專利名稱：抗凍蛋白、其生產(chǎn)和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗凍蛋白，并且涉及所述蛋白的生產(chǎn)方法和用途。更具體地講，本發(fā)明涉及從以前沒(méi)有被用于這種目的的生物中獲得抗凍蛋白；涉及由此所得到的新型抗凍蛋白；并且涉及所述蛋白在控制冷凍過(guò)程，特別是在生產(chǎn)冷凍食品中的用途；以及由此所獲得的食品。
背景技術(shù)：
所謂的‘抗凍蛋白’(AFPs)具有改變冰晶生長(zhǎng)的特性。這種抗凍蛋白的作用與諸如食鹽的較簡(jiǎn)單的離子型抗凍劑的作用不同。例如，AFP水溶液的冰點(diǎn)通常低于其熔點(diǎn)(滯后現(xiàn)象)。它們能抑制再結(jié)晶。這種蛋白似乎有助于生物在接近水的冰點(diǎn)的溫度下存活，因此，出現(xiàn)在若干種不同類型的生物體內(nèi)。這種蛋白的特性使它具有多種潛在的用途特別是用于在冷凍情況下食用的食品，用來(lái)抑制再結(jié)晶，并且保持光滑的質(zhì)地。在僅僅是為了保存而冷凍的食品中，AFPs在冷凍、保存、運(yùn)輸和解凍期間能抑制再結(jié)晶，從而通過(guò)減少細(xì)胞損傷來(lái)保持食品的質(zhì)地，并且還能通過(guò)減少水分流失降低養(yǎng)分的損失(參見(jiàn)Griffith，M.和VanyaEwart，K.Biotechnology Advances，13，PP375-402)。
有多種AFPs的來(lái)源是已知的最普遍報(bào)導(dǎo)過(guò)的有魚(yú)和植物。某些細(xì)菌具有抗凍特性(參見(jiàn)Griffith等，同上，p382)在少數(shù)情況下，還報(bào)導(dǎo)過(guò)從細(xì)菌中分離抗凍蛋白(例如，參見(jiàn)Xu H，Griffith M，Patten CL等，Can J Microbiol 44(1)64-73Jan 1998)。
人們可能認(rèn)為具有抗凍特性的生物具有優(yōu)勢(shì)，但令人吃驚的是，抗凍蛋白并非在自然界中有更廣泛的分布，并且也并非更容易發(fā)現(xiàn)。
將新型AFPs用于冷凍食品中的一個(gè)缺陷是，要確保這種AFPs是安全的，并且可以被消費(fèi)者接受。消費(fèi)者有理由要求確保他們所食用的東西是安全的。消費(fèi)者還可能對(duì)特定類型的材料表現(xiàn)出偏好或排斥例如，對(duì)‘天然’或‘有機(jī)’材料的偏愛(ài)，以及對(duì)‘添加劑’或‘化合物’或‘遺傳修飾材料-(GM)’的排斥。食品生產(chǎn)商忽視這些偏愛(ài)是冒險(xiǎn)的。
因此，需要是或者被認(rèn)為是‘天然的’有效AFPs。如果所述材料來(lái)自具有被人類食用的歷史的來(lái)源的話，由此所產(chǎn)生的合理的假設(shè)是，這種材料更有可能是安全的。這樣可以減少進(jìn)行深入的、成本高昂的毒性測(cè)試。
以前業(yè)已報(bào)導(dǎo)過(guò)某些地衣含有抗凍蛋白。具體地講，來(lái)自Alectorianigricans，Caloplaca regalis，Himantormia lugubriS，Hypogymniaphysodes，Parmelia subrudecta，Ramalina farinacea，Stereocaulonglabrum，南極石臍和亞花松蘿的AFPs是已知的[WO98/04148]。另外，業(yè)已推薦將這種AFPs用于冷凍甜食[WO98/04148]。
不過(guò)，將從地衣中獲得的AFPs用作食品的成分具有若干缺陷。并非是所有的地衣都具有AFP活性。而具有AFP活性的地衣很多又不經(jīng)常被人類所食用。地衣通常不能夠以商業(yè)化規(guī)模增殖，很多地衣只能以很少的數(shù)量從環(huán)境中獲得。因此，在地衣中仔細(xì)尋找AFPs的來(lái)源并非是顯而易見(jiàn)的。盡管如此，所進(jìn)行的所述研究導(dǎo)致了本發(fā)明的出現(xiàn)。
為了尋找合適的新的AFPs，選擇在挪威野生生長(zhǎng)的四種候選地衣進(jìn)行試驗(yàn)。這四種地衣是冰島衣，Nephroma arcticum(NephromatoceaePeltigerales科)，Umbilicaria hyperborea(石臍科)和Platismatia glauca。這四種地衣是在挪威森林中大量生長(zhǎng)的許多地衣中的四種每一種地衣都很容易以100克或100克以上的量收集到。
冰島衣是最經(jīng)常被用作食品的地衣物種。它業(yè)已被稱為“面包苔蘚(Brodmose)”。在十八和十九世紀(jì)，挪威政府鼓勵(lì)人民在家庭中使用更多的地衣。冰島衣大多數(shù)是在作物受凍和在戰(zhàn)爭(zhēng)期間被使用。它在最近的第二次世界大戰(zhàn)中已經(jīng)被使用過(guò)。業(yè)已將石臍科用作食物，并且具有“山羊面包”(geitbrod)的名稱。Cetraria nivalis，Cladonia sp.和Peltigeraaphtosa也已被用作食品。
Nephroma arcticum也已經(jīng)被用于食品中，不過(guò)不像冰島衣那樣被經(jīng)常使用；另外，傳統(tǒng)上它還被用作治療皮膚疾病的藥物。N.arcticum是具有較大和較厚葉狀體的葉狀地衣。在潮濕狀態(tài)下，其上表面是黃綠色或綠色的，而在干燥狀態(tài)下是稻草顏色的或灰綠色的。其下表面是棕色的，并且朝向其邊緣是白色的。
這種地衣主要生長(zhǎng)在背陰的巖石上以及地面上。它是北半球/高山生長(zhǎng)的植物，其主要分布在低的高山環(huán)境中。它是一種出現(xiàn)在北美洲、亞洲(包括日本)和歐洲的環(huán)極地物種。在英國(guó)，這種地衣是非常罕見(jiàn)的。它出現(xiàn)在除了挪威南部的西海岸之外的挪威全國(guó)各地，不過(guò)，在每一個(gè)地方出現(xiàn)的數(shù)量通常很少。就目前所知，到現(xiàn)在為止還沒(méi)有對(duì)其豐度進(jìn)行過(guò)詳細(xì)研究。在挪威，它不是一種受保護(hù)的物種，而且也不可能成為受保護(hù)的物種。
由于Nephroma arcticum的葉狀體大并且厚，比較容易進(jìn)行清洗。因此，很容易獲得干凈的樣品。另外，在某些地方，所述地衣覆蓋著大部分地面。因此，當(dāng)發(fā)現(xiàn)這樣一個(gè)地方之后，就能很快收集到所述地衣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了可來(lái)自地衣Nephroma arcticum的抗凍蛋白(AFPs)，特別是具有L-V-I-G-S-T-A-Q(E)-N-F-G-V-V(S)-A-A-A-T的N-末端的氨基酸序列的抗凍蛋白。
還提供了包括與上述序列具有高度相似性的氨基酸序列的AFPs或其修飾形式。
本發(fā)明還包括編碼所述蛋白的核酸序列和含有所述序列的載體。
本發(fā)明還提供了一種制備AFPs的方法，該方法包括從地衣Nephroma arcticum中提取AFP蛋白，這種蛋白在食品加工中的用途以及含有這種蛋白的食品組合物。
在本文中，術(shù)語(yǔ)‘抗凍蛋白’(AFP)表示這樣一種蛋白，它可以是改性蛋白，它能夠抑制冰晶的生長(zhǎng)(例如，參見(jiàn)US5118792)。因此，‘AFP活性’是一種蛋白抑制冰晶生長(zhǎng)的能力。例如，這種活性可以通過(guò)‘splat測(cè)定’證實(shí)(例如，參見(jiàn)Smallwood等，Biochem.J.340，385-391)。
