專利名稱：基于l1粘附分子的卵巢和子宮內(nèi)膜腫瘤的診斷和治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種診斷卵巢或子宮內(nèi)膜腫瘤或判斷其預(yù)后的方法，其特征在于在患者樣品中測定L1水平，存在L1表示存在卵巢或子宮內(nèi)膜腫瘤，或具有易患這種腫瘤的體質(zhì)。這種檢測優(yōu)選是通過一種單克隆抗L1抗體或其片段產(chǎn)生的。本發(fā)明還涉及用于治療卵巢和子宮內(nèi)膜腫瘤的藥物制劑。此外，本發(fā)明涉及一種治療卵巢和子宮內(nèi)膜腫瘤的方法。
特定腫瘤的診斷尤其是基于檢測特異性腫瘤抗原(TAG)進行的，其可以發(fā)源于細胞質(zhì)，細胞表面和細胞核。就此而論，在組織，個體和種屬特異性TAGs(其在細胞上也生理性呈遞為不同的抗原)，與在稱為腫瘤特異性新抗原的TAGs和作為一種類型的細胞在其腫瘤發(fā)生過程中的中間產(chǎn)物(其在進一步分化中消失)的TAGs之間產(chǎn)生差別。它們是通過免疫化學(xué)方法可檢測的腫瘤標記，其中最為有用的是胞內(nèi)抗原(AG)或在腫瘤細胞上形成的表面抗原(逐漸增加的)。有診斷意義的是例如瘤胚抗原(″OFA″)，例如癌胚抗原(在結(jié)腸癌的情況下)，SCC AG(″鱗狀上皮細胞癌抗原″)，甲胎蛋白(在原發(fā)性肝細胞癌的情況下)，異鐵蛋白和胎硫酸糖蛋白(在胃癌和結(jié)腸癌的情況下)，α2-H鐵蛋白(在幼兒發(fā)生惡性腫瘤的情況中)，γ-胎蛋白(在肉瘤，白血病，乳腺癌的情況中)，及“Tennessee AG”(tennagen)，“組織多肽抗原”(TPA)，瘤胚膜抗原(OFMA)，腫瘤特異性移植抗原(TSTA)，膜結(jié)合腫瘤抗原(MATA)以及次要的抗原如“類A”抗原，“Forssman”抗原，WGL等。到目前為止診斷性使用的另一種腫瘤標記是CA125(高度糖基化的細胞粘液素，其主要是在腫瘤細胞中出現(xiàn)并釋放)，這種標記目前已經(jīng)用于診斷人體卵巢癌或子宮內(nèi)膜癌，例如通過測定CA125的血清水平，或在手術(shù)后將組織樣品用抗CA125抗體進行免疫組織學(xué)染色進行診斷。然而，基于檢測CA125的診斷具有許多嚴重缺點。例如，CA125血清水平提高也可以出現(xiàn)在許多良性疾病中，例如在子宮內(nèi)膜感染，盆腔感染，肝硬化中，或在月經(jīng)期或妊娠期。CA125水平提高也可以見于非產(chǎn)科惡性腫瘤的情況中，如乳腺癌，結(jié)腸直腸癌，胰腺癌，或肺癌中。因此，這可以導(dǎo)致假陽性的診斷。CA125還見于對結(jié)腸腺癌，胃癌，肺癌和不典型的子宮內(nèi)膜增生進行免疫染色的情況中。針對早期檢測卵巢或子宮內(nèi)膜癌，測定CA125水平并結(jié)合超聲不能產(chǎn)生任何令人滿意的可信賴的結(jié)果。因此，以其敏感性和特異性，CA125不適于用于早期檢測卵巢或子宮內(nèi)膜癌，但更適合(如果可以的話)后期和復(fù)發(fā)階段，然而，仍存在上述關(guān)于特異性的問題，即診斷上無法接受的假陽性發(fā)現(xiàn)。
因此，本發(fā)明是基于提供標記物的技術(shù)問題，所述標記物可以改良和更特異性診斷卵巢和子宮內(nèi)膜癌，包括各種腫瘤類型之間的可能的差別，及檢測癌轉(zhuǎn)移的可能性，并因此改良治療措施，例如外科手術(shù)措施。進一步的技術(shù)問題是通過將L1作為治療靶，提供一種治療措施。
通過權(quán)利要求書中定性的實施方案，可以解決這個技術(shù)問題。
