一種二化螟Bt蛋白受體ALP6基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種新的二化螟Bt蛋白受體ALP6基因及其應(yīng)用， 本發(fā)明還涉及一種檢測二化螟對Bt殺蟲蛋白抗性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 二化螟屬鱗翅目，螟蛾科，是水稻上危害最為嚴(yán)重的常發(fā)性害蟲，國內(nèi)各稻區(qū)均有 分布，以長江流域及以南稻區(qū)發(fā)生較重，近年來數(shù)量呈明顯上升的態(tài)勢，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán) 重威脅。
[0003] 蘇云金芽孢桿菌Bacillus thurihgiehsis，簡稱Bt，屬于芽孢桿菌科 Bacillaceae芽孢桿菌屬Bacillus，是一種革蘭氏陽性菌和昆蟲病原菌，廣泛存在于自然 界中。自上世紀(jì)30年代以來，Bt即作為生物殺蟲劑被廣泛用于田間害蟲防治，由于其殺蟲 譜廣，專一性強(qiáng)，對人畜無害，對環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，Bt制劑現(xiàn)已成為世界上應(yīng)用最廣的一類 微生物殺蟲劑。目前，編碼Bt殺蟲蛋白的多種基因已被成功轉(zhuǎn)入到了重要的糧棉作物中， 用于田間害蟲防治并發(fā)揮了重要作用，Cry IAc、Cry2Aa是已知Bt中的殺蟲蛋白。
[0004] ALP (alkaline phosphatase，堿性磷酸酶）在鞘翅目、雙翅目與鱗翅目昆蟲中被 鑒定為Bt殺蟲蛋白受體。首先，ALP以低親和度與活化的Bt蛋白單體結(jié)合，提升Bt蛋白 單體在質(zhì)膜表面的濃度以便呈遞給類鈣粘蛋白，隨后類鈣粘蛋白以高親和度結(jié)合Bt蛋白 單體，并催化Bt蛋白進(jìn)一步酶切而促進(jìn)寡聚化。其次，寡聚化的Bt蛋白以高親和度與CAD 及APN結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)穿孔形成，最終導(dǎo)致靶標(biāo)昆蟲死亡。此外，ALP在幼蟲較低齡期大量 表達(dá)，而這一時(shí)期恰是害蟲治理的關(guān)鍵時(shí)期，在Bt蛋白殺蟲過程中ALP具有重要作用。有 研宄表明，在對Bt殺蟲蛋白產(chǎn)生抗性的3種鱗翅目害蟲種群中mALP表達(dá)量普遍顯著降低 (Jurat-Fuentes et al.，2011)〇
[0005] 隨著轉(zhuǎn)Bt基因作物種植規(guī)模的逐步擴(kuò)大，昆蟲對Bt產(chǎn)生抗性的風(fēng)險(xiǎn)也日益增加。 目前國內(nèi)外的許多研宄已證明鱗翅目、鞘翅目和雙翅目的多種昆蟲經(jīng)過室內(nèi)汰選后可以對 不同的Bt蛋白產(chǎn)生抗性。Bt殺蟲蛋白對害蟲的作用機(jī)理是研宄防止抗性形成的基礎(chǔ)，因此 為了制定和實(shí)施合理的抗性治理策略，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)Bt作物的可持續(xù)利用，研宄昆蟲對Bt產(chǎn)生抗 性的機(jī)理就顯得尤為重要。
[0006] 二化螟對Bt殺蟲蛋白的抗性檢測仍局限于生物測定方法。然而，傳統(tǒng)的生物測 定方法有一些缺點(diǎn)：（1)靈敏度低：生物測定很難檢測早期抗性或低頻率抗性；（2)周期長： 二化螟的Bt生物測定結(jié)果一般需要2天（48小時(shí)）以上；（3)對試蟲數(shù)量要求很大：測定 一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線完成一次生測至少需要約200頭試蟲，且對昆蟲飼養(yǎng)的要求也很高；(4)操作 麻煩且標(biāo)準(zhǔn)性不強(qiáng)：方法比較繁瑣，操作起來比較復(fù)雜，從蟲源、飼養(yǎng)到測定難以做到真正 的標(biāo)準(zhǔn)化，尤其要求試蟲的大小一致，不僅導(dǎo)致生測的工作量加大，而且諸多人為因素也會(huì) 影響生測結(jié)果；（5)傳統(tǒng)的方法從軟件繪出的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出的LC50和LC90值的重復(fù)性和 精確性較低；(6)傳統(tǒng)的生物測定方法測得的昆蟲抗性水平往往具有滯后性。因此，建立一 種準(zhǔn)確、簡便、快速、可靠的二化螟Bt抗性檢測手段尤為迫切。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是針對上述缺陷，提供一種二化螟Bt蛋白受體ALP6基因，并進(jìn)一步 提供所述基因在檢測二化螟對Bt殺蟲蛋白抗性中的應(yīng)用。
[0008] 上述目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0009] 本發(fā)明提供的二化螟Bt蛋白受體ALP6基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。 [0010] 進(jìn)一步，本發(fā)明將ALP6基因通過構(gòu)建原核表達(dá)載體獲得了重組ALP6蛋白，并研宄 了重組ALP6蛋白與Bt殺蟲蛋白的結(jié)合能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該重組蛋白能與Bt殺蟲蛋白特異性 結(jié)合，從而驗(yàn)證了 ALP6基因的功能。