‘能夠來(lái)自’一種特定生物的蛋白，是由天然存在于這種生物中的基因所編碼的蛋白。這種蛋白可以通過(guò)從所述生物本身中提取獲得，或者通過(guò)在合適的宿主中異源表達(dá)編碼這種蛋白的核酸序列而獲得。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明就是基于對(duì)存在于已知的人類食品來(lái)源中的具有高效AFP活性的一種蛋白的發(fā)現(xiàn)。從所述來(lái)源中提取這種蛋白得到了一種有效的AFP，這種AFP可能是安全的，因?yàn)樗鼇?lái)自一種食品來(lái)源，并且它還可能被消費(fèi)者認(rèn)為是‘天然的’。
具體地講，本發(fā)明包括可以從Nephroma arcticum中獲得的具有抗凍特性的新型蛋白。這種蛋白是本發(fā)明人到目前為止所鑒定到的一種主要的抗凍蛋白，并且業(yè)已部分確定了它的序列。本發(fā)明還包括有可能產(chǎn)生這種地衣物種的抗凍活性的其他蛋白。
通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳判斷，從Nephroma arcticum分離的主要AFP的表觀分子量為大約29kDa(不過(guò)，由于技術(shù)的限制，該分子量值可能有+/-4kDa的誤差范圍)。業(yè)已確定該蛋白的N-末端氨基酸序列為L(zhǎng)-V-I-G-S-T-A-Q(E)-N-F-G-V-V(S)-A-A-A-T正如所表明的，在8號(hào)位置(主要形式為Q，以E為少數(shù)的變體)和13號(hào)位置(主要形式為V，以S為少量變體)上，似乎存在某些序列雜合性。對(duì)肽序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行的相似性檢索，沒(méi)有鑒定到與該序列具有明顯同源性的任何已知多肽。
本發(fā)明特別包括這種蛋白，無(wú)論它是從Nephroma arcticum中直接獲得的，還是通過(guò)在遺傳修飾過(guò)的生物中表達(dá)編碼這種蛋白的DNA序列而獲得的。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括來(lái)自任何來(lái)源的與上文所列舉的序列具有高度的序列相似性的蛋白。對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，具有AFP活性并且其氨基酸序列的一部分與上述序列具有至少80％重疊的所有蛋白都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。更優(yōu)選具有至少90％的重疊，最優(yōu)選具有至少95％的重疊；例如，所述序列在其序列的合適的部分與上述序列的差別少于一個(gè)或二個(gè)殘基。
對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，可以按以下方式計(jì)算兩個(gè)(部分)氨基酸序列的重疊程度(a)對(duì)這兩種序列進(jìn)行排比，并且統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)在相同級(jí)別上的相同殘基的數(shù)量(x)；(b)統(tǒng)計(jì)每一種氨基酸的每一種變化、缺失或插入(1個(gè)點(diǎn))，并且計(jì)算所述變化、缺失或插入的總數(shù)(y)；(c)通過(guò)以下公式計(jì)算重疊的程度x.100％/(x+y)
可以理解的是，當(dāng)相似蛋白的氨基酸序列具有一個(gè)N-末端延伸部分時(shí)，由所述N-末端開(kāi)始的氨基酸序列本身可能不具有至少80％的相似性。不過(guò)，所述蛋白構(gòu)成了本發(fā)明的一部分，只要其氨基酸序列的至少一部分與上述序列具有至少80％的重疊就行。
本發(fā)明的范圍還包括上述任何蛋白的任意的修飾形式，只要這種修飾不會(huì)明顯影響所述改性蛋白的AFP活性(例如，通過(guò)splat測(cè)定判斷)就行。例如，本發(fā)明包括糖基化蛋白。
本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明的新型蛋白的核酸序列?？梢杂帽绢I(lǐng)域眾所周知的方法方便地克隆并鑒定業(yè)已部分測(cè)序的主要AFP的DNA序列；在例11中披露了一種合適的方法。一旦獲得了部分蛋白序列，就可以用類似方法產(chǎn)生編碼其他AFPs的DNA序列。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，還包括含有編碼本發(fā)明的AFP的DNA序列的載體。
對(duì)某些用途來(lái)說(shuō)，可以在不破壞環(huán)境的前提下，從野外收集到足夠的Nephroma arcticum。實(shí)際上，本發(fā)明人認(rèn)為，某些地衣業(yè)已被商業(yè)化收獲用作馴鹿飼料。因此，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)含有AFP的材料的方法，該方法包括從野外收集地衣Nephroma arcticum，并且從中回收具有AFP活性的提取物。
該方法在工業(yè)規(guī)模上的適用性明顯取決于所述地衣的供應(yīng)，并且本發(fā)明的一個(gè)重要特征是，本發(fā)明人業(yè)已檢查了挪威中部的山脈，并且發(fā)現(xiàn)Nephroma arcticum資源豐富，因此可以以足夠的數(shù)量采集用作加工食品的添加劑。本發(fā)明人業(yè)已發(fā)現(xiàn)了這種地衣的新的、豐富的地點(diǎn)，并因此認(rèn)為N.arcticum在這些山脈中是非常普遍的。有趣的發(fā)現(xiàn)是，來(lái)自挪威植物博物館的資料認(rèn)為這種地衣是稀少的，并且給人的印象是這種地衣并不是很豐富的。這體現(xiàn)的是研究的缺乏，而不是這種地衣的實(shí)際分布情況。不過(guò)，所述山區(qū)的一個(gè)問(wèn)題是，在這些地方，所述地衣的生長(zhǎng)形式使得它難于被采集到。它們與土壤和苔蘚非常緊密地結(jié)合在一起生長(zhǎng)，并且每一個(gè)葉狀體也比在低地上的體積要小。因此，采集的最佳方法可能是尋找位于樹(shù)木線下面的資源豐富的地方。
用微生物制備粗制蛋白提取物的方法以及從所述提取物中部分或完全純化具有特殊活性的蛋白的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。在例9中提供了一種適用于從N.arcticum分離非常純的主要AFP制劑的方法，該方法采用了離子交換、親和層析和凝膠過(guò)濾的組合方案。對(duì)于在食品制備中的用途來(lái)說(shuō)，如此高的純化程度是不必要的。不過(guò)，部分純化可能是需要的，例如，通過(guò)純化除去有可能經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間降解AFP的蛋白酶。
