專利名稱：蘇云金桿菌cryIA(c)基因在蠟質(zhì)芽孢桿菌中營養(yǎng)期表達質(zhì)粒的構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蘇云金桿菌的cryⅠA(c)基因的克隆和分離方法及其在蠟質(zhì)芽孢桿菌(Bαcillus cereus)中營養(yǎng)期表達質(zhì)粒的構(gòu)建。
蘇云金桿菌(Bαcillus thuringiensis)簡稱Bt，是芽孢桿菌屬的一個種，屬革蘭氏陽性的土壤習居菌(伯杰細菌鑒定手冊)。由于它能產(chǎn)生具有特異殺蟲活性的伴孢晶體蛋白也稱殺蟲毒蛋白(Insecticidal crystal proteins，簡稱ICPs)或δ-內(nèi)毒素(δ-endotoxin)，可以有效地用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、醫(yī)學等害蟲的生物防治，對人、畜、有益天敵和環(huán)境無害，因而國內(nèi)外都出現(xiàn)了Bt的商品制劑。但Bt制劑本身存在一些問題，如在田間施用時有效期短，殺蟲活性有待提高等。因此，開展了這方面的進一步研究工作。
1953年Hannay首次發(fā)現(xiàn)蘇云金桿菌的殺蟲活性與伴孢晶體，隨后證實伴孢晶體是一種蛋白質(zhì)，由18種氨基酸組成，經(jīng)昆蟲腸液消化后，才能成為毒性物質(zhì)。1967年Heimpel將之命名δ-內(nèi)毒素，又稱伴孢晶體毒素。1977年Zakharyan等提出質(zhì)粒對伴孢晶體的形成有關(guān)(Debabor et al.,1977；Minnichand Aronson,1984)。1981年Schnepf和Whiteley首次將HD-1菌株產(chǎn)生的伴孢晶體的基因克隆到大腸桿菌中，并得到了表達，從而令人信服地確定Bt毒蛋白基因定位在質(zhì)粒上，并在1985年完成其核苷酸序列分析。1988年Kenowles和Ellar根據(jù)殺蟲譜進行Bt毒蛋白基因分類，把Bt毒蛋白基因分為五類，cryⅠ類特異地抗鱗翅目昆蟲，cryⅡ類特異地抗雙翅目和鱗翅目昆蟲，cryⅢ類特異地抗鞘翅目昆蟲，cryⅣ類特異地抗雙翅目昆蟲，cryⅤ類為無毒性的結(jié)晶蛋白。1989年Hofte和Whiteley依據(jù)Bt毒蛋白基因結(jié)構(gòu)的相似性及其抗蟲譜提出了一個新的分類系統(tǒng)，在Knowles-Ellar(1988)分類系統(tǒng)的基礎(chǔ)上增加了一類cytA(Cytolytic crystal protein gene)，這種基因編碼27KD的蛋白質(zhì)，它不僅對雙翅目昆蟲有毒性，而且對無脊椎動物及脊椎動物的細胞也有毒性，能使細胞溶解。并將cry基因系統(tǒng)的23種Bt毒蛋白基因分成五大類若干亞類。Bt毒蛋白的分類又依其基因分類而分為cryⅠ類晶體蛋白，尤其是cryⅠA晶體蛋白，是一類重要的殺蟲成分，分子量為130～140KD，對鱗翅目中的許多種類有高毒性。本發(fā)明所選用的目的基因cryⅠA(c)即屬于這一類；cryⅡ類晶體蛋白，分子量70KD左右，對鱗翅目和雙翅目有較高的毒力；cryⅢ類晶體蛋白，分子量約為70KD，對鞘翅目幼蟲有特異毒性；cryⅣ類晶體蛋白分子量約為130～135KD，對雙翅目蚊幼蟲有特異毒性；cytA晶體蛋白，分子量為27KD，除對蚊幼蟲有毒外，還對動物細胞有溶解作用。此外，Tailor在1992年發(fā)現(xiàn)一種80KD的晶體蛋白，對鱗翅目和鞘翅目幼蟲都有毒性，被命名為cryⅤ。Fcitclson等1992年提取了到對動植物細胞寄生線蟲有毒的兩類晶體蛋白，命名為cryⅤ和cryⅥ，但對它們的結(jié)構(gòu)和特性未作描述。翟林在1997年發(fā)現(xiàn)了一種新的對鱗翅目昆蟲具有廣譜活性的蘇云金桿菌殺蟲蛋白命名為Vip3A。