基因?qū)胄?。根?jù)關于層粘連蛋白分子的糖鏈的報道[Biochim.Biophysi.Aeta，883112-126(1986)]，大多數(shù)的層粘連蛋白分子的糖鏈是與天冬酰胺結(jié)合的N-聯(lián)糖鏈。有43個分子的N-聯(lián)糖鏈與層粘連蛋白分子結(jié)合。在這些糖鏈中，用內(nèi)切糖苷酶H處理可釋放高甘露糖型的天冬酰胺-N-聯(lián)糖鏈。用α-甘露糖苷酶處理也觀察到基因?qū)胄蕼p低的事實提示層粘連蛋白分子的糖鏈起著重要作用。這種糖鏈具有可被α甘露糖苷酶裂解的含有α1-2-和/或α1-6-鍵合甘露糖的結(jié)構(gòu)，以(甘露糖)9-(GlucNAc)2-Asn和/或(甘露糖)6-(GlucNAc)2-Asn表示。如上所述，本實驗證明層粘連蛋白促進基因?qū)氲淖饔檬怯捎趯诱尺B蛋白分子的糖鏈的作用，特別是高甘露糖型的糖鏈。
下面實驗證實了(甘露糖)9-(GlucNAc)2-Asn參與基因?qū)氲倪^程。
將從去脂的大豆粉(Sigma)中用固定有乳糖的Sepharose CL-2B(Pharmacia)制備的大豆凝集素1克熱變性，然后用溶于20ml含10mMCaCl2的50mM Tris-HCl緩沖液(pH7.2)中的肌動蛋白酶E(ActinaseE，Kaken Pharmaceutical)20mg于37℃消化2天。用熱將酶滅活后，將所述混合物上樣到Sephadex G-15(50ml)柱和Sephadex G-25(150ml)的層析柱上層析純化(甘露糖)9-(GlucNAc)2-Asn。圖1所示為去除了天冬酰胺殘基的(甘露糖)9-(GlucNAc)2-Asn的結(jié)構(gòu)。
制備經(jīng)共價鍵結(jié)合固定有CH-271和(甘露糖)9-(GlucNAc)2-Asn的微量培養(yǎng)板。簡要地說，用4mg/ml水溶性的碳化二亞胺溶液于37℃激活96孔的碳類培養(yǎng)板(ELISA Carbo-type plate)(SumitomoBakelite)2小時，然后用無菌水洗滌3次。在經(jīng)激活處理的96孔碳類培養(yǎng)板的各孔中加入50μl的2％BSA或80μg/ml的CH-271和不同濃度的(甘露糖)9-(GlucNAc)2-Asn的各溶液。將該板于37℃固相化反應2小時。用0.2％的甘氨酸溶液于4℃封閉該板15小時，然后用于以下的基因?qū)雽嶒灐?br> 在所述微量板的各孔中加入103L1210細胞和0.1ml Eco-EGFP病毒上清(106cfu/ml)。將該板培養(yǎng)48小時后，在各孔中加入0.1ml含F(xiàn)CS、青霉素和鏈霉素的新鮮RpMI 1640培養(yǎng)基。將該板繼續(xù)培養(yǎng)24小時。收集并洗滌所述細胞。按實施例4所述方法計算基因?qū)胄省纱为毩嶒灥钠骄Y(jié)果示于表11。
表11

基因?qū)胄室裕ワ@示。
如表11所示，在固定有(甘露糖)9-(GlucNAc)2-Asn和CH-271的所述板的孔中，基因?qū)胄实脑黾右蕾囉谒锰擎湹臐舛?。因此，證實增加的基因?qū)胄蕷w因于具有與層粘連蛋白分子相同結(jié)構(gòu)的糖鏈。
實施例8將抗CD4單克隆抗體用于CD4-陽性細胞的特異性基因?qū)肴鐚嵤├?所述將1μg/ml的抗小鼠CD4單克隆抗體或抗小鼠CD44單克隆抗體(兩者均得自Pharmingen)和80μg//ml的H-271、CH-271或CH-296一起包被未經(jīng)處理的24孔微量細胞培養(yǎng)板。根據(jù)預包被方法進行H-271的包被，而根據(jù)雞尾酒法進行CH-271和CH-296的包被。
在該微量板的各孔中加入0.5ml Eco-EGFP病毒上清(107cfu/ml)。將該板于32℃孵育3小時，然后用含10％FCS、50單位/ml的青霉素、50μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌。按實施例6所述方法制備從小鼠脾細胞衍生的CD3-陽性T細胞并經(jīng)預刺激，將105該細胞加入到所述孔內(nèi)進行病毒感染3小時。然后，在該孔中加入含10％FCS、500單位的重組小鼠白介素-1α、10ng/ml重組小鼠白介素-2、50單位/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基。將該板繼續(xù)培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)后，用細胞分離緩沖液收集并洗滌所述細胞，然后用標記有藻紅蛋白(PE，Pharmingen)和propiniumiodide(PI，Sigma)的抗小鼠CD4單克隆抗體(Pharmingen)染色。將這些細胞上樣到流式細胞儀，用FACSVantage在激發(fā)光波長為488nm和發(fā)射光波長為515-545nm或562-588nm雙相分析活細胞中CD4抗原和EGFP的表達。計算CD4-陽性和CD-4陰性細胞的基因?qū)胄?。結(jié)果示于表12。表12是四次實驗的總結(jié)。
