專利名稱：制備一種人造生物移植體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由一種用于移植的生物組織和加置其上的受體耐受細(xì)胞制備人造生物移植體的方法。
本發(fā)明一般性地涉及一種控制培養(yǎng)生物組織的方法。
在移植醫(yī)學(xué)對(duì)于適宜的、盡可能低程度地引發(fā)對(duì)移植體受體有害反應(yīng)的移植體存在著大量的需求。只在特別案例中可能的是，移植體從受體自己身體中取出并移植。從免疫學(xué)的角度，這種移植手術(shù)是最不需要顧慮的了，而對(duì)于特定的管腔或器官以及較大面積待替換的皮膚卻不存在這種可能性。對(duì)于特定的器官，如今實(shí)際上考慮的只是異體捐獻(xiàn)者的同種異體的移植體，或在矯形外科學(xué)領(lǐng)域更多的是用合成材料、金屬、陶瓷等等以及不同的復(fù)合材料制備的植入體。在使用同種異體的材料時(shí)，例如捐獻(xiàn)器官，持久的對(duì)受體生物體有負(fù)擔(dān)的免疫抑制是不可缺少的。盡管如此排斥反應(yīng)仍經(jīng)常成為第一并發(fā)癥。人造材料也可以導(dǎo)致排斥反應(yīng)和炎癥過程，致使手術(shù)結(jié)果失敗。
出于不同的理由，如今經(jīng)常嘗試使用異種材料(動(dòng)物性來源)。在此其優(yōu)點(diǎn)主要是所述材料相對(duì)于同種異體(捐獻(xiàn))材料較易于獲得。而且這樣的一種“生物材料”比人造材料運(yùn)用靈活并更合適于受體身體的某些部位。然而異種移植材料卻是強(qiáng)抗原而因此成為問題。
因此人們長(zhǎng)期試圖將異種移植材料(特殊的不同的考慮用于移植的組織)處理成受體耐受性的。對(duì)此通常情況下嘗試，滅絕或去除異種移植體的提供結(jié)構(gòu)的結(jié)締組織基質(zhì)內(nèi)或上面的天然細(xì)胞以及洗盡異體蛋白質(zhì)和其它異體物質(zhì)。由間質(zhì)結(jié)締組織組成的提供結(jié)構(gòu)的基質(zhì)可以看作是一種免疫更為中性的基質(zhì)。
化學(xué)處理過的動(dòng)物性來源的移植體，例如被用作人類心臟瓣膜的替換品。所述動(dòng)物性的材料通常用戊二醛處理，為了穩(wěn)固其結(jié)構(gòu)蛋白和避免抗原反應(yīng)。然而所述用戊二醛處理過的組織在移植后卻經(jīng)受持續(xù)的硬化和漸進(jìn)的鈣化。這種移植體因此必須每隔數(shù)年被替換。
作為替代的方式也已經(jīng)嘗試移植一種無細(xì)胞化的并以此“中性化了的”暴露的膠原基質(zhì)，然而，如其所表現(xiàn)的，同樣帶有問題。無細(xì)胞化的膠原基質(zhì)經(jīng)無細(xì)胞化過程變得很疏松并且機(jī)械性能變得不穩(wěn)定。不穩(wěn)定化的重要缺點(diǎn)是在體內(nèi)植入后有經(jīng)破裂而開始失效的危險(xiǎn)。動(dòng)物模型的20％案例出現(xiàn)的是這種情況(無細(xì)胞化的豬心臟瓣膜，在低壓循環(huán)下重繁殖自體細(xì)胞，肺的位置)。
另外，暴露的膠原基質(zhì)在機(jī)體內(nèi)很容易受到膠原蛋白酶的攻擊，以至在體內(nèi)重繁殖發(fā)生之前就可能已經(jīng)被損壞了。
因此也嘗試了將用于移植的無細(xì)胞化生物組織在其移植之前就已經(jīng)再又繁殖了自體或同種異體細(xì)胞。例如在DE 19828726 A1中描述了一種制備人造生物移植體的方法，該方法首先滅絕然后去除移植體的間質(zhì)結(jié)締組織的天然細(xì)胞。所述基質(zhì)隨后重新繁殖對(duì)于受體耐受的，優(yōu)選自體細(xì)胞，以便獲得受體特異的生物移植體。
就此已經(jīng)是很有利的了，抗原成分已很大程度地被去除或被包覆。以這種方法獲得的人造生物移植體卻還沒有具備所必需的“自然”特性。在因無細(xì)胞化而松弛的基質(zhì)上的生長(zhǎng)細(xì)胞變得困難了。即使通過自身改變微小的基質(zhì)結(jié)構(gòu)也不能獲得完全自然的重新的細(xì)胞構(gòu)建。該方法也還存在著很大的問題，比如控制在各自必需的位置上所必需的不同分化細(xì)胞的生長(zhǎng)。
US PS 5192312(Orton)已經(jīng)公開了一種繁殖方法，其中用成膠原細(xì)胞生長(zhǎng)因子處理可植入的人體心臟瓣膜，并隨后繁殖設(shè)想使得植入體變成非免疫原的這樣量的成膠原細(xì)胞。生長(zhǎng)因子的準(zhǔn)備措施妨礙了此目的，因?yàn)槭褂卯惙N生長(zhǎng)因子的初級(jí)掩蔽可能導(dǎo)致加入的細(xì)胞的功能性改變并且一種異種誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移可能使細(xì)胞成為增殖表現(xiàn)型。生長(zhǎng)因子的異種加入引起信號(hào)交換的內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制，其最終雖然導(dǎo)致生成許多細(xì)胞，但通過生長(zhǎng)因子卻不能導(dǎo)入所必要的改造過程。鑒于其支撐結(jié)構(gòu)，在體外由此已經(jīng)妨礙了自體化的植入體的快速制備。在活體內(nèi)有后作用是極可能的，因?yàn)榭赡墚a(chǎn)生轉(zhuǎn)基因(變形)細(xì)胞。其在活體植入后具有更為重大的后果，因?yàn)橥N異體和異種基質(zhì)具有免疫原的殘余作用，其導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和形成鈣化焦點(diǎn)并因此導(dǎo)致長(zhǎng)期移植體的失效。