令人驚奇地發(fā)現(xiàn)L1粘著分子在卵巢和子宮內(nèi)膜癌患者的體液(例如血清、腹水和Douglas窩積液)和組織中表現(xiàn)為一種高度特異性標記，尤其是在這些高度浸潤形式的腫瘤中。L1是一種200-230kDa的神經(jīng)元粘著分子，其結(jié)構(gòu)屬于Ig超家族。L1是一種與細胞遷移相關(guān)的蛋白質(zhì)，其在腦中參與神經(jīng)元在小腦和神經(jīng)纖維束中的遷移。L1具有一些結(jié)合配體，L1自身，蛋白多糖神經(jīng)聚糖和各種整合素(Kadmon等，Differentiation 61143-150，1997)。在本發(fā)明的篩選實驗中，結(jié)果是L1在正常組織中不表達，除了周圍神經(jīng)和神經(jīng)節(jié)之外。在良性卵巢和子宮內(nèi)膜腫瘤中，檢測不到L1表達，而且篩選其它惡性腫瘤(乳腺癌，前列腺癌，宮頸癌)也是陰性的。示出L1在高度浸潤的卵巢和子宮內(nèi)膜的漿液性乳頭狀癌中表達。可溶的L1在腫瘤患者的血清和腹水或胸水中可以檢測到，但在正常血清和體液中或在患有良性腫瘤的患者體內(nèi)檢測不到?；加凶訉m內(nèi)膜的漿液性乳頭狀癌并累及卵巢的病人，其手術(shù)前通過產(chǎn)科刮除術(shù)獲得的樣品是陽性的。因此，L1作為細胞表面分子在血清和體液中的表達，對早期檢測浸潤性卵巢和子宮內(nèi)膜腫瘤是非常有意義的，對預(yù)后也是非常有意義的。因此，檢測L1可以早期發(fā)現(xiàn)和準確診斷浸潤性卵巢和子宮內(nèi)膜腫瘤或用于判斷其預(yù)后。
因此，本發(fā)明涉及一種診斷或預(yù)測卵巢或子宮內(nèi)膜腫瘤的復(fù)發(fā)，特征在于確定患者樣品中L1水平，存在L1表示存在卵巢或子宮內(nèi)膜腫瘤或具有易患這種腫瘤的體質(zhì)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知獲得患者樣品的適當方法。L1粘著分子可以通過常規(guī)方法檢測，將已知的L1蛋白的氨基酸序列或相應(yīng)基因的核酸序列作為根據(jù)(Reid，R.A.等，分子神經(jīng)科學(xué)雜志3127-135，1992)。就此而論，所述檢測可以涉及轉(zhuǎn)錄(通過常規(guī)方法檢測mRNA濃度)或L1蛋白本身，后者是優(yōu)選的?！癓1作為存在卵巢或子宮內(nèi)膜腫瘤或易患這種腫瘤體質(zhì)的指征”的含義，還包括其中L1濃度與對照物(例如健康人的體液或組織)相比較提高的情況。
在本發(fā)明方法的一個優(yōu)選的實施方案中，L1水平是通過測定組織中作為細胞表面分子的L1而確定的。從通過刮除術(shù)獲得的腫瘤組織和細胞樣品中取出適當?shù)慕M織，優(yōu)選組織是通過婦產(chǎn)科刮除術(shù)獲得的。
在本發(fā)明方法的另一個實施方案中，L1水平是通過測定體液中可溶形式L1而確定的。適當?shù)捏w液是血清，腹水或胸水或Douglas窩積液，優(yōu)選是血清。
另一個優(yōu)選的實施方案不進行檢測L1，但利用(重組的)L1檢測L1特異性抗體。為此，將純化的(重組的)L1固定在微滴定平板的表面，然后用患者血清溫育。然后通過酶綴合的二級抗體和呈色反應(yīng)檢測結(jié)合的抗體。
另一個實施方案檢測體液樣品中的L1的mRNA，體液樣品優(yōu)選的是血清。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知檢測L1、L1 mRNA和L1抗體的適當方法，及適當?shù)奶禺愋蕴结槪ㄟ^特異性抗體檢測L1蛋白是優(yōu)選的，針對可溶形式和在細胞表面形式可使用相同抗體。
在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，L1水平是通過將患者樣品與抗L1抗體或其片段接觸，然后測定抗L1抗體或其片段是否已經(jīng)結(jié)合L1而確定。對此可參閱圖6A-C。
