一種海洋芽孢桿菌產(chǎn)生的β-葡聚糖酶及其制備方法
【專利摘要】一種海洋芽孢桿菌產(chǎn)生的β?葡聚糖酶及其制備方法，屬于海洋微生物和酶制劑領(lǐng)域，所述β?葡聚糖酶由海洋芽孢桿菌N6?2產(chǎn)生，分子量為24kDa，本發(fā)明所述的β?葡聚糖酶具有較高的酶活力，且熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性較好，在釀酒工業(yè)、工業(yè)廢水處理、功能性食品的開發(fā)及飼料應(yīng)用方面具有廣闊的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。CCTCC NO: M201458620141123
【專利說明】
-種海洋芽抱桿菌產(chǎn)生的β-葡聚糖酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于海洋微生物和酶制劑領(lǐng)域，具體設(shè)及一種海洋芽抱桿菌產(chǎn)生的β-葡聚 糖酶及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] β-葡聚糖酶是一類能降解谷物中β-葡聚糖的水解酶，可應(yīng)用于啤酒生產(chǎn)中。大麥 胚乳細(xì)胞壁的主要成分是0-葡聚糖，該酶能降解0-葡聚糖分子中的0-1，3和β-1，4糖巧鏈， 使之降解為小分子，失去親水性，降低粘性，從而疏松大麥胚乳細(xì)胞壁，提高大麥利用率，使 麥芽汁粘度降低，大大縮短麥芽汁和啤酒的過濾時(shí)間，增加啤酒產(chǎn)量，改善啤酒的質(zhì)量。在 W大麥、小麥、黑麥、燕麥等谷物為畜禽的飼料中含有大量的β-葡聚糖，由于動(dòng)物(少數(shù)反當(dāng) 動(dòng)物除外)體內(nèi)沒有消化β-葡聚糖的酶，β-葡聚糖作為一種非淀粉粘性多糖，在腸道內(nèi)具有 較高的粘度，阻止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的吸收，降低了飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。β-葡聚糖酶應(yīng)用于飼料中，大 大提高了飼料的利用率。纖維寡糖具有調(diào)節(jié)腸道微生物菌群作用，是一種功能性寡糖，由于 它不易使血糖濃度升高，可作為糖尿病患者的甜昧劑等。目前制備功能性寡糖的方法有酶 水解法、酶合成轉(zhuǎn)化法、酸水解法、堿轉(zhuǎn)化法及化學(xué)合成法等。但酸水解法、化學(xué)合成法等工 藝操作復(fù)雜、耗能大，產(chǎn)率低，難于實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)規(guī)?；?而采用0-葡聚糖酶水解小麥賴桿生產(chǎn) 功能性寡糖，操作工藝簡(jiǎn)便，可大大降低生產(chǎn)成本，提高小麥賴桿的利用率，減少生物質(zhì)資 源的浪費(fèi)，減少由于賴桿焚燒帶來的空氣污染問題，具有較大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值和環(huán)境價(jià)值。 含有大量0-1,3-葡聚糖的釀酒酵母自溶性殘?jiān)嘧鳛楣I(yè)廢物或W低廉的價(jià)格作為飼料 銷售，造成了很大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。利用β-葡聚糖酶處理使葡聚糖水解為寡糖或還 原糖，可提高其水溶性，且反應(yīng)條件溫和，無毒安全，避免了使用酸堿、機(jī)械等方法破壁帶來 的污染、產(chǎn)物失活等問題。谷氨酸菌體是一種單細(xì)胞蛋白，味精廠的發(fā)酵廢液中含有大量的 谷氨酸菌體，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染且浪費(fèi)了大量的蛋白質(zhì)，利用蛋白酶和β-葡聚糖酶水解 蛋白質(zhì)，反應(yīng)條件溫和，能耗低，副反應(yīng)少，可獲得復(fù)合氨基酸水解液，又減少了化學(xué)法帶來 的環(huán)境污染問題。真菌細(xì)胞壁多糖主要由幾下質(zhì)（甲殼質(zhì)）、纖維素、葡聚糖、甘露聚糖等構(gòu) 成，β-葡聚糖酶可W水解真菌細(xì)胞壁，可W在生物防治中對(duì)植物病原真菌產(chǎn)生括抗作用，在 生物防治中具有重要的意義。