本發(fā)明因此以上述問題為基礎(chǔ)，應(yīng)該將，為移植受體挑選的用于移植的異體生物組織，特別是同種異體和異體的材料，轉(zhuǎn)變成為受體耐受的免疫可接受的人造生物移植體。
續(xù)之應(yīng)該創(chuàng)造一種方法制造機(jī)械性能穩(wěn)定的自然的移植體。其重建過程應(yīng)該在對(duì)自然重建的刺激和加速的同時(shí)盡可能地控制下進(jìn)行。
為了解決此問題，根據(jù)本發(fā)明擬定在由一種用于移植的生物組織和加置其上的受體耐受細(xì)胞制備人造生物移植體的方法中，向在調(diào)節(jié)性培養(yǎng)基中的用于移植的自體、同種異體或異種的，以天然形式存在并且未用異種生長(zhǎng)因子預(yù)處理過的組織加入受體耐受的細(xì)胞，其至少包括挑選出的有能力改造載體結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，移植體被繼續(xù)處理，直至達(dá)到原來的天然組織進(jìn)一步重建成為基本上表現(xiàn)為加入的受體特異的細(xì)胞的組織。
對(duì)于“有能力改造載體結(jié)構(gòu)的細(xì)胞”是這樣理解的，它們的貢獻(xiàn)是，分泌新的組織基質(zhì)并優(yōu)選還去除死亡的細(xì)胞。屬于此類分別根據(jù)組織類型而不同的細(xì)胞有，例如成膠原細(xì)胞或結(jié)締組織細(xì)胞以及它們的來自于優(yōu)選的自體干細(xì)胞的前體細(xì)胞。
在心血管方面屬于有改造能力的細(xì)胞有例如平滑肌細(xì)胞。通常也算上例如巨噬細(xì)胞。
所述細(xì)胞促進(jìn)和加速組織的重建，原則上它們首先由此使重建成為了可能，因?yàn)樵谄渌闆r下的其它進(jìn)程(鈣化、排斥)時(shí)間性地“超越”(“überholen”)并以這種方式妨礙組織再生或組織重建。
組織重建的激活也可以通過有目的的炎癥刺激來達(dá)到，其刺激了組織治療的進(jìn)程。有改造能力的細(xì)胞因此也可以涉及或部分涉及能釋放炎癥介質(zhì)的細(xì)胞。組織治療伴隨著加速的組織重建。而且炎癥介質(zhì)還可以在使用其它有改造能力的細(xì)胞時(shí)被附加地加入。這尤其是在有時(shí)間限制的情況下使用，以便引入一個(gè)可控制的刺激治療的炎癥過程。
算入干細(xì)胞的是骨髓細(xì)胞、來源于脂肪組織的(間充質(zhì)的)細(xì)胞、組織特異的干細(xì)胞、來自外周血液的干細(xì)胞、器官特異的干細(xì)胞以及轉(zhuǎn)移自體細(xì)胞核的細(xì)胞，例如機(jī)體自身的肌肉細(xì)胞核在成膠原細(xì)胞中(通過成功地轉(zhuǎn)核分化(Transdifferenzierung))。
本發(fā)明以一種在體外控制組織再生的根本上新的構(gòu)思為基礎(chǔ)。與至今為止使用的方法不同的是，既不象現(xiàn)有技術(shù)那樣通常去除也不必然人為地滅絕用于移植的組織的天然細(xì)胞。所述組織會(huì)更多地在一種適宜的裝置中，可以是一個(gè)通常的繁殖反應(yīng)器，經(jīng)受一個(gè)人為的“損傷治療”的過程，其間已經(jīng)初步通過組織自身的介質(zhì)，刺激作用在新生長(zhǎng)的細(xì)胞上。
對(duì)于在天然狀態(tài)下組織的理解是，組織的預(yù)備，即理解為從異種或同種異體的捐獻(xiàn)體中摘離。存在于組織中的細(xì)胞，自預(yù)備或摘離后就處于一種瀕死的狀態(tài)，其按照本發(fā)明的原則并不在進(jìn)一步的處理前通過特別的實(shí)施步驟予以去除。
通過加入受體耐受的、對(duì)于組織類型適宜的細(xì)胞，使最初的外源性移植體在處理過程中漸漸重建成為受體完全免疫耐受的人工生物移植體。
本發(fā)明的認(rèn)識(shí)基礎(chǔ)是，去除或還有積極地滅絕外源性同種異體或異種組織最初的天然細(xì)胞會(huì)加重再繁殖的難度，并且特別還因此，會(huì)失去在每個(gè)機(jī)體內(nèi)由這些細(xì)胞產(chǎn)生的自然地促使自身不斷細(xì)胞更新的刺激。尤其是會(huì)因此失去對(duì)最終所必需的基質(zhì)重建以及有效的基質(zhì)新合成重要的關(guān)鍵因素。
另外無細(xì)胞化產(chǎn)生極大的不穩(wěn)定效果，而鑒于用于植入目的臨床所必需的良好的初始穩(wěn)定性能卻是急切必需的。本發(fā)明解決了這些問題。
