專利名稱：游離細(xì)胞重復(fù)利用多次轉(zhuǎn)化制備木糖醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是用異常漢遜酵母(Hansenulaanomala)細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的方法將木糖轉(zhuǎn)化制備木糖醇。
木糖醇是自然界存在的一種五碳糖醇。作為一種甜味劑，由于它不會(huì)導(dǎo)致齲齒，且具有較高的甜度，近年來它引起人們?cè)絹碓蕉嗟淖⒁?。木糖醇的代謝無須胰島素的調(diào)節(jié)，因此在臨床上被用作糖尿病患者食物中的蔗糖的替代品。同時(shí)，它的代謝過程也無須6-磷酸葡萄糖脫氫酶的作用，因此它也是6-磷酸葡萄糖脫氫酶缺乏癥患者理想的食用甜味劑。
在自然界中，木糖醇存在于許多水果和蔬菜中，如覆盆子、草霉、萵苣、花椰菜等，但由于含量很低，直接提取非常困難且較為昂貴。目前工業(yè)上都用木糖化學(xué)催化加氫生產(chǎn)木糖醇(Jaffe et alUS 3.787,408)。木糖則由玉米芯、木材、甘蔗渣或其它木聚糖含量較豐富的原料經(jīng)水解得到，但這種方法也存在以下一些問題一、制氫、加氫設(shè)備較復(fù)雜，設(shè)備投資及操作費(fèi)用均較大；二、加氫前原料需經(jīng)多步純化，工藝復(fù)雜；三、化學(xué)加氫催化劑無專一性，造成產(chǎn)品中雜醇多且不易分離，不但增加了后處理成本，而且產(chǎn)品質(zhì)量難以提高。
由于化學(xué)加氫存在的這些問題，微生物發(fā)酵法引起了科學(xué)家的興趣。生物化學(xué)反應(yīng)的條件溫和，專一性強(qiáng)，氫直接來自細(xì)胞中的輔酶。這些特點(diǎn)克服了化學(xué)加氫法分離純化過程復(fù)雜、制氫與加氫設(shè)備昂貴等缺點(diǎn)。用純木糖發(fā)酵可達(dá)到較高的水平，木糖轉(zhuǎn)化率(消耗)達(dá)97.5-100％，木糖醇產(chǎn)率達(dá)0.46-0.7g/g(木糖)，發(fā)酵180小時(shí)木糖醇濃度達(dá)200g/L(Meyrial，V etalBiotechnol.Lett.13(4)281-286，1991)，此外還克隆了木糖還原酶和木糖醇脫氫酶基因，并在啤酒酵母中得到表達(dá)(Hallborn，J.etalBiotechnol.91090-1095，1991)。但是用純木糖發(fā)酵因原料成本太高而難于產(chǎn)業(yè)化。
直接用含木聚糖的廉價(jià)原料如玉米芯、木材、甘蔗渣等的水解液進(jìn)行發(fā)酵，可以大大降低成本，但由于這些水解液中含有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)，因此發(fā)酵水平不高，發(fā)酵100小時(shí)木糖醇濃度僅為8-17g/L(Paraj，J.L.etalEnzyme Microbial Technol.2118-24，1997)。
微生物還原木糖生產(chǎn)木糖醇的原理是隨著反應(yīng)的進(jìn)行，細(xì)胞內(nèi)消耗的NADPH必需得到補(bǔ)充(再生)，因此，下面的反應(yīng)為(進(jìn)入磷酸戊糖途徑)NADPH的再生消耗了木糖醇，因此木糖醇對(duì)木糖的理論產(chǎn)率在實(shí)際采用的半?yún)捬鯒l件下為0.87g/g(Maria F.S.Babosa et alJ.IndustrialMicrobiology，3241-252，1988)。雖然生物法生產(chǎn)木糖醇的產(chǎn)率較低，但比化學(xué)法仍有其優(yōu)越性。
目前生物法生產(chǎn)木糖醇存在的一個(gè)主要問題是有相當(dāng)一部分成本被用于培養(yǎng)細(xì)胞，因此盡管對(duì)細(xì)胞的性狀用現(xiàn)代生物技術(shù)作了許多改進(jìn)(Apajalahti et alWO 93/01299)但培養(yǎng)一批細(xì)胞只能生產(chǎn)一批木糖醇，成本仍難以大幅度降低。
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺欠，提高木糖醇的產(chǎn)率，利用酵母細(xì)胞多次重復(fù)使用進(jìn)行木糖轉(zhuǎn)化，降低生產(chǎn)成本，使微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)木糖醇的規(guī)模生產(chǎn)成為可能性。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體方法是用一株保存在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏中心登記入冊(cè)的編號(hào)為異常漢遜酵母(Hansenula anomala)突變株9922，CGMCCNo.0551。細(xì)胞培養(yǎng)后與培養(yǎng)基分離，用細(xì)胞轉(zhuǎn)化木糖或木質(zhì)素、半纖維素(玉米芯、甘蔗渣、秸桿、碎木等)水解物為木糖醇。