表12

(均數(shù)±標準差)如表12所示，用包被有單克隆抗體和纖連蛋白片段的培養(yǎng)板進行逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染時，觀察到來源于小鼠脾細胞的CD3-陽性T細胞的基因?qū)胄试黾拥淖饔谩?br> 特別應該注意到當抗CD4單克隆抗體與具有結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒活性的功能性物質(zhì)聯(lián)合使用進行病毒感染時，基因?qū)隒D4陽性細胞的效率遠遠高于導入CD4陰性細胞的效率。例如，抗CD4單克隆抗體與H-271聯(lián)合應用時，基因?qū)隒D4陽性細胞的效率非常高(大約為60％)，而所述基因?qū)隒D4陰性細胞的效率僅約20％。當將CH-271或CH-296作為纖連蛋白片段應用時，觀察到相似的結(jié)果。
另一方面，98％以上的CD4陽性和CD4陰性細胞均表達CD44抗原。因此，預測當將抗CD44單克隆抗體如上所述用于逆轉(zhuǎn)錄病毒感染時，不管所述細胞是否表達CD4抗原，基因?qū)胄示鶎⒃黾印１?2的結(jié)果證實了這一預測。
實施例9將抗CD8a單克隆抗體用于CD8陽性細胞的特異性基因?qū)氤藢-271用作具有結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒活性的功能性物質(zhì)，以及將抗小鼠CD8a單克隆抗體(Pharmingen)和抗小鼠CD44單克隆抗體用作抗體外，按實施例8所述方法進行實驗。將標記有藻紅蛋白(PE；Pharmingen)的抗小鼠CD8a單克隆抗體(Pharmingen)用于檢測CD8陽性和CD8陰性細胞。結(jié)果示于表13。表13是兩次實驗結(jié)果的總結(jié)。
表13

(均數(shù)±標準差)如表13所示，當抗CD8a單克隆抗體與纖連蛋白片段聯(lián)合應用時，觀察到來源于小鼠脾細胞的CD3-陽性T細胞的基因?qū)胄试黾拥淖饔谩?br> 如實施例8中觀察到的，當使用抗CD8a單克隆抗體時，觀察到表達被該抗體識別的CD8抗原表達細胞的高基因?qū)胄?。另一方面，當用抗CD44單克隆抗體時(98％以上的CD8陽性和CD8陰性細胞均表達CD44)，在這兩種細胞之間未發(fā)現(xiàn)基因?qū)胄实牟町悺?br> 實施例8和9的實驗結(jié)果很有意義，這些結(jié)果證實如果將可特異性結(jié)合所述靶細胞的抗體和具有結(jié)合病毒活性的功能性物質(zhì)的混合物(雞尾酒樣)包被培養(yǎng)容器，用含有目的基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染培養(yǎng)容器中含有靶細胞的細胞群體時，可將目的基因特異地導入該靶細胞中。
實施例10利用抗體的細胞特異性基因?qū)肴鐚嵤├?所述，根據(jù)雞尾酒方法用80μg/ml的CH-271和1μg/ml一種抗不同細胞表面抗原的單克隆抗體(抗CD4、抗CD8、抗CD44、抗CD49c、抗CD49d和抗CD49e的抗體，均來自Pharmingen)包被未經(jīng)處理的24孔微量細胞培養(yǎng)板。
將K562(人慢性髓性白血病細胞，ATCC CCL-243)、HSB-2(人急性淋巴母細胞性白血病細胞，CCRF-HSB-2，ATCC CCL-120.1)、MOLT-3(人急性淋巴母細胞性白血病細胞，ATCC CRL-1552)和TF-1(人紅白血病細胞，ATCC CRL-2003)作為靶細胞，用標記的各自的單克隆抗體對這些細胞進行流式細胞儀分析以測定相應抗體的抗原表達。