只要讓外源性用于移植的繁殖有天然細(xì)胞的異種或同種異體的組織保持在它的天然狀態(tài)下，在一種例如由營(yíng)養(yǎng)物構(gòu)成的調(diào)節(jié)性環(huán)境下的組織培養(yǎng)或組織保存，通過重建組織的細(xì)胞釋放出有利于自然重建(內(nèi)源性刺激)的細(xì)胞介質(zhì)。所述介質(zhì)以特定的方式分布在組織內(nèi)部，只有極少的部分游離到調(diào)節(jié)性培養(yǎng)基中。在用于移植的仍由它的天然細(xì)胞構(gòu)造的組織的培養(yǎng)期間，如果向調(diào)節(jié)性培養(yǎng)基分批或連續(xù)地加入新的受體耐受的細(xì)胞，這些細(xì)胞在重建過程中相繼遷入并隨著時(shí)間替換天然細(xì)胞，天然細(xì)胞在更換調(diào)節(jié)性培養(yǎng)基時(shí)逐漸被帶離。其中根本的是，所述受體耐受細(xì)胞至少包括挑選出的有能力用于改造載體結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，例如，結(jié)締組織細(xì)胞或成膠原細(xì)胞。此外可以存在其它的受體耐受的細(xì)胞。技術(shù)人員可以根據(jù)如上陳述和說明挑選出分別與重建的組織類型相應(yīng)合適的使用細(xì)胞。
基本上同樣已知的是，在天然的，還有沒有無細(xì)胞化的，例如沒有變性的同種異體的移植體表面可以繁殖內(nèi)皮細(xì)胞。該過程也在移植手術(shù)后活體內(nèi)自發(fā)進(jìn)行，當(dāng)體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞在同種異體或異種移植體上落戶時(shí)。這樣的內(nèi)皮細(xì)胞化并不會(huì)導(dǎo)致真正的移植組織重建以及“改造”。通過免疫程序相當(dāng)快地在異體的(和保持異體的)組織上發(fā)生從個(gè)別的焦點(diǎn)(鈣化焦點(diǎn))擴(kuò)展開來的鈣化進(jìn)程。所述移植的組織或器官就此隨著時(shí)間漸漸地被損壞并最終功能衰竭。
動(dòng)物試驗(yàn)表明，例如心臟瓣膜在24至48小時(shí)之間已經(jīng)自發(fā)地內(nèi)皮細(xì)胞化。組織并非因此重建了而是加厚了。內(nèi)皮細(xì)胞生理學(xué)意義上停留在表面。如同L.Maxwell，J.B.Gavin，B.G.Barratt-Boyes，在《心瓣膜同種異體移植和異種移植在營(yíng)養(yǎng)不良性鈣化的影響范圍及起始上的區(qū)別》(Differences between heart valve allografts and xenograftsin the incidence and initiation of dystrophic calcification)，病理學(xué)(1989，21，5-10)中的研究結(jié)果，存在的剩余捐獻(xiàn)體細(xì)胞發(fā)展成為鈣化巢，其最終使得瓣膜失效。
經(jīng)移植的組織和器官的排斥和鈣化可以通過根據(jù)本發(fā)明的方法得以避免，因?yàn)橐呀?jīng)在移植之前就進(jìn)行了體外改造，就此用于移植的組織被很大程度地重建了。
對(duì)此，在本方法中所使用的受體特異細(xì)胞包括有改造能力的細(xì)胞是必須的。屬于此類的特別包括成膠原細(xì)胞，其通過環(huán)境刺激可以引發(fā)，分泌新基質(zhì)和促進(jìn)去除舊細(xì)胞。其它細(xì)胞類型可以附加地與成膠原細(xì)胞混合，在組織的不同層次或不同區(qū)域上應(yīng)用。
優(yōu)選將受體耐受細(xì)胞在培養(yǎng)起始時(shí)一次，即對(duì)移植體的處理，并多次間隔性地或連續(xù)性地加入到在培養(yǎng)基中。
在此受體耐受細(xì)胞可以滴加或涂抹在重建的天然組織上，或連續(xù)或分批地伴隨調(diào)節(jié)性培養(yǎng)基加入。
加入給要重建的移植體的受體耐受或受體特異的細(xì)胞可以用特定的實(shí)施方案與一種特別是能包括血纖維蛋白，肌肉中的膠原粘蛋白或人工合成的粘蛋白的生物耐受的粘合劑混合，或者可以加入到培養(yǎng)基的懸浮物中。
移植體的處理可以在多次交換或連續(xù)流動(dòng)的培養(yǎng)基的情形下進(jìn)行，培養(yǎng)基可以是一種通常使用的。
重建過程優(yōu)選借助機(jī)械性支持，其轉(zhuǎn)移浸洗組織的培養(yǎng)基并且具有傳送新的受體耐受細(xì)胞的液體流，其洗去在重建過程中的排斥/被替換細(xì)胞。使所述組織可以在這期間一次性地或間隔性地沖洗，借此產(chǎn)生一種機(jī)械刺激，有利于要被取代的細(xì)胞的脫除。
因此對(duì)于本發(fā)明重要的是，用受體耐受細(xì)胞在多次交換或連續(xù)流動(dòng)的調(diào)節(jié)性培養(yǎng)基中持續(xù)處理移植體，直至很大程度上完成了在這樣的組織上的對(duì)原本是天然組織的重建，使其基本上只具有用于繁殖使用的受體特異的細(xì)胞。
在調(diào)節(jié)性培養(yǎng)基中用受體耐受細(xì)胞處理天然組織，其中調(diào)節(jié)性培養(yǎng)基或是連續(xù)循環(huán)的或者是多次交換的，這是相應(yīng)于在基質(zhì)上本身已知的細(xì)胞繁殖方式，例如在現(xiàn)有技術(shù)中已知的并可以用不同的方式實(shí)施的。