孫維國(guó)等利用李氏木霉作為菌種，W微晶纖維素、玉米漿、憐 酸二氨鐘、硫酸錠和碳酸巧為原料，進(jìn)行液體深層發(fā)酵生產(chǎn)0-葡聚糖酶，極大的降低了生產(chǎn) 成本，產(chǎn)品主原料成本降低83.3% (申請(qǐng)公布號(hào):CN101993865A)。江正強(qiáng)等利用枯草芽抱桿 菌(83別11118 8油^113)1'1'-68(保藏編號(hào)為〔61〇：齡.3340)通過搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，產(chǎn)酶水平 為430-3000υ/ιΛ;進(jìn)行化發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)30h，酶活可達(dá)到2500-5000U/mL(申請(qǐng)公布號(hào)： CN101845423A)〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種海洋芽抱桿菌產(chǎn)生的β-葡聚糖酶及其制備 方法。
[0004] 本發(fā)明還提供一種β-葡聚糖酶，該β-葡聚糖酶由海洋芽抱桿菌N6-2產(chǎn)生，分子量 為24kDa;該海洋芽抱桿菌Ν6-2于2014年11月23日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、，保藏號(hào) 為CCTCC NO:M2014586，保藏地址為中國(guó)武漢市武昌塔挪山武漢大學(xué)，分類命名為Baci 1 lus SP.N6-2。
[0005] 進(jìn)一步，所述海洋芽抱桿菌N6-2產(chǎn)生的β-葡聚糖酶的制備方法:海洋芽抱桿菌 Ν6-2菌株，接種于含有種子培養(yǎng)基的試管中，在15-36Γ的搖床中100-3(K)rpm，培養(yǎng)25-3化； 將上述培養(yǎng)后的菌株按2-6% (v/v)的接種量接種于盛有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，15-36Γ， 100-300rpm，發(fā)酵培養(yǎng)48-9化;取菌株發(fā)酵液，離屯、，除掉發(fā)酵液中的菌體和雜質(zhì)，并調(diào)節(jié)其 pH在6.5-7.5，即為粗制發(fā)酵樣品；超濾法粗提，獲得10~30kDa組分，用硫酸錠沉淀法獲得 硫酸錠飽和濃度在30 % -65 %的組分，將30 % -65 %的組分過Q離子交換層析柱，將穿透峰Q1 脫鹽后真空冷凍干燥保存，將收集的穿透峰Q1，過CM離子交換柱，收集穿透峰C1，脫鹽后真 空冷凍干燥保存，即為海洋芽抱桿菌N6-2所產(chǎn)生的β-葡聚糖酶。
[0006] 進(jìn)一步，所述的種子培養(yǎng)基的成分及終濃度：牛肉膏0.2-0.8%，蛋白腺1-2%，氯 化鋼0.3-1 %，ρ冊(cè).8-7.5。
[0007] 進(jìn)一步，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及終濃度:薦糖0.5-1%，牛肉膏0.2-0.8%，蛋 白腺1-2%，氯化鋼0.3-1 %，礦物油0.5-1%〇，Ρ冊(cè).8-7.5。
[0008] 本發(fā)明還提供一種β-葡聚糖酶的制備方法，其具體步驟為：
[0009] (1)菌株的發(fā)酵：
[0010] 取海洋芽抱桿菌Ν6-2菌株，接種于含有種子培養(yǎng)基的試管中，在15-36Γ的搖床中 100-300巧m，培養(yǎng)25-30h;
[0011] 將上述培養(yǎng)后的菌株按4% (v/v)的接種量接種于盛有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，15- 36°C，100-300rpm，發(fā)酵培養(yǎng)48-9化;取菌株發(fā)酵液，離屯、，除掉發(fā)酵液中的菌體和雜質(zhì)，并 調(diào)節(jié)其pH在6.5-7.5，即為粗制發(fā)酵樣品。
[0012] (2)超濾截留
[0013] 取海洋芽抱桿菌N6-2發(fā)酵液，在SOOOrpm下離屯、，除掉菌體與部分雜質(zhì)。依次用分 子量為5040曰、301^)曰、101^)曰、化化、340曰的濾膜，截留發(fā)酵液，獲得10~3040曰的組分，調(diào)節(jié) 抑值至7.0;
