国产精品1024永久观看,大尺度欧美暖暖视频在线观看,亚洲宅男精品一区在线观看,欧美日韩一区二区三区视频,2021中文字幕在线观看

  • <option id="fbvk0"></option>
    1. <rt id="fbvk0"><tr id="fbvk0"></tr></rt>
      <center id="fbvk0"><optgroup id="fbvk0"></optgroup></center>
      <center id="fbvk0"></center>

      <li id="fbvk0"><abbr id="fbvk0"><dl id="fbvk0"></dl></abbr></li>

      致病微生物的檢測方法

      文檔序號:389878閱讀:287來源:國知局

      專利名稱::致病微生物的檢測方法
      技術領域
      :本發(fā)明涉及可用于檢測致病微生物的寡核苷酸探針或引物、使用所述探針或引物檢測致病微生物的方法、以及用于所述方法的試劑盒。
      背景技術
      :用免疫學方法檢測來源于致病微生物的蛋白的方法、以及例如在用核酸擴增反應擴增來源于致病微生物的基因的特定區(qū)而檢測所述區(qū)的方法已知是致病微生物的檢測方法。核酸擴增反應包括聚合酶鏈式反應(PCR)法(美國專利第4,683,195號、第4,683,202號和第4,800,159號);逆轉錄-PCR(RT-PCR)法,是PCR法和逆轉錄酶反應的組合(TrendsinBiotechnology,10146-152(1992));連接酶鏈式反應(LCR)法(EP320,308,于1989年6月14日公開);和基于轉錄的擴增系統(tǒng)(TAS)法(PCRProtocols,AcademicPressInc.,1990,第245-252頁)。已經開發(fā)了可以在等溫條件下進行的核酸擴增法。其實例包括鏈置換擴增(SDA)法(JP-B7-114718);自身支持性序列擴增(NASBA)法(日本專利2650159號);轉錄介導擴增(TMA)法;Qβ復制酶(3SR)法;基于核酸序列的擴增(日本專利2710159號);和各種改進的SDA法(美國專利第5,824,517號、WO99/09211、WO95/25180和WO99/49081)。在美國專利第5,916,777號中描述了一種在等溫條件下酶促合成寡核苷酸的方法。此外,環(huán)介導的等溫擴增(LAMP)法(WO00/28082)以及等溫嵌合引物起始的核酸擴增(ICAN)法(WO00/56877)也是已知的。如上所述,在致病微生物檢測方法中可以利用各種核酸擴增法。然而,通過選擇靶核酸中一個適合于所述核酸擴增反應的區(qū)、選擇適合于核酸擴增法的引物以及選擇適合于在所述核酸擴增法后進行的靶核酸檢測法的探針而達到實用的致病微生物檢驗所需的檢測靈敏度一直是困難的。此外,一直需要可以以低操作成本提供可再現(xiàn)結果的致病微生物的檢測方法。下文描述了結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)復合體、淋病球菌、衣原體和丙型肝炎病毒(HCV)作為致病微生物的實例。(a)結核分枝桿菌復合體結核病是在人類死因中排名靠前的一種疾病。雖然迄今已經開發(fā)了各種療法,但仍有許多患者。結核病在常規(guī)上用培養(yǎng)法或涂片法診斷。由于結核分枝桿菌復合體生長緩慢,所以需要1-8周(通常約1個月)來獲得試驗結果。因此,常規(guī)方法不是快速的。此外,其準確度為70%或更低。因而,該方法并不是一個令人滿意的診斷方法。在這種情況下,最近開發(fā)了多種用結核分枝桿菌復合體基因作為靶從痰等直接檢測的快速而準確的方法和用于所述方法的試劑。結核分枝桿菌復合體包括結核分枝桿菌、牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)BCG、非洲分枝桿菌(Mycobacteriumafricanum)、田鼠分枝桿菌(Mycobacteriummicroti)和Mycobacteriumcanetti。例如,在Lancet,No.8671,第1069頁(1989)中描述了一種用從試樣如痰中提取的DNA通過PCR法快速檢測結核分枝桿菌復合體的方法。在該方法中,用PCR法擴增一種作為靶的編碼結核分枝桿菌復合體65kDa抗原的基因,然后通過電泳檢測??晒┯糜跈z測用化學發(fā)光探針通過擴增16S核糖體RNA所獲得的擴增產物的試劑盒在市場上可得自Gen-Probe。用于將編碼16S核糖體RNA的DNA用作靶的PCR的試劑盒,在市場上也可得自Roche。結核分枝桿菌復合體特異性的、稱為IS6110的基因的序列已經發(fā)表(NucleicAcidsResearch,18188(1990)),據(jù)描述該基因可用作用于檢測結核分枝桿菌復合體的探針。事實上,使用PCR法檢測IS6110基因的方法已有報道(J.Clin.Microbiol.,282668(1990))。此后,許多文獻描述了使用IS6110基因作為靶的PCR法以及該基因的實用性。用除PCR法以外的核酸擴增法如SDA法(日本專利2814422號)或LCR法(JP-A10-500023)檢測IS6110基因已有描述。然而,由于用于檢測結核分枝桿菌復合體的上述方法對于實際臨床試驗并不令人滿意,所以需要進一步改進。例如,在許多文獻中報道了用核糖體RNA基因作為靶的核酸擴增檢測法。在這樣一種方法中,擴增屬于分枝桿菌屬細菌中一個共同的部分,然后用種特異性探針鑒定結核分枝桿菌復合體。由于對于結核分枝桿菌復合體的特異性僅取決于按照上述方法的探針序列,因而方法的可靠性包括檢測靈敏度不夠。此外,已經報道了在依照培養(yǎng)法測定為陽性的許多病例中按照所述方法檢測方面的失敗情況。已經報道了用結核分枝桿菌復合體特異性的IS6110基因作為靶以便提高特異性和檢測靈敏度的PCR法。然而,在7個部門中對于用IS6110基因作為靶的試驗的比較性研究已經證明,用該方法獲得的試驗結果在各部門之間有很大變化(假陽性3-77%;靈敏度2-90%)(J.Clin.Microbiol.,32277(1994))。從試樣中提取核酸的方法復雜,并且從試驗者感染的危險的角度來看不夠安全。在擴增產物的檢測方法中利用雜交。通常使用這樣一種方法首先用強堿在液相中使擴增的雙鏈核酸變性,然后將通過變性產生的單鏈核酸與探針在中性條件下、在被解鏈的互補核酸存在下雜交(Amplicor試劑盒所附的說明,得自Roche)。依照此方法,有一個問題,即靈敏度和特異性并未提高,因為從雙鏈核酸解鏈的互補擴增核酸以競爭方式干擾探針的雜交。換句話說,在該方法中,所擴增的雙鏈DNA通過堿變性被轉變?yōu)閱捂?,被中和,然后與探針在中性條件下雜交。另一方面,可以進行熱變性,而避開堿變性。在這種情況下,精確檢查大量試樣是不可能的。結果,需要許多步驟,將轉變?yōu)閱捂湹钠渲幸粭lDNA鏈以競爭方式與探針雜交,因而降低了檢測靶核酸的靈敏度。由于結核病是一種傳染病,故需要立即診斷和采取措施,例如隔離患者。然而,由于依照常規(guī)方法或者使用市售試劑盒從收集試樣到報告結果需要約6小時或更長的時間,所以結果的報告以及對患者采取的相應措施并不是在收集試樣的當天進行,而是在第二天進行。因此,對公眾健康產生的一個嚴重問題即不能最大限度地降低結核病感染傳播仍有待解決。如上所述的已發(fā)表的信息表明,沒有可靠且可用于實用醫(yī)學的處理結核分枝桿菌復合體的方法。(b)淋病球菌淋病球菌(或淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae))是美國最常報道的細菌感染之一的淋病的病原體。在Miyada和Born,1991,Mol.Cell.Probes,5327-335;美國專利第5,256,536號;和美國專利第5,525,717號中,描述了用來源于含有與淋病奈瑟氏球菌胞嘧啶DNA甲基轉移酶基因(M.NgoPII)序列顯著同源的可讀框(ORF1)的基因組片段的DNA探針檢測淋病奈瑟氏球菌。然而,已知沒有可以用來特異性地檢測淋病球菌并且有足夠靈敏度的方法。已經報道了一例也感染沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)的感染淋病球菌的患者。(c)衣原體“衣原體”是指屬于衣原體屬(Chlamydia)的微生物。衣原體屬的三個物種-沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體(C.psittaci)和肺炎衣原體(C.pneumoniae)在臨床上有重要性,因為它們可以感染人類而引起疾病。其中,據(jù)報道,在男性和女性中都引起生殖道感染的沙眼衣原體的感染是發(fā)達社會最為常見的性感染。因而,需要可以用來特異性地及時檢測沙眼衣原體的方法和供所述方法用的試劑。(d)HCV傳統(tǒng)上,采用逆轉錄-PCR(RT-PCR)法檢測諸如血清的樣品中的HCV。該方法包括如下10個步驟(1)從血清提取HCV的RNA;(2)用所提取的RNA作為模板合成cDNA;(3)通過其中將溫度上下調節(jié)的PCR法進行擴增;(4)與固定化探針雜交;(5)通過洗滌除去未反應的試劑;(6)與標記試劑反應;(7)通過洗滌除去未反應的試劑;(8)加入顯色試劑;(9)加入試劑以終止顯色;和(10)測量吸光度。已經檢查了通過采用實時檢測PCR法的均相檢測法對HCV的檢測(J.Virol.Methods,Vol.64,第147-159頁(1997))。對于血液制品、或者用于輸血的血液或捐獻的血液的質量控制、治療進程的判斷、病情的監(jiān)測或治療費用的降低而言,高靈敏度、方便、快速并且低成本地對大量試樣進行HCV測定是非常重要的。PCR法所需的嚴格的溫度控制,需要復雜而過大的測量裝置,而目前最大通量是5小時內最多96個試樣。測量大量試樣則是不可能的(在血液中心或臨床實驗室檢驗中心需要在2小時內測量1000個或更多試樣)。由于常規(guī)方法有上述各種問題,因此需要用于在限定的短時間內在大量試樣中測量HCV核酸的簡便的技術。發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是提供一種用于高靈敏度、準確、方便、在限定的短時間內低成本地對大量試樣測量致病微生物的方法。發(fā)明概述由于深入的研究,本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種利用優(yōu)于常規(guī)核酸擴增法的核酸擴增法檢測致病微生物的方法。此外,本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)了可供所述方法使用的用于擴增靶核酸的嵌合寡核苷酸引物以及用于檢測靶核酸的探針。另外,本發(fā)明人構建了可供該方法用的試劑盒。因而完成了本發(fā)明。本發(fā)明的第一個方面涉及一種含有SEQIDNO39的核苷酸序列或其部分、或者由SEQIDNO11的核苷酸序列組成的探針,所述探針可以用來檢測結核分枝桿菌復合體即結核分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌和/或Mycobacteriumcanetti。本發(fā)明的第二個方面涉及一種含有SEQIDNO27的核苷酸序列或其部分、或者由SEQIDNO21的核苷酸序列組成的探針,所述探針可以用來檢測淋病球菌-淋病奈瑟氏球菌。本發(fā)明的第三個方面涉及一種含有SEQIDNO22的核苷酸序列或其部分、或者由SEQIDNO20的核苷酸序列組成的探針,所述探針可以用來檢測衣原體-沙眼衣原體。本發(fā)明的第四個方面涉及一種由SEQIDNO34或35的核苷酸序列組成的探針,所述探針可以用來檢測HCV。本發(fā)明的第五個方面涉及一種可以在堿性pH下與得自致病微生物的靶核酸雜交的探針。依照第五個方面,優(yōu)選可以在8-14的堿性pH下與得自致病微生物的靶核酸雜交的探針,并且得自所述致病微生物優(yōu)選為結核分枝桿菌復合體、淋病球菌、衣原體或HCV。所述致病微生物的靶核酸選自來自結核分枝桿菌復合體的IS6110基因的核苷酸序列、來自淋病球菌的cppB基因的核苷酸序列、來自衣原體的pLGV440的核苷酸序列或者來自HCV的5’非翻譯區(qū)的核苷酸序列,并且可以優(yōu)選使用能夠與所述基因雜交的探針。這樣一種探針的實例如下含有SEQIDNO39的核苷酸序列或其部分的探針,其中所述SEQIDNO39的核苷酸序列存在于來自結核分枝桿菌復合體的IS6110基因中,最好是由SEQIDNO11的核苷酸序列組成的探針;含有SEQIDNO27的核苷酸序列或其部分的探針,其中所述SEQIDNO27的核苷酸序列存在于來自淋病球菌的cppB基因中,最好是由SEQIDNO21的核苷酸序列組成的探針;含有SEQIDNO22的核苷酸序列或其部分的探針,其中所述SEQIDNO22的核苷酸序列存在于來自衣原體的pLGV440中,最好是由SEQIDNO20的核苷酸序列組成的探針;或含有SEQIDNO34或35的核苷酸序列或其部分的探針,其中所述SEQIDNO34和35的核苷酸序列存在于來自HCV的5’非翻譯區(qū)中,最好是由SEQIDNO34或35的核苷酸序列組成的探針??