作為調(diào)節(jié)性培養(yǎng)基可以使用慣用的細(xì)胞培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)物，如需要可以在其中配以不同的附加物。在此適宜的營(yíng)養(yǎng)物是技術(shù)人員所知道的。將受體特異的細(xì)胞以連續(xù)或多次分批加入到調(diào)節(jié)性培養(yǎng)基中。
對(duì)于受體特異細(xì)胞的理解是受體自體的或免疫相容及耐受的細(xì)胞。也可以在不同的繁殖以及處理時(shí)間階段加入不同種類的細(xì)胞，以便可以在組織上生長(zhǎng)由不同種類的細(xì)胞組成的不同的細(xì)胞層。另外可以向組織提供不同細(xì)胞的混合物。進(jìn)而可以加置不同部位的細(xì)胞，例如在皮膚移植體的上側(cè)和下側(cè)，或者在管型脈管的外側(cè)和內(nèi)側(cè)加置不同的細(xì)胞。
作為受體耐受的細(xì)胞，基本上所有的體細(xì)胞可以考慮在內(nèi)，例如，根據(jù)所使用的底物，如下描述的也考慮在內(nèi)結(jié)締組織細(xì)胞(成膠原細(xì)胞、纖維細(xì)胞)、肌肉細(xì)胞(肌細(xì)胞)、內(nèi)皮細(xì)胞、皮膚細(xì)胞(特別是角化細(xì)胞)，分化為器官細(xì)胞的細(xì)胞(心臟細(xì)胞、腎臟細(xì)胞等等)，優(yōu)選的是帶有膠原構(gòu)架的有結(jié)構(gòu)的器官，其一般所有可以合理用于重建特定的用于植入的組織的細(xì)胞。適宜的還有前體細(xì)胞，優(yōu)選來源于受體的自體干細(xì)胞。屬于干細(xì)胞的包括上面已經(jīng)提到的。
重建的組織及移植體，其首先處于天然狀態(tài)，如摘取的，并之后在本方法的過程中重建，可以基本上涉及每一種可移植的組織。特別計(jì)入其中的是一般的脈管、動(dòng)脈、靜脈、動(dòng)脈瓣、心瓣膜、部分器官及整個(gè)器官、皮膚、肌腱、角膜、軟骨、骨骼、喉、心臟、呼吸管、神經(jīng)、半月板(Miniskus)、椎間盤、輸尿管、尿道、膀胱、內(nèi)耳小節(jié)骨、耳和鼻的軟骨、關(guān)節(jié)軟骨、結(jié)締組織、脂肪組織、分泌組織、神經(jīng)和肌肉以及其它等等。
對(duì)于在受體耐受細(xì)胞的幫助下組織的重建，分別挑選符合各自的組織類型的細(xì)胞或混合細(xì)胞。這些受體耐受的，優(yōu)選自體或經(jīng)基因修飾并因此成為受體特異的同種異體或異種細(xì)胞包括了除對(duì)本發(fā)明重要的成膠原細(xì)胞或結(jié)締組織細(xì)胞外還有這樣的細(xì)胞，其適于所希望的組織的建造，和可選擇地還有那些可以刺激和/或控制組織重建的細(xì)胞，例如，產(chǎn)生細(xì)胞因子和/或具有趨化性影響的細(xì)胞，其中主要是來源于白細(xì)胞家族(淋巴細(xì)胞、血小板、巨噬細(xì)胞、柱狀細(xì)胞、粒性白細(xì)胞)的細(xì)胞，例如所有形式的白血球、粒性白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、脾細(xì)胞、記憶細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、以及外周血或骨髓干細(xì)胞(來自血液和骨髓)或脂肪組織的干細(xì)胞，優(yōu)選多能性的干細(xì)胞。
對(duì)于心臟瓣膜優(yōu)選使用成膠原細(xì)胞或成肌纖維細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞。對(duì)于皮膚移植體使用角化細(xì)胞，來源于中胚層的細(xì)胞(中胚層細(xì)胞)和如需要皮膚附屬構(gòu)造物。
本發(fā)明的一個(gè)重要方面在于，理想化的自體成膠原細(xì)胞通過在起始階段尚存的在體外趨于壞死的供體細(xì)胞的信號(hào)作用可以由靜止向活性表型突變。這對(duì)于受體特異或受體耐受細(xì)胞(其同樣是從健康組織中獲取的靜止表型的細(xì)胞)的基因表達(dá)具有重要的結(jié)果。在體外誘導(dǎo)一個(gè)“疾病狀態(tài)”和隨后的“治療狀態(tài)”。在此可以加強(qiáng)并允許與理想化的受體自身或受體特異的輔助細(xì)胞的合作作用。所述用于組織重建的受體耐受細(xì)胞因此優(yōu)選的還包括巨噬細(xì)胞，但也有血小板以及有免疫職能的細(xì)胞如淋巴細(xì)胞。
本發(fā)明的中心是，將處理繼續(xù)，直至很大程度上，如果實(shí)際上還達(dá)不到完全重建，或者直至為在活體內(nèi)的持續(xù)重建的繼續(xù)進(jìn)行開始鋪平了道路。