Crickmore-N等于1998年對Bt毒蛋白的命名系統(tǒng)進行了綜述，他認為Whitely等1989年的分類系統(tǒng)，不再適合于種類快速增加的Bt毒蛋白的命名，提出了一個基于氨基酸序列的同一性的等級聚類分析命名法，將原有的羅馬字母改為阿拉伯數(shù)字如cry1Aa，以便更好地適應(yīng)不斷擴大的新種類，在這一命名系統(tǒng)中包括133個伴孢晶體蛋白，分屬24個大類。這種命名法已被許多學者認可并采用。Bravo-A等1998年利用這種命名法對從Mexican收集的Bαcillus thuringiensis基因進行了分類鑒定，能夠檢測到cry1、cry3、cry5、cry7、cry8、cry9、cry11、cry12、cry13、cry14、cry14、cry21和cyt基因，分屬于cry1和cry9兩個大類，對鱗翅目害蟲有殺蟲活性。
1981年Schnepf首次將蘇云金桿菌kurstaki HD-1的毒蛋白基因進行了分離克隆，并在1985年完成其核苷酸序列分析，自此，越來越多的Bt cry基因被分離、鑒定和克隆。1994年Broadwell對過去10年的cry基因克隆和測序研究進行了綜述，共有5個不同殺蟲譜的cry基因家族已經(jīng)被分離克隆，從cryⅠ-cryⅤ，并對其可能的宿主包括原核生物和真核生物(植物在內(nèi))進行了論述。1997年P(guān)erferson報道已有100多個Bt cry基因被分離和克隆，分屬20個大類。同時cry基因的鑒定、克隆技術(shù)也不斷改進，1997年Benv-Dov等采用多重PCR法，利用通用引物和特異性引物，將60個cry基因進行快速鑒定克隆。此后，Chang等1998年從Bαcillus thuringiensis subsp.kenyαe中分離并克隆了cry1E基因，Barboza等1998年克隆了新的cry基因-cry1Ea4并進行了表達，可殺死甜菜夜蛾(Spodopterα exiguα),Chang等1999年從Bαcillus thuringiensis subsp.kenyαe中分離并克隆了cry1E基因。Bt毒蛋白基因的分離鑒定及克隆為重組微生物和轉(zhuǎn)基因抗蟲植物打下了基礎(chǔ)，并準備了原料。
最早用于克隆Bt毒蛋白基因的宿主菌是Escherichiα coli(即大腸桿菌，基因工程中常用的載體菌)，克隆和測序均在這一菌中進行，但在E.coli中毒蛋白的產(chǎn)量遠遠低于Bt本身，這可能是由于Bt和E.coli中毒蛋白的調(diào)控子不同所致。Bt毒蛋白基因最好的表達宿主是Bt本身，將Bt毒蛋白基因轉(zhuǎn)入Bt的其它亞種體內(nèi)，能擴大原有Bt的殺蟲譜，提高殺蟲效果。1983年Klier等將猝倒亞種crylAa基因轉(zhuǎn)至以色列亞種體內(nèi)，重組工程菌既對鱗翅目大菜粉蝶有毒性也對雙翅目伊蚊有毒殺活性。1988年Garduno等將對鞘翅目有毒菌株Bt擬步甲亞種的基因轉(zhuǎn)到對蚊幼蟲有毒的以色列亞種體內(nèi)，使重組后微生物對鞘翅目、雙翅目以及鱗翅目害蟲均有毒性。Ecogen公司1990用庫斯塔克亞種和擬步甲亞種結(jié)合產(chǎn)生的工程菌，商品名為Foli，來防治鱗翅目和鞘翅目昆蟲，是一種有高毒效的新商品。1997年Clonaje等對蚊幼蟲有殺蟲活性的Bt medellin毒蛋白基因轉(zhuǎn)入Bt以色列亞種體內(nèi)，重組工程菌對蚊幼蟲有高毒性。1998年Barboza等將Bt crylEa4基因轉(zhuǎn)入一個無cry基因的Bt菌株中，重組菌株表達Bt crylEa4基因，產(chǎn)生菱形晶體蛋白。也進行了將Bt毒蛋白基因轉(zhuǎn)入非Bt微生物宿主中，使轉(zhuǎn)化后的重組菌兼具宿主菌的特點并表達Bt毒蛋白。