[0014] 進(jìn)一步，所述的種子培養(yǎng)基的成分及終濃度：牛肉膏0.2-0.8%，蛋白腺1-2%，氯 化鋼0.3-1 %，p冊(cè).8-7.5。
[0015] 進(jìn)一步，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及終濃度:薦糖0.5-1%，牛肉膏0.2-0.8%，蛋 白腺1-2%，氯化鋼0.3-1 %，礦物油0.5-1%〇，P冊(cè).8-7.5。
[0016] (3)硫酸錠沉淀法粗提
[0017] 取步驟(2)所述的10~30kDa組分，置于冰浴之中，緩慢向其中加入硫酸錠固體粉 末，使其水溶液濃度達(dá)到30%，4°C靜置化，lOOOOrpm離屯、，沉淀作為雜蛋白，遺棄；取上清 液，向其中緩慢加入硫酸錠固體粉末，使其水溶液濃度達(dá)到65 %，4°C靜置化，lOOOOrpm，離 屯、，棄上清，取沉淀;沉淀用50mmol/L的抑7.96^徑甲基氨基甲燒鹽酸鹽(Tr i S-HC1)緩沖液 溶解，裝入3W)a透析袋，置于相同緩沖液中透析，地、化、1化換一次緩沖液，既得到硫酸錠飽 和濃度在30 % -65 %的組分。
[0018] (4)Q離子交換層析
[0019] 取步驟(3)所述的硫酸錠飽和濃度30%-65%的組分，過Q離子交換層析柱，上樣緩 沖液為20-60mmol/L的pH6.0-8.0Ξ徑甲基氨基甲燒鹽酸鹽(Tris-肥1)緩沖液，每次上樣量 為5-20mL，洗脫液為含Imol/L化C1的上樣Tris-肥1緩沖液，洗脫液W100 %(v/v)的濃度進(jìn) 行洗脫，流速為3mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，收集穿透峰Q1，脫鹽后真空冷凍干燥保存；
[0020] 進(jìn)一步，上述步驟(4)中的上樣緩沖液優(yōu)選為50mmol/L，pH7.96。
[0021 ] 進(jìn)一步，上述步驟(4)中每次上樣量?jī)?yōu)選為5mL。
[0022] (5)CM離子交換層析
[0023] 取步驟(4)中收集的穿透峰Q1，過CM離子交換柱，上樣緩沖液為20-60mmol/L的 P冊(cè).0-9.0氨氧化鋼甘氨酸緩沖液(化OH-Glycine)，每次上樣量為1-lOmL洗脫液為含Imol/ L化Cl的氨氧化鋼甘氨酸上樣緩沖液，洗脫液W100 %(v/v)的濃度進(jìn)行洗脫，流速為3mL/ min,收集穿透峰Cl，脫鹽后真空冷凍干燥保存，即為海洋芽抱桿菌N6-2所產(chǎn)生的β-葡聚糖 酶。
[0024] 進(jìn)一步，上述步驟(5)中的上樣緩沖液優(yōu)選為25mmol/L，ρΗ9.0;
[0025] 進(jìn)一步，上述步驟(5)中每次上樣量?jī)?yōu)選為2mL。
[00%] 本發(fā)明還設(shè)及該酶在工業(yè)中的應(yīng)用，如釀酒工業(yè)，工業(yè)廢水處理等。本發(fā)明還設(shè)及 該酶在食品行業(yè)中的應(yīng)用，如魔芋等飲品的制備。本發(fā)明還設(shè)及該酶在飼料方面的應(yīng)用。
[0027] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果：
[0028] 本發(fā)明制取的β-葡聚糖酶純度高，分子量明確，克服了 W往制備方法中純度不高 的缺點(diǎn)，酶活力高，具有良好的熱穩(wěn)定性，在60°C水浴保溫比后酶活力保持在64.54%，在50 °C水浴中保溫化后相對(duì)酶活力保持在87.12%，30-50°C范圍內(nèi)酶活力保持在80% W上，溫 度適用范圍廣，易存儲(chǔ)。最適PH為6.0屬于酸性酶，PH穩(wěn)定性較好，PH= 4時(shí)相對(duì)酶活力為 82.42%，PH= 11時(shí)相對(duì)酶活力為77.81 %。最適PH范圍與動(dòng)物腸道PH范圍吻合，在飼料方面 具有廣闊應(yīng)用前景。MnCb對(duì)β-葡聚糖酶的活性具有明顯的促進(jìn)作用，相對(duì)酶活可W達(dá)到 155.45%。而CuCl2、CaCl2對(duì)β-葡聚糖酶的活性具有較弱的抑制作用相對(duì)酶活力分別為 85.99%和95.47%，運(yùn)與一般β-葡聚糖酶特性明顯不同，特別適用于處理工業(yè)廢水，如Μη2+ 含量比較高的谷氨酸發(fā)酵廢液等。
【附圖說明】
[0029] 圖1.海洋芽抱桿菌Ν6-2的系統(tǒng)發(fā)育樹；