將保存在斜面培養(yǎng)基(2％葡萄糖，1％酵母膏，1％蛋白胨，2％瓊脂，自然pH)上的酵母菌接于液體培養(yǎng)基(葡萄糖和/或蔗糖和/或麥芽糖和或木糖0.1-5.0％，有機(jī)和/或無機(jī)氮源0.02-2.0％，pH4.0-6.5)中，在24-37℃振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間可控制在8-96小時(shí)之間，以12-48小時(shí)為最佳，然后離心收集細(xì)胞。該細(xì)胞與含木糖溶液反應(yīng)。木糖溶液中木糖濃度在1％-50％之間，以6％-35％最佳，木糖可以一次加入或流加；反應(yīng)溫度范圍可以為18-58℃，以25-40℃最佳；反應(yīng)時(shí)間可以控制在12-300小時(shí)之間，最佳反應(yīng)時(shí)間為18-240小時(shí)；細(xì)胞可重復(fù)使用。反應(yīng)液中木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇，木糖醇濃度最高可達(dá)200g/L，產(chǎn)率為0.5-0.8g/g。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)比，有如下特點(diǎn)一、采用微生物轉(zhuǎn)化法，將細(xì)胞培養(yǎng)與木糖醇轉(zhuǎn)化分別進(jìn)行，因此既可利用價(jià)格低廉的水解物作原料，又避免了發(fā)酵法中細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制的問題，分次轉(zhuǎn)化液木糖醇濃度可達(dá)30-60g/L，流加木糖轉(zhuǎn)化液木糖醇濃度可達(dá)160-180g/L，木糖醇對(duì)木糖產(chǎn)率0.5-0.8g/g，達(dá)到純木糖發(fā)酵水平，而可比純木糖發(fā)酵大大降低成本。
二、游離細(xì)胞可多次重復(fù)使用，在轉(zhuǎn)化5-10次時(shí)細(xì)胞的仍保持約50％的活力，這樣培養(yǎng)的游離細(xì)胞，既有固定化細(xì)胞可多次重復(fù)使用的長(zhǎng)處，又避免了固定化帶來的增加工藝過程、降低細(xì)胞活力等問題，從而進(jìn)一步降低了成本。
三、本方法除細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)需無菌操作，轉(zhuǎn)化反應(yīng)可在簡(jiǎn)單的設(shè)備和控制條件下進(jìn)行。由于細(xì)胞可多次利用，細(xì)胞培養(yǎng)只占整個(gè)工藝的一小部分，因此本方法的設(shè)備與工藝均比現(xiàn)有技術(shù)簡(jiǎn)單。
以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。
取50ml發(fā)酵液以8000rpm離心10分鐘收集菌體，所得菌體用于轉(zhuǎn)化木糖制備木糖醇的反應(yīng)。
實(shí)驗(yàn)中種子培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基的組成如下種子培養(yǎng)基葡萄糖和/或蔗糖和/或麥芽糖和或木糖0.1-4.0％，有機(jī)和/或無機(jī)氮源0.01-2.0％，pH4.5-6.5。
發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖和/或蔗糖和/或麥芽糖和或木糖0.1-5.0％，有機(jī)和/或無機(jī)氮源0.02-2.0％，pH4.0-6.5。
用10ml蒸餾水懸浮例1中所得菌體，并將其轉(zhuǎn)入100ml三角瓶中。向瓶中加入0.8g木糖和0.05g葡萄糖與菌懸液混勻后在搖床上進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm。反應(yīng)22小時(shí)后停止，離心分離菌體與反應(yīng)液，菌體用于重復(fù)轉(zhuǎn)化反應(yīng)。反應(yīng)上清液取樣后測(cè)定木糖和木糖醇的濃度并計(jì)算木糖醇產(chǎn)率及反應(yīng)強(qiáng)度。
分別用陰、陽離子交換樹脂及活性炭對(duì)水解液進(jìn)行中和、除離子及脫色等提純步驟，再將其減壓濃縮至木糖濃度為8％，此水解液用作酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化的原料。實(shí)施例4按照例1所述方法發(fā)酵制備轉(zhuǎn)化反應(yīng)所需酵母菌體，并將其與36ml例3中的水解液混合后轉(zhuǎn)入250ml三角瓶中，置于搖床上進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為220rpm。反應(yīng)48小時(shí)后停止，離心分離菌體與反應(yīng)液，菌體用于重復(fù)轉(zhuǎn)化反應(yīng)。反應(yīng)上清液取樣后測(cè)定木糖和木糖醇的濃度并計(jì)算木糖醇產(chǎn)率及反應(yīng)強(qiáng)度。
重復(fù)上述步驟進(jìn)行菌體對(duì)木糖的反復(fù)轉(zhuǎn)化，菌體對(duì)木糖反復(fù)轉(zhuǎn)化七次，每次轉(zhuǎn)化反應(yīng)的結(jié)果如下表所示。
實(shí)施例5稱取1000g風(fēng)干的甘蔗渣，用5000ml 2％硫酸溶液將其浸泡后，加熱至121℃(1大氣壓)水解1.5小時(shí)。壓濾除去固形物即得甘蔗渣水解液，其中D-木糖含量約為3％。