[0011] 在此基礎(chǔ)上，提供了一種檢測二化螟對Bt殺蟲蛋白抗性的方法，它包括以下步 驟：
[0012] 1)二化螟總基因組DNA的提?。?br>[0013] 2)設(shè)計(jì)特異性引物，按常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化、測序；
[0014] 3)將測序結(jié)果與所述的二化螟Bt蛋白受體ALP6基因序列進(jìn)行對比，檢查回收得 到的DNA是否出現(xiàn)突變位點(diǎn)；
[0015] 所述特異性引物為：
[0016] ALP6 基因的上游引物序列為 ATGCCCGCTAATCTGTTGCTGCTG ;
[0017] ALP6 基因的下游引物序列為 CAACCGCAACAATCCGAAGGCA。
[0018] 本發(fā)明的有益效果是：
[0019] 1)與傳統(tǒng)的二化螟對Bt殺蟲蛋白抗性檢測方法相比，本發(fā)明所提供的方法無需 將田間試蟲飼養(yǎng)至適宜蟲齡后再進(jìn)行測定以確定抗性水平，而是直接從田間采樣測試，不 需飼養(yǎng)試蟲，從而減少了中間過程，縮短了檢測周期，節(jié)省了勞動(dòng)力和資源。
[0020] 2)本發(fā)明具有檢測速度快，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，檢測靈敏度和精度高，檢測所需的 試蟲數(shù)量少，能實(shí)現(xiàn)真正的標(biāo)準(zhǔn)化操作，為二化螟對Bt殺蟲蛋白抗性的實(shí)時(shí)監(jiān)測提供了一 種新方法，進(jìn)一步為二化螟蟲害的有效治理提供了重要參考。
【附圖說明】
[0021] 圖1是ALP6基因 5'-RACE片段、3'-RACE片段和ORF (開放閱讀框）片段擴(kuò)增產(chǎn)物 電泳圖。圖中 Ml 為 DLlOOODNAmarker ;M2 為 DL2000DNAmarker ;第 1 道為 5' -RACE cDNA 片 段；第2道為3' -RACE cDNA片段；第3道為ORF片段。
[0022] 圖2是重組質(zhì)粒pET-28a(+)-ALP6的酶切鑒定。圖中：1是pET-28a雙酶切；M是 DL5000Marker ;2 是 ALP6 基因雙酶切。
[0023] 圖3是重組菌株pET-28a (+) -ALP6表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析，以及重組蛋白ALP6 的蛋白純化與結(jié)合分析。圖中M :26616 (Fermentas) ;1 :CK(重組載體未誘導(dǎo)）；2 :表達(dá)（重 組載體IPTG誘導(dǎo)）；3 :重組蛋白純化；4 :重組蛋白ALP6與CrylAc結(jié)合；5 :重組蛋白ALP6 與Cry2Aa結(jié)合。（說明：圖中ECL發(fā)光顯影呈現(xiàn)黑點(diǎn)表示ALP6可與Bt蛋白結(jié)合。）
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0025] 實(shí)施例1基因的克隆
[0026] L 按照 SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit 要求，設(shè)計(jì)克隆二化螟 Bt 蛋白 受體ALP6基因全長cDNA的PCR引物：
[0027] GSPl = 5'-GAACCCTTTCTCGTTGCGACTCAGTG-3' ；
[0028] GSP2 = 5,-GGTGGCTAACCGCAACTGGGAGAATG-3,。
[0029] 2.二化螟中腸總RNA的提?。?br>[0030] 二化螟敏感品系在人工飼料上室內(nèi)飼養(yǎng)多代，未接觸任何Bt制劑或蛋白。
[0031] ①用于RNA提取的玻璃器皿經(jīng)過去RNA酶處理（180 °C，烘烤4h);
[0032] ②準(zhǔn)備12-15頭二化螟4齡幼蟲，在冰上解剖取其中腸，在預(yù)冷的0. 7% NaCl中漂 洗干凈，用濾紙將緩沖液吸干，放入玻璃勻漿器；
[0033] ③加入Iml Trizol，在冰上充分勻漿后轉(zhuǎn)入I. 5ml離心管，室溫孵育5min ;
[0034] ④加入200 μ 1氯仿，劇烈震蕩15sec，室溫放置3min，4°C，12000rpm離心20min ;
[0035] ⑤小心將上清轉(zhuǎn)移到另一干凈離心管中，加入500 μ 1異丙醇，上下顛倒混勻，4°C 孵育15min ;
[0036] ⑥4°C，12000rpm離心lOmin，棄上清，加入800 μ 1 70%乙醇清洗沉淀；
[0037] ⑦4°C，7500rpm離心5min，用移液槍將乙醇徹底去除，干燥沉淀；
[0038] ⑧加入適量去RNA酶的水，溶解沉淀；
[0039] ⑨用瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測RNA的純度和濃度。
[0040] 3. cDNA 第一鏈合成
[0041] ①混勻以下試劑，并瞬時(shí)離心，將反應(yīng)管室溫放置：
[0042] 5X First-Strand Buffer 2.0 μ? DTT (二硫蘇糖醇 20mM) 1.0 μ? dNTP Mix (IOmM) 1.0 μ? 總體積 4.0 μ?