在此，適當?shù)目贵w可以是單克隆，多克隆或合成抗體或其片段。就此而論，“片段”是指多克隆抗體的所有部分(例如Fab-，F(xiàn)v-或“單鏈Fv”片段)，其具有與完全抗體相同的表位特異性。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知這種片段的產(chǎn)生。本發(fā)明的抗體優(yōu)選是多克隆抗體。本發(fā)明的抗體可以根據(jù)標準方法制備，以L1的兩種形式(可溶的/固定在細胞表面)呈遞的L1或其合成片段，優(yōu)選作為免疫原。生產(chǎn)這種多肽或肽及其片段，例如可以通過獲得相應(yīng)的基因，克隆并重組表達而進行。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知獲得單克隆抗體的方法。適于本發(fā)明診斷方法的抗L1抗體是可以商購的。這些抗體例如是初級人單克隆抗L1抗體15551A(Pharmingen公司，美國圣地亞哥)或MCA1753(BIOZOL Diagnostica Vertrieb GmbH，Eching，德國)。
在本發(fā)明方法的一個更優(yōu)選的實施方案中，L1水平是通過一種初級單克隆抗L1抗體和一種可商購的二級生物素綴合的抗體抗體和鏈親和素過氧化物酶而確定的。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知進行這種實施方案的方法。
在本發(fā)明方法的另一個優(yōu)選實施方案中，所述患者樣品是固定的，例如是石蠟切片。患者樣品也可以是通過常規(guī)方法吸附于塑料平皿壁上，這樣L1不喪失其結(jié)合特異性，例如與特異性抗體的結(jié)合特異性。
在本發(fā)明方法的另一個優(yōu)選的實施方案中，所述抗L1抗體或其片段是固定的，即其吸附于例如塑料平皿壁上，而不喪失其與L1的結(jié)合特異性。
抗體的結(jié)合可以通過常規(guī)方法檢測，例如Western印跡，ELISA，放射性免疫分析(RIA)等，RIA和ELISA是優(yōu)選的。
本發(fā)明的方法的上述優(yōu)選實施方案之一是通過RT-PCR檢測L1mRNA。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過L1的外顯子27可區(qū)分人L1的不同亞型(即造血系統(tǒng)L1和神經(jīng)系統(tǒng)L1)。造血系統(tǒng)L1不表達外顯子27(Ebeling等，Eur J Immunol 262508-2516，1996)。此外顯子編碼L1胞漿末端的4個氨基酸。使用針對L1此區(qū)域的特異性引物，通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)卵巢腫瘤(細胞系和腫瘤標本)表達神經(jīng)系統(tǒng)形式的L1，其特征為具有12個核苷酸的插入(圖4)。使用相同的引物還發(fā)現(xiàn)在腫瘤病人的血清中可以檢測到L1特異性的mRNA。通過RT-PCR檢測腫瘤衍生的mRNA是用ELISA檢測蛋白以外的一種靈敏的診斷技術(shù)。
基于本發(fā)明，生產(chǎn)了一種用于本發(fā)明診斷方法的試劑盒，并優(yōu)選含有抗L1抗體或其片段，及L1或其結(jié)合活性部分作為對照?！敖Y(jié)合活性部分”是指一種與所述抗體反應(yīng)的片段，所述抗體最好是完整分子與其反應(yīng)的抗體。根據(jù)試劑盒的生產(chǎn)，所述抗體可以綴合于另一種單位，例如一種標記，和/或其可以固定于一種固體載體(底物)上。所述試劑盒還可以含有一種二級抗體，以檢測L1/抗體復(fù)合物。所述抗體或其片段可以以游離形式存在或固定于固體載體上，例如固定于塑料平皿，試管，微滴定平板，試條上。所述試劑盒還可以含有闡述抗體或其片段在檢測易患腫瘤的體質(zhì)或腫瘤存在情況的分析中的使用說明書。所述試劑盒還可以含有檢測標記的適當試劑，或標記陽性和陰性對照物的試劑，沖洗溶液，稀釋緩沖液等。