在所述微量板的各孔中加入0.5ml的Ampho-EGFP病毒上清(1×106cfu/ml)。將該板于32℃培養(yǎng)3小時，然后用含10％FCS、50單位/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌。在各孔中加入懸浮在1ml培養(yǎng)基中的1×105各不相同細胞進行病毒感染。繼續(xù)培養(yǎng)3天后，用細胞分離緩沖液收集并洗滌該細胞，按實施例4所述方法用流式細胞法計算EGFP基因?qū)胄省?br> 結(jié)果示于表14，顯示的結(jié)果是三次獨立實驗的平均值。
表14

假設未加抗體的相應細胞的基因?qū)胄蕿?00％加入抗體的基因?qū)胄室韵鄬χ担ケ硎尽?br> CD抗原表達比(CD ag exp.Ratio)代表FACS測量時陽性細胞的比例(％)，如下所示-10％或更少；+/-10-30％；+30-60％；++60-90％；+++90％或更高。
如表14所示，當用雞尾酒的方法將CH-271作為病毒結(jié)合物質(zhì)并將抗細胞上的抗原的抗體作為細胞結(jié)合物質(zhì)時，抗原表達效率與基因?qū)胄氏嚓P。
此外，以80μg/ml的聚賴氨酸替代CH-271作為具有結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒活性的功能性物質(zhì)進行基因?qū)雽嶒?。所用的單克隆抗體、細胞和其它實驗條件如以上所述。結(jié)果示于表15，顯示的是三次獨立實驗的平均結(jié)果。
表15

假設未加抗體的相應細胞基因?qū)胄蕿?00％，加入抗體的基因?qū)胄室韵鄬χ?％)表示。
CD抗原表達比(CD ag exp.Ratio)代表FACS測量時陽性細胞的比例(％)，如下所示-10％或更少；+/-10-30％；+30-60％；++；60-90％；+++90％或更高。
如表15所示，當用雞尾酒的方法將聚賴氨酸作為病毒結(jié)合物質(zhì)并將抗細胞上的抗原的抗體作為細胞結(jié)合物質(zhì)時，抗原表達率與基因?qū)胄氏嚓P。
上述兩組實驗結(jié)果證明，根據(jù)雞尾酒方法，將可特異性識別靶細胞表達的抗原的抗體作為細胞結(jié)合物質(zhì)，可以通過基因?qū)雽⒒蛱禺愋缘貙肽康陌屑毎?br> 實施例11將基因?qū)朐诤ヨF胺的培養(yǎng)基中預培養(yǎng)的靶細胞將用含10％FCS、50單位/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的人髓細胞性白血病HL-60細胞(ATCC CCL-240)在感染實驗前一天轉(zhuǎn)換到含不同濃度去鐵胺(Sigma)的相同培養(yǎng)基中。將所述細胞于37℃、5％CO2存在下培養(yǎng)20小時。使用時用不含去鐵胺的新鮮培養(yǎng)基洗滌該細胞，然后按2×105細胞/ml的濃度懸浮細胞并用于下列感染實驗。
在未經(jīng)處理的24孔微量細胞培養(yǎng)板的各孔中加入0.5ml的80μg/ml的CH-271。將該板置于4℃過夜，用2％BSA封閉30分鐘并用PBS洗滌。在該微量板的各孔中加入0.5ml的Ampho-EGFP病毒上清(106cfu/ml)。將該板于32℃培養(yǎng)3小時并用含10％FCS、50單位/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌。在各孔中加入105個預培養(yǎng)的HL-60細胞。將該板培養(yǎng)48小時。在各孔中加入0.5ml含10％FCS、50單位/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)該板24小時。然后按實施例4所述方法測定基因?qū)胄省＝Y(jié)果示于表16和17。
表16

表17

如表16和表17所示，用去鐵胺預處理HL-60細胞20小時，就可觀察到基因?qū)胄实脑黾印Ｒ阎獑为氂肅H-271時基因?qū)氲紿L-60細胞的效率非常低。
實施例12培養(yǎng)上清中病毒感染抑制物質(zhì)的存在的檢測將實施例2中制備的TKNeo病毒上清用DMEM、NIH/3T3細胞(ATCC CRL-1658)的培養(yǎng)上清或CRIP細胞的培養(yǎng)上清稀釋至312.5cfu/ml的濃度用于下列步驟。