1986年Annapur等將Bt毒蛋白基因轉(zhuǎn)入對植物病原菌有抑制作用的枯草芽孢桿菌Bαcillus subtilis、巨大芽孢桿菌Bαcillus megαtisim以及蠟質(zhì)芽孢桿菌Bαcillus ceresus體內(nèi)，使其高效表達，這樣產(chǎn)生的工程微生物既能防病又能殺蟲，是一類新型微生物農(nóng)藥。1986年Obukwicz等將Bt毒蛋白基因轉(zhuǎn)入一種能在玉米根際定植的熒光假單胞菌體內(nèi)(Pseudomonαsfluorescens)，將其制成生物制劑用于玉米拌種，可以控制地下害蟲的危害。美國Mycogen公司1992年將這種重組微生物通過物理或化學方法，制備出一種生物囊制劑，可以延長其殘效期4～5倍。Turner等1991年，Lampel等1994年將Btδ-內(nèi)毒素基因轉(zhuǎn)入了能在玉米維管束定植的玉米內(nèi)生細菌Clαvibαcter xyli subsp.cynontis(CXC)體內(nèi)，工程菌(CXC/Bt)防治歐洲玉米螟，能減少玉米螟危害60％。1998年Selinger等將Bt kurstαki δ-內(nèi)毒素基因轉(zhuǎn)入到根圍定居菌Bαcillus pumitus體內(nèi)，用于防治地老虎害蟲(Agrotisorthogoniα)，結(jié)果顯示將Btδ-內(nèi)毒素基因?qū)敫鶉毦糜谏锷锓乐问强尚械?。也有將Bt毒蛋白基因轉(zhuǎn)入蘭細菌和根瘤菌的報道。
另外，1987年Vaeck等報道了第一例轉(zhuǎn)Bt毒蛋白基因煙草抗煙草天蛾后，轉(zhuǎn)Bt基因植物的研究得到了迅猛的發(fā)展，新的cry基因不斷被發(fā)掘，轉(zhuǎn)cry基因的植物種類正在擴展。1998年Schuler等將不同的cry基因?qū)χ参锏霓D(zhuǎn)化進行了綜述。有些轉(zhuǎn)cry基因的作物正在進行田間抗蟲實驗，而一些表現(xiàn)穩(wěn)定抗蟲的轉(zhuǎn)基因作物已經(jīng)或正在走向市場。
本發(fā)明的目的是向棉花內(nèi)生細菌蠟質(zhì)芽孢桿菌克隆Bt殺蟲毒蛋白基因cryⅠA(c)，構(gòu)建成棉花內(nèi)生工程菌。該棉花內(nèi)生工程菌不僅在產(chǎn)孢期能產(chǎn)生伴孢晶體蛋白，在營養(yǎng)生長期也能產(chǎn)生殺蟲毒蛋白，殺蟲毒力比Bt制劑提高了，而且該工程菌接種棉花后，能夠在棉株體內(nèi)定植、擴增，表達殺蟲毒蛋白，在棉花的整個生長季節(jié)都能表現(xiàn)殺蟲活性。
本發(fā)明的目的是通過分離和克隆Bt殺蟲毒蛋白基因cryⅠA(c)，然后在蠟質(zhì)芽孢桿菌中營養(yǎng)期表達質(zhì)粒構(gòu)建該基因來達到的。
分離和克隆Bt殺蟲毒蛋白基因cryⅠA(c)的步驟如下A、提取Bαcillus thuringiensis基因組DNA；B、純化Bαcillus thuringiensis基因組DNA；C、從Bαcillus thuringiensis基因組DNA中分離cryⅠA(c)基因；D、用限制性內(nèi)切酶部分消化進行cryⅠA(c)基因作圖。
在蠟質(zhì)芽孢桿菌中營養(yǎng)期表達質(zhì)粒構(gòu)建蘇云金桿菌cryⅠA(c)基因的步驟如下A、構(gòu)建質(zhì)粒pEG434B、將Bt cryⅠA(c)基因插入質(zhì)粒pEG434形成質(zhì)粒pEG501；C、構(gòu)建質(zhì)粒pBC601附

圖1是在蠟質(zhì)芽孢桿菌中營養(yǎng)期表達質(zhì)粒構(gòu)建蘇云金桿菌cryⅠA(c)基因的流程圖。
以下通過實施例來更詳細地說明本發(fā)明。