在通過上述抗L1抗體或其片段診斷性檢測卵巢或子宮內(nèi)膜腫瘤陽性的情況中，可以根據(jù)已知方法通過致敏的腫瘤特異性T淋巴細胞進行免疫治療，使用這些抗體或其片段，或使用衍生自L1(在已知氨基酸序列的基礎(chǔ)上)并優(yōu)選長度為至少9-12個氨基酸的肽進行致敏。另外，也可以使用抗L1的抗體，目的是使用L1作為腫瘤特異性靶抗原。
因此，本發(fā)明還涉及一種藥物制劑，其含有一種抗L1抗體或其片段或衍生自L1的肽，或一種L1的反義寡核苷酸。
所述抗體優(yōu)選是單克隆抗體。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述單克隆抗體是一種源自動物(例如小鼠)的抗體，一種人化的抗體或一種嵌合抗體或其片段。類似人抗體或人化抗體的嵌合抗體的潛在抗原性降低，然而，其對靶細胞的親和性未降低。嵌合和人化抗體及類似人抗體的抗體的產(chǎn)生分別見于Queen等，美國科學(xué)院院報86(1989)，10029，和Verhoeyan等，科學(xué)239(1988)，1534)所述。人源化的免疫球蛋白具有可變的框架區(qū)，其基本源自人免疫球蛋白(稱為受體免疫球蛋白)，和互補決定區(qū)，其基本源自非人免疫球蛋白(例如小鼠)(稱為供體免疫球蛋白)。如果存在恒定區(qū)，其也基本源自人免疫球蛋白。當施用于人類患者時，人源化的(和人的)抗體比小鼠或其它種屬抗體具有許多有利之處(a)人免疫系統(tǒng)應(yīng)不認為人化抗體的恒定區(qū)是外源的，因此對抗這種注入的抗體的所述抗體應(yīng)答，應(yīng)小于對抗完全外源小鼠抗體或部分外源嵌合抗體的應(yīng)答；(b)由于人化抗體的效應(yīng)器區(qū)域是人，其與人免疫系統(tǒng)的其它部分的相互作用更好；及(c)注入的人化抗體的半衰期基本等于天然發(fā)生的人抗體的半衰期，這樣與其它種屬抗體相比可以較少量和較低頻率施用。
在一個優(yōu)選的實施方案中，抗L1單克隆抗體標記了123I，以用于顯像和腹腔內(nèi)或靜脈內(nèi)注射，如VanZanten-Przybysz，I.(Int JCancer 92106-114，2001)所述。穩(wěn)定結(jié)合了細胞毒性藥物的抗L1單克隆抗體可以用于注射，以殺滅腫瘤細胞。這種細胞毒性藥物例如是放射性核素，毒性蛋白(例如皂草素)，化療劑或具有其它特異性的抗體(例如抗T細胞抗體，例如CD3)，以形成雙重功能的抗體，其通過胞毒性T細胞殺滅腫瘤細胞。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，卵巢或子宮內(nèi)膜腫瘤過量表達的L1可用來引導(dǎo)細胞毒性T淋巴細胞，以在原位殺滅腫瘤細胞。
A)可將L1序列衍生的肽接種到腫瘤病人。優(yōu)選地，使用一種混合物，所述混合物包括一種乳劑，其包括HLA-A1(ATEGWFIGF和GSDDSLADY)、HLA-A2(LLANAYIYV和WLDEDGTTV)和HLA-A3(VLTGYVLSY)限制的L1肽和G-CSF，以及MontanideISA-51佐劑(Seppic，F(xiàn)airfield，NJ，USA)。病人接種的疫苗包含5種L1肽(每種50-200微克，優(yōu)選為100微克)和150-200微克(優(yōu)選190微克)的HLA-DR限制性的破傷風(fēng)輔助肽AQYIKANSKFIGITEL。該肽是破傷風(fēng)毒素的p2肽(830-844殘基)加上一個氨基端的丙氨酸以防止N端的谷氨酸殘基形成焦谷氨酸。破傷風(fēng)p2肽是一種混雜的HLA-DR分子的結(jié)合物。疫苗與150-200毫克(優(yōu)選225毫克)GM-CSF和Montanide ISA-51佐劑一同施用。病人優(yōu)選地在第0、7、14、28、35和42天進行免疫共6次，如Yamshchikov等(Int J Cancer 92703(2001))所述。各個病人的時間表、劑量和免疫次數(shù)可由醫(yī)生依據(jù)腫瘤的種類、腫瘤的生長速度、有無轉(zhuǎn)移以及病人的數(shù)據(jù)(如體重、身高等)等來決定。