在未經(jīng)處理的24孔微量細胞培養(yǎng)板的各孔中加入0.5ml的32μg/ml的CH-296。將該板置于室溫2小時，用2％BSA封閉30分鐘并用PBS洗滌。在該板的各孔中加入1ml上述提及的病毒上清和2×104NIH/3T3細胞。將該板于37℃培養(yǎng)過夜。然后將所述細胞培養(yǎng)于含0.75mg/ml的G418的選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天。計數(shù)形成的集落隆數(shù)。將G418抗性克隆數(shù)和不含G418的培養(yǎng)基內(nèi)形成的克隆數(shù)之比定義為基因?qū)胄?。結(jié)果示于表18。
表18

如表18所示，與用DMEM稀釋時的基因?qū)胄时容^，當用NIH/3T3細胞培養(yǎng)上清或CRIP細胞培養(yǎng)上清稀釋病毒時，所述基因?qū)胄式抵?/5或更低。NIH/3T3細胞是許多包裝細胞系，如CRIP細胞和GP+EmvAm12細胞的親代細胞，可將這些細胞用于生產(chǎn)本實驗使用的TKNeo病毒載體的生成細胞。觀察到這些細胞的培養(yǎng)上清的抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的活性的現(xiàn)象提示，用相似包裝細胞制備的病毒上清也含有抑制性物質(zhì)。
實施例13病毒上清中的病毒感染抑制物質(zhì)的去除以下步驟用于去除實施例12中發(fā)現(xiàn)的病毒感染抑制物質(zhì)。將實施例2中制備的TKNeo病毒上清用CRIP細胞的培養(yǎng)上清稀釋到5000cfu/ml濃度。將已稀釋的上清進一步用DMEM二倍稀釋以用作含逆轉(zhuǎn)錄病毒的樣品。
如實施例11所述，在用CH-296包被的培養(yǎng)板的各孔中加入1ml所述病毒上清。將該板孵育1到5個小時，使病毒顆粒與CH-296接觸并結(jié)合。然后用PBS洗滌該板3次。在各孔中加入1ml含2×104NIH/3T3細胞的DMEM。對照組將2×104NIH/3T3細胞懸浮于1ml上述提及的病毒上清中并立即轉(zhuǎn)移到用CH-296包被的培養(yǎng)板中。將這些培養(yǎng)板于37℃培養(yǎng)過夜，使所述病毒感染細胞。感染后，將該細胞用含0.75mg/ml G418的選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)10天，并計數(shù)形成的集落數(shù)。將G418抗性集落數(shù)和不含G418的培養(yǎng)基內(nèi)形成的集落數(shù)之比定義為基因?qū)胄?。結(jié)果示于圖3。
如圖3所示，與對照組的導入效率比較，當病毒顆粒與包被在培養(yǎng)板上的CH-296接觸并結(jié)合3小時時，觀察到較高的基因?qū)胄?。因此證明用上述方法可去除病毒上清中抑制病毒感染的活性。
實施例14病毒上清中的丁酸鈉的去除通過將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒pLEIN導入CRIP細胞獲得重組逆轉(zhuǎn)錄病毒生成細胞，將該細胞培養(yǎng)于含10％CS的DMEM中。當細胞在10厘米的培養(yǎng)皿中生長達半融合時，將培養(yǎng)基換成7ml含10％FCS的RPMI 1640或7ml含5mM丁酸鈉(Nacalai Tesque)和10％FCS的RPMI 1640。將細胞培養(yǎng)24小時后，用0.45μm的濾膜過濾上清以獲得病毒上清。按實施例2所述方法測定該病毒上清的滴度。不含丁酸鈉的病毒上清的滴度為3.3×104cfu/ml，而含5mM丁酸鈉的病毒上清的滴度為2×106cfu/ml。
丁酸鈉具有抑制細胞周期從而抑制細胞生長以及誘導細胞分化的活性。因此可能對感染的細胞有不利的影響。下面是對去除病毒上清中的丁酸鈉的評估。
將HL-60細胞作為靶細胞。按實施例12所述方法在用CH-296包被的培養(yǎng)板的各孔中加入0.5ml上述提及的病毒上清。將該板于37℃孵育3小時，使病毒顆粒與CH-296接觸并結(jié)合。孵育后，用PBS洗滌該板3次。在各孔中加入0.5ml含5×104HL-60細胞的10％FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基。對照組將5×104HL-60細胞懸浮于0.5ml上述提及的病毒上清中并立即加入到用CH-296包被的培養(yǎng)板中。將這些培養(yǎng)板于37℃培養(yǎng)過夜，使所述病毒感染細胞。孵育后，在各孔中加入1ml的含10％FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基。將該板繼續(xù)培養(yǎng)48小時。然后計數(shù)細胞數(shù)。此外，根據(jù)實施例4所述用流式細胞儀法檢測EGFP表達細胞以分析所述基因?qū)胄?。結(jié)果示于表19。