當(dāng)需要將AFP用于食品中時(shí)，必須對(duì)所述提取方法進(jìn)行改進(jìn)，以便只使用無(wú)毒的化合物。在例6中披露了一種這樣的方法，不過(guò)，也可以使用其他提取方法。因此，重要的是要指出將任何這樣的AFP制劑用于冷凍食品，都必須證實(shí)該制劑確實(shí)是無(wú)毒的。存在從事這種研究的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，它們使用對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來(lái)說(shuō)是眾所周知的技術(shù)。
本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)具有AFP活性的材料的方法，該方法包括在能合成所述蛋白的條件下培養(yǎng)含有編碼本發(fā)明的新型蛋白的DNA序列的生物，所述DNA序列受合適的基因調(diào)控元件的控制，并且從培養(yǎng)物中回收具有AFP活性的提取物。該生物可以是Nephroma arcticum的一種組成生物，其中，所述編碼AFP的基因是天然存在的，或者是一種業(yè)已作過(guò)遺傳學(xué)修飾的不同的生物，以便能生產(chǎn)AFP。
地衣由兩種或兩種以上共生生活的生物組成。地衣共生菌是一種真菌，而共生光合生物是藻類或蘭細(xì)菌。在某些場(chǎng)合下，包括Nephromaarcticum，所述真菌同時(shí)與藻類和蘭細(xì)菌共生生活在一起。共生光合生物通過(guò)光合作用提供能量。
可以培養(yǎng)諸如Nephroma arcticum的地衣的組成生物。具體地講，可以培養(yǎng)單一的組成生物可以生產(chǎn)真菌共生物的培養(yǎng)物，可以生產(chǎn)藻類共生物的培養(yǎng)物，并且可以生產(chǎn)細(xì)菌共生物的培養(yǎng)物。可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)AFP測(cè)定確定能產(chǎn)生大部分AFP的培養(yǎng)物。然后，就可以將所述培養(yǎng)物用作AFP的商業(yè)來(lái)源。該方法所具有的優(yōu)點(diǎn)是，一方面它不會(huì)產(chǎn)生環(huán)境問(wèn)題，因?yàn)椴粫?huì)將N.arcticum從野外消除，另一方面不采用GM技術(shù)。這一點(diǎn)有可能是重要的，因?yàn)槟承┫M(fèi)者不希望其食品中含有添加劑或者是通過(guò)遺傳修飾技術(shù)生產(chǎn)的成分。在例12中披露了如何培養(yǎng)所述組成生物。
另一種方法是培養(yǎng)含有編碼本發(fā)明的抗凍蛋白的DNA序列的遺傳轉(zhuǎn)化的生物，所述DNA序列受一種基因啟動(dòng)子的控制，該啟動(dòng)子適合導(dǎo)致所述DNA序列在所述轉(zhuǎn)化的生物中產(chǎn)生抗凍蛋白?？梢詫⒕幋a所述抗凍蛋白的DNA序列插入合適的表達(dá)載體中，該載體含有在合適條件下轉(zhuǎn)錄并翻譯成所需蛋白的必要因子，包括該序列的正確取向，正確的讀框以及合適的導(dǎo)向和表達(dá)序列。制備合適的載體的方法，以及用該載體轉(zhuǎn)化多種不同類型生物的方法為本領(lǐng)域所熟知。
原則上講，可以用這種方法對(duì)任何生物進(jìn)行修飾，以便產(chǎn)生所需要的蛋白，例如，可以對(duì)細(xì)菌、酵母、植物或植物、昆蟲(chóng)或動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行修飾。一般優(yōu)選細(xì)菌、酵母和植物或植物細(xì)胞系統(tǒng)。另外，適用于實(shí)施本發(fā)明方法的遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)的生物構(gòu)成了本發(fā)明的另一方面。
用遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)的生物生產(chǎn)AFP的優(yōu)點(diǎn)可能包括更容易控制所述生物，和所述生物生長(zhǎng)的更快，以及有可能獲得更高的產(chǎn)量。提取和部分純化或全面純化也可能更容易進(jìn)行。特別是當(dāng)AFP被設(shè)計(jì)成分泌到培養(yǎng)基中時(shí)更是這樣。分泌的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，對(duì)于某些宿主生物來(lái)說(shuō)，至少在培養(yǎng)基中積累的蛋白酶的含量通常比較低，這樣，就可以增強(qiáng)AFP的穩(wěn)定性。
適用于由所述培養(yǎng)的生物制備含有蛋白的提取物的方法為本領(lǐng)域所熟知；適用于從所述提取物中部分或全面純化AFP的步驟類似于在上文所披露的從N.arcticum提取物本身中提取它所采用的步驟。
還可以提供適用于生產(chǎn)本發(fā)明的AFPs的合適的遺傳轉(zhuǎn)化的生物，這種生物因?yàn)榫哂休^強(qiáng)的抗凍能力，它本身就是有用的。該方法特別適用于植物所述植物可以是諸如小麥或玉米的禾本科植物；或者是諸如大豆、番茄或萵苣的雙子葉植物。所述植物同樣構(gòu)成了本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明的AFPs通?？捎糜谌舾煞N產(chǎn)品中，優(yōu)選用于冷凍食品或者打算冷凍的食品中。所述食品的例子有冷凍食品，如蔬菜、醬油、湯、小吃、乳制品和冷凍甜食。我們所說(shuō)的冷凍甜食包括果汁凍、水冰、granites、冰凍果泥和含乳冷凍甜食，如冰淇淋、冷凍酸奶或乳蛋糕、果汁牛奶凍和冰乳。優(yōu)選的食品是冷凍蔬菜和冷凍甜食，例如，冰淇淋、水冰。如果使用干燥混合物或濃縮物的話，其濃度可能較高，以便確其保在最終冷凍食品中的含量在理想范圍內(nèi)。
例如，可以通過(guò)在例7中所披露的再結(jié)晶抑制(RI)測(cè)定，確定添加到食品中的含有AFP的溶液的合適的用量。RI測(cè)定是定量測(cè)定，但是它也是費(fèi)時(shí)間的，并且需要特殊設(shè)備。Jarman等(WO99/37782)早先業(yè)已披露了用于測(cè)定冰再結(jié)晶抑制的分析方法。本發(fā)明人業(yè)已發(fā)現(xiàn)，對(duì)于大多數(shù)用途來(lái)說(shuō)，AFP的優(yōu)選含量占最終產(chǎn)品重量的0.00005-0.3％，特別是0.0001-0.2％。
在制備食品時(shí)，沒(méi)有必要添加高度純化形式的AFP可以作為含有AFP的組合物形式添加，例如，產(chǎn)生AFP的生物的提取物。不過(guò)，正如上文所討論過(guò)的，部分純化可能是有利的，例如，可以除去蛋白酶。
可以用本領(lǐng)域所公知的任何合適的方法生產(chǎn)本發(fā)明的冷凍甜食。優(yōu)選在冷凍之前，在環(huán)境溫度下或者在高于環(huán)境溫度的溫度下將有關(guān)配方的所有成分充分混合。冷凍甜食中的固體含量(例如，糖、脂肪、香味劑)被適當(dāng)調(diào)整到占最終產(chǎn)品重量的至少3％，通常在10-70％的范圍內(nèi)，特別是40-70％。
提供下面的實(shí)施例僅僅是出于說(shuō)明目的。
例1采集地衣并運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行研究在本實(shí)施例中所使用的地衣樣品是從亞高山環(huán)境中采集的。
用手挑選地衣，并且在運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室期間將地衣裝在紙袋中。在清洗之前，在實(shí)驗(yàn)室中，將所述紙袋放入+5℃的冷藏室中。