B)衍生自病人的樹突狀細胞可以用上述L1肽進行激活，如Lau等(J Immunother 2466-78(2001))所述。樹突狀細胞優(yōu)選地由來自腫瘤病人的、具有塑料粘附性的外周血單個核細胞，與IL-4和GM-CSF在無血清培養(yǎng)基中共同孵育8天而獲得。此樹突狀細胞再經(jīng)L1肽(每種50微克/毫升)過夜激活，然后用于(靜脈)輸注。
在進一步優(yōu)選的實施方案中，卵巢或子宮內(nèi)膜腫瘤過量表達的L1可以用L1反義寡核苷酸治療。鑒于遷移是腫瘤細胞播散的前提條件，因此應(yīng)當清除腫瘤細胞內(nèi)的L1。這可通過現(xiàn)有的反義技術(shù)而實現(xiàn)?？捎肔1反義寡核苷酸來下調(diào)腫瘤細胞的L1的表達。其優(yōu)選地對應(yīng)于序列AGGCTGTCGTCACTGCCCA并是人類L1序列+3593/3611核苷酸的反轉(zhuǎn)互補。硫代磷酸寡聚核苷酸優(yōu)選地注射入病人的腹腔，劑量為1-12毫克/公斤，以使寡核苷酸達到足夠高的濃度。各個病人的時間表、劑量和免疫次數(shù)可由醫(yī)生依據(jù)腫瘤的種類、腫瘤的生長速度、有無轉(zhuǎn)移以及病人的數(shù)據(jù)(如體重、身高等)等來決定。
B卵巢漿液性癌示出乳頭狀和隙狀外形，在基質(zhì)中具有實體瘤塊。用抗L1染色示出強陽性免疫組織化學(xué)染色。
C具有散布的腫瘤腺和結(jié)締組織生成反應(yīng)的網(wǎng)膜。通過抗L1抗體示出腫瘤細胞的強同源免疫染色。
D由卵巢癌細胞浸潤的闌尾壁。通過抗L1抗體對腫瘤細胞的強同源染色。正常粘膜腺和淋巴組織無染色。小末梢神經(jīng)束示出強陽性染色。
E陰道壁示出在固有層中的小腫瘤塊，及在擴張的淋巴組織中的小瘤栓。用抗L1免疫染色示出強同源染色。
F在子宮肌膜的淋巴組織中卵巢癌栓，示出通過抗L1對腫瘤細胞的異質(zhì)性染色。
圖2從刮宮物中檢測L1A從刮宮術(shù)獲得的組織B來自卵巢腺瘤的對照切片圖3通過ELISA檢測體液(1F-14F)和血清(1S-32S)中可溶的L1。樣品4F，5F，8F，12F和23F源自女性卵巢癌患者。
圖4PCR外顯子27經(jīng)PCR分析后的1％瓊脂糖凝膠分離來自卵巢腫瘤標本或已知細胞系(AR、OAW、Me163)的mRNA并轉(zhuǎn)錄成cDNA。以該cDNA作為模板對外顯子27進行PCR分析。使用編碼兩種形式的質(zhì)粒作為對照(-RSLE/+RSLE)。
圖5比較兩種不同的ELISA形式A如實施例2所示，微滴定板以L1單克隆抗體1包被，繼之以3％的BSA/TBS封閉，并與病人的血清一同孵育。所結(jié)合的可溶性L1用生物素化的L1單克隆抗體檢測，繼而用鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶檢測。這種ELISA形式可檢測二聚體(多聚體)和單體的L1。B與A中所述過程相似，但可溶性L1用L1單克隆抗體1繼而用鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶檢測。該ELISA形式僅可檢測二聚體(多聚體)的L1。
圖6A卵巢腫瘤標本經(jīng)裂解后使用抗L1胞漿部分的抗體，通過SDS-PAGE和Western印跡分析B腫瘤病人的血清以偶聯(lián)了瓊脂糖的L1抗體進行免疫沉淀，經(jīng)SDS-PAGE分離，用相同的抗L1抗體進行Western印跡分析C用ELISA分析腫瘤病人和正常個體的血清中的可溶性L1。括號內(nèi)為各組的病人編號。