[0030] 圖2. SDS-PAGE檢測(cè)該β-葡聚糖酶的純度；
[0031 ]圖3.海洋芽抱桿菌Ν6-2產(chǎn)生的β-葡聚糖酶質(zhì)譜圖；
[0032] 圖4.溫度對(duì)酶活力的影響；
[0033] 圖5.溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響；
[0034] 圖6.pH對(duì)酶活力的影響；
[0035] 圖7. pH對(duì)酶穩(wěn)定性的影響；
[0036] 圖8.金屬離子對(duì)酶活力的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 下面通過實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受實(shí)施 例任何形式的限制。
[0038] 實(shí)施例1菌株N6-2的形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析
[0039] (1)形態(tài)特征
[0040] 革蘭氏染色結(jié)果顯示，菌株N6-2為革蘭氏陰性菌，且具有明顯的芽抱，菌體形態(tài)呈 現(xiàn)短桿棒狀，多是有兩個(gè)菌體相連。菌落特征為白色或者是乳黃白色，表面光滑，有突起。掃 描電鏡圖片顯示，菌株N6-2呈現(xiàn)短桿棒狀，菌體表面光滑，兩端呈現(xiàn)突起，部分剛分裂的菌 體呈現(xiàn)大豆?fàn)睿蟛糠志w處于二分裂狀態(tài)，兩個(gè)菌體相連，且中間凹陷，連接處細(xì)長(zhǎng)，菌體 間有粘膜產(chǎn)生。單個(gè)菌體的大小為寬:0.9-1.5皿，長(zhǎng):1-3.7皿。
[0041 ] (2)生理生化反應(yīng)特征
[0042] 由于該菌為革蘭氏陰性菌，故可W用API 20E細(xì)菌鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生理生化分析。結(jié) 果見表1。
[0043] 表1.菌株N6-2的生理生化鑒定結(jié)果
[0044]
[0046] 注：表陰性；V'表示陽性
[0047] API 20E結(jié)果顯示陽性：巧樣酸鋼利用、色氨酸水解、Kohn明膠水解、發(fā)酵利用陽 性:薦糖產(chǎn)酸，氧化酶反應(yīng)。
[004引 （3)168 rDNA序列分析
[0049] 吸取1.5mL的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的N6-2菌液，4°C，10000巧m，離屯、lOmin。棄上清液， 加入4(Κ)化的TE緩沖液，用槍頭將沉淀吹打均勻，加入10化的溶菌酶，混合均勻，置于37 °C水 浴中90min，4°C，10000巧m，離屯、1 Omin，保留上清即為DNA溶液。
[(K)加]采用16S rDM通用引物，由上海生工生物工程合成。正向引物：27F5'- AGAGTTTGATCCTGGTCAG-3'，反向引物：1492R 5'-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3' ； 16S rDNA序列 的 PCR 條件是:95°C 預(yù)變性 5min;95°C 變性 4〇3,55°(：退火1111111，72°(：延伸9〇3，循環(huán)30次，721： 延伸lOmin。PCR反應(yīng)體系是:反應(yīng)體系：2扣L，模板DNA: 0.5化，上游引物：2化，下游引物：2μ L，10X easy tap buffe;r:5yL，dNTP:4yL，Easy tap DNA polymerase:0.5yL，雙蒸水：l]_yL。 [0化1 ] 用1.5%的瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，WD2000Marker為標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)照試劑。 菌株N6-2的16S rDNA PCR產(chǎn)物送到北京華大基因進(jìn)行測(cè)序。序列見SEQ1，測(cè)得菌株N6-2的 16S rDNA序列長(zhǎng)度為1409bp。