梢詫Φ谝粋€至第五個方面的探針進行標記。所述探針可以是這樣一種用于檢測致病微生物的探針為具有來自SEQIDNO11、20、21、34或35的核苷酸序列的8-53個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列的寡核苷酸,所述探針可以被熒光標記,使得熒光強度在探針與靶核酸雜交時不受抑制,而熒光強度在探針不與靶核酸雜交時受到抑制。所述探針可以是這樣一種用于檢測致病微生物的探針所述探針由來自SEQIDNO11、20、21、34或35的核苷酸序列的8個或8個以上連續(xù)核苷酸的序列組成,或者所述探針可以用羅丹明型熒光染料或者噁嗪型熒光染料在5’端標記,并且所述探針由來自SEQIDNO34的核苷酸序列的8個或8個以上連續(xù)核苷酸的序列組成。所述探針可以是這樣一種用于檢測致病微生物的探針具有一種報道熒光染料和一種作為熒光染料的猝滅染料用于標記,并且由來自SEQIDNO11、20、21、34或35的核苷酸序列的8個或8個以上連續(xù)核苷酸的序列組成。所述報道染料可以是熒光素型染料,而猝滅染料可以是DABCYL型染料??梢詢?yōu)選使用具有選自熒光物質、染料、酶、生物素、膠體金和放射性同位素的標記的探針。本發(fā)明的第六個方面涉及一種用于檢測致病微生物的方法,所述方法包括進行第一個至第五個方面的探針與得自致病微生物的靶核酸的雜交。依照第六個方面,與得自致病微生物的靶核酸的雜交可以在堿性pH下進行。所述致病微生物的實例為結核分枝桿菌復合體、淋病球菌、衣原體或HCV。如果所述致病微生物是結核分枝桿菌復合體,則所述靶核酸優(yōu)選為IS6110基因或其片段。優(yōu)選進行第一個或第五個方面的探針與得自結核分枝桿菌復合體的擴增IS6110基因和/或其片段的雜交。優(yōu)選用具有SEQIDNO36或37的核苷酸序列或與所述序列部分重疊的序列的引物,擴增得自結核分枝桿菌復合體的IS6110基因和/或其片段。如果所述致病微生物是淋病球菌,則所述靶核酸優(yōu)選為cppB基因或其片段。優(yōu)選進行第二個或第五個方面的探針與得自淋病球菌的擴增cppB基因和/或其片段的雜交。優(yōu)選用具有SEQIDNO28或29的核苷酸序列或與所述序列部分重疊的序列的引物,擴增得自淋病球菌的cppB基因和/或其片段。如果所述致病微生物是衣原體,則所述靶核酸優(yōu)選為pLGV440或其片段。優(yōu)選進行第三個或第五個方面的探針與得自衣原體的擴增pLGV440和/或其片段的雜交。優(yōu)選用具有SEQIDNO23-26中的任一核苷酸序列或與所述序列部分重疊的序列的引物,擴增得自衣原體的pLGV440和/或其片段。如果致病微生物是HCV,則所述靶核酸優(yōu)選為得自HCV的5’非翻譯區(qū)或其片段。優(yōu)選進行第四個或第五個方面的探針與得自HCV的擴增的5’非翻譯區(qū)和/或其片段的雜交。優(yōu)選用具有SEQIDNO30-33中的任一核苷酸序列或與所述序列部分重疊的序列的引物,擴增得自HCV的5’非翻譯區(qū)和/或其片段。本發(fā)明的第七個方面涉及一種檢測致病微生物的方法,所述方法包括用第六個方面的檢測得自致病微生物的靶核酸的方法,來檢測得自結核分枝桿菌復合體、淋病球菌、衣原體或HCV的核酸。本發(fā)明的第八個方面涉及一種檢測致病微生物的方法,所述方法包括檢測依照包括下述步驟的核酸擴增法擴增的核酸(a)通過將作為模板的核酸、脫氧核糖核苷酸三磷酸、具有鏈置換活性的DNA聚合酶、至少一種引物和RNA酶H混合,制備反應混合物,其中所述引物是一種與作為模板的核酸的核苷酸序列基本互補的嵌合寡核苷酸引物,并且含有核糖核苷酸以及至少一種選自脫氧核糖核苷酸和核苷酸類似物的物質,所述核糖核苷酸位于引物的3’末端或者位于3’端一側;以及(b)將反應混合物保溫足夠的時間,以產生反應產物。依照第八個方面,優(yōu)選所述反應混合物還包含一種其序列與作為模板的核酸的核苷酸序列基本同源的嵌合寡核苷酸引物??梢詢?yōu)選使用一種以下通式所示的嵌合寡核苷酸引物通式5’-dNa-Nb-dNc-3’(a11或11以上的整數(shù);b1或1以上的整數(shù);c0或者1或1以上的整數(shù);dN脫氧核糖核苷酸和/或核苷酸類似物;N未經修飾的核糖核苷酸和/或經修飾的核糖核苷酸,其中dNa中的某些dN可以被N取代)。在所述嵌合寡核苷酸引物中,c可以是0,所述核苷酸類似物可以是脫氧核糖肌苷核苷酸或者脫氧核糖尿嘧啶核苷酸,而所述經修飾的核糖核苷酸可以是(α-S)核糖核苷酸。優(yōu)選使用由SEQIDNO13-16、23-26和28-31中的任一核苷酸序列組成的嵌合寡核苷酸引物。所述方法還包括用第一個至第五個方面的探針檢測擴增的核酸。本發(fā)明的第九個方面涉及一種以下通式所示的、用于檢測致病微生物的嵌合寡核苷酸引物通式5’-dNa-Nb-dNc-3’(a11或11以上的整數(shù);b1或1以上的整數(shù);c0或者1或1以上的整數(shù);dN脫氧核糖核苷酸和/或核苷酸類似物;N未經修飾的核糖核苷酸和/或經修飾的核糖核苷酸,其中dNa中的某些dN可以被N取代)。依照第九個方面,可以優(yōu)選使用其中c為0的引物。優(yōu)選其中所述核苷酸類似物為脫氧核糖肌苷核苷酸或脫氧核糖尿嘧啶核苷酸、而所述經修飾的核糖核苷酸為(α-S)核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物。雖然并不打算限制本發(fā)明,但優(yōu)選例如由SEQIDNO13-16、23-26和28-31中的任一序列表示的、用于檢測致病微生物的嵌合寡核苷酸引物。本發(fā)明的第十個方面涉及用于從結核分枝桿菌復合體擴增IS6110基因和/或其片段、具有SEQIDNO36或37的核苷酸序列或與所述序列部分重疊的序列的引物;用于從淋病球菌擴增cppB基因和/或其片段、具有SEQIDNO27的核苷酸序列或與所述序列部分重疊的序列的引物;用于從衣原體擴增pLGV440和/或其片段、具有SEQIDNO22的核苷酸序列或與所述序列部分重疊的序列的引物;和用于從HCV擴增5’非翻譯區(qū)和/或其片段、具有SEQIDNO41-43中的任一核苷酸序列或與所述序列部分重疊的序列的引物。依照第十個方面,所述引物可以是其中所述核苷酸序列中的一部分被核糖核苷酸取代的嵌合寡核苷酸引物??梢詫Φ诰艂€或第十個方面的引物進行標記。所述標記的實例為熒光物質、染料、酶、生物素或膠體金。本發(fā)明的第十一個方面涉及一種用于檢測靶核酸的組合物,所述組合物含有第一個至第五個方面的探針。本發(fā)明的第十二個方面涉及一種用于檢測靶核酸的組合物,所述組合物含有第九個或第十個方面的引物。第十一個或第十二個方面可以用來檢測致病微生物。本發(fā)明的第十三個方面涉及一種用于檢測致病微生物的組合物,所述組合物用于第六個至第八個方面的檢測致病微生物的方法,并且所述組合物含有至少一種用于靶核酸擴增或者雜交的試劑。依照第十三個方面,可以含有選自具有鏈置換活性的DNA聚合酶、RNA酶H和脫氧核糖核苷酸三磷酸的一種試劑。所述DNA聚合酶可以是得自熱堅芽孢桿菌(Bacilluscaldotenax)的缺乏5’→3’外切核酸酶的BcaDNA聚合酶,而所述RNA酶H可以是得自屬于熱球菌屬(Pyrococcus)細菌和/或屬于古生球菌屬(Archaeoglobus)細菌的II型RNA酶H。本發(fā)明的第十四個方面涉及一種用于檢測致病微生物的試劑盒,所述試劑盒含有第一個至第五個方面的探針。依照第十四個方面,可以含有第九個或第十個方面的引物。所述試劑盒可以用來檢測結核分枝桿菌復合體、淋病球菌、衣原體或HCV。所述試劑盒可以是用于第六個至第八個方面的檢測致病微生物的方法、并且含有至少一種用于靶核酸擴增或雜交的試劑的試劑盒??梢院羞x自具有鏈置換活性的DNA聚合酶、RNA酶H和脫氧核糖核苷酸三磷酸的一種試劑。所述DNA聚合酶優(yōu)選是得自熱堅芽孢桿菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的BcaDNA聚合酶,而所述RNA酶H可以是得自屬于熱球菌屬細菌和/或屬于古生球菌屬細菌的II型RNA酶H。所述試劑盒可以含有一種用于捕獲擴增產物的支持體??梢詢?yōu)選使用其中所述支持體選自微量滴定板、微珠、磁珠、膜和玻璃的試劑盒。本發(fā)明的第十五個方面涉及一種檢測結核分枝桿菌復合體的方法,所述方法包括用胞壁質酶處理含結核分枝桿菌復合體的試樣,以提取核酸。附圖簡述圖1一幅圖,說明HCV-RNA濃度和熒光強度變化之間的關系以及當依照本發(fā)明的方法在不同HCV-RNA濃度下進行測量時與常規(guī)方法在測量范圍方面的差別的比較。發(fā)明詳述此中所用的脫氧核糖核苷酸(也稱為dN)是指其糖部分由D-2-脫氧核糖組成的核苷酸。所述脫氧核糖核苷酸包括例如具有腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤或胸腺嘧啶作為堿基部分的脫氧核糖核苷酸。此外,所述脫氧核糖核苷酸也包括具有經修飾堿基如7-脫氮鳥苷的脫氧核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸類似物如脫氧肌苷核苷酸。此中所用的核糖核苷酸(也稱為N)是指其糖部分由D-核糖組成的核苷酸。所述核糖核苷酸包括具有腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤或尿嘧啶作為堿基部分的核糖核苷酸。所述核糖核苷酸也包括經修飾的核糖核苷酸如其中α位磷酸基團的氧原子被硫原子取代的經修飾的核糖核苷酸(也稱為(α-S)核糖核苷酸或(α-S)N)或其它衍生物。此中所用的嵌合寡核苷酸引物是指含有脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的引物。所述引物可以含有核苷酸類似物和/或經修飾的核糖核苷酸。本發(fā)明中所使用的嵌合寡核苷酸引物包括具有位于引物的3’末端或3’端一側的核糖核苷酸的任何嵌合寡核苷酸引物,所述嵌合寡核苷酸引物可以在本發(fā)明的方法中用來延伸核酸鏈,可以用內切核酸酶切割,并且可以用來進行鏈置換反應。此中所用的3’端一側是指從諸如引物的核酸中心至3’末端的部分。同樣,5’端一側是指從核酸中心至5’端的部分。此中所用的內切核酸酶可以是作用于通過從已退火到作為模板的核酸上的所述嵌合寡核苷酸引物延伸DNA所產生的雙鏈DNA、并且在所述引物中含有核糖核苷酸的部分特異性切割所述核酸的任何內切核酸酶。此中所用的DNA聚合酶是指用DNA鏈作為模板從頭合成DNA鏈的酶。所述DNA聚合酶包括天然存在的DNA聚合酶和具有上述活性的變異型酶。例如,這樣的酶包括具有鏈置換活性的DNA聚合酶、缺乏5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶和也具有逆轉錄酶活性或內切核酸酶活性的DNA聚合酶。此中所用的“鏈置換活性”是指可以實現(xiàn)鏈置換的活性,也就是說它可以基于作為模板的核酸的序列繼續(xù)進行DNA復制、同時置換所述DNA鏈而釋放已經退火到模板鏈上的互補鏈。另外,由于鏈置換而從作為模板的核酸釋放的DNA鏈在此被稱為“置換鏈”。此中所用的堿性pH是指高于7的pH。此中所用的致病微生物是指致病細菌或病毒。此中所用的靶核酸是指得自致病微生物的基因中經受核酸擴增或檢測的任何區(qū),所述靶核酸可以是DNA或是RNA。在下文將詳細描述本發(fā)明。(1)本發(fā)明的探針本發(fā)明探針的特征在于,它可以用來檢測致病微生物,例如結核分枝桿菌復合體、淋病球菌、衣原體或HCV。在堿性pH下可以與靶核酸穩(wěn)定雜交的探針是本發(fā)明探針的一個優(yōu)選實施方案的例子。雖然并不打算限制本發(fā)明,但是例如可以在堿性條件下、例如在高于7.0的堿性pH、優(yōu)選在pH8-14范圍內、更優(yōu)選在pH8-10范圍內可以與具有所述探針的核苷酸序列互補序列的靶核酸雜交的探針,是依照本發(fā)明的可以在堿性pH下雜交的探針的例子。雖然并不打算限制本發(fā)明,但其實例包括含有SEQIDNO11、20、21、34或35的核苷酸序列的探針。本發(fā)明的探針可以用來在中性pH的常規(guī)條件下雜交。使用本發(fā)明的探針,可以在一個雜交步驟中使用通過堿性處理而變性為單鏈的雙鏈核酸,而無需中和。結果,與常規(guī)方法相比,所述方法被簡化,靈敏度被提高10倍或10倍以上。此外,在堿性pH下雜交,可以提高雜交特異性。對于檢測與得自試樣的核酸雜交的探針的方法并無具體限制。任何已知的檢測方法都可以用于本發(fā)明。使用以合適方法標記的本發(fā)明探針,可以有效地和/或高靈敏度地檢測樣品中的靶核酸。對于標記探針的方法并無具體限制。例如,可以使用放射性同位素(32P等)、染料、熒光物質、發(fā)光物質、各種配體(生物素、洋地黃毒苷等)、酶等。標記探針的存在可以用適用于該標記的檢測方法加以證實。就不能直接檢測的配體而論,可以結合使用具有可檢測標記并且能夠與所述配體結合的物質。例如,通過聯(lián)合使用配體標記的探針和酶標記的抗配體抗體擴增信號,可以高靈敏度地檢測靶核酸。所述探針可以具有標記物質以供檢測。