以下實施例闡述了本發(fā)明實施例1對刮宮組織的檢測示出L1表達分別與腫瘤的臨床發(fā)展進程和病理程度之間的高度相關(guān)。
根據(jù)標準方法將腫瘤組織包埋于石蠟中，并制作系列切片。在存在1mmol EDTA(pH8.0)的情況下，在微波爐中處理切片(10分鐘，92℃)之后，利用MCA1753抗體(Biozol Diagnostica Vertiebs GmbH)進行組織免疫染色。利用酶偶聯(lián)的二級抗體檢測結(jié)合的初級抗體(載體ABC試劑盒；www.vectorlabs.com)。一些染色實例示于

圖1。臨床數(shù)據(jù)示于表1A和1B。
圖2示出L1也可以利用刮宮組織檢測。使用上述方法，得到與腫瘤切片相似的染色模式。利用刮宮物測定L1可以在表1A和1B的含義內(nèi)在手術(shù)前對腫瘤早期分類。
實施例2ELISA示出在腫瘤患者的血清和腹水中存在L1，觀測到L1的存在與腫瘤類型(卵巢和子宮內(nèi)膜腫瘤)之間的相關(guān)性。
使用“捕獲”ELISA測試體液(腹水，血清)樣品中可溶的L1的存在情況。為此，將微滴定平板用實施例1中所述人抗L1抗體包被(濃度1ug/ml)，然后用PBS中3％BSA進行封閉步驟(45分鐘，室溫)，以消除與平板的非特異性結(jié)合。將所述體液以不同濃度加入(體液與含3％BSA的PBS的比值為1∶2和1∶10)，及在室溫進行溫育1小時。因此，隨后在Tris緩沖的鹽溶液(TBS，pH8.0，存在0.02％Tween-20)中進行4次沖洗。通過加入人生物素綴合的抗L1抗體測定結(jié)合的可溶的L1。為此，將生物素化抗體MCA1753加入微滴定平板中1小時。隨后進行上述4次沖洗步驟。用過氧化物酶綴合的鏈霉抗生物素蛋白(Dianova Hamburg，德國)在室溫另外溫育1小時。最后，進行4次沖洗。
之后，將底物溶液加入微滴定平板中，在出現(xiàn)顯色反應(yīng)之上，在ELISA讀數(shù)器上評價結(jié)果。結(jié)果示于圖3。
實施例3檢測可溶性L1的一種新ELISA形式實施例2中所述的ELISA使用的是用L1 mAb 1(捕獲單克隆抗體)包被微滴定平板，及用生物素化的(或其它標記的)L1 mAb 2(檢測單克隆抗體)檢測可溶的L1。這種類型的ELISA稱為G/K形式。我們已經(jīng)研制了另一種形式的ELISA，其中我們使用這兩種抗體捕獲和檢測L1的相同mAb(K/K形式)。在圖5A和5B中，示出使用陽性血清(CA526，卵巢腫瘤患者)和一些得自不相關(guān)腫瘤的對照血清進行的這兩種類型的ELISA對比。觀測到圖5B中新ELISA形式與圖5A所示先前形式相比，提供了較好的信號/噪音比(約5-8倍)。因為只有當用于捕獲的抗體未被封閉時才能進行K/K形式，因此這些結(jié)果意味著在血清樣品中，可溶的L1是二聚體或多聚體。用單體和二聚體L1(L1-Fc融合蛋白是二聚體)進行的這兩種ELISA的對照數(shù)據(jù)(圖5所示)支持這個觀點。
實施例4在腫瘤樣品中檢測L1 mRNA的PCR分析進行PCR分析的引物序列推導(dǎo)自人L1 cDNA序列(EMBL，登記號M 74387)。為檢測腫瘤組織或患者血清樣品中編碼L1的人mRNA，使用商購的試劑盒(Roche Molecular Biochemicals)分離mRNA，并轉(zhuǎn)錄至cDNA中。一種嵌套式PCR使用以下引物組合進行第一次，擴增引物1ACTGAGGGCTGGTTCATC(有義)，引物2CTTGCACTGTACTGGCCA(反義)(45秒，94℃，循環(huán)一次；1分鐘，94℃，1分鐘，56℃，1分鐘，72℃，循環(huán)30次)。針對第二次PCR，使用1ul的第一次PCR反應(yīng)物，使用引物1ACTCAGTGAAGGATAAGGAG(有義)，引物2TTGAGCGATGGCTGCTGCT。在另一個方案中，使用以下引物引物1AGGTCCCTGGAGAGTG(有義)；引物2TTGAGCGATGGCTGCTGCT(反義)。PCR反應(yīng)溫度如上述，PCR產(chǎn)物優(yōu)選在含有0.5ug/ml溴化乙錠的2％瓊脂糖凝膠上分離?；蛘?，將所述凝膠用標記的L1寡核苷酸探針(TCTGAGGCCCGACCGATGAAAGATGAGACCTTC)通過southern印跡進行印跡及雜交以提高敏感性。表1卵巢癌