實施例(一)、Bt cryⅠ(c)基因的分離和克隆1、材料供試菌株Bαcillus thuringiensis subsp.kurstαki HD-73(由美國俄勒岡州大學提供)培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基(Bacto-胰蛋白胨10g/l；Bacto-酵母抽提物5g/l；NaCl10g/l；pH 7.5),TE緩沖液，10％(w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS),20mg/ml蛋白酶K,5mmol/l NaCl,CTAB/NaCl溶液，24∶1氯仿/異戊醇，25∶4∶1酚/氯仿/異戊醇，異丙醇，70％乙醇，SphⅠ,NruⅠ內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶，WizardTMDNA purification system2、方法A、Bαcillus thuringiensis subsp.kurstαki HD-73基因組DNA的提取將培養(yǎng)至飽和狀態(tài)的細菌培養(yǎng)物沉淀，用TE緩沖液重懸，加入10％的SDS和蛋白酶K，于37℃下溫育1小時，加入5M的NaCl，充分混勻，再加入CTAB/NaCl溶液混勻后，于65℃溫育10分鐘(從這一步開始可以同時除去多糖和其它污染的大分子)，加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，離心4～5分鐘，將上清液中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻，離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)入另一支新管中，加入0.6體積異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來，稍加離心，用1ml70％乙醇洗滌，離心5分鐘，棄上清，稍加干燥，重溶于10ul的TE緩沖液，每次酶切反應(yīng)用10-15ul。
B、Bαcillus thuringiensis subsp.kurstαki HD-73基因組DNA的純化往盛有待純化DNA溶液的1.5ml離心管中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，在旋渦混合器上劇烈振蕩10秒，室溫下離心15秒，用200ul的微量移液器將含有DNA的上層(水)相小心地移入一只新管中，如果在水相和有機相交界處有白色沉淀物，則重新抽提有機相，合并水相。往DNA溶液中加入1/10體積的3mol/l pH 5.2的乙酸鈉，在旋渦混合器上稍加振蕩或用手指輕彈離心管壁幾次使之混勻，加入2-2.5倍體積冰冷的100％乙醇，在旋渦混合器上振蕩混勻并置于碎干冰上5分鐘或更長時間，在固定角度離心機上離心5分鐘，棄去上清，加入1ml室溫的70％乙醇，顛倒離心管數(shù)次，再離心5分鐘，棄上清，在真空干燥器中干燥沉淀，將干燥的沉淀物溶于適當體積的TE緩沖液(pH8.0)。
C、從Bαcillus thuringiensis subsp.kurstαki HD-73基因組DNA中分離cryⅠA(c)基因采用SphⅠ-NruⅠ內(nèi)切酶，將基因組DNA溶液取18ul，加入滅菌的微量離心管中，加入2ul的10×Buffer K，混勻，加入1ul SphⅠ(10u/ul)、1ul NruⅠ(10u/ul)限制酶混勻，置于37℃下溫育3小時，加入0.5mol/LEDTA(pH8.0)使終濃度達10mmol終止反應(yīng)，酶切產(chǎn)物通過0.7％的瓊脂糖凝膠電泳檢測。得到7.4-kb的SphⅠ-NruⅠ酶切片段。