首先用自來(lái)水清洗所述地衣。然后用手清洗地衣，并且在潮濕狀態(tài)下保存。在清洗之后，用液氮沖洗，并且轉(zhuǎn)移到冰箱中(-80℃)，將它裝在位于硬紙盒里面的紙袋中，直到裝在苯乙烯容器中隨同干冰一起運(yùn)送到英國(guó)。所有地衣都是在采集之后36小時(shí)之內(nèi)清洗，并且在液氮中冷凍的。
例2測(cè)定兩種食用地衣(Nephroma arcticum和冰島衣)中的AFP活性。
地衣組織的勻漿用在-20℃下預(yù)冷的研缽和研棒在液氮中將在-80℃下保存的冷凍組織研磨成細(xì)粉。將所述細(xì)粉轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的研缽和研棒中，并且用等體積的緩沖液A(0.2M Tris；10mM EDTA；20mM抗壞血酸；pH7.8；30％蔗糖w/w)進(jìn)一步勻漿。以14000rpm的速度將勻漿物離心(Jouanl4臺(tái)式離心機(jī))4分鐘，并將上清液保持在冰上待用。
通過(guò)splat測(cè)定檢測(cè)AFP活性通過(guò)改進(jìn)的“splat測(cè)定”測(cè)定AFP活性(SmallWood等，Isolation andcharacterisation of a novel antifreeze protein from carrot(Daucus carota)，Biochem.J.340，385-391)。將要進(jìn)行研究的4毫升溶液轉(zhuǎn)移到一個(gè)清潔的作過(guò)適當(dāng)標(biāo)記的13毫米的圓形蓋玻片上。將另一個(gè)蓋玻片放在液滴上面，用手指將這兩個(gè)蓋玻片壓在一起，以便形成一個(gè)夾心體。將該夾心體放入一個(gè)干冰盒子中的保持在-80℃下的庚烷溶液中。在制備了所有夾心體之后，用在干冰中預(yù)冷的鑷子將這些夾心體從-80℃的庚烷溶液中轉(zhuǎn)移到裝有-6℃庚烷的觀察室中。在將夾心體轉(zhuǎn)移到-6℃時(shí)，可以觀察到夾心體從透明外觀向不透明外觀的轉(zhuǎn)變。在光學(xué)照相顯微鏡(尼康)上用20倍物鏡觀察冰晶，并且在-6℃下培養(yǎng)60分鐘后，用攝象機(jī)和圖象分析系統(tǒng)(LUCIA，尼康)記錄圖象。
對(duì)于半定量分析來(lái)說(shuō)，對(duì)一系列1∶2的上清液稀釋液進(jìn)行分析，以便確定能夠檢測(cè)到較小的冰晶體積的最低的稀釋比例。按照生產(chǎn)商的說(shuō)明，利用BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)Bio-Rad蛋白測(cè)定，確定上清液中的蛋白含量。
結(jié)果制備Nephroma arcticum和冰島衣的提取物，并測(cè)定AFP活性。檢測(cè)的Nephroma arcticum的AFP活性呈陽(yáng)性。檢測(cè)的冰島衣的AFP活性呈陰性。Nephroma arcticum表現(xiàn)出明顯的AFP活性Nephroma arcticum樣品的一系列1∶2的稀釋液表明，在總蛋白含量為0.1毫克/毫升的水平上，仍然可以檢測(cè)到AFP活性。
例3測(cè)定三種豐富地衣(Nephroma arcticum、Umbilicaria hyperborea和Platismatia glauca)的AFP活性。
蛋白提取三種地衣Nephroma arcticum(Nephromatoceae Peltigerales科)、Umbilicaria hyperborea(石臍科)和Platismatia glauca是于冬天在挪威采集的，并且在-80℃下保存。
將地衣組織浸入液氮中，并馬上用獨(dú)立的研缽手工研磨，同時(shí)定期添加液氮。
通過(guò)在4℃下在玻璃燒杯中，在Tris/HCl‘提取緩沖液’(分別為750毫升、550毫升和550毫升)中攪拌磨碎的地衣組織(Nephromaarcticum250克，Umbilicaria hyperborea128克和Platismatia glauca100克)，制備粗制蛋白提取物。1升‘提取緩沖液’含有一瓶購(gòu)自Sigma的通用蛋白酶抑制劑混合物。所述通用蛋白酶抑制劑混合物含有4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟(AEBSF)，抑蛋白酶肽，苯丁抑制素，反式環(huán)氧琥珀酰-L-亮氨酰-酰胺(4-胍基)丁烷(E-64)，亮抑酶肽和EDTA鈉鹽。
在Waring商用攪切機(jī)中，將粗制蛋白提取物勻漿5分鐘，并通過(guò)購(gòu)自Calbiochem的米拉布過(guò)濾。用Virtis Freezemobile 25EL將三種地衣粗制提取物冷凍干燥一夜，并在-20℃下保存。
Splat測(cè)定將1毫升冷凍干燥的粗制提取物(Nephroma arcticum、Umbilicariahyperborea和Platismatia glauca)懸浮在裝在Eppendorf試管中的500□l的超純凈水中，并且在微型離心機(jī)(MSE Micro Centaur)上，以13000rpm的速度離心5分鐘。保留上清液，并將每一種提取物的50□l的樣品用于檢測(cè)熱穩(wěn)定性，在95℃下，在eppendorf試管Thermomixer5436中檢測(cè)2分鐘。通過(guò)在下面將要詳細(xì)說(shuō)明的形式的splat測(cè)定，馬上測(cè)定兩種粗制提取物(熱處理過(guò)的或未處理過(guò)的)AFP活性(有關(guān)所使用的測(cè)定的進(jìn)一步的信息披露于Byass等，Unilever WO9804148中)。
將用于splat測(cè)定的樣品與等體積的60％的蔗糖混合，使蔗糖的最終濃度為0％。將待檢測(cè)的所述樣品的少量試樣(5微升)壓在2片顯微鏡蓋玻片之間。通過(guò)將該夾心體轉(zhuǎn)移到干冰/三甲基戊烷的溶液(-70℃)中進(jìn)行快速冷卻，然后再轉(zhuǎn)移到冷卻到-6℃的三甲基戊烷溶液中。按照下面所提供的評(píng)分系統(tǒng)，以半定量形式評(píng)估AFP活性。
Splat得分觀察到的晶體形態(tài)學(xué)+++++ 非常小，非常密集的晶體+++ 小，不密集；或者小，相當(dāng)密集，具有某些中等大小的晶體+++小，不密集，具有中等大的晶體；或者小-中等，不密集+ 中等或大的晶體，具有某些小晶體
+大，圓形分離的晶體(例如，30％的蔗糖對(duì)照)結(jié)果

以上結(jié)果表明，在檢測(cè)過(guò)的三種地衣中，Nephroma arcticum產(chǎn)生了大部分的AFP活性。
例4放大用Nephroma arcticum制備含有AFP提取物。
將8.94克冷凍干燥的Nephroma arcticum提取物(按照例3中“蛋白提取”部分所披露的方法制備)重新懸浮在70毫升冰鎮(zhèn)的純凈水中，并且在4℃下攪拌20分鐘。在Sorval離心機(jī)上，用GSA轉(zhuǎn)子以8000rpm的速度將粗制提取物離心20分鐘。依次用Nalgene0.8□膜過(guò)濾消毒裝置和0.2□膜過(guò)濾消毒裝置對(duì)上清液進(jìn)行過(guò)濾。將Nephroma arcticum的棕色的提取物分裝到塑料試管中，并且冷凍保藏直到需要使用。