[0化2] 將菌株N6-2的16S rDNA序列在NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中通過化AST進(jìn)行分析。通過 MEGA6軟件Neighbor-joining選項(xiàng)繪制發(fā)育樹：BLAST重復(fù)1000次，選擇模型核酸P- dis化nce，得到結(jié)果如圖1所示。
[0053] 下載與實(shí)驗(yàn)菌株親緣關(guān)系較近的序列，用BioEdit軟件進(jìn)行多序列對(duì)比，與菌株 N6-2的 16S rDNA序列（1409bp)相似性比較高的菌株為BacillussafensisstrainFO- 036b(T)(99.72%)、Bacillus pumilus ATCC 7061(T)(99.65%)、Bacillus altiUidinis 41KF化(Τ)(99.29%)通過《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，可W確定為芽抱桿菌屬(Bacillus)的 細(xì)菌，且相似性最高的是沙福芽抱桿菌，可能是屬于沙福芽抱桿菌的變種，是一種新的芽抱 桿菌的變種，命名為Bacillus SP.N6-2。該圖也證明了Bacillus SP.N6-2的系統(tǒng)學(xué)地位。
[0054] 實(shí)施例2海洋芽抱桿菌N6-2產(chǎn)生的β-葡聚糖酶的分離純化
[0055] (1)菌株的發(fā)酵：
[0056] 取海洋芽抱桿菌Ν6-2菌株，接種于含有種子培養(yǎng)基的試管中，在28Γ的搖床中 150巧m，培養(yǎng)28h;將上述培養(yǎng)后的菌株按4%(v/v)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，28°C， 150rpm搖床培養(yǎng)80h;取菌株發(fā)酵液，離屯、，去掉發(fā)酵液中的菌體和雜質(zhì)，并調(diào)節(jié)其pH在7.0， 即為粗制發(fā)酵樣品。
[0057] (2)超濾截留：
[0058] 取海洋芽抱桿菌N6-2發(fā)酵液，在SOOOrpm下離屯、，除掉菌體與部分雜質(zhì)。依次用分 子量為5040曰、3040曰、1040曰、化0曰、340曰的濾膜，截留發(fā)酵液，將發(fā)酵液分成3~化0曰、5~ 10kDa、10~30kDa、30~50kDa的組分，電泳檢測(cè)。
[0059] (3)硫酸錠沉淀法濃縮：
[0060] 取步驟(2)所述的10~30kDa組分，置于冰浴之中，緩慢向其中加入硫酸錠固體粉 末，使其水溶液濃度達(dá)到30%，4°C靜置化，lOOOOrpm，離屯、lOmin，沉淀作為雜蛋白，遺棄，取 上清取，向其中緩慢加入硫酸錠固體粉末，使其水溶液濃度達(dá)到65 %，4°C靜置2h， lOOOOrpm，離屯、lOmin，取沉淀，棄上清。沉淀用50mmol/L的pH7.96Ξ徑甲基氨基甲燒鹽酸鹽 (Tris-HCl)緩沖液溶解，裝入3W)a透析袋，置于相同緩沖液中透析，地，化，1化換一次等濃 度緩沖液，既獲得硫酸錠飽和濃度在30 % -65 %的組分。
[0061 ] (4)離子交換色譜法提取β-葡聚糖酶
[0062] 1.Q離子交換層析
[0063] 取步驟(3)所述的硫酸錠飽和濃度30%-65%的組分，過Q離子交換層析柱，上樣緩 沖液為50mmol/L的抑7.96Ξ徑甲基氨基甲燒鹽酸鹽(Tris-肥1)緩沖液，每次上樣量為5mL， 洗脫液為含Imol/L化Cl的化is-HCl上樣緩沖液，洗脫液W100% (v/v)的濃度進(jìn)行洗脫，流 速為3mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，收集各峰，將穿透Q1組分脫鹽后真空冷凍干燥保存；
[0064] 2. CM離子交換層析
[0065] 取收集的穿透峰Q1，過CM離子交換柱，上樣緩沖液為25mmol/L的抑9.0氨氧化鋼甘 氨酸緩沖液(化OH-Glycine)，每次上樣量2mL，洗脫液為含Imol/L化C1的氨氧化鋼甘氨酸 上樣緩沖液，洗脫液Wl〇〇%(v/v)的濃度進(jìn)行洗脫，流速為3mL/min，收集各峰，將穿透峰C1 組分脫鹽后真空冷凍干燥保存，即為海洋芽抱桿菌N6-2產(chǎn)生的β-葡聚糖酶。
[0066] 實(shí)施例3海洋芽抱桿菌Ν6-2產(chǎn)生的β-葡聚糖酶的純度檢測(cè)
[0067] l.Protein-PAK ? 60疏水性的蛋白分析柱檢測(cè)純度