本發(fā)明的一個(gè)重要的優(yōu)點(diǎn)在于，可以較快地完成植入過程。在傳統(tǒng)的方法中，異體細(xì)胞被首先去除，就此顯著地削弱了基質(zhì)的機(jī)械性能，隨后再繁殖，其所需的時(shí)間至少要24至96小時(shí)。基質(zhì)的穩(wěn)定性能在再繁殖期間逐漸增加，卻最后只能達(dá)到初始數(shù)值的70-80％(例如測(cè)量牽引負(fù)荷)。根據(jù)本發(fā)明的方法使組織的重建在約4天(3至6天)內(nèi)成為可能，其機(jī)械穩(wěn)定性在整個(gè)過程中幾乎保持沒有變化。因?yàn)榻M織已經(jīng)相應(yīng)于起始的生理穩(wěn)定性和可負(fù)荷性，顯著減少了在植入后第一時(shí)間內(nèi)破裂的危險(xiǎn)。重建在體內(nèi)(在植入手術(shù)后)繼續(xù)活體進(jìn)行。
在用受體耐受細(xì)胞處理之前應(yīng)該將用于移植的自體的、同種異體的或異種的，以天然形式提供的組織進(jìn)行無菌化。這特別是在使用異種組織時(shí)要采用的，因?yàn)閼?yīng)該確保排除異種病毒和細(xì)菌伴隨進(jìn)入新制備的人工生物移植體中。即使對(duì)于同種異體的初始組織也應(yīng)該確保排除其傳播疾病的可能。只有重建用于其它使用目的自體組織有可能允許有例外。即便如此無菌化處理也是有意義的，只是不必那么繁瑣。
對(duì)于在天然形式下的組織的理解是這樣的組織，基本上使其處于被摘取時(shí)的狀態(tài)。“天然”在這里意味著自然的、沒有變化的、沒有變性的。所述組織應(yīng)該在進(jìn)入用受體耐受細(xì)胞的處理階段時(shí)，還帶有其天然細(xì)胞，以便可以利用用于組織重建的內(nèi)源性刺激。如上已經(jīng)提及的這些細(xì)胞，因?yàn)轭A(yù)備過程和如需要運(yùn)輸所消耗的時(shí)間而一般已經(jīng)處于開始?jí)乃赖臓顟B(tài)。
無菌化處理應(yīng)該盡可能溫和地完成。出于達(dá)到無菌化的目的可以例如用滅菌溶液沖洗或用氣體無菌化處理(氣熏)。
目前通過等離子離子化的無菌化被看作是特別適宜的，其中氣體排除是在H2O2的伴隨下完成的。對(duì)此將一種過氧化氫水溶液注射到無菌室中并使之蒸發(fā)。在降低的環(huán)境壓力下在一種射線能量的幫助下應(yīng)用一種低溫等離子。經(jīng)此產(chǎn)生一個(gè)電場(chǎng)，其產(chǎn)生一種等離子。過氧化氫在等離子狀態(tài)下被分裂產(chǎn)生自由基。自由基是用于滅菌的活性物種。這種方式不會(huì)遺留毒性殘存物，因?yàn)樵诜磻?yīng)結(jié)束后自由基生成水、氧氣和其它無毒性的產(chǎn)物。過氧化氫的應(yīng)用也符合在許多細(xì)胞中存在的自然過程(例如巨噬細(xì)胞)。
如需要可以特別檢驗(yàn)無菌化的效果，例如無菌化處理后測(cè)試特定的應(yīng)該是嚴(yán)格禁止的病毒或細(xì)菌的存在。
用于移植的組織可以在預(yù)備后在可能需要的無菌化處理之前再經(jīng)受一個(gè)不會(huì)導(dǎo)致變性的操作步驟，如沖洗。小心地冷凍天然移植體組織也是可以的，只要在此避免深程度的組織變化。
在本發(fā)明進(jìn)一步構(gòu)建的實(shí)施方案中，在使用受體耐受細(xì)胞期間或之后再向調(diào)節(jié)性培養(yǎng)基中加入細(xì)胞介質(zhì)和/或因子或化學(xué)介質(zhì)。特定因子的作用已經(jīng)經(jīng)過了研究，以便技術(shù)人員可以有目的地選擇和使用細(xì)胞生長(zhǎng)因子、細(xì)胞分化因子、化學(xué)趨化因子等。特別可以使用的有，神經(jīng)肽其可以具有激活間葉細(xì)胞的能力。成膠原細(xì)胞可以影響繁殖和化學(xué)趨化性。在適宜的神經(jīng)肽中特別值得一提的是神經(jīng)激肽(神經(jīng)激肽A(NKA))、物質(zhì)P(SP)、血管活性的腸肽(Vasoactive Intestinal-peptide(VIP))、降血鈣素基因相關(guān)的肽(calcitonin-gene-related peptide(CGRP))；作為其它主要的化學(xué)趨化和/或控制繁殖作用的介質(zhì)/因子可以各自根據(jù)細(xì)胞和組織的類型使用纖連蛋白(Fn)，細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-1β(IL-1 beta)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)，干擾素，如干擾素-γ(IFN-gamma)，粒性白細(xì)胞-巨噬細(xì)胞群體-刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulation factor(GM-CSF))，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-beta 1(TGF-beta 1))，成骨蛋白-1(osteogenic protein-1(OP-1))，重組人類成骨蛋白-1(rhOP-1)，尿激酶類的纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogenactivator(u-PA))，PDGF(platelet-derived growth factor)，特別是PDGF AA、PDGF AB、PDGF BB、HGF(肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocytegrowth factor))、VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelialgrowth factor))、FGF(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growthfactor))、ECGF(內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(endothelial cell growthfactor))，糖蛋白類，如α-2-巨球蛋白(alpha-2M)、克拉拉細(xì)胞蛋白(CC-16)、血小板因子4、β-血小板球蛋白、嗜中性白細(xì)胞活化肽-1，另外還有合成的介質(zhì)，例如6-磷酸甘露糖、銜接蛋白(Adaptil)等。
所述每個(gè)介質(zhì)、因子、輔助因子的具體作用對(duì)于分離細(xì)胞領(lǐng)域的技術(shù)人員是熟知的，從而在這里所描述的發(fā)明范圍內(nèi)可以挑選按照各自目的適宜的介質(zhì)/因子。
在本發(fā)明進(jìn)一步構(gòu)建的實(shí)施方案中，將本方法如此進(jìn)行下去，在調(diào)節(jié)性培養(yǎng)基和/或組織中加入有免疫職能的細(xì)胞，特別是巨噬細(xì)胞，其將細(xì)胞介質(zhì)和/或因子釋放至調(diào)節(jié)性培養(yǎng)基中。特別是，在此的調(diào)節(jié)性培養(yǎng)基可以由自體，即，受體自身的血液組成，其時(shí)間性地進(jìn)行補(bǔ)充或時(shí)間性地通過血液替換。就此來自血液的巨噬細(xì)胞可以選擇性地粘附在組織上。所述巨噬細(xì)胞從還沒有或尚未完全重建的組織獲得免疫刺激并由此釋放出細(xì)胞特異的介質(zhì)，其加快重建。血小板溶解并釋放例如生長(zhǎng)因子。組織重建被激活、被控制、被加速。
在本發(fā)明進(jìn)一步構(gòu)建的實(shí)施方案中，將本方法如此進(jìn)行下去，從有免疫職能細(xì)胞的培養(yǎng)物，特別是巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)物，將細(xì)胞介質(zhì)和/或因子釋放至調(diào)節(jié)性培養(yǎng)基上或轉(zhuǎn)移至其中。這種培養(yǎng)物也可以含有淋巴細(xì)胞或血小板。進(jìn)一步這里也可以加入干細(xì)胞。
適宜用于增強(qiáng)釋放因子或介質(zhì)的培養(yǎng)物的，例如有免疫職能細(xì)胞的培養(yǎng)物或巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)物可以在一個(gè)生物反應(yīng)器中制備，該生物反應(yīng)器和預(yù)備及處理人工生物移植體的反應(yīng)器以適宜的方式相連。從生物反應(yīng)器中攝取的因子可以以適宜的量加入到通過連續(xù)或分批的方式加入的調(diào)節(jié)性培養(yǎng)基中。
通過適宜的生物反應(yīng)器可以在此實(shí)施一種依靠壓力和負(fù)載的改造，例如通過脈動(dòng)灌注運(yùn)轉(zhuǎn)，例如用于脈管和心瓣膜，其對(duì)于重建組織的自然性有著很積極的作用。這改善了體外培養(yǎng)的人工生物組織符合于正常生理學(xué)的明顯性。
一種可替換方式是，所述巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物以及其它有免疫職能的細(xì)胞的培養(yǎng)物可以在用受體耐受細(xì)胞的處理過程中用對(duì)細(xì)胞介質(zhì)和/或因子有透過性的薄膜、膜或隔離壁與調(diào)節(jié)性培養(yǎng)基保持隔離并且生成的介質(zhì)和/或因子可以連續(xù)地釋放到調(diào)節(jié)性培養(yǎng)基中。
對(duì)于用于移植的組織的處理通常在一個(gè)生物反應(yīng)器中進(jìn)行，其中在一特定空間中預(yù)先儲(chǔ)放培養(yǎng)基并如需要循環(huán)培養(yǎng)基。在所述空間中可以用一種可通透的隔離壁構(gòu)成一個(gè)用于有免疫職能的細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)物的培養(yǎng)物空間，以便使所生成的細(xì)胞介質(zhì)和/或因子可以持續(xù)地進(jìn)入調(diào)節(jié)性培養(yǎng)基。一種可替換方式是，有免疫職能的細(xì)胞也可以分開地培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物可以加入用于組織培養(yǎng)物的生物反應(yīng)器中。另外所述產(chǎn)品(即，器官或通常指組織)還可以出于調(diào)節(jié)的目的并同或在添入受體特異的全血或個(gè)別血成分(蛋白、纖連蛋白、凝血酶、纖維蛋白原、血漿、血清、細(xì)胞組分)下泵流培養(yǎng)(perfundiert)以及協(xié)同培養(yǎng)。作為有免疫職能的細(xì)胞可以特別使用的是所有形式的白血球、粒性細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、脾細(xì)胞、記憶細(xì)胞和胸腺細(xì)胞。