D、用限制性內(nèi)切酶部分消化進行cryⅠA(c)基因作圖用低頻率切割的不同限制性內(nèi)切酶消化DNA(如PstⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、KpnⅠ、XbaⅠ、XhoⅠ等)，用32p末端標記消化產(chǎn)物，5’末端可先用小牛腸堿性磷酸酶處理，再用T4多核苷酸激酶進行標記，3’末端可先用大腸桿菌DNA聚合酶ⅠKlenow酶或T4 DNA聚合酶來標記。用第二種內(nèi)切酶消化DNA片段，通過凝膠電泳分離產(chǎn)物，純化那些僅單末端帶放射性標記的DNA片段，用系列稀釋酶法以相對高頻度切割的限制性酶部分消化分離的DNA片段，電泳分離片段并進行自顯影曝光，用放射性標記的DNA分子量標準，估算出片段的長度，推導出每種限制性內(nèi)切酶的酶切位點數(shù)目，DNA圖譜便告完成。
(二)在Bαcillus cereus Bc9002中營養(yǎng)期表達質(zhì)粒pBC601的構(gòu)建A、構(gòu)建質(zhì)粒pEG434(a)提取和純化質(zhì)粒pBCl6接種一個蠟質(zhì)芽孢桿菌(含pBC16質(zhì)粒)(從華美生物工程公司購得)的單菌落于5ml無菌LB培養(yǎng)液中，在37℃培養(yǎng)至飽和狀態(tài)(OD600≈4)，取1.5ml培養(yǎng)液離心20秒，沉淀用100ul GTE(葡萄糖/Tris/EDTA)溶液重懸并于室溫靜置5分鐘，加入200ul NaOH/SDS溶液，混勻，于冰上放置5分鐘，加入150ul乙酸鉀溶液，在旋渦混合器上振蕩2秒，于冰上放置5分鐘，離心3分鐘，然后吸取0.4ml上清液移入干凈的微量離心管中，加0.8ml 95％乙醇，于室溫靜置2分鐘，室溫離心3分鐘，用1ml 70％的乙醇清洗沉淀，然后真空干燥，沉淀用30ul TE緩沖液重溶，溶于TE緩沖液的質(zhì)粒DNA可在4℃短時間保存，并可于-20℃或-70℃長時間保存。
(b)采用EcoRⅠ內(nèi)切酶，將質(zhì)粒pBC16溶液取18ul，加入滅菌的微量離心管中，加入2ul 10×Buffer H，混勻，加入2ul EcoRⅠ限制酶混勻，置于37℃下溫育3小時，加入0.5mol/L EDTA(pH8.0)使終濃度達10mmol終止反應(yīng)，酶切產(chǎn)物通過0.7％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，分離回收3.1-kb的EcoRⅠ片段。
(c)提供互補的含EcoRⅠ位點的寡聚核苷酸(序列為5’GAATTCGTTAACCATGGCATGCGATATCGGATCCTCGCGAAGCTTCCGGGAC；3’CTTAAGCAATTGGTACCGTACGCTATAGCCTAGGGGAGCGCTTCGAAGGCCCTG)(從上海生工公司購得)，在該寡聚核苷酸退火后在T4 DNA連接酶的作用下，插入3.1kb的pBC16 EcoRⅠ片段的末端，形成pEG434質(zhì)粒(如圖1)。此質(zhì)粒含有四環(huán)素抗性標記基因的強啟動子以及一個多克隆位點(EcoRⅠ、HpaⅠ、NcoⅠ、SphⅠ、EcoRⅤ、BamHⅠ、NruⅠ、HindⅢ、HpaⅡ、EcoRⅠ)。
B、將Bt cryⅠA(c)基因插入質(zhì)粒pEG434形成質(zhì)粒pEG501將已經(jīng)分離克隆的來自Bαcillus thuringiensis subsp.kurstαki HD-73的cryⅠA(c)基因SphⅠ-NruⅠ片段，連接到用SphⅠ-NruⅠ內(nèi)切酶消化的質(zhì)粒pEG434的大片段上，形成質(zhì)粒pEG501。此質(zhì)粒中cryⅠA(c)基因位于四環(huán)素抗性基因強啟動子的下游，以保證此基因可以在營養(yǎng)生長期不依賴于芽孢形成而表達。
C、構(gòu)建質(zhì)粒pBC601(a)用與質(zhì)粒pBC16相同的提取與純化方法來提取和純化質(zhì)粒pEG501。