[0068] 取經(jīng)CM柱收集的穿透峰C1，過Protein-PAK ? 60疏水性蛋白分析柱，上樣量為化 L，流動(dòng)相為水，峰圖結(jié)果顯示為單一峰。
[00例 2. SDS-PAGE電泳檢測(cè)β-葡聚糖酶的純度
[0070] 基于現(xiàn)有SDS-PAGE技術(shù)，將超濾膜截留（1號(hào)樣品）、硫酸錠沉淀30%-65%(2號(hào)樣 品）、CM離子交換峰Cl(3,4號(hào)樣品）、Q離子交換穿透峰Ql(5號(hào)樣品）進(jìn)行12%的SDS-PAGE凝 膠電泳檢測(cè)。紅框顯示就是海洋芽抱桿菌N6-2產(chǎn)生的β-葡聚糖酶。見圖2。
[0071] 實(shí)施例4ESI質(zhì)譜檢測(cè)β-葡聚糖酶的分子量
[0072] 將穿透峰C1水溶液通過Cole化rmer 74900注射累打入ESI-MS進(jìn)行分析。（此實(shí)驗(yàn) 由中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過程研究所協(xié)助完成)檢測(cè)結(jié)果顯示海洋芽抱桿菌N6-2產(chǎn)生 的β-葡聚糖酶的分子量是24kDa。見圖3。
[0073] 實(shí)施例郎-葡聚糖酶活性測(cè)定
[0074] 1.酶活力單位定義化/mU:在40°C和抑6.0條件下，Imin從β-葡聚糖溶液中分解產(chǎn) 生?μL?ο?還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活單位。
[00巧]2.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：配制0、0.5、1、2、3、4、5、6、7111邑/1^的葡萄糖溶液，向每 只試管中加入1.7mL的葡萄糖溶液，在每支試管中加入3mL DNS試劑，于沸水中煮lOmin。每 管中加蒸饋水定容到25mL混勻，用空白管調(diào)零點(diǎn)，于550皿處進(jìn)行比色測(cè)定，記錄OD55〇，W葡 萄糖(mg)為橫坐標(biāo)，WOD550為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0076] 2.酶活力測(cè)定體系：設(shè)置1個(gè)空白組，1個(gè)反應(yīng)組，向反應(yīng)組試管中加入 1.5mL10mg/mL的β-葡聚糖溶液，40°C水浴預(yù)熱5min，加入0.2mL適當(dāng)稀釋后的酶液，空白組 加入1.5血lOmg/mL的β-葡聚糖溶液，40°C水浴預(yù)熱5min后加入0.2血適當(dāng)稀釋后滅活酶液。 40°C水浴反應(yīng)15min后加入3mL DNS試劑終止反應(yīng)，于沸水中煮lOmin。每管中加蒸饋水定容 至lj25mL混勻，W空白調(diào)零，在550nm處進(jìn)行比色測(cè)定。
[0077] 3.實(shí)驗(yàn)測(cè)得該β-葡聚糖酶的酶活力為:13.3U/mL。
[0078] 實(shí)施例郎-葡聚糖酶特性研究
[0079] 1.最適溫度:在試管中加入1.5mL 1.0%的pH = 6.0的β-葡聚糖底物，然后加入適 當(dāng)稀釋后的酶液200化分別在20、30、40、50、60、70、80、90°(：水浴條件下反應(yīng)15.0111111測(cè)定酶 活。結(jié)果見圖4,該酶最適溫度為40°C。
[0080] 2.熱穩(wěn)定性:酶液分別在0、30、40、45、50、60、65、70、75、80 °C水浴中保溫60min立 即冰浴，分別取0-葡聚糖底物1.5血，加入經(jīng)不同溫度處理后的酶液20化L，40°C水浴15min， 測(cè)定酶活。結(jié)果見圖5,該酶在60°CW下具有良好的熱穩(wěn)定性。60°C時(shí)酶活力保持在 64.54%，在50°C時(shí)相對(duì)酶活力保持在87.12%。
[0081 ] 3.最適抑:配置抑為2、3、4、5、6、7、8的憐酸氨二鋼巧樣酸緩沖液和抑為9的氨氧化 鋼-甘氨酸緩沖液，并用上述緩沖液分別配1.0%的0-葡聚糖溶液，取底物1.5mL，適當(dāng)稀釋 后的酶液20化L，分別在40°C水浴條件下反應(yīng)15. Omin測(cè)定酶活。結(jié)果見圖6，該酶的最適pH 為6。