例5從Nephroma arcticum中提取的AFP的熱穩(wěn)定性研究如果將要被用作食品的食用成分的AFP是在其生產(chǎn)期間通過(guò)巴斯德滅菌的話，重要的是，AFP在有可能使用的溫度下是穩(wěn)定的。在本實(shí)施例中，研究了從Nephroma arcticum中提取的AFP的熱穩(wěn)定性。
用BCA蛋白測(cè)定試劑盒(由Pierce提供)分析含有AFP的提取物(按例3方法制備)的總蛋白濃度。發(fā)現(xiàn)該提取物的總蛋白含量大約為5.8毫克/毫升。對(duì)該提取物的少量樣品進(jìn)行稀釋，以便它的蛋白的最終濃度為2毫克/毫升，然后將16微升稀釋過(guò)的提取物放入5個(gè)eppendorf試管的每一個(gè)中。將其中的4個(gè)試管放入95℃下的eppendorfThermomixer中。對(duì)每一個(gè)試管進(jìn)行不同時(shí)間的熱處理1分鐘、2分鐘、5分鐘或10分鐘。用第5個(gè)試管作對(duì)照，并且不進(jìn)行熱處理。在加熱之后，將所述樣品馬上放在冰上，并且通過(guò)splat測(cè)定測(cè)定AFP活性。
2毫克/毫升Nephroma arcticum提取物的splat活性

由于從Nephroma arcticum中提取的AFP在95℃下加熱時(shí)能夠存活，因此它適用于在生產(chǎn)期間要通過(guò)巴斯德滅菌進(jìn)行消毒的食品中。例如，冰淇淋“混合物”在冷卻和冷凍之前，通常要在82℃的溫度下保持25秒，以便進(jìn)行巴斯德滅菌。結(jié)果表明，從Nephroma arcticum中提取的AFP在所述巴斯德滅菌過(guò)程中能夠存活。
例6通過(guò)適合(進(jìn)行毒理學(xué)測(cè)定)在冷凍食品中采用的方法從Nephromaarcticum中制備AFP。
取樣用相同方法制備獨(dú)立的制劑，并且將提取物合并到一起，以便形成最終的提取物。分別使用29克(提取物1)和35克(提取物2)組織。所使用的組織是由發(fā)明人之一(Rolv Lundheim)在1999/2000冬季，在挪威采集的N.arcticum，運(yùn)送到(在干冰上)英國(guó)的實(shí)驗(yàn)室中，并且在-70℃下保存待用。
所使用的緩沖液提取緩沖液包括200mM Tris-HCl(Fisher chemicals)，20mM抗壞血酸(抗壞血酸鈉，Sigma)，10mM EDTA(二鈉鹽，Sigma)，pH7.8。
透析緩沖液是50mM Tris-HCl，3mM EDTA，pH7.5。
提取在液氮中用研缽和研棒將N.arcticum組織研磨成細(xì)粉。將磨碎的材料放入裝有180毫升冷卻過(guò)的提取緩沖液的燒杯中，并且在冰上攪拌30分鐘。通過(guò)薄棉布過(guò)濾所得到的提取物。用研缽和研棒以及少量的額外緩沖液(提取物1，40毫升，提取物2，80毫升)再次研磨固體材料。同樣用薄棉布對(duì)二次提取物進(jìn)行過(guò)濾。來(lái)自以上兩個(gè)步驟的合并的過(guò)濾液就是粗制提取物(提取物1，大約140毫升，提取物2，大約200毫升)。
純化在搖動(dòng)水浴中，在60℃下對(duì)粗制提取物進(jìn)行加熱。當(dāng)提取物的溫度達(dá)到60℃時(shí)，將其培養(yǎng)15分鐘。然后在冰上冷卻提取物，在被冷卻到4℃的Sorvall RC-5B上用SS34轉(zhuǎn)子以1000rpm的速度離心20分鐘。由于在該處理之后，上清液并未完全澄清，以相同的速度在干凈的試管中對(duì)上清液進(jìn)行再次離心。
用截?cái)喾肿恿繛?000-8000D的Spectra/Por透析管對(duì)提取物進(jìn)行透析。透析緩沖液如上文所述。緩沖液體積為2升(提取物1)，或3升(提取物2)。并且在大約18小時(shí)的時(shí)間內(nèi)3次更換緩沖液。透析是在4℃下進(jìn)行的。
濃縮將透析過(guò)的提取物保留在透析管中，并且放入夾層盒。用PEG(聚乙二醇17500，F(xiàn)luka)覆蓋樣品。將樣品保持在4℃下，同時(shí)其體積減少。在PEG浴中放置大約2天之后，提取物的體積為35毫升(提取物1)和30毫升(提取物2)。在濃縮之后，再次以15000rpm的速度對(duì)提取物進(jìn)行離心，并且依次通過(guò)0.45和0.22微米的針筒式過(guò)濾裝置進(jìn)行過(guò)濾。
最終提取物的制備和鑒定將按上述方法制備的兩種提取物合并在一起，并且以5毫升的量進(jìn)行分裝，然后在-20℃下冷凍。該提取物就是用于RI測(cè)定和水冰測(cè)定的提取物(參見(jiàn)例7)。
通過(guò)splat測(cè)定測(cè)定所述提取物的AFP活性。獲得了以下結(jié)果(按照例2所述方法進(jìn)行評(píng)分)。結(jié)果表明，所述最終提取物可以稀釋100倍，并且在splat測(cè)定中仍然具有活性。

測(cè)定該提取物的pH為6.9。
采用生產(chǎn)商說(shuō)明書中的標(biāo)準(zhǔn)方法微孔平板形式，通過(guò)考馬斯Plus-200蛋白測(cè)定，估算所述提取物的蛋白濃度。估計(jì)所述最終提取物的總蛋白濃度為大約1毫克/毫升。
例7確定需要向食品中添加多少AFP再結(jié)晶抑制(RI)測(cè)定用蔗糖晶體將含有來(lái)自Nephroma arcticum的AFP(按例6方法制備)的溶液調(diào)整到蔗糖含量為30wt％。將一滴3微升的樣品放在22毫米的蓋玻片上。
然后將直徑為16毫米的蓋玻片放在其表面，并且在樣品上放200克的砝碼，以確保具有均勻的載玻片厚度。用透明的指甲油密封所述蓋玻片的邊緣。將所述載玻片放置在Linkam THM600溫控顯微鏡平臺(tái)上。將所述平臺(tái)迅速冷卻(每分鐘50℃)到-40℃，以便產(chǎn)生大量小的結(jié)晶。然后將所述平臺(tái)的溫度迅速升高(每分鐘50℃)到+6.0℃，并且保持在該溫度下。用Leitz OrtholuxII顯微鏡在-6℃下觀察冰相。通過(guò)偏振光調(diào)節(jié)和λ平板增強(qiáng)所述冰晶體的反差。在T＝0和T＝60分鐘記錄圖象，并且用圖象分析軟件(AnalySIS，Soft-Imaging Software GmbH，D48153，Munster，Hammerstrasse，89德國(guó))進(jìn)行分析。按以下方法計(jì)算晶體生長(zhǎng)。
按以下方法測(cè)定在特定時(shí)間點(diǎn)上的冰晶體群的平均大小獲取該群體的圖象(用上述裝置獲取)，然后挑選該圖象中包括至少200個(gè)冰晶體的區(qū)域。通過(guò)描繪每一個(gè)晶體的外形，并且用所述圖象分析軟件計(jì)算其最大直徑，確定每一個(gè)晶體的最大直徑。
每一個(gè)RI實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次(因此，分析了至少600個(gè)冰晶體的圖象)。表格中的數(shù)據(jù)記錄的是平均冰晶體生長(zhǎng)(即在0時(shí)間和60分鐘之后平均冰晶體直徑的差別)。
計(jì)算可信度極限，可信度水平為平均95％。
制備Nephroma arcticum AFP制劑的若干稀釋液，以便了解該樣品能夠稀釋到何種程度并且仍然能有效抑制冰的再結(jié)晶。在實(shí)際操作中，如果所述稀釋液或制劑的樣品能在3μm或更低的RI測(cè)定中能導(dǎo)致結(jié)晶生長(zhǎng)，我們就認(rèn)為AFP制劑或AFP制劑的稀釋液能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)冰再結(jié)晶的有效抑制。