前述的兩種可替換方式也可以組合應(yīng)用，其中不僅有免疫職能的，以及免疫調(diào)節(jié)的細(xì)胞為了制備特定的介質(zhì)/因子而在組織生物反應(yīng)器內(nèi)或外進(jìn)行協(xié)同培養(yǎng)，還同時(shí)加入天然獲取或人工合成的介質(zhì)/因子至組織培養(yǎng)基中。
生產(chǎn)介質(zhì)、因子、輔助因子并釋放到調(diào)節(jié)性培養(yǎng)基中的有免疫職能的細(xì)胞的協(xié)同培養(yǎng)物，是特別有益的，因?yàn)橛糜诟髯阅康奶貏e適宜的介質(zhì)/因子可以在必需的培養(yǎng)步驟中直接伴隨生成，以便可以放棄額外的昂貴和稍弱特異性的因子的使用。
下面就一些實(shí)施例來描述本發(fā)明實(shí)施例1一種同種異體的低溫冷藏的靜脈分化轉(zhuǎn)變成為自體的動(dòng)脈低溫冷藏的同種異體靜脈在未經(jīng)進(jìn)一步處理的情形下無菌地置入一個(gè)生物反應(yīng)器中，并且理想的是用無血清的或自體血清/血漿濃集的培養(yǎng)基泵流培養(yǎng)(perfundiert)。將預(yù)擴(kuò)張了的自體的源于動(dòng)脈的成膠原細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞加置于先前低溫冷藏的靜脈外側(cè)。在此這是通過在培養(yǎng)前滴加或涂抹和粘合劑混合的細(xì)胞，或者通過滴加或涂抹培養(yǎng)基中的細(xì)胞懸浮液，而加置到一種(自體的)血纖維蛋白膠、膠原質(zhì)膠、合成的來自貝類粘蛋白來實(shí)現(xiàn)的。上皮細(xì)胞(用肌成膠原細(xì)胞預(yù)先繁殖所特許的)被加置到在脈管腔中。這是在緩慢旋轉(zhuǎn)在生物反應(yīng)器中的脈管得以實(shí)現(xiàn)的，其中生物反應(yīng)器可以是各種適宜的裝置。成膠原細(xì)胞被消亡細(xì)胞的細(xì)胞碎片激活合成新的基質(zhì)、建造新的組織結(jié)構(gòu)并增強(qiáng)其在組織/基質(zhì)中的一體化。一個(gè)多層的肌細(xì)胞外套在幾天內(nèi)形成了。
所述動(dòng)脈化了的(重建的)脈管就此沒有穩(wěn)定性的損失(如通常在無細(xì)胞化后達(dá)至＜20％的原有強(qiáng)度)，是很快就作好了移植準(zhǔn)備的。
實(shí)施例2一種異種的低溫冷藏的動(dòng)脈的分化轉(zhuǎn)變成為自體的人類動(dòng)脈異種動(dòng)脈在未經(jīng)任何無細(xì)胞化處理的情況下用自體細(xì)胞脈管細(xì)胞按類似第一個(gè)實(shí)施例的方法，但是還沒有內(nèi)皮細(xì)胞下繁殖。使這種嫁接雜合的構(gòu)造(重建的組織)用自體血液沖洗。在這個(gè)階段巨噬細(xì)胞選擇性地附著在暴露的基質(zhì)上。淋巴細(xì)胞通過異種基質(zhì)獲取了免疫刺激。血小板溶解并釋放如PDGF的生長(zhǎng)因子。在大約4小時(shí)的作用時(shí)間后(足夠用于巨噬細(xì)胞的附著)，自體血液再次用血漿濃集的培養(yǎng)基替換并隨后培養(yǎng)幾天(約3-10天)。在這個(gè)階段通過用于繁殖而加入的(自體的)肌成膠原細(xì)胞促進(jìn)了基質(zhì)的轉(zhuǎn)變。通過脈動(dòng)負(fù)荷完成一種定向壓力控制的新基質(zhì)分子和纖維的沉積。同樣使新合成的細(xì)胞帶的定向一體化成為可能。
可替換的方式是，血小板(獲取大約3000g)和白血球(1800g)的制備可以分開地在生物反應(yīng)器中不同的部位或同步在一個(gè)分開的裝置中協(xié)同培養(yǎng)。在后面的那種情況下，使如此獲取的培養(yǎng)產(chǎn)物加入到本來的組織生物反應(yīng)器中的組織培養(yǎng)物中。
權(quán)利要求
1.由一種用于移植的生物組織和加置其上的受體耐受細(xì)胞制備人工生物移植體的方法，其特征在于，-向用于移植的自體、同種異體或異種的，以天然形式存在的并且未用異種生長(zhǎng)因子預(yù)處理的組織在調(diào)節(jié)性培養(yǎng)基中加入受體耐受的細(xì)胞，其至少包括挑選出的有改造載體結(jié)構(gòu)能力的細(xì)胞，-繼續(xù)移植體的處理直至達(dá)到天然組織進(jìn)一步被重建成為基本上表現(xiàn)為加入的受體耐受細(xì)胞的組織。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，有改造載體結(jié)構(gòu)能力的細(xì)胞是結(jié)締組織細(xì)胞或其前體，特別是成膠原細(xì)胞或結(jié)締組織的前體細(xì)胞，優(yōu)選自體的干細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，重建的組織是心臟組織并且有改造能力的細(xì)胞是平滑肌細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，有改造能力的細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的方法，其特征在于，受體耐受細(xì)胞在培養(yǎng)起始時(shí)一次地，多次間斷地或連續(xù)地加入到培養(yǎng)基中。