例如,配體或受體物質、放射性同位素、熒光物質、發(fā)光物質或顯色物質可以優(yōu)選用作標記物質,但并不限于此。依照本發(fā)明的方法,可以優(yōu)選使用所謂均相檢測法。在所述均相檢測法中,將具有標記物質的探針與通過擴增目標區(qū)所獲得的核酸雜交,然后在洗滌游離探針之后進行檢測?;蛘?,可以省去洗滌步驟。例如,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.85,第8790-8794頁(1996)中描述的熒光共振能量轉移(FRET)法、NatureBiotechnologyvol.14,第303-308頁(1996)中描述的分子信標法、Anal.Chem.,vol.72,第3717-3724頁(2000)中描述的巧妙探針法(smartprobemethod)等可以優(yōu)選用作利用熒光的均相檢測法。其中探針在5’端用羅丹明型染料或噁嗪型染料標記、而在3’端用具有引起猝滅的核苷酸序列的寡核苷酸或報道染料標記、并且探針的5’端一側和3’端一側自我退火的分子信標(molecularbeacons)法或巧妙探針法,是本發(fā)明一個實施方案的例子。如果在用本發(fā)明的擴增法擴增的核酸存在下使用這樣一種探針,則所述探針與擴增的核酸雜交,去除了所述探針的自我退火結構,導致熒光信號發(fā)射,不抑制熒光強度。另一方面,如果缺乏擴增的核酸,則因為所述探針保留自我退火結構,熒光強度被抑制,所以檢測不到熒光信號。具體地說,就巧妙探針法而論,所述熒光染料優(yōu)選為羅丹明型染料或噁嗪型染料。所述染料可以是連接于探針5’端以便與3’端核苷酸序列合作的任一種染料。由于所述合作,如果熒光探針不與靶核酸結合,則熒光強度受抑制,而如果熒光探針與靶核酸結合,則熒光強度不受抑制。就分子信標法而論,可以使用其中當熒光探針不與靶核酸結合時由于熒光共振能量轉移導致熒光強度受抑制,而結合時熒光強度不受抑制的組合。優(yōu)選使用FAM(6-羧基-熒光素)、TAMRA(6-羧基-四甲基-羅丹明)、JA242(噁嗪)或DABCYL(4-二甲氨基偶氮苯-4’-磺酰氯)作為所述熒光染料。這樣一種熒光染料是本領域已知的,并且是市售的。例如,Nuc.AcidsRes.,vol.12,第3387-3403頁(1984),J.Am.Chem.Soc.,vol.112,第1253-1254頁(1990)或Anal.Chem.,vol.70,第4771-4779頁(1998)中描述的方法可以用作將寡核苷酸熒光標記的方法。對于本發(fā)明探針的長度并不具體限制。長度可以例如為12聚體或12聚體以上,優(yōu)選20聚體或20聚體以上,更優(yōu)選為40聚體或40聚體以上。本發(fā)明的用于檢測結核分枝桿菌復合體的探針可以用來檢測結核分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌和/或Mycobacteriumcanetti。所述探針的靶核酸根據(jù)待檢測的核酸或生物而適當?shù)剡x擇。雖然并不打算限制本發(fā)明,但是例如以IS6110基因作為靶核酸的探針可以用來檢測結核分枝桿菌復合體。通過從由SEQIDNO12表示的得自結核分枝桿菌復合體的IS6110基因的核苷酸序列中選擇合適的區(qū),可以設計這樣一種探針。雖然并不打算限制本發(fā)明,但是可以例如從含有SEQIDNO39的核苷酸序列的區(qū)、優(yōu)選從含有SEQIDNO40的核苷酸序列的區(qū)、更優(yōu)選從含有SEQIDNO38的核苷酸序列的區(qū)中,選擇所述序列。特別是,可以從含有SEQIDNO11的核苷酸序列的區(qū)中選擇所述序列。由于這樣一種探針與得自結核分枝桿菌復合體的IS6110基因或其片段高特異性地穩(wěn)定雜交,所以它對于所述基因的檢測和結核分枝桿菌復合體的檢測特別有用。本發(fā)明的檢測淋病球菌的探針可以用來檢測淋病奈瑟氏球菌??梢愿鶕?jù)待檢測的核酸或生物,適當?shù)剡x擇所述探針的靶核酸。雖然并不打算限制本發(fā)明,但是可以例如使用以隱蔽性質粒蛋白B(cppB)基因作為靶核酸的探針來檢測淋病球菌。通過從由SEQIDNO27表示的得自淋病球菌的cppB基因的核苷酸序列中選擇合適的區(qū),可以設計這樣一種探針。雖然并不打算限制本發(fā)明,但是可以例如從含有SEQIDNO27的核苷酸序列的區(qū)、優(yōu)選從含有SEQIDNO21的核苷酸序列的區(qū)中選擇所述序列。由于這樣一種探針與得自淋病球菌的cppB基因或其片段高特異性地穩(wěn)定雜交,所以它對于所述基因的檢測和淋病球菌的檢測特別有用。本發(fā)明的用于檢測衣原體的探針可以用來檢測沙眼衣原體。根據(jù)待檢測的核酸或生物,適當?shù)剡x擇所述探針的靶核酸。雖然并不打算限制本發(fā)明,但是例如可以以隱蔽性質粒pLGV440作為靶核酸的探針可以用來檢測衣原體。通過從由SEQIDNO22表示的得自衣原體的pLGV440的核苷酸序列選擇合適的區(qū),可以設計這樣一種探針。雖然并不打算限制本發(fā)明,但是可以例如從含有SEQIDNO22的核苷酸序列的區(qū)、優(yōu)選從含有SEQIDNO44的核苷酸序列的區(qū)、更優(yōu)選從含有SEQIDNO20的核苷酸序列的區(qū)選擇所述序列。由于這樣一種探針與得自衣原體的pLGV440或其片段高特異性地穩(wěn)定雜交,所以它對于所述基因的檢測和衣原體的檢測特別有用。對于本發(fā)明的用于檢測HCV的探針并無具體限制,只要它是可以與以擴增靶核酸所用的正向引物和反向引物為界的區(qū)的核苷酸序列雜交。雖然并不打算限制本發(fā)明,但是可以優(yōu)選在8個堿基至53個堿基的范圍內、更優(yōu)選在8個堿基至36個堿基的范圍內選擇所述探針的長度。例如,可以從SEQIDNO43的核苷酸序列選擇具有上述范圍內的8個或8個以上連續(xù)核苷酸的核苷酸序列的探針。雖然并不打算限制本發(fā)明,但是具有從SEQIDNO34或35的核苷酸序列選擇的8個或8個以上連續(xù)核苷酸的核苷酸序列的探針,是這樣一種探針的例子。(2)本發(fā)明的檢測方法依照本發(fā)明的檢測靶核酸的方法,用上述(1)中所述的探針,可以省去在使雙鏈靶核酸變性為單鏈的步驟之后的中和步驟。換句話說,依照本發(fā)明的檢測靶核酸的方法,與具有與探針的核苷酸序列互補序列的核酸的雜交,可以在pH高于7、優(yōu)選在pH8-14范圍內的pH的堿性條件下進行。所述雜交條件包括但不限于本領域技術人員稱為“嚴格性條件”的條件。在T.Maniatis等(編著),MolecularCloningALaboratoryManual,2nded.,1989,ColdSpringHarborLaboratory中描述的那些條件或在此中的實施例中描述的那些條件可以用作這樣的條件。雜交溶液的典型組成的實例包括以下組成含有0.5%SDS、5×Denhardt氏溶液(0.1%牛血清白蛋白(BSA)、0.1%聚乙烯吡咯烷酮、0.1%Ficoll400)和100μg/ml鮭精DNA的6×SSC(1×SSC0.15MNaCl,0.015M檸檬酸鈉)。雜交溶液的pH可以依照本發(fā)明調節(jié)至8-14。雖然并不打算限制本發(fā)明,但是雜交可以在例如低于所述探針Tm值5℃或5℃以上的溫度下進行。探針的Tm值可以例如按照以下等式確定Tm=81.5-16.6(log10[Na]+)+0.41(%G+C)-(600/N)其中N是探針的鏈長;%G+C是探針中鳥嘌呤和胞嘧啶殘基的含量。如果探針的鏈長短于18個堿基,則Tm值可以按照以下公式估計Tm=[(%A+T)×2+(%G+C)×4]其中(%A+T)是探針中腺嘌呤和胸腺嘧啶殘基的含量;(%G+C)是探針中鳥嘌呤和胞嘧啶殘基的含量。通過證實探針與靶核酸在上述雜交條件雜交,可以選擇出適合于檢測靶核酸的探針。對于依照本發(fā)明的檢測法的雜交條件并無具體限制。使用已知的雜交條件,優(yōu)選嚴格性雜交條件。雜交溶液的pH可以在8-14范圍內調節(jié)。在作為本發(fā)明的檢測靶核酸的方法的示例性實施方案的一個檢測結核分枝桿菌復合體的方法中,可以優(yōu)選使用適合于檢測得自結核分枝桿菌復合體的IS6110基因的探針。雖然并不打算限制本發(fā)明,但是依照本發(fā)明,可以優(yōu)選使用含有例如SEQIDNO39的核苷酸序列或其部分、優(yōu)選SEQIDNO40的核苷酸序列或其部分、更優(yōu)選SEQIDNO38的核苷酸序列或其部分、最優(yōu)選SEQIDNO11的核苷酸序列的探針。在一個檢測淋病球菌的方法中,可以優(yōu)選使用例如適合于檢測得自淋病球菌的cppB基因的探針。雖然并不打算限制本發(fā)明,但是依照本發(fā)明,可以優(yōu)選使用含有例如SEQIDNO27的核苷酸序列或其部分、優(yōu)選SEQIDNO21的核苷酸序列或其部分的探針。在一個檢測衣原體的方法中,可以優(yōu)選使用適合于檢測得自衣原體的pLGV440的探針。雖然并不打算限制本發(fā)明,但是依照本發(fā)明,可以優(yōu)選使用含有例如SEQIDNO22的核苷酸序列或其部分、優(yōu)選SEQIDNO44的核苷酸序列或其部分、更優(yōu)選SEQIDNO20的核苷酸序列或其部分的探針。在一個檢測HCV的方法中,雖然并不打算限制本發(fā)明,但優(yōu)選5’非翻譯區(qū)。依照本發(fā)明,可以優(yōu)選使用含有例如SEQIDNO43的核苷酸序列或其部分、優(yōu)選SEQIDNO34的核苷酸序列或其部分、或者SEQIDNO35的核苷酸序列或其部分的探針。依照本發(fā)明的檢測致病微生物的方法,使用上述(1)中所述的探針,可以特異性地檢測相應的致病微生物。由于所述探針與得自每種致病微生物的基因或其片段高特異性地穩(wěn)定雜交,所以它對于所述基因的檢測和每種致病微生物的檢測特別有用。使用上述(1)中所述的探針,依照本發(fā)明的檢測法,可以在pH高于7、優(yōu)選pH8-14、更優(yōu)選pH8-10的堿性條件下,進行所述探針和含核酸的樣品之間的雜交。因此,所述方法提供了一種檢測得自致病微生物的基因或其片段的方法,所述方法不包括在使靶核酸變性的步驟之后的中和步驟。依照該方法,可以檢測在試樣中含有的結核分枝桿菌復合體等。本發(fā)明的所述方法可以用來檢測或定量測定樣品中的特定基因。換句話說,可以從可能含有核酸(DNA或RNA)的任何樣品中檢測或定量測定特定的基因??梢詮闹袡z測或定量測定特定基因的樣品的實例包括但不限于得自生物體的樣品,如全血、血清、血沉棕黃層、尿液、糞、腦脊髓液、精液、唾液、組織(例如癌組織或淋巴結)和細胞培養(yǎng)物(例如哺乳動物細胞培養(yǎng)物或細菌細胞培養(yǎng)物)、懷疑污染或感染微生物(如病毒或細菌)的樣品(例如食品或生物制劑)、和可能含有生物體的樣品如土壤和廢水。此外,所述方法可以用來例如基于靶核酸的存在檢測致病微生物的存在或定量測定致病微生物。特別是,所述檢測致病微生物的方法可用于衛(wèi)生或環(huán)境領域。可以優(yōu)選用RNA或DNA作為供上述檢測方法用的待用作模板的核酸。通過使用例如用去垢劑、超聲處理、振蕩/用玻璃珠攪拌或弗氏壓碎器來裂解,可以從上述材料中制備含核酸的制備物,但并不限于此。在某些情況下,最好進一步加工所述制備物,以純化核酸(例如在存在內源核酸酶的情況下)。在某些情況下,采用已知方法,例如酚抽提、層析、離子交換、凝膠電泳或密度梯度離心,來純化核酸。當使用具有來源于RNA的序列的核酸作為靶時,可以用通過用RNA作為模板的逆轉錄反應所合成的cDNA作為模板,進行本發(fā)明的所述方法。在所用的反應條件下退火到作為模板的RNA上的任何引物,都可以用于逆轉錄反應中。所述引物可以是具有與作為模板的特定RNA互補的核苷酸序列的引物(特異性引物)、寡聚dT(脫氧胸腺嘧啶)引物和具有隨機序列的引物(隨機引物)。從特異性退火的觀點來看,用于逆轉錄的引物的長度優(yōu)選為6個或6個以上的核苷酸、更優(yōu)選9個或9個以上的核苷酸。從寡核苷酸合成的觀點來看,長度優(yōu)選為100個或更少的核苷酸,更優(yōu)選30個或更少的核苷酸。嵌合寡核苷酸引物可以用作逆轉錄的引物。所述嵌合寡核苷酸引物也可以在使用逆轉錄之后獲得的cDNA作為模板的本發(fā)明的擴增核酸的方法中,用作鏈置換反應的引物。這樣一種引物可以是具有以下(3)中所述特性并且可以用于從RNA進行的逆轉錄反應中的任一種引物。例如,可以優(yōu)選使用具有SEQIDNO32或33的核苷酸序列的引物。具有用RNA作為模板合成cDNA的活性的任何酶,都可以用于逆轉錄反應中。其實例包括來源于各種來源的逆轉錄酶,例如禽類成髓細胞瘤病毒源逆轉錄酶(AMVRTase)、莫洛尼鼠類白血病病毒源逆轉錄酶(MMLVRTase)和勞斯相關病毒2逆轉錄酶(RAV-2RTase)。另外,可以使用也具有逆轉錄活性的DNA聚合酶。對于本發(fā)明,優(yōu)選在高溫下具有逆轉錄活性的酶,例如得自棲熱菌屬(Thermus)細菌的DNA聚合酶(例如TthDNA聚合酶)和得自芽孢桿菌屬(Bacillus)的嗜熱菌的DNA聚合酶。