(b)提取、純化宿主菌Bαcillus cereus Bc9002染色體DNA與Bαcillusthuringiensis subsp.kurstαki HD-73基因組DNA的提取純化方法一致。
(c)宿主菌Bc9002染色體DNA的NcoⅠ酶切及回收8.0-kb的NcoⅠ片段采用NcoⅠ內(nèi)切酶，將染色體DNA溶液取18ul，加入滅菌的微量離心管中，加入2ul 10×NcoⅠ限制酶緩沖液，混勻，加入2ul NcoⅠ限制酶混勻，置于37℃下溫育3小時，加入0.5mol/L EDTA(pH8.0)使終濃度達10mmol終止反應(yīng)，酶切產(chǎn)物通過0.7％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，分離回收8.0-kb的NcoⅠ片段。
(d)將已經(jīng)分離回收的8.0-kb的宿主菌Bc9002染色體DNA片段連接到pBC18質(zhì)粒(從華美生物工程公司購得)上，再連接到用NcoⅠ內(nèi)切酶消化的質(zhì)粒pEG501上，形成質(zhì)粒pBC601。
該質(zhì)粒中含有四環(huán)素抗性標記基因的強啟動子tetr,Bt cryⅠA(c)的SphⅠ-NruⅠ的7.4-kb的片段，宿主菌Bc9002染色體DNA8.0-kb的NcoⅠ片段。該綜合質(zhì)粒pBC601可在宿主菌的營養(yǎng)生長期長期表達殺蟲毒蛋白Bt cryⅠA(c)，并且因含有宿主菌的染色體片段可以與宿主菌的染色體DNA發(fā)生同源重組，從而將該營養(yǎng)期表達質(zhì)粒整合到宿主菌Bc9002的染色體上。由此構(gòu)建成棉花內(nèi)生工程菌。
權(quán)利要求
1.一種分離和克隆蘇云金桿菌殺蟲毒蛋白基因cryⅠA(c)的方法，它包括A、蘇云金桿菌基因組DNA的提??；B、蘇云金桿菌基因組DNA的純化；C、從蘇云金桿菌基因組DNA中分離cryⅠA(c)基因；D、用限制性內(nèi)切酶部分消化進行cryⅠA(c)基因作圖。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于蘇云金桿菌基因組DNA的提取選擇供試菌株培養(yǎng)，將培養(yǎng)至飽和狀態(tài)的細菌培養(yǎng)物沉淀，用TE緩沖液重懸，加入10％的SDS和蛋白酶K，于37℃下溫育1小時，加入5M的NaCl，充分混勻，再加入CTAB/NaCl溶液混勻后，于65℃溫育10分鐘，加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，離心4～5分鐘，將上清液中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻，離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)入另一支新管中，加入0.6體積異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來，稍加離心，用1ml70％乙醇洗滌，離心5分鐘，棄上清，稍加干燥，重溶于10ul的TE緩沖液，每次酶切反應(yīng)用10-15ul。
3.權(quán)利要求1的方法，其特征在于蘇云金桿菌基因組DNA的純化往盛有待純化DNA溶液的1.5ml離心管中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，在旋渦混合器上劇烈振蕩10秒，室溫下離心15秒，用200ul的微量移液器將含有DNA的上層(水)相小心地移入一只新管中，如果在水相和有機相交界處有白色沉淀物，則重新抽提有機相，合并水相；往DNA溶液中加入1/10體積的3mol/1 pH5.2的乙酸鈉，在旋渦混合器上稍加振蕩或用手指輕彈離心管壁幾次使之混勻，加入2-2.5倍體積冰冷的100％乙醇，在旋渦混合器上振蕩混勻并置于碎干冰上5分鐘或更長時間，在固定角度離心機上離心5分鐘，棄去上清，加入1ml室溫的70％乙醇，顛倒離心管數(shù)次，在離心5分鐘，棄上清，在真空干燥器中干燥沉淀，將干燥的沉淀物溶于適當體積的TE緩沖液(pH8.0)。