[0082] 4. pH穩(wěn)定性:配置pH為2、3、4、5、6、7、8的憐酸氨二鋼巧樣酸緩沖液和pH為9、10、 11、12的氨氧化鋼-甘氨酸緩沖液，用上述不同的pH緩沖液在室溫條件下處理酶化，取β-葡 聚糖底物1.5mL，加入經(jīng)上述緩沖液處理后的酶液200yL，分別在40°C水浴條件下反應(yīng) 15. Omin測(cè)定酶活。結(jié)果見圖7，該酶在pH = 4-11之間具有良好的抑穩(wěn)定性。抑=4時(shí)相對(duì)酶 活力為82.42%，pH=ll時(shí)相對(duì)酶活力為77.81 %。
[0083] 5.金屬離子的影響：在試管中加入1.5ml 1.0%的β-葡聚糖底物(抑=6.0)，分別 加入20化L含50.0 mmo 1 /L化合物的酶液使各反應(yīng)體系中各化合物終濃度分別為5.8mmo 1/L， 40°C水浴下反應(yīng)15 . Omin，W蒸饋水作對(duì)照測(cè)定各金屬離子對(duì)β-葡聚糖酶活的影響。由圖8 可W看出MnCl2對(duì)β-葡聚糖酶的活性具有明顯的促進(jìn)作用，相對(duì)酶活可W達(dá)到155.45%。而 加(：12、〔曰(：12對(duì)0-葡聚糖酶的活性具有較弱的抑制作用相對(duì)酶活力分別為85.99%和 95.47%。而HgCl2抑制作用最強(qiáng)，明顯抑制β-葡聚糖酶的酶活。ZnCl2、FeCl3具有一定的抑制 作用相對(duì)酶活力分別為54.52%和21.24%。
[0084] 綜上所述，該β-葡聚糖酶具有較高的酶活力，且熱穩(wěn)定性和抑穩(wěn)定性較好，在釀酒 工業(yè)、工業(yè)廢水處理、功能性食品的開發(fā)及飼料應(yīng)用方面具有廣闊的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種β-葡聚糖酶，其特征在于所述β-葡聚糖酶由海洋芽孢桿菌N6-2產(chǎn)生，分子量為 24kDa，所述的海洋芽孢桿菌Ν6-2于2014年11月23日保藏于中國(guó)武漢典型培養(yǎng)物保藏中心， 保藏號(hào)為CCTCC N0:M2014586,所述β-葡聚糖酶的制備方法:將海洋芽孢桿菌N6-2菌株接種 于含有種子培養(yǎng)基的試管中，在15_36°C的搖床中100_300rpm，培養(yǎng)25-30h;將上述培養(yǎng)后 的菌株按2-6% (v/v)的接種量接種于盛有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，15-36°C，100_300rpm，發(fā) 酵培養(yǎng)48-90h;取菌株發(fā)酵液，離心，除掉發(fā)酵液中的菌體和雜質(zhì)，并調(diào)節(jié)其pH在6.5-7.5， 即為粗制發(fā)酵樣品；超濾法粗提，獲得10~30kDa組分，用硫酸銨沉淀法獲得硫酸銨飽和濃 度在30 % -65 % (g/ml)的組分，將30 % -65 % (g/ml)的組分過Q離子交換層析柱，將穿透峰Q1 脫鹽后真空冷凍干燥保存，將收集的穿透峰Q1，過CM離子交換柱，收集穿透峰C1，脫鹽后真 空冷凍干燥保存，即為海洋芽孢桿菌N6-2所產(chǎn)生的β-葡聚糖酶。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述β_葡聚糖酶的制備方法，其特征在于所述的種子培養(yǎng)基的成分 及質(zhì)量體積比：牛肉膏〇. 2-0.8%、蛋白胨1 -2%、氯化鈉0.3-1 %，ρΗ6.8-7.5。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述β_葡聚糖酶的制備方法，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分 及終濃度:蔗糖〇. 5-1 % (質(zhì)量體積比）、牛肉膏0.2-0.8% (質(zhì)量體積比）、蛋白胨1-2% (質(zhì)量 體積比）、氯化鈉0.3-1 % (質(zhì)量體積比），礦物油0.5-1%。(v/v)，ρΗ6.8-7.5。4. 權(quán)利要求1所述β_葡聚糖酶的制備方法，其特征在于它的具體步驟為： (1) 菌株的發(fā)酵： 取海洋芽孢桿菌Ν6-2菌株，接種于含有種子培養(yǎng)基的試管中，在15-36°C的搖床中100-300rpm，培養(yǎng)25-30h; 將上述培養(yǎng)后的菌株按4%(v/v)的接種量接種于盛有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，15-36°C， 100-300rpm，發(fā)酵培養(yǎng)48-90h;取菌株發(fā)酵液，離心，除掉發(fā)酵液中的菌體和雜質(zhì)，并調(diào)節(jié)其 pH在6.5-7.5，即為粗制發(fā)酵樣品。 (2) 超濾截留 取海洋芽孢桿菌N6-2發(fā)酵液，在SOOOrpm下離心，除掉菌體與部分雜質(zhì)。依次用分子量 為50kDa、30kDa、10kDa、5kDa、3kDa的濾膜，截留發(fā)酵液，獲得10~30kDa的組分，調(diào)節(jié)pH值至 7.0； 所述的種子培養(yǎng)基的成分及終濃度:牛肉膏0.2-0.8% (質(zhì)量體積比），蛋白胨1-2% (質(zhì) 量體積比），氯化鈉0.3-1 % (質(zhì)量體積比），pH6.8-7.5。 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及終濃度:蔗糖〇.5-1% (質(zhì)量體積比），牛肉膏0.2-0.8% (質(zhì) 量體積比），蛋白胨1-2 % (質(zhì)量體積比），氯化鈉0.3-1 % (質(zhì)量體積比），礦物油0.5-1%。( v/ v)，pH6·8-7·5。 (3) 硫酸銨沉淀法粗提 取步驟(2)所述的10~30kDa組分，置于冰浴之中，緩慢向其中加入硫酸銨固體粉末，使 其水溶液濃度達(dá)到30 % (g/ml)，4 °C靜置2h，lOOOOrpm離心，沉淀作為雜蛋白，遺棄;取上清 取，向其中緩慢加入硫酸銨固體粉末，使其水溶液濃度達(dá)到65 % (g/ml)，4 °C靜置2h， lOOOOrpm，離心，棄上清，取沉淀;沉淀用50mmol/L的pH7.96三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖 液溶解，裝入3kDa透析袋，置于相同緩沖液中透析，4h、8h、12h換一次緩沖液，既得到硫酸銨 飽和濃度在30 % -65 % (g/ml)的組分。 (4) Q離子交換層析 取步驟(3)所述的硫酸銨飽和濃度30%-65%(g/ml)的組分，過Q離子交換層析柱，上樣 緩沖液為20-60mmol/L的pH6.0-8.0三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液，每次上樣量為5-20mL，洗脫液為含lmol/L NaCl的上樣Tris-HCl緩沖液，洗脫液以100% (v/v)的濃度進(jìn)行洗 脫，流速為3mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，收集穿透峰Q1，脫鹽后真空冷凍干燥保存； 上述步驟中的上樣緩沖液為50mmol/L，pH7.96。 上述步驟中每次上樣量為5mL。 (5)CM離子交換層析 取步驟(4)中收集的穿透峰Q1，過CM離子交換柱，上樣緩沖液為20-60mmol/L的pH6.0-9.0氫氧化鈉甘氨酸緩沖液，每次上樣量為1-lOmL洗脫液為含lmol/L NaCl的氫氧化鈉甘氨 酸上樣緩沖液，洗脫液以1〇〇 % (v/v)的濃度進(jìn)行洗脫，流速為3mL/min，收集穿透峰C1，脫鹽 后真空冷凍干燥保存，即為海洋芽孢桿菌N6-2所產(chǎn)生的β-葡聚糖酶。 上述步驟中的上樣緩沖液為25mmol/L，ρΗ9.0; 上述步驟中每次上樣量為2mL。5. 權(quán)利要求1所述β_葡聚糖酶在工業(yè)中的應(yīng)用。6. 權(quán)利要求1所述β_葡聚糖酶在釀酒工業(yè)和工業(yè)廢水處理中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求1所述β_葡聚糖酶在食品行業(yè)中的應(yīng)用。8. 權(quán)利要求1所述β_葡聚糖酶在制備魔芋等飲品中的應(yīng)用。9. 權(quán)利要求1所述β_葡聚糖酶在飼料加工中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/07GK106011113SQ201610618679
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月29日
【發(fā)明人】鄭蘭紅, 康道樂, 楊康利, 梁方方, 朱美虹
【申請(qǐng)人】中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所