雖然并不打算限制本發(fā)明,但是例如優(yōu)選得自芽孢桿菌屬嗜熱菌的DNA聚合酶,例如得自嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.st)的DNA聚合酶(BstDNA聚合酶)和BcaDNA聚合酶。例如,BcaDNA聚合酶并不需要錳離子來進行逆轉錄反應。此外,它可以合成cDNA,而同時抑制作為模板的RNA在高溫條件下形成二級結構。具有逆轉錄酶活性的天然存在的酶和所述酶的變異體都可以使用,只要它們具有所述活性。雙鏈DNA(例如上述分離的基因組DNA或PCR片段)和單鏈DNA(例如通過逆轉錄反應從總RNA或mRNA制備的cDNA)都可以優(yōu)選用作本發(fā)明所用核酸擴增法中的模板DNA。優(yōu)選雙鏈DNA在使其變性為單鏈DNA后使用。如上所述,靶核酸上與本發(fā)明探針雜交的區(qū),在用合適的核酸擴增法擴增后,可以用于雜交。對于待使用的核酸擴增法并無具體限制,只要它可以用來擴增靶核酸上的一個區(qū)。例如,可以使用的核酸擴增法包括聚合酶鏈式反應(PCR)法(美國專利第4,683,195、4,683,202和4,800,159號);連接酶鏈式反應(LCR);鏈置換擴增(SDA)法(JP-B7-114718);自身支持性序列擴增(3SR)法;基于核酸序列的擴增(NASBA)法(日本專利2650159號);轉錄介導擴增(TMA)法;Qβ復制酶法(日本專利2710159號);和等溫嵌合引物起始的核酸擴增(ICAN)(WO00/56877)。ICAN法是這樣一種方法,其中在等溫條件下,用嵌合寡核苷酸引物、內切核酸酶和具有鏈置換活性的DNA聚合酶,連續(xù)擴增具有模板核酸上特定核苷酸序列的DNA。“連續(xù)”是指反應在不改變反應溫度或反應混合物的組成的條件下進行。此中所用的“等溫”是指每個步驟中酶和核酸鏈作用的溫度基本恒定的條件。通常,由脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸組成、并且所述核糖核苷酸位于3’端或3’端一側的引物,可以用作嵌合寡核苷酸引物。例如,一種具有以下通式所示結構的寡核苷酸可以用作ICAN法的引物通式5’-dNa-Nb-dNc-3’(a11或11以上的整數(shù);b1或1以上的整數(shù);c0或者1或1以上的整數(shù);dN脫氧核糖核苷酸和/或核苷酸類似物;N未經修飾的核糖核苷酸和/或經修飾的核糖核苷酸,其中dNa中的某些dN可以被N取代)。例如,脫氧核糖肌苷核苷酸可以用作核苷酸類似物,而(α-S)核糖核苷酸可以用作經修飾的核糖核苷酸??梢院兴龊塑账犷愃莆铮灰鰮饺牖旧喜幌鳛橐锏墓δ?。基于模板上需要擴增的區(qū)的5’和3’核苷酸序列,制備兩種引物(一種具有與5’核苷酸序列同源的序列,而另一種具有與3’核苷酸序列互補的序列),并將其用于擴增。在本發(fā)明中,可以使用可以作用于通過從已退火到作為模板的核酸上的上述嵌合寡核苷酸引物延伸DNA而產生的雙鏈DNA、并且切割延伸的鏈以實現(xiàn)鏈置換反應的任何內切核酸酶。也就是說,所述內切核酸酶是可以在雙鏈DNA的所述嵌合寡核苷酸引物部分產生缺口的酶??梢杂糜诒景l(fā)明的內切核酸酶的實例包括但不限于核糖核酸酶。特別是,可以優(yōu)選使用作用于由DNA和RNA組成的雙鏈核酸的RNA部分的內切核糖核酸酶H(RNA酶H)。在本發(fā)明中,可以優(yōu)選使用具有上述活性的任何核糖核酸酶,包括嗜常溫酶和耐熱性酶。例如,在以下實施例中所述的本發(fā)明方法中,得自大腸桿菌的RNA酶H可以用于約50℃至約70℃的反應中。在本發(fā)明的方法中,也可以優(yōu)選使用耐熱性核糖核酸酶。可以優(yōu)選使用的耐熱性核糖核酸酶的實例包括但不限于市售的核糖核酸酶HybridaseTMThermostableRNaseH(EpicenterTechnologies)、以及得自芽孢桿菌屬嗜熱菌、棲熱菌屬細菌、熱球菌屬細菌、棲熱袍菌屬(Thermotoga)、古生球菌屬細菌、甲烷球菌屬(Methanococcus)細菌等的RNA酶H。此外,可以優(yōu)選使用天然存在的核糖核酸酶和變異體。此中所示的RNA酶H的酶單位是依照參比實施例中所述的測量酶單位的方法表示的數(shù)值。所述RNA酶H并不限于特定的RNA酶H,只要它可以用于本發(fā)明的方法。例如,所述RNA酶H可以來源于各種病毒、噬菌體、原核生物或真核生物。它可以或者是細胞RNA酶H或者是病毒RNA酶H。所述細胞RNA酶H的實例為大腸桿菌RNA酶HI,而病毒RNA酶H的實例為得自HIV-1的RNA酶H。在本發(fā)明的方法中可以使用I型、II型或III型RNA酶H。例如,可以優(yōu)選使用但不限于得自大腸桿菌的RNA酶HI或者得自熱球菌屬細菌或古生球菌屬細菌的RNA酶HII。使用在本發(fā)明方法中所用的內切核酸酶如RNA酶H進行切割反應的效率,可能隨引物3’端周圍的核苷酸序列而變,并且可能影響所需DNA的擴增效率。因此,設計對于所用的RNA酶H最適的引物是很自然的。在ICAN法中,使用對DNA具有鏈置換活性的DNA聚合酶。特別是,可以優(yōu)選使用基本上無5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶。在ICAN法可以使用具有所述鏈置換活性的任何DNA聚合酶,但不限于此。其實例包括得自芽孢桿菌屬嗜熱菌如熱堅芽孢桿菌(下文稱為B.ca)和嗜熱脂肪芽孢桿菌(下文稱為B.st)的缺乏其5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶的變異體、以及得自大腸桿菌的DNA聚合酶I的大片段(Klenow片段)。嗜常溫和耐熱性DNA聚合酶都可以優(yōu)選用于本發(fā)明。所述酶可以或者是從其原始來源純化的酶、或者是用基因工程技術產生的重組蛋白。所述酶可以經過修飾,例如通過使用基因工程技術或其它方法取代、缺失、添加或插入。這類酶的實例包括BcaBESTDNA聚合酶(TakaraShuzo),它是缺乏其5’→3’外切核酸酶活性的BcaDNA聚合酶。這種酶在50℃至70℃表現(xiàn)出其活性,可以優(yōu)選用于所述方法。已知某些DNA聚合酶在特定條件下具有內切核酸酶活性,如RNA酶H活性。這樣的DNA聚合酶可以用于本發(fā)明的方法中。一方面,可以在允許RNA酶H活性表達的條件下,例如在Mn2+存在下,使用所述DNA聚合酶。在這種情況下,可以無需加入RNA酶H,而進行本發(fā)明的方法。其中BcaDNA聚合酶可以在含Mn2+的緩沖液中表現(xiàn)出RNA酶活性的方面并不限于使用BcaDNA聚合酶。已知具有RNA酶H活性的DNA聚合酶,例如得自嗜熱棲熱菌(Thermusthermophilus)的TthDNA聚合酶,可以用于本發(fā)明中。通過將嵌合寡核苷酸引物、含作為模板的核酸的樣品、內切核酸酶、DNA聚合酶、脫氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)等在具有所述酶可在其中表現(xiàn)出其活性的組成的緩沖液中混合,然后在合適的溫度下將反應混合物保溫達足以產生反應產物的時間,進行ICAN法。在所述反應之前,可以將嵌合寡核苷酸引物和作為模板的核酸混合,在使雙鏈核酸變性的溫度(例如90℃或更高)下保溫,然后冷卻至本發(fā)明方法所用的反應溫度或所述溫度以下進行退火,雖然這樣的步驟對于擴增反應并非必不可少的。如果用RNA作為本發(fā)明檢測方法中的模板,則可以用一個步驟進行逆轉錄反應和核酸擴增反應。雖然并不打算限制本發(fā)明,但是例如可以優(yōu)選使用AMVRTase、MMLVRTase或RAV-2RTase與BcaDNA聚合酶的組合,作為逆轉錄酶和鏈置換型DNA聚合酶的組合。或者,可以使用一種具有逆轉錄酶活性和鏈置換活性的DNA聚合酶。本發(fā)明的檢測靶核酸的方法可以通過從含靶核酸的樣品中直接擴增靶核酸來進行。在這種情況下,待擴增的靶核酸的鏈長并不限于特定長度。例如,200bp或更短的區(qū)、優(yōu)選150bp或更短的區(qū)對于靶核酸的靈敏檢測是有效的。通過設計本發(fā)明的嵌合寡核苷酸引物以產生上述待擴增的鏈長,可以高靈敏度地檢測樣品中的靶核酸。另外,使用含有Bicine、Tricine、HEPES、磷酸鹽或tris作為緩沖組分的反應緩沖液以及含有亞精胺或丙二胺的退火溶液,用本發(fā)明的檢測方法,甚至從微量核酸樣品中也可以以較高的靈敏度檢測靶核酸。在這種情況下,所使用的內切核酸酶和DNA聚合酶并不限于具體的內切核酸酶和DNA聚合酶。例如,優(yōu)選得自大腸桿菌、熱球菌屬細菌或古生球菌屬細菌的RNA酶H和BcaBESTDNA聚合酶的組合。認為內切核酸酶和DNA聚合酶的優(yōu)選單位可以隨所述酶的類型而變。在這樣一種情況下,所述緩沖液的組成和所述酶的加入量可以用檢測靈敏度或者擴增產物量的增加作為指標來加以調節(jié)。在其中使用雙鏈DNA作為模板和使用兩種嵌合寡核苷酸引物的核酸擴增法的該方面,在從所述引物產生由合成的相互退火的引物-延伸鏈組成的雙鏈核酸的延伸反應期間,可以在模板-延伸鏈中間體中發(fā)生模板轉換,雖然模板轉換取決于反應條件等。所述雙鏈核酸在兩個末端均具有嵌合寡核苷酸引物。然后,可以再從兩端起始包括鏈置換的延伸互補鏈的反應。作為所述反應的結果,產生在一端具有引物序列的擴增產物。此外,如果模板轉換發(fā)生在所述反應期間,則又產生與上述相似的雙鏈核酸??梢砸勒毡景l(fā)明利用一種擴增核酸的方法,所述方法包括用上述具有鏈置換活性的DNA聚合酶進行模板轉換反應。例如,缺乏5’→3’外切核酸酶活性的BcaDNA聚合酶的變異型酶,優(yōu)選具體用作能夠在鏈置換反應期間實現(xiàn)模板轉換反應的DNA聚合酶。這樣一種酶在市場上可作為BcaBESTDNA聚合酶(TakaraShuzo)獲得。它也可以依照日本專利2978001號中所述的方法,從含有所述酶的基因的大腸桿菌HB101/pUI205(FERMBP-3720)制備。大腸桿菌HB101/pUI205(FERMBP-3720)從1991年5月10日(原始保藏日)起保藏于獨立行政法人產業(yè)技術綜合研究所特許生物寄托中心(InternationalPatentOrganismDepositary,NationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology,AISTTsukubaCentral6,1-1,Higashil-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki305-8566,Japan)。在本發(fā)明的檢測法中,可以在靶核酸擴增期間將dUTP作為底物摻入。因此,如果用dUTP作為底物,則有可能通過用尿嘧啶N-糖苷酶(UNG)降解擴增產物,而防止由于擴增產物的夾帶物污染所致的假陽性。依照本發(fā)明的檢測法,可以用已知的核酸檢測方法來檢測用上述核酸擴增法擴增的靶核酸。這類方法的實例包括通過電泳檢測具有特定大小的反應產物、以及通過與探針雜交的檢測。此外,可以優(yōu)選使用其中結合使用磁珠等的檢測方法。在經電泳檢測中,通常使用熒光物質,例如溴化乙錠。與探針的雜交可以與通過電泳檢測相結合。所述探針可以用放射性同位素或非放射性物質如生物素或熒光物質來標記。另外,在步驟(b)中使用標記核苷酸,可以有助于檢測摻入了標記核苷酸的擴增產物,或者可以增強供利用所述標記檢測用的信號。也可以用熒光偏振法、熒光能量轉移等來進行檢測。通過構建合適的檢測系統(tǒng),可以自動檢測或定量測定靶核酸。另外,可以優(yōu)選使用通過混合式層析法(hybridchromatographymethod)的肉眼檢測。在本發(fā)明的檢測方法中,可以使用核糖核苷酸(RNA)探針或由核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸組成的嵌合寡核苷酸探針,所述探針用以導致猝滅狀態(tài)的距離定位的兩種或更多種熒光物質標記。所述探針不發(fā)射熒光。當它退火到從與所述探針互補的靶核酸擴增的DNA上時,RNA酶H則消化所述探針。所述探針上熒光物質之間的距離則增加,導致發(fā)射熒光。因此,所述發(fā)射顯示出存在靶核酸。如果在本發(fā)明的擴增核酸的方法中使用RNA酶H,則僅通過加入所述探針至反應混合物中,就可以檢測靶核酸。例如,可以優(yōu)選使用熒光物質6-羧基熒光素(6-FAM)和N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)的組合,來標記所述探針。用于本發(fā)明檢測方法的等溫擴增法并不需要使用諸如熱循環(huán)儀之類的設備。在本發(fā)明的擴增法中所使用的引物數(shù)可以是一種或兩種,這低于常規(guī)方法中所用的引物數(shù)。由于PCR所使用的諸如dNTP等之類的試劑可以應用于本發(fā)明的所述方法中,所以與常規(guī)方法相比,操作費用可以降低。因此,本發(fā)明的所述方法可以優(yōu)選用于例如常規(guī)進行檢測的遺傳檢驗領域。本發(fā)明的所述方法在比PCR更短的時間內提供更大量的擴增產物。因而,本發(fā)明的方法可以用作便捷、快速和靈敏的檢測基因的方法。