RI測(cè)定結(jié)果通過(guò)分析1200個(gè)晶體的圖象確定平均晶體生長(zhǎng)。

以上結(jié)果表明，可以將AFP制劑稀釋20倍，但仍然能獲得對(duì)冰再結(jié)晶的有效抑制。因此，將該制劑的1∶20的稀釋液(＝5％)用于例8所示的冷凍食品原型中。
例8將地衣AFP用于水冰中為了制備水冰，制備兩種液體預(yù)混合物(A)20％蔗糖+0.2刺槐豆膠，用水配制(負(fù)對(duì)照；不是本發(fā)明的)。
用水配制的20％蔗糖+0.2刺槐豆，含有從Nephroma arcticum中提取的AFP。業(yè)已用所述預(yù)混合物將AFP的濃度稀釋到能提供大約2μm的RI值。在這種情況下，它是1∶20的稀釋液或5％的濃度——有關(guān)RI的數(shù)據(jù)參見(jiàn)例7。
因此，預(yù)混合物B具有以下配方

通過(guò)Vickers硬度測(cè)定確定硬度按照以下方法制備每一種配方(A，B)的水冰方塊(10毫米×55毫米×95毫米)。在Gelato Chef2000(Magimix UK Ltd)冰淇淋生產(chǎn)機(jī)中將每一種配方冷凍到-35℃。將該混合物轉(zhuǎn)移到預(yù)先冷卻到-30℃，其內(nèi)部尺寸為10毫米×55毫米×95毫米的硅橡膠模具中。在脫模之前，在-30℃下將該制劑冷凍1小時(shí)，并且在通過(guò)Vickers硬度測(cè)定測(cè)定其硬度之前，在-25℃下保存。
Vickers硬度測(cè)定是一種壓痕測(cè)定，它包括將一個(gè)錐形體形狀的尖頭壓入材料表面，并且記錄所施加的力，作為尖頭頂端位移的函數(shù)。力和位移是在壓痕加載周期和非加載周期測(cè)定的。該測(cè)定披露于“Handbook ofPlastics Test materials”Ed.R.P.Brown，Pub.George Godwin Limited，TheBuilder Group，1-3 Pemberton Row，F(xiàn)leet Street，London，1981。Vickers錐形體幾何學(xué)是工程工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(BSi47，1990)。在其頂端的頂角為136度。硬度是按照以下公式確定的HV=FmaxA]]>其中，Hv是Vickers硬度，F(xiàn)max是所施加的最大的力(參見(jiàn)圖2)，而A是在所述材料表面所留下的壓痕的突出面積。面積A是通過(guò)假定所述壓痕具有與形成它的尖頭，即Vickers錐形體具有相同的幾何形狀而測(cè)定的，因此，所述突出的面積可以根據(jù)圖3中由di所提供的壓痕深度來(lái)測(cè)定。
A＝24.5di2來(lái)自硬度測(cè)定的結(jié)果用每一種混合物制備3個(gè)冷凍塊。對(duì)每一種冷凍混合物一共進(jìn)行8次硬度讀數(shù)[8個(gè)壓痕分布在3個(gè)冰凍塊之間，以便使來(lái)自一個(gè)冷凍塊的誤差能夠適應(yīng)所述結(jié)果中的另一個(gè)的]。硬度數(shù)據(jù)(Mpa)

以上結(jié)果表明，地衣AFP能明顯改變冷凍食品的質(zhì)地，采用這種特定配方(通常是水冰)，并且使用這種特定濃度的AFP，產(chǎn)生了較硬的質(zhì)地。
例9純化AFP用于N-末端分析為了獲得準(zhǔn)確的N-末端序列資料，需要制備一種非常純的樣品。下面就提供用于制備這種樣品的方法。有必要指出的是，通常沒(méi)有必要制備這樣純的樣品用作食品添加劑。
提取AFP在液氮中用預(yù)先冷卻的研棒和研缽將8.6克干凈的、干燥的地衣組織研磨成細(xì)粉。以1∶1的比例將所述細(xì)粉在緩沖液A(0.2mM Tris；10mMEDTA，20mM抗壞血酸；pH7.8)中勻漿。將勻漿物放入50毫升Falcon試管中，并且在冰上超聲處理15分鐘，然后轉(zhuǎn)移到1.5毫升Eppendorf試管中，并且在4℃下以14000rpm的速度離心4分鐘。收集上清液，并且保持在冰上。再次用4毫升緩沖液A提取沉淀，并且將上清液加入早先獲得的上清液中。通過(guò)在4℃下，以14000rpm的速度離心10分鐘，使合并的上清液澄清，并且在HiTrap脫鹽柱(Pharmacia)上按照生產(chǎn)商的說(shuō)明將鹽脫到緩沖液B(50mM Tris-HCl；pH7.5)中。
離子交換層析對(duì)脫鹽的樣品進(jìn)行過(guò)濾(0.2微米微過(guò)濾器)，并將1.5毫升樣品以1毫升/分鐘的速度加樣到用相同緩沖液預(yù)平衡的6毫升Mono Q陰離子交換柱上。監(jiān)測(cè)洗脫液的導(dǎo)電性和OD280，并且收集2毫升的級(jí)份。當(dāng)OD280恢復(fù)到本底時(shí)，添加線性梯度的0-0.5M氯化鈉?？箖龌钚栽诖蠹s0.2M氯化鈉濃度下洗脫(通過(guò)splat測(cè)定判斷)。
親和層析合并活性陰離子交換級(jí)份，并濃縮(通過(guò)在4℃下，在聚乙二醇化合物“PEG”中透析濃縮)。將濃縮樣品加樣到28毫升Concanavalin A(ConA)柱(Pharmacia FPLC)上，該柱業(yè)已用3倍柱體積的緩沖液C[Tris緩沖的鹽溶液(TBS-20mM Tris/HCl；0.5M氯化鈉；pH7.4)；1mM氯化鈣，1mM氯化錳]平衡過(guò)，并通過(guò)2倍柱體積的緩沖液C洗滌。所述活性是通過(guò)大約3倍柱體積的緩沖液D(TBS，100mM甲基α-D-甘露糖吡喃糖苷)洗脫的。流速為2毫升/分鐘，并且在整個(gè)過(guò)程中收集2毫升的級(jí)份。合并活性級(jí)份，并進(jìn)行濃縮，并且加樣到下面所披露的凝膠過(guò)濾柱上。
凝膠過(guò)濾層析用Millipore 30kDa截?cái)酀饪s儀，將活性級(jí)份濃縮10倍，并測(cè)定流通物和保留物的抗凍活性。合并活性濃縮物，并進(jìn)一步濃縮(10倍)；對(duì)22微升樣品進(jìn)行過(guò)濾，并且加樣到Pharmacia SMART系統(tǒng)上的業(yè)已用緩沖液B(50mM Tris-HCl，pH7.5)預(yù)平衡過(guò)的Superdex75凝膠滲透柱上。流速為40微升/分鐘，并收集50微升的級(jí)份。合并凝膠過(guò)濾步驟之后的活性級(jí)份，濃縮，并用于例10所披露的N-末端分析。
結(jié)論在上面所提供的純化方案中，利用凝膠電泳(用銀染色的SDS-PAGE)鑒定AFP。該技術(shù)一致性地確定了與AFP活性同時(shí)純化的29kDa的陰性染色的帶(通過(guò)splat測(cè)定判斷)。因此，該蛋白被認(rèn)為是AFP，并且按例20所述方法對(duì)該帶進(jìn)行N-末端測(cè)序。
例10測(cè)定來(lái)自Nephroma arcticum的AFP的N-末端序列。
將同樣為90微升的純化的N.arcticum AFP樣品(按例9所述方法制備)加樣到4個(gè)相鄰的泳道中，并且通過(guò)SDS-PAGE分離，然后通過(guò)Western吸印方法吸印到PVDF膜上。所述膜業(yè)已用甲醇浸泡過(guò)，并且，所使用的吸印緩沖液是10mM CAPS，pH11，和10％甲醇。用麗春紅對(duì)所述膜進(jìn)行染色，并且用針標(biāo)記有關(guān)的帶，然后用水除去染料。將所述膜風(fēng)干并且保存。測(cè)序是用Procise492蛋白測(cè)序儀(應(yīng)用生物系統(tǒng))按照生產(chǎn)商的說(shuō)明進(jìn)行的。下面提供了所獲得的N-末端序列。本發(fā)明人認(rèn)為，作為本發(fā)明主題的AFP的該序列是新的，并且是獨(dú)特的。