[0043] ②分別向這些管中加入對應(yīng)的以下試劑：
[0044] 準(zhǔn)備 5'-RACE cDNA
[0045] RNA 1 Ομ? 5'-CDS PrimerA 1 .Ομ? ddH.O 1.75μ1。 準(zhǔn)備 3'-RACEcDNA RNA I .Ομ? 3'-CDS PrimerA ?.ΟμΙ ddH.O 2.75μ1。
[0046] 混勻試劑，瞬時(shí)離心，721孵育31^11，然后42°0冷卻21^11，最后14,00〇1^111離心 IOsec0
[0047] ③向5' RACE反應(yīng)管中各加入1 μ I SMARTer IIA oligo,混勻后瞬時(shí)離心。
[0048] ④室溫下，按順序混勻以下試劑：
[0049] 預(yù)混緩沖液 4.0μ1 RNase 抑制劑(40 U/μΙ) 0,25μ1 SMARTScribe? Reverse Transcriptase (100 U) I .Ομ? 總體積 5.25μ1
[0050] ⑤分別向5' -RACE、3' -RACE的RNA反應(yīng)管中加入步驟④中的5. 25 μ 1混合物，每 管體積均為10 μ 1，使用槍輕柔地混勻試劑，瞬時(shí)離心。
[0051] ⑥42°C孵育90min，70°C加熱IOmin終止反應(yīng)。
[0052] ⑦用150 μ I EDTA緩沖液稀釋第一鏈反應(yīng)產(chǎn)物，-20 °C保存。
[0053] 4. cDNA 5' 末端快速擴(kuò)增一 5'-RACE
[0054] 根據(jù)SMARTer? RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒中5' -full race試劑盒說明書進(jìn)行，具體 方法如下：
[0055] ①準(zhǔn)備預(yù)混液用于PCR反應(yīng)，每次的反應(yīng)總體積是50 μ 1，混合以下試劑：
[0056] 超純水 34.5μ1 IOxPCR反應(yīng)緩沖液 5.0μ1 dNTP Mix(IOmM) Ι.ΟμΙ 50χ Advantage 2 Polymerrse Mix I .Ομ?
[0057] 總體積 41.5μ1〇
[0058] ②PCR反應(yīng)體系：
[0059] S'-RACE cDNA 2.5μ1 UPM(IOx) 5μ1 GSPl(lOpM) I μ? 預(yù)混液 41.5μ1 總體積 50μ1〇
[0060] PCR反應(yīng)程序：
[0061] 94°0預(yù)變性31^11;94°0變性3〇8,72°0復(fù)性延伸21^11，5個(gè)循環(huán) ：94°0變性3〇8， 70°C復(fù)性 30s，72°C延伸 2min，5 個(gè)循環(huán)；94°C變性 30s，68°C復(fù)性 30s，72°C延伸 2min，25 個(gè) 循環(huán)；72°C延伸IOmin。
[0062] 擴(kuò)增完成后，取PCR產(chǎn)物用6X核酸上樣緩沖液點(diǎn)樣，1. 0%瓊脂糖凝膠，IXTAE緩 沖液，120V，電泳20分鐘觀察結(jié)果。擴(kuò)增結(jié)果如圖1第1道所示得到973bp的DNA片段。
[0063] 將DNA片段純化后連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOPlO感受態(tài)細(xì)胞中，篩 選陽性克隆子送南京金斯瑞公司進(jìn)行測序分析。
[0064] 5. cDNA 3' 末端快速擴(kuò)增一 3'-RACE
[0065] ①準(zhǔn)備預(yù)混液用于PCR反應(yīng)，每次的反應(yīng)總體積是50 μ 1，混合以下試劑：
[0066] 超純水 34.5μ1 IOxPCR反應(yīng)緩沖液 5.0μ1 dNTP Mix(IOmM) Ι.ΟμΙ 5〇xAdvantage 2 Polymerrse Mix Ι.ΟμΙ 總體積 41.5μ1。
[0067] ②PCR反應(yīng)體系：
[0068] RACEcDNA 2.5μ1 UPM(IOx) 5μ1 GSP2(1(^M) Ιμ?