當使用本發(fā)明的檢測方法時,可以結合使用使得反應系統(tǒng)小且提高集成程度的裝置,以便分析大量的試樣。其中通過應用最近的超精細加工技術將本發(fā)明檢測方法的基本過程(例如從細胞提取DNA、核酸擴增反應、目標DNA的檢測等)集成到幾平方厘米至指尖大小的微芯片上的系統(tǒng)可以結合使用作為這樣的裝置。此外,可以任選地結合包括凝膠電泳或毛細管電泳的過程或者與檢測探針的雜交。這樣一種系統(tǒng)被稱為微芯片-CE(毛細管電泳)微芯片或納米芯片。任何核酸擴增反應都可以用于所述系統(tǒng),只要目標DNA片段使用所述方法來擴增。雖然并不打算限制本發(fā)明,但是例如可以優(yōu)選使用可以用來在等溫條件下擴增核酸的方法,例如ICAN法。由于聯(lián)合使用這樣一種方法可以簡化所述系統(tǒng),因而所述方法非常適用于如上所述的集成系統(tǒng)。利用本發(fā)明的技術,可以構建更高度集成的系統(tǒng)。雖然并不打算限制本發(fā)明,但是例如可以依照本發(fā)明的檢測方法優(yōu)選使用以下嵌合寡核苷酸引物用于檢測結核分枝桿菌復合體、具有SEQIDNO13-16中任一個所示的核苷酸序列的嵌合寡核苷酸引物;用于檢測淋病球菌、具有SEQIDNO28或29所示的核苷酸序列的嵌合寡核苷酸引物;用于檢測衣原體、具有SEQIDNO23-26中任一個所示的核苷酸序列的嵌合寡核苷酸引物;或用于檢測HCV、具有SEQIDNO30或31所示的核苷酸序列的嵌合寡核苷酸引物。目標擴增產物可以通過用這樣一種嵌合寡核苷酸引物擴增樣品中的靶核酸、然后電泳或實時檢測來證實。此外,靶核酸可以用以下探針,依照本發(fā)明的檢測方法來檢測用于檢測結核分枝桿菌復合體、從含有SEQIDNO11、12和38-40中任一個所示的核苷酸序列的區(qū)中選擇的探針;用于檢測淋病球菌、從含有SEQIDNO27所示的核苷酸序列的區(qū)中選擇的探針;用于檢測衣原體、從含有SEQIDNO22或44所示的核苷酸序列的區(qū)中選擇的探針;或用于檢測HCV、從含有SEQIDNO43-45中任一個所示的核苷酸序列的區(qū)中選擇的探針。如果在本發(fā)明的所述方法中使用等溫核酸擴增法,則僅需要一個恒溫水浴作為反應設備,并且無需諸如熱循環(huán)儀之類的精密設備??梢杂檬惺鄣姆止夤舛扔?、熒光檢測器、平板讀出儀等作為用于測量熒光信號的設備。因此,有可能對大量試樣快速進行測量,而取代常規(guī)的檢驗工作。本發(fā)明的所述方法所必需的試劑也是市售的。用本發(fā)明的所述方法如下檢測HCV制備一種含有以下成分的混合物依照常規(guī)方法從試樣中提取的HCVRNA、逆轉錄反應的引物、逆轉錄酶(如果使用具有逆轉錄活性的DNA聚合酶,則不需要逆轉錄酶)和dNTP(包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP);用從所述HCVRNA產生的cDNA作為模板,使用所述嵌合寡核苷酸引物和用于ICAN的DNA聚合酶,在恒溫下擴增靶核酸;在均相系統(tǒng)中進行擴增產物與熒光標記探針的雜交;并且測量熒光強度。在以下實施例中詳細描述所述反應的具體條件。在所述反應中,首先從作為模板的HCV-RNA合成cDNA,然后用所述cDNA作為模板,用ICAN法進行DNA擴增。由于所擴增的DNA含有與熒光探針互補的一個區(qū),因此熒光探針與所述單鏈擴增DNA雜交。熒光探針的雜交,消除了對熒光強度的抑制,導致熒光強度增加。另一方面,如果樣品不含HCVRNA,則不發(fā)生雜交,那么熒光強度仍受抑制,熒光強度弱。因此,通過測量熒光強度,可以便捷、快速而高特異性地檢測樣品中的HCVRNA。依照本發(fā)明的所述方法,基于均相系統(tǒng)中的熒光強度,檢測HCVRNA,而無需洗滌步驟。本發(fā)明的優(yōu)勢在于它可以通過改變熒光染料和測量波長而處理多個項目的同時測量。具體地說,除HCV之外,HBV、HIV和HTLV也是血液中心的重要檢測項目。采用ICAN引物和相應項目特異性的探針,并且用具有不同測量波長的熒光染料標記所述探針,可以同時對所述項目進行測量。反應終點時熒光強度的測量,使得能夠靈敏且定量測量大量的試樣,例如在血液中心。另一方面,反應的動態(tài)熒光測量使得能夠定量測定以便監(jiān)測治療。因此,本發(fā)明的所述方法非常便捷,因為它不需要復雜而專門的設備來進行常規(guī)RT-PCR法所需的上下調節(jié)溫度,它改進了大量試樣不能在有限時間和裝備下測量的不便之處,并且不需要洗滌步驟。(3)本發(fā)明的引物嵌合寡核苷酸引物是本發(fā)明檢測方法所用的引物的例子。使用由脫氧核糖核苷酸、核苷酸類似物或者未經修飾或經修飾的核糖核苷酸組成并且所述核糖核苷酸定位于引物3’端或3’端一側的引物作為所述引物。例如,可以用具有以下通式所示結構的寡核苷酸作為ICAN法的引物通式5’-dNa-Nb-dNc-3’(a11或11以上的整數(shù);b1或1以上的整數(shù);c0或者1或1以上的整數(shù);dN脫氧核糖核苷酸和/或核苷酸類似物;N未經修飾的核糖核苷酸和/或經修飾的核糖核苷酸,其中dNa中的某些dN可以被N取代)。例如,脫氧核糖核肌核苷酸、脫氧核糖尿嘧啶核苷酸、經修飾的脫氧核糖核苷酸等可以用作核苷酸類似物,而(α-S)核糖核苷酸可以用作經修飾的核糖核苷酸?;谀0迳闲枰獢U增的區(qū)的5’和3’核苷酸序列,制備兩種引物(一種具有與5’核苷酸序列同源的序列,而另一種具有與3’核苷酸序列互補的序列),并將其用于擴增。例如,通過依照上述方法,用待檢測結核分枝桿菌復合體樣品進行核酸擴增反應,然后進行擴增產物和本發(fā)明探針之間的雜交,可以依照本發(fā)明檢測結核分枝桿菌復合體??梢詤⒖嫉米越Y核分枝桿菌復合體的如SEQIDNO12所示的IS6110基因的核苷酸序列,設計和制備核酸擴增的引物,使得它適用于各種核酸擴增法。雖然并不打算限制本發(fā)明,但是可以用來擴增IS6110基因以下區(qū)的引物優(yōu)選用于本發(fā)明例如含有SEQIDNO39的核苷酸序列或其部分的區(qū);優(yōu)選含有SEQIDNO40的核苷酸序列或其部分的區(qū);更優(yōu)選含有SEQIDNO38的核苷酸序列或其部分的區(qū)。另外,優(yōu)選可以用來擴增含SEQIDNO11的核苷酸序列的區(qū)的引物。此外,通過用GenBank基因數(shù)據(jù)庫分析先前所報道的結核分枝桿菌復合體IS6110的核苷酸序列的多態(tài)性,并且進行搜索,包括搜索與結核分枝桿菌復合體IS6110同源的相關序列,可以采用所獲得的本發(fā)明的引物,優(yōu)選使用具有SEQIDNO36或37的核苷酸序列的核酸擴增引物,進行高靈敏度的定量核酸擴增。這樣一種引物可用于采用各種核酸擴增法擴增得自結核分枝桿菌復合體的IS6110基因或其片段。與如上所述的結核分枝桿菌復合體的檢測一樣,可以適當?shù)厥褂锰结樅颓逗瞎押塑账嵋?,依照本發(fā)明來檢測淋病球菌、衣原體或HCV。所述引物不限于具有上述核苷酸序列的引物。按照本發(fā)明,可以優(yōu)選使用具有所述核苷酸序列周圍的序列(即與所述序列部分重疊的序列)的引物。通過根據(jù)所用的核酸擴增法的特征,適當?shù)剡x擇與所述序列重疊的核苷酸序列,可以制備引物。采用例如得自AppliedBiosystemsInc.(ABI)的394型DNA合成儀,依照亞磷酰胺法,可以合成具有所需核苷酸序列的嵌合寡核苷酸引物。或者,可以用任何方法,包括磷酸三酯法、H-膦酸酯法和硫代膦酸酯法,合成所述嵌合寡核苷酸引物??梢允褂靡?’端部分中的脫氧核糖核苷酸被核糖核苷酸取代、使得可以用于ICAN法的引物,作為使用ICAN法的核酸擴增引物。這類引物的實例包括分別具有SEQIDNO13-16、23-26和28-31中任一核苷酸序列的嵌合寡核苷酸引物。所述引物可以用適當?shù)奈镔|標記,所述物質例如熒光物質、染料、配體(生物素、洋地黃毒苷等)或膠體金。例如,通過在支持體上捕獲用以配體標記的引物所擴增的靶核酸,提供了一種靈敏、便捷的定量測量法。在這種情況下,微量滴定板、微珠、磁珠、膜和玻璃是示例性的固相。從痰試樣提取的DNA樣品可能含有來源于除人類DNA之外的呼吸道固有細菌或病毒的DNA。那么,用得自從未感染過結核分枝桿菌復合體的志愿者的痰作為試樣,檢驗得自結核分枝桿菌復合體的基因的擴增,以便檢查依照本發(fā)明研制的引物的特異性。無陽性,導致這樣的檢驗可以證明所述引物的特異性。采用所述嵌合寡核苷酸引物,通過ICAN法,進行從收集于38位志愿者的痰提取的每種DNA的IS6110基因片段的擴增。結果沒有觀察到陽性結果,證明所述引物對于結核分枝桿菌復合體的特異性高,并且從非IS6110靶DNA中沒有獲得假陽性結果。(4)本發(fā)明的組合物本發(fā)明提供一種用于以上(2)中所述的本發(fā)明檢測法的組合物。所述組合物的實例包括含有以上(1)中所述探針和以上(3)中所述引物的組合物。另一方面,所述組合物可以采用包含含所述探針的檢測用組合物和含所述引物的擴增用組合物的形式。所述組合物可以采用包含含乙酸鎂的組合物和含所述引物的組合物的形式。所述組合物可以含有緩沖組分、dNTP等。它可以含有經修飾的脫氧核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸三磷酸類似物。此外,它可以含有用于檢驗由于降解、失活等所致的本發(fā)明組合物中試劑擴增失敗(假陰性)的內部對照(IC)。所述內部對照可以用本發(fā)明的引物來擴增。含有適當濃度的上述各種組分的用于本發(fā)明檢測方法的組合物是另一實施方案的例子。擴增反應可以僅通過加入合適的模板和對于這種組合物合適的嵌合寡核苷酸引物來進行。如果擴增的對象是事先已知,則優(yōu)選含有適合于擴增所述對象的嵌合寡核苷酸引物的組合物。含有適合于本發(fā)明核酸擴增法的濃度的上述各種組分的組合物是一個特別優(yōu)選的實施方案的例子??梢詢H通過加入合適的模板至這樣的組合物中,進行擴增反應。如果所述組合物含有檢測探針,則可以以實時方式檢測來源于致病微生物的靶核酸。雖然并不打算限制本發(fā)明,但是例如通過用本發(fā)明的所述方法或用于所述方法的組合物或試劑盒來檢測HCV,與常規(guī)AmplicorHCV試劑盒(兩個數(shù)量級)相比,可以使測量范圍更寬,高至3個數(shù)量級。此外,與常規(guī)AmplicorHCV試劑盒所需的約5小時的總時間相比,依照本發(fā)明可以將總時間大大縮短至約45分鐘。因此,可以增加可以在一天內處理的試樣數(shù)。(5)本發(fā)明的試劑盒本發(fā)明的試劑盒是用于檢測得自致病微生物的靶核酸的試劑盒。雖然并不打算限制本發(fā)明,但是它含有可以在pH高于7的堿性條件下與靶核酸雜交的探針,例如以上(1)中所述的探針。用于檢測結核分枝桿菌復合體的試劑盒是本發(fā)明試劑盒的一個實施方案的例子。所述試劑盒含有可以用來特異性檢測結核分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌和/或Mycobacteriumcanetti的探針。所述試劑盒可以用來在pH高于7的堿性條件下檢測結核分枝桿菌復合體。用于檢測淋病球菌的試劑盒是本發(fā)明試劑盒的一個實施方案的例子。所述試劑盒含有可以用來特異性檢測淋病奈瑟氏球菌的探針。所述試劑盒可以用來在pH高于7的堿性條件下檢測淋病球菌。用于檢測衣原體的試劑盒是本發(fā)明試劑盒的一個實施方案的例子。所述試劑盒含有可以用來特異性檢測沙眼衣原體的探針。所述試劑盒可以用來在pH高于7的堿性條件下檢測衣原體。用于檢測HCV的試劑盒是本發(fā)明試劑盒的一個實施方案的例子。所述試劑盒含有可以用來特異性檢測HCV的探針。所述試劑盒可以用來在pH高于7的堿性條件下檢測HCV。在另一實施方案中,所述試劑盒可以含有一種引物。所述試劑盒可以含有用于擴增靶基因的核酸擴增法的試劑(例如DNA聚合酶)、用于檢測探針反應的試劑、用于從試樣提取核酸的試劑等。這樣一種試劑盒優(yōu)選用于便捷快速地進行本發(fā)明的檢測結核分枝桿菌復合體等的方法。特別是,在檢查大量樣品中結核分枝桿菌復合體等存在時,所述試劑盒可以用來高度再現(xiàn)性和可靠性地提供試驗結果。此外,所述試劑盒可以含有用于檢驗假陰性的內部對照(IC)和用于檢測所述內部對照的探針。所述內部對照可以用本發(fā)明的所述引物來擴增。在一個實施方案中,所述試劑盒采用包裝形式,帶有關于依照本發(fā)明使用探針、引物、DNA聚合酶和內切核酸酶的說明??梢赃x擇市售的DNA聚合酶和/或內切核酸酶,并且依照本發(fā)明使用。另外,所述試劑盒可以含有當用RNA作為模板時所使用的逆轉錄反應的試劑。所述DNA聚合酶可以選自上述的DNA聚合酶。所述內切核酸酶可以選自PfuRNA酶HII或AfuRNA酶HII?!罢f明”是描述所述試劑盒使用方法的印刷品,例如說明制備用于鏈置換反應的試劑溶液的方法、建議的反應條件等。所述說明包括小冊子或傳單形式的說明手冊、粘貼到試劑盒上的標簽和含所述試劑盒的包裝表面上的說明。所述說明也包括通過電子媒介例如Internet公開或提供的信息。本發(fā)明的試劑盒還可以含有含Bicine、Tricine、HEPES、磷酸鹽或tris作為緩沖成分的反應緩沖液和退火溶液。另外,它可以含有DNA聚合酶和RNA酶H。