表19

如表19所示，當對照組應用加入丁酸鈉制備的病毒上清時，觀察到較高的基因?qū)胄?，證實了病毒制備中丁酸鈉的作用。然而觀察到用所述含丁酸鈉的上清時活細胞的數(shù)目只有用不含丁酸鈉的上清時的1/4或更少，證實丁酸鈉抑制細胞生長。另一方面，預先將病毒顆粒與包被在培養(yǎng)板上的CH-296接觸并結(jié)合，未觀察到細胞生長受抑制，而此現(xiàn)象見于應用含丁酸鈉的上清的對照組。觀察到基因?qū)胄实脑黾?，而不是減少。因此證明，通過病毒與CH-296接觸后的洗滌，排除了丁酸鈉的影響，可實現(xiàn)高基因?qū)胄省?br> 下面用DEAE-葡聚糖進行相似的實驗。
將DEAE-葡聚糖(Sigma)按10mg/ml的濃度溶于PBS中。將該溶液用0.22μm濾膜過濾滅菌并將其用于包被培養(yǎng)板。在未經(jīng)處理的6孔細胞培養(yǎng)板(Iwaki Glass)的各孔中加入1.1ml的混合物，該混合物通過將10體積的PBS與1體積的DEAE-葡聚糖溶液混合所得。將該板于4℃孵育過夜。去除培養(yǎng)板孔中的DEAE-葡聚糖溶液。在各孔中加入2ml的2％BSA溶液處理30分鐘。用2ml/孔的PBS洗滌該板3次。對照組除應用PBS替代DEAE-葡聚糖溶液外，按相同步驟制備培養(yǎng)板。
按上述加入丁酸鈉的方法，應用通過將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒pLEIN導入GP+E86細胞[J.Virol.，621120-1124(1988)]而獲得的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒生成細胞制備病毒上清。在各孔中加入1ml的病毒稀釋液(1.6×106cfu/ml)，該稀釋液通過用20體積的含10％CS的DMEM稀釋1體積所述病毒上清而獲得。將該板于37℃培養(yǎng)2小時，然后用2ml/孔的PBS洗滌該板3次。在各孔中加入5×104NIH/3T3細胞。將該板于37℃、5％CO2存在下培養(yǎng)3天。培養(yǎng)后，用胰蛋白酶處理并收集所述細胞。按實施例4所述用流式細胞儀法分析EGFP表達細胞以測定基因?qū)胄?。結(jié)果示于表20。
表20

基因?qū)胄适且訣GFP陽性細胞與總細胞數(shù)之比(％)來表示。
如表20所示，證明DEAE-葡聚糖同樣具有結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒的活性，并可將其用于本發(fā)明的基因?qū)敕椒ā?br> 實施例15應用離心法使功能性物質(zhì)與逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合將導入了含有新霉素抗性基因[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，842150-2154(1987)]的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒DOL載體的CRIP細胞培養(yǎng)于含10％CS、50單位/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的DMEM中。按下述方法制備DOL病毒上清。當所述病毒生成細胞在10厘米的培養(yǎng)皿中生長達半融合時，將培養(yǎng)基換成5ml的含10％CS的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)24小時后，收集上清并用0.45μm的濾膜(Millipore)過濾該上清。所述病毒上清的滴度為8.7×105cfu/ml。
用于逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細胞的離心管(50ml聚丙烯圓錐形管，F(xiàn)alcon)按下述方法用CH-296包被。簡要地說，將3ml的含40μg/mlCH-296的PBS慢慢地加入該離心管的底部。將該管垂直放置于4℃培養(yǎng)16個小時。將CH-296溶液換成3.5ml含2％BSA的PBS。將該管置于室溫下繼續(xù)孵育30分鐘，然后用5ml的Hanks’平衡鹽溶液(HBSS，Gibco)洗滌。