4.權(quán)利要求1的方法，其特征在于從蘇云金桿菌基因組DNA中分離cryⅠA(c)基因采用SphⅠ-NruⅠ內(nèi)切酶，將基因組DNA溶液取18ul，加入滅菌的微量離心管中，加入2ul的10×Buffer K，混勻，加入1ul SphⅠ(10u/ul)、1ul NruⅠ(10u/ul)限制酶混勻，置于37℃下溫育3小時，加入0.5mol/LEDTA(pH8.0)使終濃度達10mmol終止反應(yīng)，酶切產(chǎn)物通過0.7％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到7.4kb的SphⅠ-NruⅠ酶切片段。
5.權(quán)利要求1的方法，其特征在于用限制性內(nèi)切酶部分消化進行cryⅠA(c)基因作圖用低頻率切割的不同限制性內(nèi)切酶消化DNA，用32P末端標記消化產(chǎn)物，5’末端可先用小牛腸堿性磷酸酶處理，再用T4多核苷酸激酶進行標記，3’末端可先用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow酶或T4 DNA聚合酶來標記，用第二種內(nèi)切酶消化DNA片段，通過凝膠電泳分離產(chǎn)物，純化那些僅單末端帶放射性標記的DNA片段，用系列稀釋酶法以相對高頻度切割的限制性酶部分消化分離的DNA片段，電泳分離片段并進行自顯影曝光，用放射性標記的DNA分子量標準，估算出片段的長度，推導出每種限制性內(nèi)切酶的酶切位點數(shù)目，DNA圖譜便告完成。
6.在蠟質(zhì)芽孢桿菌的營養(yǎng)期表達質(zhì)粒中構(gòu)建蘇云金桿菌cryⅠA(c)基因的方法，它包括A、質(zhì)粒pEG434的構(gòu)建；B、將BtcryⅠA(c)基因插入質(zhì)粒pEG434形成質(zhì)粒pEG501；C、質(zhì)粒pBC601的構(gòu)建。
7.權(quán)利要求6的方法，其特征在于質(zhì)粒pEG434的構(gòu)建(a)提取和純化質(zhì)粒pBC16接種一個蠟質(zhì)芽孢桿菌(含pBC16質(zhì)粒)的單菌落于5ml無菌LB培養(yǎng)液中，在37℃培養(yǎng)至飽和狀態(tài)，取1.5ml培養(yǎng)液離心20秒，沉淀用100ul GTE溶液重懸并于室溫靜置5分鐘，加入200ulNaOH/SDS溶液，混勻，于冰上放置5分鐘，加入150ul乙酸鉀溶液，在旋渦混合器上振蕩2秒，于冰上放置5分鐘，離心3分鐘，然后吸取0.4ml上清液移入干凈的微量離心管中，加0.8ml 95％乙醇，于室溫靜置2分鐘，室溫離心3分鐘，用1ml 70％的乙醇清洗沉淀，然后真空干燥，沉淀用30ul TE緩沖液重溶，溶于TE緩沖液的質(zhì)粒DNA可在4℃短時間保存，并可于-20℃或-70℃長時間保存。(b)采用EcoRⅠ內(nèi)切酶，將質(zhì)粒pBC16溶液取18ul，加入滅菌的微量離心管中，加入2ul 10×Buffer H，混勻，加入2ul EcoRⅠ限制酶混勻，置于37℃下溫育3小時，加入0.5mol/L EDTA(pH8.0)使終濃度達10mmol終止反應(yīng)，酶切產(chǎn)物通過0.7％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，分離回收3.1-kb的EcoRⅠ片段。(c)提供互補的含EcoRⅠ位點的寡聚核苷酸(序列為5’GAATTCGTTAACCATGGCATGCGATATCGGATCCTCGCGAAGCTTCCGGGAC ；3’CTTAAGCAATTGGTACCGTACGCTATAGCCTAGGGGAGCGCTTCGAAGGCCCTG)，在該寡聚核昔酸退火后在T4 DNA連接酶的作用下，插入3.1kb的pBC16 EcoRⅠ片段的末端，形成pEG434質(zhì)粒，此質(zhì)粒含有四環(huán)素抗性標記基因的強啟動子以及一個多克隆位點(EcoRⅠ、HpaⅠ、NcoⅠ、SpaⅠ、EcoRⅤ、BamHⅠ、NruⅠ、HindⅢ、HpaⅡ、EcoRⅠ)。