此外,所述試劑盒可以含有經修飾的脫氧核糖核苷酸或脫氧核苷酸三磷酸類似物。通過適當選擇本發(fā)明試劑盒所用的檢測探針,提供可以用來檢測得自致病微生物的靶核酸的試劑盒。(6)本發(fā)明的核酸提取方法本發(fā)明提供一種用于提取核酸的方法,所述方法可用來高度靈敏地檢測結核分枝桿菌復合體等。從臨床樣本中提取核酸是一個精密而繁瑣的程序。所述程序的對象范圍寬泛,包括液體試樣(尿液、胸膜液、脊髓液、血液等)、粘稠的試樣(膿、痰等)、細胞和組織。目前,對于從這樣的試樣中提取結核分枝桿菌復合體等的基因沒有標準方法。因此,迄今在關于結核分枝桿菌復合體等的遺傳檢驗的報道中,使用各種核酸提取方法。在常規(guī)方法中,在含有去垢劑、堿、有機溶劑或離液劑的溶液中進行混合,或者在有玻璃珠的情況下進行超聲處理。本發(fā)明人比較了上述各種常規(guī)方法與其中對結核分枝桿菌復合體使用胞壁質酶(一種來源于一種放線菌-球孢鏈霉菌(Streptomycesglobisporus)的胞壁質酶由Sigma出售,名稱為變溶菌素),胞壁質酶已經用于從屬于李斯特氏菌屬(Listeria)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和鏈球菌屬(Streptococcus)的微生物中提取核酸。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn),其中用胞壁質酶消化結核分枝桿菌復合體的方法最好。此外,本發(fā)明人發(fā)現(xiàn),通過將用所述酶消化過的細胞煮沸5分鐘,可以獲得更好的結果。檢查了通過下述步驟對結核分枝桿菌復合體的檢測用胞壁質酶處理含結核分枝桿菌復合體的樣品達30分鐘,然后于96℃處理5分鐘,用ICAN法擴增基因。結果,意外地發(fā)現(xiàn),可以以10倍于使用諸如去垢劑的試劑的常規(guī)方法的靈敏度,檢測得自結核分枝桿菌復合體的DNA。這種檢測靈敏度相當于5個拷貝的結核分枝桿菌復合體基因組。上述順序檢測程序可以排除依照使用去垢劑或離液劑的常規(guī)方法可能污染核酸提取物的組分對核酸擴增反應的抑制效應。此外,加熱步驟達到將結核分枝桿菌復合體等滅菌的效果。因而,所述方法的優(yōu)勢在于它提供防止實驗室中對于檢驗人員已成為麻煩的結核分枝桿菌復合體等感染的效應。因此,采用本發(fā)明的方案,可以快速、安全而高度靈敏地從結核分枝桿菌復合體等中提取DNA。例如,如果用痰作為樣品,則最好首先依照已知用于加工痰的NALC(N-乙酰-L-半胱氨酸)-NaOH法加工痰,然后進行上述本發(fā)明的核酸提取方法。本發(fā)明的檢測方法可以包括用胞壁質酶處理含有結核分枝桿菌復合體等的試樣以提取核酸的步驟。包括探針、引物、核酸提取方法和核酸擴增法在內的用于本發(fā)明檢測方法的完整方案,使得能夠非??焖佟⒖煽慷叨褥`敏地檢測結核分枝桿菌復合體等。使用所述方法在3小時內完成從收集試樣到報道結果的程序是可能的。檢驗所需的時間與常規(guī)試劑盒(例如得自Roche的試劑盒)所需的時間(6小時)相比減少一半。因此,本發(fā)明的所述方法使得能夠在當天提供檢驗結果并且立即隔離受感染的患者,并且從公眾健康的角度來看,由于早期防止結核病的傳播,對社會作出更多的貢獻。以下實施例更詳細地說明本發(fā)明,但不應解釋為限制本發(fā)明的范圍。另外,本領域技術人員通過根據(jù)本發(fā)明進行類推,可以容易地在防止擴增產物夾帶物污染方面作出改進,以及作出同時擴增和檢測另一結核分枝桿菌復合體基因等的內部對照的改進。實施例以下實施例進一步詳細描述本發(fā)明,但不應解釋為限制本發(fā)明的范圍。參比實施例1激烈熱球菌(Pyrococcusfuriosus)RNA酶HII基因的克隆(1)從激烈熱球菌制備基因組DNA將含有1%胰蛋白胨(DifcoLaboratories)、0.5%酵母膏(DifcoLaboratories)、1%可溶性淀粉(NacalaiTesque)、3.5%JamarineSSolid(JamarineLaboratory)、0.5%JamarineSLiquid(JamarineLaboratory)、0.003%MgSO4、0.001%NaCl、0.0001%FeSO4·7H2O、0.0001%CoSO4、0.0001%CaCl2·7H2O、0.0001%ZnSO4、0.1ppmCuSO4·5H2O、0.1ppmKAl(SO4)2、0.1ppmH3BO4、0.1ppmNa2MoO4·2H2O和0.25ppmNiCl2·6H2O的2L培養(yǎng)基置于2L培養(yǎng)瓶中,于120℃滅菌20分鐘,通入氮氣,以除去溶解氧,然后在培養(yǎng)基中接種激烈熱球菌(從DeutscheSammlungvonMikroorganismen(德意志微生物保藏中心)購買;DSM3638),于95℃不振蕩培養(yǎng)16小時。培養(yǎng)后,通過離心收集細胞。然后將所得細胞懸浮于4ml25%蔗糖、50mMtris-HCl緩沖液(pH8.0)中。向其中加入0.4ml10mg/ml氯化溶菌酶(lysozymechloride)(NacalaiTesque)的水溶液。讓混合物于20℃反應1小時。反應后,向反應混合物中加入含有150mMNaCl、1mMEDTA和20mMtris-HCl(pH8.0)的24ml混合物、0.2ml20mg/ml蛋白酶K(TakaraShuzo)和2ml10%十二烷基硫酸鈉水溶液。將混合物于37℃溫育1小時。反應后,混合物經過苯酚-氯仿抽提,然后乙醇沉淀,制備約1mg基因組DNA。(2)RNA酶HII基因的克隆Pyrococcushorkioshii的完整基因組序列已經發(fā)表[DNAResearch,555-76(1998)]。已知在基因組中存在一個編碼RNA酶HII同源物的基因(PH1650)(SEQIDNO1,NationalInstituteofTechnologyandEvaluationhttp//www.nite.go.jp/的主頁)。搜索了PH1650基因(SEQIDNO1)和激烈熱球菌的部分發(fā)表的基因組序列(UniversityofUtah,UtahGenomeCenterhttp//www.genome.utah.edu/sequence.html的主頁)之間的同源性。結果,發(fā)現(xiàn)一個高度同源的序列。根據(jù)所述同源序列,合成引物1650Nde(SEQIDNO2)和1650Bam(SEQIDNO3)。用在(1)中獲得的200ng激烈熱球菌基因組DNA作為模板,用20pmol1650Nde和20pmol1650Bam作為引物,在100μl體積中進行PCR。用TaKaRaExTaq(TakaraShuzo)作為DNA聚合酶,按照所附的方案進行PCR。如下進行PCR94℃30秒、55℃30秒和72℃1分鐘,進行30個循環(huán)。約0.7kb的擴增DNA片段用NdeI和BamHI(都得自TakaraShuzo)消化。將所得的DNA片段插入到質粒載體pET3a(Novagen)的NdeI位點和BamHI位點之間,制備質粒pPFU220。(3)含RNA酶HII基因的DNA片段的核苷酸序列的測定按照雙脫氧法,測定在(2)中獲得的插入到pPFU220中的所述DNA片段的核苷酸序列。所測定的核苷酸序列的分析揭示出存在一個推定編碼RNA酶HII的可讀框(ORF)。所述可讀框的核苷酸序列示于SEQIDNO4中。從所述核苷酸序列導出的RNA酶HII的氨基酸序列示于SEQIDNO5中。用質粒pPFU220轉化的大腸桿菌JM109被命名和指定為大腸桿菌JM109/pPFU220,并且于2000年9月5日(原始保藏日)保藏于獨立行政法人產業(yè)技術綜合研究所特許生物寄托中心(IntemationalPatentOrganismDepositary,NationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology),AISTTsukubaCentral6,1-1,Higashi1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki305-8566,Japan,保藏號為FERMP-18020,并且根據(jù)布達佩斯條約在獨立行政法人產業(yè)技術綜合研究所特許生物寄托中心于2001年7月9日(轉至國際保藏單位的日期)轉為保藏號FERMBP-7654。(4)經純化的RNA酶HII制劑的制備用(2)中獲得的pPFU220轉化大腸桿菌HMS174(DE3)(Novagen)。將所得的帶有pPFU220的大腸桿菌HMS174(DE3)接種到含有100μg/ml氨芐青霉素的2LLB培養(yǎng)基中,于37℃振蕩培養(yǎng)16小時。培養(yǎng)后,將經離心收集的細胞懸浮于66.0ml超聲處理緩沖液[50mMtris-HCl(pH8.0)、1mMEDTA、2mM苯基甲磺酰氟]中,進行超聲處理。將通過超聲處理懸浮液以12,000rpm離心10分鐘而獲得的上清液于60℃加熱15分鐘。然后再次以12,000rpm離心10分鐘,以收集上清液。從而獲得61.5ml熱處理上清液。將所述熱處理上清液經過用緩沖液A[50mMtris-HCl(pH8.0)、1mMEDTA]平衡的RESOURSEQ柱(AmershamPharmaciaBiotech),用FPLC系統(tǒng)(AmershamPharmaciaBiotech)進行色譜分離。結果,RNA酶HII流過RESOURSEQ柱。將60.0ml所述流通RNA酶HII流分經過用緩沖液A平衡的RESOURSES柱(AmershamPharmaciaBiotech),用FPLC系統(tǒng),以0-500mMNaCl線性梯度洗脫。獲得用約150mMNaCl洗脫出的含RNA酶HII的流分。用Centricon-10(Amicon),通過超濾濃縮2.0ml所述RNA酶HII流分。將250μl所述濃縮液經過用含有100mMNaCl和0.1mMEDTA的50mMtris-HCl(pH8.0)平衡的Superdex200凝膠過濾柱(AmershamPharmaciaBiotech),用同一種緩沖液洗脫。結果,RNA酶HII在相當于17千道爾頓分子量的位置洗脫出來。這一分子量對應于單體形式的RNA酶HII的分子量。將如此洗脫出的RNA酶HII用作PfuRNA酶HII制劑。如下測定如此獲得的PfuRNA酶HII制劑的RNA酶H活性。將10mMtris-HCl(pH8.0)、1mM二硫蘇糖醇(NacalaiTesque)、0.003%牛血清白蛋白(fractionV,Sigma)、4%甘油、20μg/mlpoly(dT)(AmershamPharmaciaBiotech)和30μg/mlpoly(rA)(AmershamPharmaciaBiotech)混合在一起。讓混合物于37℃保溫10分鐘,用作供測量RNA酶H活性用的底物溶液。加入1μl1MMnCl2至100μl底物溶液中。讓混合物于40℃保溫。加入適當稀釋的PfuRNA酶HII制劑至所述混合物中,以起始反應。于40℃反應30分鐘后,向其中加入10μl0.5MEDTA以終止反應。然后測量260nm的吸光度。結果,加入PfuRNA酶HII制劑的反應混合物的260nm吸光度高于用在加入PfuRNA酶HII制劑之前加入10μl0.5MEDTA的反應混合物觀測到的吸光度。因此,表明該制劑具有RNA酶H活性。參比實施例2AfuRNA酶HII的制備得自閃爍古生球菌(Archaeoglobusfulgidus)的RNA酶HII基因的克隆(1)從閃爍古生球菌制備基因組DNA將從8ml培養(yǎng)物收集的閃爍古生球菌(從德意志微生物和細胞保藏中心購買;DSM4139)細胞懸浮于100μl25%蔗糖、50mMtris-HCl(pH8.0)中。向其中加入20μl0.5MEDTA和10μl10mg/ml氯化溶菌酶(NacalaiTesque)的水溶液。讓混合物于20℃反應1小時。反應后,向反應混合物中加入含有150mMNaCl、1mMEDTA和20mMtris-HCl(pH8.0)的800μl混合物、10μl20mg/ml蛋白酶K(TakaraShuzo)和50μl10%十二烷基硫酸鈉水溶液。將混合物于37℃溫育1小時。反應后,混合物經過苯酚-氯仿抽提,然后乙醇沉淀并風干,然后溶于50μlTE中,獲得基因組DNA溶液。(2)RNA酶HII基因的克隆閃爍古生球菌的完整基因組序列已經發(fā)表[Klenk,HP等,Nature,390364-370(1997)]。已知存在一個編碼RNA酶HII同源物的基因(AF0621)(SEQIDNO6,http//www.tigr.org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage.htlm)。根據(jù)AF0621基因(SEQIDNO6)的序列,合成引物AfuNde(SEQIDNO7)和AfuBam(SEQIDNO8)。用(1)中制備的30ng閃爍古生球菌基因組DNA作為模板,用AfuNde和AfuBam各20pmol作為引物,在100μl體積中進行PCR。用PyrobestDNA聚合酶(TakaraShuzo)作為DNA聚合酶,按照所附的方案進行PCR。