按下述方法使DOL逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合到包被有CH-296的離心管的底部。簡要地說，將5ml的未經(jīng)稀釋的DOL病毒上清或其10倍、或其100倍的稀釋液加入所述離心管中。于25℃以2900xg離心該管3小時，迫使所述逆轉(zhuǎn)錄病毒與CH-296結(jié)合。作為對照，將上述提及的病毒上清加入到用含40μg/ml CH-296的PBS進行CH-296包被的未經(jīng)處理的6孔細胞培養(yǎng)板(Falcon)中，形成8μg/cm2的密度。將該板置于37℃4小時以便于結(jié)合并將其用于下面的步驟。
用包被有CH-296的離心管，并通過離心將逆轉(zhuǎn)錄病毒強行結(jié)合于CH-296，將基因?qū)隢IH/3T3細胞。簡要地說，將1×105NIH/3T3細胞加入到用CH-296包被的離心管中，該離心管內(nèi)有已經(jīng)離心過的所述病毒上清的系列稀釋液中的一種。將該管于37℃孵育3小時(以下稱離心法)。作為選擇，將上述提及的微量板在相同條件下孵育(此后稱結(jié)合法)。對照組在用CH-296包被的微量板中加入所述病毒上清和NIH/3T3細胞的混合物，并將該板于37℃孵育3小時。將應用后一種方法所得的結(jié)果定義為用傳統(tǒng)感染的方法所得的結(jié)果，并將其用作對比(此處以下稱上清法)。孵育后，收集細胞。按實施例13所述方法測定收集的細胞的基因?qū)胄?。結(jié)果示于圖4。圖4中，水平軸代表病毒上清的稀釋度而垂直軸代表基因?qū)胄??？招臈l圖，陰影條圖和實條圖分別代表用上清法、結(jié)合法和離心法所得的結(jié)果。
如圖4所示，應用離心法的基因?qū)胄矢哂趥鹘y(tǒng)的上清法和結(jié)合法(該方法中病毒在感染前自發(fā)地被吸附到CH-296)。因此證明通過離心力強行使病毒沉淀，可使更多的病毒顆粒在離心管的底部與CH-296結(jié)合。具體地說，當應用稀釋的病毒上清時，離心效應非常明顯。
此外，測定了經(jīng)離心法或靜置(結(jié)合法)結(jié)合病毒后收集的病毒上清的滴度。結(jié)果示于表21。
表21

如表21所示，當樣品靜置時，收集的上清約含有結(jié)合前上清滴度的80-90％。另一方面，用離心法強制性結(jié)合后的上清的滴度只有結(jié)合前上清的1/10或更低，這些結(jié)果證明，通過離心力使更多的病毒顆粒與CH-296結(jié)合。離心后用于洗滌離心管的PBS含有大約原病毒量的2％。此外，不管有無洗滌這一步驟，都觀察到幾乎相同的基因?qū)胄?。這些結(jié)果提示當應用離心法時，病毒顆?？删o密地與CH-296結(jié)合。
此外，將離心法的基因?qū)胄逝c細胞在離心過程中感染病毒的方法的基因?qū)胄首髁吮容^。
比較了用離心法和離心-感染的方法將基因?qū)隢IH/3T3細胞的效率，后者是用離心力將病毒沉淀到細胞上使其感染(參見WO95/10619)。如實施例14所述，用GP+E86細胞制備病毒上清，并用NIH/3T3細胞的培養(yǎng)上清將濃度稀釋到1×105cfu/ml，取5ml該病毒上清用于該比較。簡要地說，按下述方法進行基因?qū)搿⑸鲜鎏峒暗牟《旧锨寮尤氲接肅H-296包被的離心管中。于30℃以2900xg離心該管4小時，然后用PBS洗滌。然后將細胞加入到該管中，于37℃感染4小時(離心法)。將細胞加入到包被有CH-296的離心管中，并培養(yǎng)2小時。在該管中加入所述病毒上清。于30℃以2900xg離心該管4小時進行感染(離心-感染法)。在這些方法中，離心管均按上述方法用CH-296包被，并將1×105的NIH/3T3細胞用于基因?qū)?。將感染后的細胞重新平板接種到60-mm的培養(yǎng)皿中，并培養(yǎng)2天。然后按實施例4所述方法用流式細胞儀法測定EGFP基因?qū)胄?，結(jié)果示于圖5。
如圖5所示，結(jié)果證明，離心法的基因?qū)胄矢哂陔x心-感染法的基因?qū)胄?。認為這是由于通過洗滌去除了病毒上清中的感染抑制性物質(zhì)。
權(quán)利要求