AWD帶病生存 DOD死于疾病NED無疾病跡象表2子宮癌
*僅有2例高度進展期的子宮內(nèi)膜樣型子宮癌并伴有附件累及，如表2所示。這些腫瘤的子宮內(nèi)膜和卵巢的L1均為阻性，病人的預(yù)后差。此外，所有38例低臨床分期的子宮內(nèi)膜樣型腫瘤的L1均為陰性，且病人預(yù)后良好(隨診8-54個月)。
權(quán)利要求
1.一種診斷卵巢或子宮內(nèi)膜腫瘤或判斷其預(yù)后的方法，特征在于在患者樣品中測定L1水平，存在L1則表示存在卵巢或子宮內(nèi)膜腫瘤，或具有易患這種腫瘤的體質(zhì)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中L1水平是通過測定作為組織中細胞表面分子的L1而測定的。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述L1水平是通過檢測體液中可溶形式L1而確定的。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述體液是血清。
5.權(quán)利要求1-4任一項的方法，其中L1水平是通過將患者樣品與抗L1抗體或其片段接觸，然后測定所述抗L1抗體或其片段是否結(jié)合L1。
6.權(quán)利要求5的方法，其是作為放射性免疫分析或ELISA進行的。
7.權(quán)利要求1-4任一項的方法，其中所述L1水平是通過測定結(jié)合患者樣品中(重組的)L1的抗L1抗體或其片段的存在情況而測定的。
8.權(quán)利要求1-4任一項的方法，其中L1水平是通過測定體液中L1 mRNA的存在情況而測定的。
9.權(quán)利要求8的方法，其中L1 mRNA的檢測是通過RT-PCR進行的。
10.一種藥物制劑，其含有一種抗L1抗體或其片段。
11.一種藥物制劑，其含有一種衍生自L1或其片段的肽。
12.一種藥物制劑，其含有一種L1反義寡核苷酸。
13.抗L1抗體或其片段在治療卵巢或子宮內(nèi)膜腫瘤的中的應(yīng)用。
14.衍生自L1或其片段的肽在治療卵巢或子宮內(nèi)膜腫瘤中的應(yīng)用。
15.L1反義寡核苷酸在治療卵巢或子宮內(nèi)膜腫瘤中的應(yīng)用。
16.一種在需要這種治療的患者體內(nèi)治療卵巢或子宮內(nèi)膜腫瘤的方法，所述方法包括為患者施用足量的綴合于胞毒劑的L1抗體或其片段。
17.一種在需要這種治療的患者體內(nèi)治療卵巢或子宮內(nèi)膜腫瘤的方法，所述方法包括為患者施用足量的疫苗制劑形式的衍生自L1或其片段的蛋白質(zhì)。
18.一種在需要這種治療的患者體內(nèi)治療卵巢或子宮內(nèi)膜腫瘤的方法，所述方法包括為患者施用足量的L1反義寡核苷酸。
全文摘要
一種診斷卵巢或子宮內(nèi)膜腫瘤或判斷其預(yù)后的方法，特征在于在患者樣品中測定L1水平，優(yōu)選通過抗L1抗體測定，存在L1則表示存在卵巢或子宮內(nèi)膜腫瘤或具有易患這種腫瘤的體質(zhì)。另外，還提供了治療卵巢或子宮內(nèi)膜腫瘤的方法。
文檔編號C12N15/09GK1479871SQ01812534
公開日2004年3月3日 申請日期2001年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月10日
發(fā)明者彼得·阿爾特福格特, 米納·福格爾, 彼得 阿爾特福格特, 福格爾 申請人:德國公共權(quán)利基金會癌癥研究中心, 摩爾研究應(yīng)用有限公司