分別用陰、陽離子交換樹脂及活性炭對(duì)水解液進(jìn)行中和、除離子及脫色等純化過程，再將其減壓濃縮至木糖濃度為8％，此水解液用作酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化的原料。
重復(fù)上述步驟進(jìn)行菌體對(duì)木糖的反復(fù)轉(zhuǎn)化，菌體對(duì)木糖反復(fù)轉(zhuǎn)化五次，每次轉(zhuǎn)化反應(yīng)的結(jié)果如下表所示。
實(shí)施例7按照例1所述方法發(fā)酵制備轉(zhuǎn)化反應(yīng)所需酵母菌體，將其與2.88g木糖和36ml水混合后轉(zhuǎn)入250ml三角瓶中，置于搖床上進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為220rpm。每隔24小時(shí)加1.35g木糖，共流加6次，反應(yīng)于238小時(shí)結(jié)束。離心分離菌體與反應(yīng)液，菌體用于第二批轉(zhuǎn)化反應(yīng)。反應(yīng)上清液取樣后測(cè)定木糖和木糖醇的濃度并計(jì)算木糖醇產(chǎn)率及反應(yīng)強(qiáng)度。
重復(fù)上述步驟進(jìn)行菌體對(duì)木糖的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，每批轉(zhuǎn)化反應(yīng)的結(jié)果如下表所示。
權(quán)利要求
1.一種木糖醇的制備方法，該方法包括先培養(yǎng)異常漢遜酵母(Hansenula anomala)細(xì)胞；培養(yǎng)后的酵母細(xì)胞與培養(yǎng)基分離得到游離細(xì)胞；利用該游離細(xì)胞轉(zhuǎn)化含木糖的底物；含木糖底物一次性或經(jīng)流加的方式與游離細(xì)胞混合進(jìn)行反應(yīng)制備木糖醇；將反應(yīng)后的酵母細(xì)胞與反應(yīng)液分離，細(xì)胞可重復(fù)多次與含木糖底物進(jìn)行反應(yīng)制備木糖醇。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所用酵母菌為異常漢遜酵母(Hansenula anomala)突變株9922，CGMCC No.0551。
3.如權(quán)利要求1所述的先培養(yǎng)異常漢遜酵母(Hansenula anomala)突變株9922，CGMCC No.0551，其特征在于培養(yǎng)基的組分中含有木糖或木質(zhì)素、半纖維素水解物；葡萄糖；酵母膏；蛋白胨。
4.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)過程，其特征在于培養(yǎng)溫度范圍為24-37℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的最適溫度為28-32℃。
6.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)過程，其特征在于培養(yǎng)時(shí)間為8-96小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的最適培養(yǎng)時(shí)間范圍為12-48小時(shí)。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所用含木糖底物為木糖或木質(zhì)素、半纖維素水解物包括玉米芯、甘蔗渣、秸桿、碎木等。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于反應(yīng)溫度范圍為22-45℃。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于反應(yīng)時(shí)間的范圍為12-300小時(shí)。
11.如權(quán)利要求1所述的含木糖底物的流加過程，其特征在于將固體木糖或濃縮后的含木糖底物分次加入反應(yīng)體系，反應(yīng)一次結(jié)束。
12.如權(quán)利要求1所述的重復(fù)反應(yīng)過程，其特征在于將從反應(yīng)液中分離的細(xì)胞與含木糖底物混合后再次進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
全文摘要
一種重復(fù)利用微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化木糖或木質(zhì)素、半纖維素水解物制備木糖醇的方法,木糖醇的產(chǎn)率最高達(dá)到0.84g/g木糖,反應(yīng)液中木糖醇濃度最高達(dá)到178.77g/L。該方法工藝簡(jiǎn)單、成本低、產(chǎn)率高,可利用廉價(jià)原料生產(chǎn)木糖醇,對(duì)木糖醇的生產(chǎn)有實(shí)際意義。
文檔編號(hào)C12P7/04GK1381585SQ01110778
公開日2002年11月27日 申請(qǐng)日期2001年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月20日
發(fā)明者江寧, 賀鵬, 盧大軍, 沈安, 王欽宏, 劉小琳 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院微生物研究所