8.權(quán)利要求6的方法，其特征在于將權(quán)利要求1所得到的Bt cryⅠA(c)基因插入質(zhì)粒pEG434形成質(zhì)粒pEG501將權(quán)利要求1所分離克隆的cryⅠA(c)基因SphⅠ-NruⅠ片段，連接到用SphⅠ-NruⅠ內(nèi)切酶消化的質(zhì)粒pEG434的大片段上，形成質(zhì)粒pEG501，此質(zhì)粒中cryⅠA(c)基因位于四環(huán)素抗性基因強啟動子的下游，以保證此基因可以在營養(yǎng)生長期不依賴于芽孢形成而表達。
9.權(quán)利要求6的方法，其特征在于質(zhì)粒pBC601的構(gòu)建(a)用與權(quán)利要求7的質(zhì)粒pBC16的提取與純化方法相同的方法來提取和純化質(zhì)粒pEG501；(b)提取、純化宿主菌蘇云金桿菌Bc9002染色體DNA用與權(quán)利要求1的蘇云金桿菌基因組DNA的提取純化方法相同的方法來提取和純化；(c)宿主菌Bc9002染色體DNA的NcoⅠ酶切及8.0-kb的NcoⅠ片段的回收采用NcoⅠ內(nèi)切酶，將染色體DNA溶液取18ul，加入滅菌的微量離心管中，加入2ul 10×NcoⅠ限制酶緩沖液，混勻，加入2ul NcoⅠ限制酶混勻，置于37℃下溫育3小時，加入0.5mol/L EDTA(pH8.0)使終濃度達10mmol終止反應(yīng)，酶切產(chǎn)物通過0.7％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，分離回收8.0-kb的NcoⅠ片段；(d)將已經(jīng)分離回收的8.0-kb的宿主菌Bc9002染色體DNA片段，連接到用NcoⅠ內(nèi)切酶消化的質(zhì)粒pEG501上，形成質(zhì)粒pBC601。
10.由權(quán)利要求6的方法獲得的質(zhì)粒pBC601，該質(zhì)粒中含有四環(huán)素抗性標記基因的強啟動子tetr,Bt cryⅠA(c)的SphⅠ-NruⅠ的7.4-kb的片段，宿主菌Bc9002染色體DNA8.0-kb的NcoⅠ片段。
11.含有權(quán)利要求10的質(zhì)粒的棉花內(nèi)生工程菌蠟質(zhì)芽孢桿菌。
12.權(quán)利要求11的棉花內(nèi)生工程菌在防治農(nóng)業(yè)害蟲上的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及蘇云金桿菌殺蟲毒蛋白基因cryIA(c)的分離和克隆方法、在蠟質(zhì)芽孢桿菌中構(gòu)建營養(yǎng)期表達質(zhì)粒的方法以及由此獲得的質(zhì)粒,還涉及含有該質(zhì)粒的棉花內(nèi)生工程菌－蠟質(zhì)芽孢桿菌。所構(gòu)建成的棉花內(nèi)生工程菌不僅在產(chǎn)孢期產(chǎn)生殺蟲毒蛋白,在營養(yǎng)生長期也能產(chǎn)生殺蟲毒蛋白,而且該工程菌接種棉花后,能夠在棉株體內(nèi)定植、擴增,表達殺蟲毒蛋白,在棉花的整個生長季節(jié)都能表現(xiàn)殺蟲活性。
文檔編號C12N1/21GK1319669SQ0110997
公開日2001年10月31日 申請日期2001年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月28日
發(fā)明者張青文, 徐靜 申請人:張青文, 徐靜