如下進行PCR94℃30秒、55℃30秒和72℃1分鐘,進行40個循環(huán)。約0.6kb擴增DNA片段用NdeI和BamHI(都得自TakaraShuzo)消化。然后通過將所得的DNA片段加入到質粒載體pTV119Nd(一種其中pTV119N的NcoI位點被轉變?yōu)镹deI位點的質粒)的NdeI位點和BamHI位點之間,構建質粒pAFU204。(3)含RNA酶HII基因的DNA片段的核苷酸序列的測定按照雙脫氧法,測定在(2)中獲得的插入到pAFU204中的所述DNA片段的核苷酸序列。所測定的核苷酸序列的分析揭示出一個推定編碼RNA酶HII的可讀框。所述可讀框的核苷酸序列示于SEQIDNO9中。從所述核苷酸序列導出的RNA酶HII的氨基酸序列示于SEQIDNO10中。用質粒pAFU204轉化的大腸桿菌JM109被命名和指定為大腸桿菌JM109/pAFU204,并且于2001年2月22日(原始保藏日)保藏于獨立行政法人產業(yè)技術綜合研究所特許生物寄托中心(IntemationalPatentOrganismDepositary,NationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology),AISTTsukubaCentral6,1-1,Higashi1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki305-8566,Japan,保藏號為FERMP-18221,并且根據(jù)布達佩斯條約在獨立行政法人產業(yè)技術綜合研究所特許生物寄托中心于2001年7月9日(轉至國際保藏單位的日期)轉為保藏號FERMBP-7691。(4)經純化的RNA酶HII制劑的制備用(2)中獲得的pAFU204轉化大腸桿菌JM109。將所得的帶有pAFU204的大腸桿菌JM109接種到含有100μg/ml氨芐青霉素的2LLB培養(yǎng)基中,于37℃振蕩培養(yǎng)16小時。培養(yǎng)后,將經離心收集的細胞懸浮于37.1ml超聲處理緩沖液[50mMtris-HCl(pH8.0)、1mMEDTA、2mM苯基甲磺酰氟]中,進行超聲處理。將通過超聲處理懸浮液以12,000rpm離心10分鐘而獲得的上清液于70℃加熱15分鐘。然后再次以12,000rpm離心10分鐘,以收集上清液。從而獲得40.3ml熱處理上清液。將所述熱處理上清液經過用緩沖液A[50mMtris-HCl(pH8.0)、1mMEDTA]平衡的RESOURSEQ柱(AmershamPharmaciaBiotech),用FPLC系統(tǒng)(AmershamPharmaciaBiotech)進行色譜分離。結果,RNA酶HII流過RESOURSEQ柱。所述流通RNA酶HII流分經過用緩沖液A平衡的RESOURSES柱(AmershamPharmaciaBiotech),用FPLC系統(tǒng)(AmershamPharmaciaBiotech)進行色譜分離。結果,RNA酶HII流過所述RESOURSES柱。將40.0ml所述流通RNA酶HII流分用2L含有50mMNaCl的緩沖液B[50mMtris-HCl(pH7.0)、1mMEDTA]透析2小時。再重復透析2次。將40.2ml透析過的酶溶液經過用含有50mMNaCl的緩沖液B平衡的HiTrap-肝素柱(AmershamPharmaciaBiotech),用FPLC系統(tǒng),以50-550mMNaCl線性梯度洗脫。結果,獲得用約240mMNaCl洗脫出的含RNA酶HII的流分。用Centricon-10(Amicon),通過超濾濃縮7.8ml所述RNA酶HII流分。將從約600μl所述濃縮液分離出的4個部分分別經過用含有100mMNaCl和0.1mMEDTA的50mMtris-HCl(pH7.0)平衡的Superose6凝膠過濾柱(AmershamPharmaciaBiotech),用同一種緩沖液洗脫。結果,RNA酶HII在相當于30.0千道爾頓分子量的位置洗脫出來。這一分子量對應于單體形式的RNA酶HII的分子量。將如上所述洗脫出的RNA酶HII用作AfuRNA酶HII制劑。按照參比實施例1-(4)中所述的方法,測定如此獲得的AfuRNA酶HII制劑的酶活性。結果,觀察到所述AfuRNA酶HII制劑的RNA酶H活性。如下計算本發(fā)明所述方法中所用的耐熱性RNA酶H的單位值。將1mgpoly(rA)或poly(dT)(都得自AmershamPharmaciaBiotech)溶于含有1mMEDTA的1ml40mMtris-HCl(pH7.7)中,制備poly(rA)溶液和poly(dT)溶液。然后加入poly(rA)溶液(至終濃度為20μg/ml)和poly(dT)溶液(至終濃度為30μg/ml)至含有4mMMgCl2、1mMDTT、0.003%BSA和4%甘油的40mMtris-HCl(pH7.7)中。讓混合物于37℃反應10分鐘,然后冷卻至4℃,制備poly(rA)-poly(dT)溶液。加入1μl適當稀釋的酶溶液至100μl所述poly(rA)-poly(dT)溶液中。讓混合物于40℃反應10分鐘。向其中加入10μl0.5MEDTA,以終止反應。然后測量260nm的吸光度。作為對照,加入10μl0.5MEDTA至反應混合物中,讓所得混合物于40℃反應10分鐘,然后測量吸光度。通過從無EDTA時反應物的吸光度中減去對照的吸光度,獲得一個數(shù)值(吸光度之差)。因此,基于所述吸光度之差,測量由于所述酶促反應從poly(rA)-poly(dT)雜合體中釋放的核苷酸的濃度。一個單位的RNA酶H定義為按照以下公式計算、增加相當于在10分鐘內釋放1nmol核糖核苷酸的A260的酶量單位=[吸光度之差×反應體積(ml)]/0.0152×(110/100)×稀釋率參比實施例3依照以下方法,測量本發(fā)明所述方法中所用的嗜常溫RNA酶H的單位值。(1)所用試劑溶液的制備供測量活性用的反應混合物在無菌水中含有指定終濃度的以下物質40mMtris-HCl(pH7.7,37℃)、4mM氯化鎂、1mMDTT、0.003%BSA、4%甘油和24μMpoly(dT)。poly[8-3H]腺苷酸溶液將370kBqpoly[8-3H]腺苷酸溶液溶于200μl無菌水中。聚腺苷酸溶液用無菌超純水將聚腺苷酸稀釋至3mM的濃度。酶稀釋液在無菌水中含有指定終濃度的以下物質25mMtris-HCl(pH7.5,37℃)、5mM2-巰基乙醇、0.5mMEDTA(pH7.5,37℃)、30mM氯化鈉和50%甘油。熱變性小牛胸腺DNA的制備將200mg小牛胸腺DNA懸浮于100mlTE緩沖液中并讓其溶脹?;谠赨V260nm下測量的吸光度,用無菌超純水將溶液稀釋至1mg/ml的濃度。將所述稀釋液于100℃加熱10分鐘,然后在冰浴中快速冷卻。(2)用于測量活性的方法加入7μlpoly[8-3H]腺苷酸溶液至以上(1)中制備的測量活性用的985μl反應混合物中。將混合物于37℃保溫10分鐘。加入8μl聚腺苷酸至混合物中,使終濃度為24μM。再將混合物于37℃保溫5分鐘。如此制備了1000μlpoly[8-3H]rA-poly-dT反應混合物。然后將200μl反應混合物于30℃保溫5分鐘。向其中加入1μl酶溶液的適當連續(xù)稀釋液。在規(guī)定時間內從反應混合物中取出每種樣品50μl,用于隨后的測量。將按分鐘計的從加入酶至取樣的時間定義為Y。加入1μl所述酶稀釋液以取代酶溶液,制備總CPM或空白的50μl反應混合物。向樣品中加入100μl100mM焦磷酸鈉、50μl熱變性小牛胸腺DNA溶液和300μl10%三氯乙酸(對于測量總CPM,300μl超純水)。將混合物于0℃保溫5分鐘,然后以10000rpm離心10分鐘。離心后,將250μl所得上清液置于小瓶中。向其中加入10mlAquasol-2(NENLifeScienceProducts)。在液體閃爍計數(shù)器中測量CPM。(3)單位的計算按照以下公式計算每種酶的單位值單位/ml={(測量的CPM-空白CPM)×1.2*×20×1000×稀釋率}200(μl)/(總CPM×Y(min.)×50(μl)×9**)1.2*每50μl總CPM中所含有的poly[8-3H]rA-poly-dT量(nmol)。9**校正系數(shù)。實施例1(1)從痰中提取DNA依照美國CDC(CentersforDiseasesControlandPrevention)建議的NALC法加工痰。具體地說,將痰置于50ml螺旋蓋試管中。向其中加入等體積NALC溶液(通過加入0.5gN-乙酰-L-半胱氨酸至50ml0.1M檸檬酸鈉和50ml4%氫氧化鈉的混合物中而制備的)。用試管混合器將混合物充分攪拌20秒,制備試樣液(fluidal)。于室溫靜置15分鐘后,加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS)至總體積為50ml。然后,通過以3000×g或更高速度離心20分鐘,收集沉淀。加入50μl裂解緩沖液(含有1單位變溶菌素(Sigma)的10mMHEPES緩沖液(pH7.8))至沉淀中并充分混合。將混合物于37℃反應30分鐘,然后在沸水或96℃的加熱塊中加熱5分鐘。任選用微量離心機離心,獲得上清液。如上所述制備的上清液用作隨后程序中得自痰的DNA提取物。另外,也用Dr.GenTLE(得自酵母)(TakaraShuzo),按照所附的說明進行核酸提取。(2)探針和嵌合寡核苷酸引物的制備根據(jù)GenBank登記號X52471的核苷酸序列,制備用于檢測得自結核分枝桿菌復合體的IS6110基因的特異性寡核苷酸探針。具體地說,用DNA合成儀,合成在5’端具有異硫氰酸熒光素(FITC)的寡核苷酸探針MTIS-2BF(SEQIDNO11)。制備用于用ICAN法合成來源于結核分枝桿菌復合體IS6110基因的DNA片段的嵌合寡核苷酸引物。具體地說,根據(jù)得自結核分枝桿菌復合體的IS6110基因的核苷酸序列(SEQIDNO12),用DNA合成儀合成在5’端具有生物素的正向引物MTIS-2F(SEQIDNO13)和反向引物MTIS2-RBio(SEQIDNO14)。同樣,用DNA合成儀,合成在5’端具有生物素的正向引物K-F1033-2(SEQIDNO15)和反向引物K-R1133-2Bio(SEQIDNO16)。(3)用ICAN法擴增制備表1中所示的用于ICAN反應的反應混合物,并于60℃保溫30分鐘。表15×反應緩沖液的組成100mMHEPES-氫氧化鉀(pH7.8)500mM乙酸鉀5%二甲基亞砜(DMSO)0.05%牛血清白蛋白(BSA)也用引物K-F1033-2/K-R1133-2的組合,同樣進行ICAN擴增反應。反應后,用一部分反應混合物進行電泳,以證實目標擴增片段。(4)用固相平板發(fā)光法檢測將鏈霉抗生物素蛋白(NacalaiTesque)以2μg/ml的濃度溶于PBS中,向96孔微量滴定板的各孔中加入150μl所得的溶液,以供白色發(fā)光檢測。讓板于4℃靜置過夜,以進行固定化。棄去鏈霉抗生物素蛋白溶液后,將200μl1%BSA-PBS溶液加入各孔中,讓板于4℃靜置過夜以進行封閉。棄去溶液,將如此獲得的板用于隨后的實驗中,作為鏈霉抗生物素蛋白包被板。將50μl雜交緩沖液(含有1%TritonX-100和1%BSA的5×SSC)和10μl含有用實施例1-(3)中的引物組合MTIS-2F/MTIS2-RBio獲得的擴增片段的ICAN反應混合物,加入至鏈霉抗生物素蛋白包被板的各孔中。將混合物充分混合,于室溫反應15分鐘,以使其被捕獲到所述板的表面。接著,向各孔中加入5μlDNA變性溶液(0.1NNaOH)。將所得混合物充分混合,經過DNA變性3分鐘,以使被捕獲到板表面的雙鏈DNA變性為單鏈DNA。用雜交緩沖液稀釋上述探針MTIS2BF至5pmol/ml的濃度,向各孔加入100μl所述稀釋液。將混合物充分混合,于室溫反應40分鐘。各孔的pH為13-14。反應后,棄去孔中的溶液。各孔用200μl/孔的洗滌緩沖液(25mMTris-HCl(pH7.5)、150mMNaCl、1%BSA、0.05%Tween20)洗滌兩次。隨后,向各孔加入100μl含有雜交溶液中2μg/ml濃度的過氧化物酶標記的抗FITC兔抗體(Chemicon)的溶液。讓混合物于室溫反應20分鐘。反應后,棄去混合物,各孔用200μl/孔的洗滌緩沖液洗滌4次,向各孔加入100μl發(fā)光底物SuperSignalELISAPicoSubstrate(Pierce)。立即用發(fā)光平板讀出儀(Labsystems)對所述板測量相對發(fā)光強度。(5)檢測靈敏度的測量用含有得自痰的相當于0、5或10個拷貝的結核分枝桿菌復合體基因組的DNA的樣品,如上所述檢測結核分枝桿菌復合體DNA。結果,對于含有5個拷貝所述基因組的樣品,可以檢測到S/N比約為300的強發(fā)光,如表2所示。表2基因組發(fā)光強度(RLU)0拷貝115個拷貝307810個拷貝6287如上所述,證明本發(fā)明使得能夠快速而高度靈敏地檢驗結核分枝桿菌復合體。此外,證明本發(fā)明的核酸提取法和其中使用得自酵母的Dr.GenTLE的試劑的方法,都可以穩(wěn)定地用于本發(fā)明的檢測結核分枝桿菌復合體的方法。因此,證明本發(fā)明的核酸提取法就操作便捷而論是有用的。