例10中所披露的N-末端序列[SEQ ID NO1]1L 10F2V 11G3I 12V4G 13V(S)5S 14A6T 15A7A 16A8Q(E)17T9N例11用遺傳修飾過(guò)的生物生產(chǎn)AFP為了在商業(yè)上更常見(jiàn)的宿主生物中生產(chǎn)Nephroma arcticum AFP，將AFP基因克隆到選擇的宿主系統(tǒng)中，并在其中進(jìn)行表達(dá)?；诩?xì)菌、酵母、植物、植物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、和動(dòng)物細(xì)胞的GM表達(dá)系統(tǒng)是已知的。一般優(yōu)選基于細(xì)菌、酵母和植物的表達(dá)系統(tǒng)。下面介紹如何克隆來(lái)自Nephroma arcticum的AFP基因。
克隆來(lái)自Nephroma arcticum的AFP基因在例10中提供了Nephroma arcticum AFP的N-末端。一旦了解了該序列，就可以克隆AFP的完整的基因——不需要進(jìn)行任何進(jìn)一步的有創(chuàng)造性的步驟——通過(guò)使用本領(lǐng)域眾所周知的克隆真核生物基因的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。下面提供了對(duì)該方法的說(shuō)明。
對(duì)于真核生物來(lái)說(shuō)，可以采用若干種方法克隆其N-末端氨基酸序列已知的基因。所有真核生物基因都具有一個(gè)聚腺苷酸尾巴，并且將該信息用于克隆。通常，第一個(gè)步驟是獲得業(yè)已長(zhǎng)時(shí)間接觸寒冷天氣(并因此誘導(dǎo)了AFP的產(chǎn)生)的Nephroma arcticum樣品。然后用專門出售的標(biāo)準(zhǔn)試劑盒，并且按照生產(chǎn)商的說(shuō)明，從所述樣品中分離聚腺苷酸化RNA?；蛘撸梢詮牡匾碌慕M成生物的AFP生產(chǎn)培養(yǎng)物中分離聚腺苷酸化RNA。在這種情況下，要對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行冷沖擊，以便誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生AFP。冷沖擊可以通過(guò)將1燒瓶細(xì)胞放在冰上而完成。一旦分離了聚腺苷酸化RNA，就可以用逆轉(zhuǎn)錄酶制備互補(bǔ)的DNA。可以獲得用于該步驟的標(biāo)準(zhǔn)試劑盒。可以將第一股cDNA鏈直接用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中，或者制備雙鏈DNA，并用于PCR，或者制備cDNA文庫(kù)。
在PCR中，將所述DNA用作該反應(yīng)的模板。PCR反應(yīng)需要2種引物。一種引物被設(shè)計(jì)成已知的N-末端氨基酸序列，并最有可能是簡(jiǎn)并的，因?yàn)槊艽a子使用所固有的簡(jiǎn)并性。N-末端氨基酸序列TAQNFGVVA的引物序列的例子是ACI GCI CAR AAY TTY GGI GTI GTI GC[SEQ ID NO2]其中，I＝肌苷，R＝A或G，Y＝C或T除了該例子之外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)計(jì)出很多種不同的引物，這些引物可以設(shè)計(jì)成所述N-末端氨基酸序列(正如在例10中所提供的)的不同部分。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員通常傾向于在克隆實(shí)驗(yàn)中使用N-末端序列的多種引物。
所使用的第二種引物是dT寡核苷酸序列，它能結(jié)合在該克隆的聚腺苷酸尾巴的3’末端。采用這種引物的PCR反應(yīng)能產(chǎn)生可以標(biāo)準(zhǔn)方法分離，并且克隆到合適載體上的帶。然后對(duì)載體插入片段進(jìn)行測(cè)序，并且將DNA翻譯成相應(yīng)的氨基酸序列，以便驗(yàn)證從Nephroma arcticum中獲得的N-末端序列的存在。通過(guò)將所述DNA序列克隆到一種表達(dá)載體上，可以生產(chǎn)并檢測(cè)AFP，以便證實(shí)它具有與直接從Nephroma中分離的AFP相同的特性。
另一個(gè)克隆途徑是利用cDNA在合適的載體中制備文庫(kù)。然后可以篩選該文庫(kù)中編碼Nephroma蛋白的基因。可以用若干種方法篩選所述基因。例如，可以制備上述N-末端氨基酸序列的簡(jiǎn)并引物，并且用某種方式進(jìn)行標(biāo)記，例如，用放射性進(jìn)行標(biāo)記。然后可以用該引物篩選所述文庫(kù)，因?yàn)樗芙Y(jié)合存在于該文庫(kù)中的與它互補(bǔ)的鏈。然后可以按上述方法對(duì)鑒定的克隆進(jìn)行測(cè)序。還可以制備一種抗從Nephroma中純化的AFP蛋白的抗體，并用于篩選所述文庫(kù)，如果業(yè)已在一種表達(dá)載體中制備了所述文庫(kù)的話。同樣，可以按上述方法對(duì)所述克隆進(jìn)行測(cè)序。
例12通過(guò)培養(yǎng)從Nephroma arcticum中獲得的生物生產(chǎn)AFP地衣真菌可以在實(shí)驗(yàn)室條件下單獨(dú)生長(zhǎng)。這就需要一種能提供正常情況下所述真菌從光合共生物中獲得的養(yǎng)分，以及所述地衣從環(huán)境中獲得的微量元素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。所述真菌可以在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)或者是在含有合適生長(zhǎng)培養(yǎng)基的瓊脂表面生長(zhǎng)。所述真菌還可以在消過(guò)毒的土壤上生長(zhǎng)(Stocker-Worgotter，E.and Turk R.1991.Lichenologist.23.127-138)。
從地衣葉狀體上切下子囊果(子囊真菌的有性子實(shí)體)，并且用磷酸緩沖的鹽溶液洗滌，如Bubrick和Galun所披露的(1986.Lichenologist.18，47-49)。然后可以將所述子囊果固定在裝有合適生長(zhǎng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上面(Bishcoff，H.W.and Bold H.C.1963.University ofTexas Publications No.6318，Physiological studies.4，1-95)。會(huì)釋放出孢子并且落在所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基上。在孢子萌發(fā)之后，可以將瓊脂的小塊轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中(Ahmadjian，U.1993.The Lichen symbiosis.JohnWiley&sons Inc.New York)。Stocker-Worgotter，E.和Turk R.1991提供了生長(zhǎng)培養(yǎng)基的例子(Lichenologist.23.127-138)。