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的方法，其特征在于，受體耐受細(xì)胞滴加或涂抹在用于重建的天然組織上，或連續(xù)或分批式地加入到調(diào)節(jié)性培養(yǎng)基中。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的方法，其特征在于，加入的受體耐受的細(xì)胞與生物耐受的粘合劑混合，其特別是可以包括血纖維蛋白、膠原蛋白或粘蛋白，或置入到培養(yǎng)基的懸浮液中。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)的方法，其特征在于，移植體在培養(yǎng)物中的處理在多次交換的或連續(xù)流動(dòng)的培養(yǎng)基下進(jìn)行。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)的方法，其特征在于，在用受體耐受細(xì)胞的處理期間向調(diào)節(jié)性培養(yǎng)基中加入細(xì)胞介質(zhì)和/或因子或化學(xué)介質(zhì)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的方法，其特征在于，所述方法是這樣實(shí)施的，在調(diào)節(jié)性培養(yǎng)基和/或組織中附加地加入特別有能力釋放細(xì)胞介質(zhì)和/或因子并可激活的細(xì)胞，特別是巨噬細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于，特別有能力釋放細(xì)胞介質(zhì)和/或因子并可激活的細(xì)胞，特別是巨噬細(xì)胞，預(yù)先保持在培養(yǎng)物中，優(yōu)選在生物反應(yīng)器中，特別優(yōu)選在還處理移植體的同一生物反應(yīng)器中。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其特征在于，巨噬細(xì)胞或相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)物在用受體耐受細(xì)胞繁殖或處理期間經(jīng)對(duì)細(xì)胞介質(zhì)和/或因子有通透性的膜、薄膜或隔離壁與調(diào)節(jié)性培養(yǎng)基分隔開并且所產(chǎn)生的介質(zhì)和/或因子連續(xù)地釋放到調(diào)節(jié)性培養(yǎng)基中。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)的方法，其特征在于，使用于移植的自體、同種異體和異種的以天然形式存在的組織先進(jìn)行無菌化處理，優(yōu)選通過用滅菌溶液沖洗或通過氣體熏。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其特征在于，無菌化過程通過H2O2等離子離子化完成。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14任一項(xiàng)的方法，其特征在于，使用于移植的組織在其預(yù)備后，優(yōu)選在無菌化之前或之后，再經(jīng)歷一個(gè)不會(huì)導(dǎo)致變性的操作步驟。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15任一項(xiàng)的方法，其特征在于，使用于移植的組織在其預(yù)備后，優(yōu)選在無菌化之前或之后，附加沖洗一次或多次。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16任一項(xiàng)的方法，其特征在于，受體耐受細(xì)胞是移植受體的自體細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至16任一項(xiàng)的方法，其特征在于，使用于受體的受體耐受細(xì)胞是作為耐受挑選出來的同種異體或經(jīng)過基因修飾的同種異體細(xì)胞。
全文摘要
由一種用于移植的生物組織和加置其上的受體耐受細(xì)胞制備人工生物移植體的方法，該方法是在體外進(jìn)行受控的組織再生過程，其中挑選出的有能力用于改造載體結(jié)構(gòu)的細(xì)胞加入到置于培養(yǎng)物中的天然組織，并且繼續(xù)培養(yǎng)直至產(chǎn)生基本上重建了的、表現(xiàn)為加入的受體耐受細(xì)胞的新組織。
文檔編號(hào)C12N5/08GK1440299SQ01812301
公開日2003年9月3日 申請(qǐng)日期2001年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月29日
發(fā)明者奧古斯蒂努斯·巴德 申請(qǐng)人:奧古斯蒂努斯·巴德