1.用逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因?qū)氚屑毎姆椒?，其特征在于該方法包?1)將含有逆轉(zhuǎn)錄病毒的溶液與具有結(jié)合所述逆轉(zhuǎn)錄病毒的活性并固定于支持物上3小時或更長時間的功能性物質(zhì)接觸；(2)洗滌所述結(jié)合有所述逆轉(zhuǎn)錄病毒的支持物；和(3)將結(jié)合有所述逆轉(zhuǎn)錄病毒的支持物與靶細胞接觸并孵育其中，所述功能性物質(zhì)選自纖連蛋白、纖連蛋白片段、成纖維細胞生長因子、V型膠原蛋白、聚賴氨酸和DEAE-葡聚糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述具有結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒活性的功能性物質(zhì)具有結(jié)合靶細胞的活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中應用其上同時固定有所述具有結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒活性的功能性物質(zhì)和具有結(jié)合所述靶細胞的活性的另一種功能性物質(zhì)的支持物，所述具有結(jié)合所述靶細胞活性的功能性物質(zhì)選自細胞粘附蛋白、激素、細胞因子、抗體、糖鏈、碳水化合物和代謝物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中將細胞培養(yǎng)器皿或微粒支持物用作所述支持物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述含有逆轉(zhuǎn)錄病毒的溶液是在能促進逆轉(zhuǎn)錄病毒產(chǎn)生的物質(zhì)存在下獲得的逆轉(zhuǎn)錄病毒生成細胞的培養(yǎng)上清。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述含有逆轉(zhuǎn)錄病毒的溶液是在有丁酸鈉存在時獲得的培養(yǎng)上清。
7.一種用逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因?qū)氚屑毎姆椒?，其特征在于該方法包括在兩種功能性物質(zhì)存在下用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染靶細胞(1)選自纖連蛋白、纖連蛋白片段、成纖維細胞生長因子、V型膠原蛋白、聚賴氨酸和DEAE-葡聚糖的功能性物質(zhì)；和(2)選自特異性結(jié)合靶細胞表面的CD抗原的抗體和來源于層粘連蛋白或高甘露糖型糖鏈的糖鏈的功能性物質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述具有結(jié)合所述逆轉(zhuǎn)錄病毒的活性的功能性物質(zhì)具有結(jié)合靶細胞的活性。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的方法，其中兩種功能性物質(zhì)的至少一種固定在支持物上。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中將細胞培養(yǎng)器皿或微粒支持物用作所述支持物。
全文摘要
利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將基因?qū)氚屑毎母牧挤椒?，其中通過將逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合到固定在載體上并具有結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒活性的功能性物質(zhì)上并經(jīng)隨后的洗滌；應用能特異性識別細胞的抗體、作為具有結(jié)合靶細胞活性的物質(zhì)的層粘連蛋白或富含甘露糖型的糖鏈；預處理靶細胞使轉(zhuǎn)鐵蛋白受體活化；或?qū)⑿碌墓δ苄曰鶊F導入功能性物質(zhì)，使基因?qū)胄实玫礁纳?，并有效地轉(zhuǎn)化靶細胞。
文檔編號C12N15/867GK1737156SQ200410011520
公開日2006年2月22日 申請日期1999年6月25日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月1日
發(fā)明者上野充博, 吉岡廣文, 小西治子, 橋野仁一, 森下三保, 蝶野英人, 宮村毅, 佐野睦, 淺田起代藏, 藤永蕙, 加藤郁之進 申請人:寶生物工程株式會社