還可以利用由Stocker-Worgotter改進(jìn)的(1995.Canadian Journal ofBotany74(Suppl 1)S579-S589)的由Yamamoto Y所披露的方法(1990.博士論文，京都大學(xué))，從分解的葉狀體中獲得所述真菌的培養(yǎng)物。
可以用類似方法培養(yǎng)地衣的光合共生物。為了獲得純性培養(yǎng)物，切割小的葉狀體片段，并且在解剖顯微鏡下通過(guò)微量移液管除去藻類細(xì)胞，并且轉(zhuǎn)移到合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中(Ahmadjian，V.1973.InThe LichensV.Ahmadjian and M.E.Hale，eds.Academic Press，New York，pp.653-659)。所述藻類細(xì)胞可以在液體和固體(瓊脂)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。對(duì)培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基的詳細(xì)說(shuō)明可以參見(jiàn)Ahmadjian 1993。
Nephroma arcticum包括Coccomyxa屬的藻類(Peveling，E.andGalun，M.1976.New Phytol.77.713)和念珠藻屬的蘭細(xì)菌(Wetmore，C.M.1960.Publ.Mus.Mich.State.Univ.Biol.Serl，369)。念珠藻屬的蘭細(xì)菌和Coccomyxa屬的藻類可以從諸如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏機(jī)構(gòu)獲得。這些生物并非來(lái)自Nephroma arcticum，不過(guò)，用這些培養(yǎng)物進(jìn)行的研究，業(yè)已提供了適合培養(yǎng)所述生物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的信息。有若干研究者業(yè)已培養(yǎng)了從地衣中獲得的念珠藻屬的蘭細(xì)菌(Ahmadjian 1993)。
序列表<110>尤尼利弗公開(kāi)有限公司(Unilever plc)荷蘭聯(lián)合利華有限公司(Unilever NV)<120>抗凍蛋白、其生產(chǎn)和用途<130>F3258<160>2<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>17<212>PRT<213>Nephroma arcticum<220><221>變體<222>(13)..(13)<223>殘基13可以是V和S<400>1Leu Val Ile Gly Ser Thr Ala Glx Asn Phe Gly Val Val Ala Ala Ala1 5 10 15Thr<210>2<211>26<212>DNA<213>人工的<220><223>PCR引物<220><221>修飾堿基<222>(3)..(3)<223>i<220><221>修飾堿基<222>(6)..(6)<223>i<220><221>修飾堿基<222>(18)..(18)<223>i<220><221>修飾堿基<222>(21)..(21)<223>i<220><221>修飾堿基<222>(24)..(24)<223>i<400>2acngcncara ayttyggngt ngtngc 2權(quán)利要求
1.一種可來(lái)自地衣Nephroma arcticum的抗凍蛋白。
2.一種具有抗凍活性的蛋白，其氨基酸序列的一部分與序列L-V-I-G-S-T-A-Q(E)-N-F-G-V-V(S)-A-A-A-T具有至少80％的重疊。
3.如權(quán)利要求2的抗凍蛋白，所述蛋白可來(lái)自Nephroma arcticum。
4.如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的抗凍蛋白，其分子量為25-33kDa。
5.如權(quán)利要求2-4中任意一項(xiàng)的抗凍蛋白，所述蛋白的氨基酸序列的一部分與序列L-V-I-G-S-T-A-Q(E)-N-F-G-V-V(S)-A-A-A-T具有至少90％的重疊。
6.如權(quán)利要求2-4中任意一項(xiàng)的抗凍蛋白，所述蛋白的氨基酸序列包括序列L-V-I-G-S-T-A-Q(E)-N-F-G-V-V(S)-A-A-A-T。
7.如權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)的抗凍蛋白，所述蛋白具有至少一種共價(jià)修飾。
8.如權(quán)利要求7的抗凍蛋白，其中，所述修飾是糖基化。
9.一種編碼上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的抗凍蛋白的核酸序列。
10.一種含有權(quán)利要求9的核酸序列的載體。
11.一種用于生產(chǎn)上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的抗凍蛋白(AFP)的方法，該方法包括以下步驟(i)從野外收集Nephroma arcticum；(ii)用步驟(i)的材料制備含有蛋白的提取物，所述提取物具有AFP活性。
12.一種用于生產(chǎn)上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的抗凍蛋白(AFP)的方法，該方法包括以下步驟(i)在能合成所述蛋白的條件下培養(yǎng)含有權(quán)利要求9的DNA序列的生物，所述DNA序列受合適的基因調(diào)控元件的控制，并且；(ii)從培養(yǎng)物中回收具有AFP活性的提取物。
13.如權(quán)利要求12的方法，其中，所述生物是Nephroma arcticum的一種組成生物。
14.如權(quán)利要求12的方法，其中，所述生物由于遺傳修飾而含有權(quán)利要求9的DNA序列。
15.如權(quán)利要求14的方法，其中，所述抗凍蛋白被引導(dǎo)分泌到培養(yǎng)基中。
16.一種遺傳修飾過(guò)的生物，含有權(quán)利要求9的核酸序列。
17.用權(quán)利要求11-15中任意一項(xiàng)的方法制備的具有AFP活性的含有蛋白的提取物，所述提取物適合用作食品添加劑。
18.一種含有權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)的抗凍蛋白的食品。
19.如權(quán)利要求18的食品，所述食品是冷凍甜食制品。
全文摘要
可來(lái)自地衣Nephroma arcticum的抗凍蛋白以及其氨基酸序列的一部分與氨基酸序列L－V－I－G－S－T－A－Q(E)－N－F－G－V－V(S)－A－A－A－T具有至少80％的重疊的具有抗凍活性的蛋白，及其修飾形式。還披露了所述蛋白的制備方法，所述蛋白在食品加工中的用途，以及含有所述蛋白的食品組合物。
文檔編號(hào)A23G9/32GK1439019SQ01811849
公開(kāi)日2003年8月27日 申請(qǐng)日期2001年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月27日
發(fā)明者M·J·貝里, C·J·杜塞特, R·S·倫德黑姆, M·－P·塞維拉, S·－A·懷特曼 申請(qǐng)人:荷蘭聯(lián)合利華有限公司