實施例2按照實施例1中所述的方法,對從26位懷疑感染結核分枝桿菌復合體的患者收集的痰進行結核分枝桿菌復合體DNA的檢測。另外,對相同的試樣用AmplicorMycobacteriumtuberculosis(Roche)和依照使用Ogawa培養(yǎng)基的培養(yǎng)法的結核分枝桿菌復合體檢驗進行檢測,AmplicorMycobacteriumtuberculosis(Roche)是一種基于PCR的常規(guī)試劑盒,在所述試劑盒中用編碼16SrRNA的DNA作為靶。結果示于表3。表3Ogawa培養(yǎng)陽性病例陰性病例法(n=9)(n=17)基因擴增法PCR本發(fā)明方法PCR本發(fā)明方法P*N*P*N*P*N*P*N*8190215017*P陽性;N陰性。如表3所示,用本發(fā)明的方法獲得的結果與用培養(yǎng)檢驗獲得的結果很好地相符。依照所述PCR法,依照所述培養(yǎng)法測定為陰性的兩個病例被測定為假陽性,而依照所述培養(yǎng)法測定為陽性的一個病例被測定為假陰性。因此,證明與所述常規(guī)方法相比,用本發(fā)明的方法可以非??焖俸捅憬莸孬@得準確的試驗結果。實施例3檢查了本發(fā)明的檢測方法對于結核分枝桿菌復合體的特異性。使用得自表4中所列的37種菌株的基因組DNA。表4分枝桿菌屬(Mycobacterium)GTCNo.603鳥分枝桿菌(M.avium)857膿腫分枝桿菌(M.abscessus)499牛分枝桿菌(M.bovis)BCG858龜分枝桿菌(M.chelonae)609偶發(fā)分枝桿菌(M.fortuitum)610胃分枝桿菌(M.gastri)612戈登分枝桿菌(M.gordonae)613胞內分枝桿菌(M.intracellulare)614堪薩斯分枝桿菌(M.kansadii)616海分枝桿菌(M.marinum)617無色分枝桿菌(M.nonchromogenicum)1725外來分枝桿菌(M.peregrinum)619瘰疬分枝桿菌(M.scrofulaceum)620猿分枝桿菌(M.simiae)622斯氏分枝桿菌(M.szulgai)623土分枝桿菌(M.terrae)624次要分枝桿菌(M.triviale)601結核分枝桿菌(M.tuberculosis)626蟾分枝桿菌(M.xenopi)假單胞菌屬(Psedomonas)2銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)埃希氏菌屬(Escherichia)503大腸桿菌(E.coli)鏈球菌屬(Streptococcus)1234無乳鏈球菌(S.agalactiae)1700變異鏈球菌(S.mutans)261肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)262化膿鏈球菌(S.pyogenes)217S.sanguinis葡萄球菌屬(Staphylococcus)GTCNo.286金黃色葡萄球菌金黃亞種(S.aureussubsp.aureus)289表皮葡萄球菌(S.epidermidis)266中間葡萄球菌(S.intermedius)265腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)腸球菌屬(Enterococcus)228糞腸球菌(E.faecalis)227屎腸球菌(E.faecium)消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)200大消化鏈球菌(P.magnus)口腔球菌屬(Stomatococcus)311粘滑口腔球菌(S.mucilaginosus)棒桿菌屬(Corynebacterium)1438假結核棒桿菌(C.pseudotuberculosis)李斯特氏菌屬(Listeria)149單核細胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)555豬紅斑丹毒絲菌(E.rhuthiopathiae)基于OD值計算相應基因組DNA的拷貝數(shù),制備各含有2×107拷貝的稀釋液。用基因組DNA作為模板,以便用具有表5所示組成的反應混合物進行檢測。表5組分體積(μl)5×反應緩沖液(pH7.8)10100mM乙酸鎂210mMdNTP(TakaraShuzo)2.5引物MTIS-2F(100μM)0.5引物MTIS-2RBio(100μM)0.5AfuRNA酶HII(17.5U/μl)0.5BcaBESTDNA聚合酶(16U/μl)0.5DNA提取物1H2O32.5合計50μl將反應混合物于60℃保溫1小時。如實施例1(4)中所述進行檢測。結果僅可以特異性地檢測到結核分枝桿菌菌株和牛分枝桿菌BCG菌株。根據(jù)這些結果,證明本發(fā)明的方法是高度特異性的。實施例4(1)檢查用磁珠對結核分枝桿菌復合體的檢測。用引物MTIS-2F和MTIS-2RBio作為引物。作為模板,用無菌水制備從實施例2中的陽性試樣提取的基因組的30倍、300倍和3000倍稀釋液。反應如下進行。簡而言之,將按終濃度計的32mMHEPES-氫氧化鉀緩沖液(pH7.8)、100mM乙酸鉀、1%DMSO、0.01%BSA、4mM乙酸鎂、dNTP各500μM、引物MTIS-2F和MTIS-2R各50pmol、8.75UAfuRNA酶H、8UBcaBESTDNA聚合酶和1μl所述模板以及無菌水混合至50μl的終體積。將反應混合物置于已經設定于60℃的熱循環(huán)儀ThermalCyclerPersonal中,保溫60分鐘。用鏈霉抗生物素蛋白包被磁珠(Pierce),在自動檢測儀Lumipuls(Fujirebio)中對所得的擴增片段進行檢測。讓具有固定化鏈霉抗生物素蛋白、能夠結合100pmol生物素的磁珠與比色杯第一層上的生物素?;瘮U增片段反應5分鐘。然后,向其中加入0.1NNaOH。與FITC標記探針MTISBF雜交5分鐘。洗滌后,向其中加入POD標記的抗FITC抗體。反應5分鐘并且洗滌后,向其中加入發(fā)光底物。結果表明,在常規(guī)自動檢測儀中,用磁珠可以在短時間(20分鐘)內半定量地進行檢測。使用實施例1中所述的試劑。通過光計數(shù)(photocounting)測量發(fā)光水平,進行檢測。結果示于表6。表6模板光計數(shù)S/N比×303.55×10729.6×3001.21×10710.0×30000.21×1071.7500.12×107-根據(jù)表6所示的結果,證明可以以等同于常規(guī)平板發(fā)光法的靈敏度進行檢測。(2)檢查結合使用內部對照(IC)的檢測系統(tǒng)。如下制備內部對照。簡而言之,用人類基因組DNA作為模板,用SEQIDNO17和18的引物進行PCR擴增。按照常規(guī)方法純化所得的擴增片段,將其插入到pT7BlueT-vector(Novagen)中。將該質粒用作內部對照。按照實施例3中所述的方法進行反應,加入1pg、3pg或10pg所述質粒。作為模板,使用0、2或20個拷貝的結核分枝桿菌復合體基因組。使用在5’端具有FITC標記的用于IC的探針(SEQIDNO19)(ICF探針)和FITC標記的探針MTISBF進行檢測。結果,用每種濃度的IC質粒,可以檢測結核分枝桿菌復合體基因組。特別是,表明優(yōu)選使用3pg的所述IC質粒。(3)檢查作為檢測上述擴增片段的混合式層析法。將鏈霉抗生物素蛋白(NacalaiTesque)固定化至硝化纖維素膜上。將一個吸水性墊與其相連,構成一個混合式層析條(strip)。依照混合式層析法,用這種條檢測在實施例1中獲得的擴增片段。通過用1步TMB-印跡法(Pierce)顯色來進行檢測。具體地說,讓含有擴增片段的反應混合物在硝化纖維素膜上顯色。然后,用0.1NNaOH溶液、FITC標記探針、洗滌溶液和顯色溶液按該順序顯色。結果,檢測到結核分枝桿菌復合體陽性擴增片段的藍色條帶。證明該方法可用作快速遺傳檢驗法,因為在進行本發(fā)明的所述方法中,用肉眼在5-10分鐘內獲得結果。實施例5在實施例1-4中獲得的結果基礎上,構建了一種用于結核分枝桿菌復合體的試劑盒。相應的組分示于以下(1)用于ICAN擴增的試劑(50個反應)5×反應緩沖液500μl100mM乙酸鎂100μl10mMdNTP混合物125μl0.1mMMTIS-2F引物25μl0.1mMMTIS-SRBio引物25μlAfuRNA酶HII(17.5U/μl)25μlBcaBESTDNA聚合酶(16U/μl)25μl(2)用于檢測的試劑(50個反應)鏈霉抗生物素蛋白固定化96孔板50塊板雜交緩沖液2.5ml(5×SSC,1%TritonX100,1%BSA)變性試劑(0.1NNaOH)0.5mlMT探針檢測溶液5ml(25nMMTIS-2BF探針)IC探針檢測溶液5ml(25nMICF探針)標記抗體溶液(BlockAce5ml(DainipponPharmaceutical)∶PBS=1∶3,500單位POD-抗FITC抗體)10×洗滌溶液(250mMtris緩沖液(pH7.5),1.5M20mlNaCl,1%BSA,0.5%Tween20)發(fā)光試劑A(SuperSignalELISAPicoSubstrateA2.5ml溶液(Pierce))發(fā)光試劑B(SuperSignalELISAPicoSubstrateB2.5ml溶液(Pierce))內部對照溶液(IC質粒,TE緩沖液)0.1ml陽性對照溶液(含IS6110的質粒,TE緩沖液)0.02ml陰性對照溶液(TE緩沖液)0.02ml用上述試劑檢測到結核分枝桿菌菌株和牛分枝桿菌BCG菌株。因此證明,所述試劑可以快速、靈敏而特異性地檢測。實施例6(1)從棉拭試樣提取DNA將含有去垢劑(AmplicorSTD(Roche)的一種試樣處理試劑)的提取緩沖液加入到通過用棉拭摩擦男性尿道和女性宮頸取出的棉拭試樣中。將混合于95℃-100℃加熱10分鐘。(2)探針和嵌合寡核苷酸引物的制備制備用于檢測得自衣原體的隱蔽性質粒的特異性寡核苷酸探針。具體地說,用DNA合成儀,合成在5’端具有異硫氰酸熒光素(FITC)的寡核苷酸探針CT1234(SEQIDNO20)。另外,制備用于檢測得自淋病球菌的cppB基因的特異性寡核苷酸探針。具體地說,用DNA合成儀,合成在5’端具有異硫氰酸熒光素(FITC)的寡核苷酸探針CppB3(SEQIDNO21)。制備用于用ICAN法合成來源于衣原體的隱蔽性質粒的DNA片段的嵌合寡核苷酸引物。具體地說,根據(jù)得自衣原體的隱蔽性質粒的核苷酸序列(SEQIDNO22),用DNA合成儀合成在5’端分別具有生物素的正向引物F1212-22(SEQIDNO23)和F1162-22(SEQIDNO24)以及反向引物R1272-22Bio(SEQIDNO25)和R1379-22Bio(SEQIDNO26)。制備用于用ICAN法合成來源于淋病球菌的cppB基因的DNA片段的嵌合寡核苷酸引物。具體地說,根據(jù)得自衣原體的隱蔽性質粒的核苷酸序列(SEQIDNO27),用DNA合成儀合成在5’端具有生物素的正向引物pJDBF-1(SEQIDNO28)和反向引物pJDBR-3Bio(SEQIDNO29)。(3)用ICAN法擴增制備表7中所示的用于ICAN法的反應混合物,并于55℃保溫60分鐘。表7組分體積(μl)5×反應緩沖液(pH7.8)10100mM乙酸鎂210mMdNTP(TakaraShuzo)2.5引物F1212-22(100μM)0.5引物R1272-22Bio(100μM)0.5引物pJDBF-1(100μM)0.5引物pJDBR-3(100μM)0.5PfuRNA酶HII(63ng/μl)0.5BcaBESTDNA聚合酶(TakaraShuzo,8U/μl)0.5DNA提取物1H2O32.5合計50μl5×反應緩沖液的組成100mMHEPES-氫氧化鉀(pH7.8)500mM乙酸鉀5%二甲基亞砜(DMSO)0.05%牛血清白蛋白(BSA)反應后,用一部分反應混合物進行電泳,觀察到目標擴增片段。(4)用固相平板發(fā)光法檢測將鏈霉抗生物素蛋白(NacalaiTesque)以2μg/ml的濃度溶于PBS中,向96孔微量滴定板的各孔中加入150μl所得的溶液,以供白色發(fā)光檢測。讓板于4℃靜置過夜,以進行固定化。棄去鏈霉抗生物素蛋白溶液后,將200μl1%BSA-PBS溶液加入各孔中,讓板于4℃靜置過夜以進行封閉。棄去溶液,將如此獲得的板用于隨后的實驗中,作為鏈霉抗生物素蛋白包被板。將50μl雜交緩沖液(含有1%TritonX-100和1%BSA的5×SSC)加入至鏈霉抗生物素蛋白包被板的各孔中。向各孔中加入10μl含有用實施例1-(3)中的引物F1212-22/R1272-22Bio和pJDBF-1/pJDBR-3Bio的組合獲得的擴增片段的ICAN反應混合物(每個試樣兩個孔)。將混合物充分混合,于室溫反應15分鐘,以使其被捕獲到所述板的表面。接著,向各孔中加入5μlDNA變性溶液(0.1NNaOH)。將所得混合物充分混合,經過DNA變性3分鐘,以使被捕獲到板表面的雙鏈DNA變性為單鏈DNA。用雜交緩沖液稀釋上述探針CT1234或CppB3至5pmol/ml的濃度,向各孔加入100μl所述稀釋液。將混合物充分混合,于室溫反應40分鐘。各孔的pH為13-14。反應后,棄去孔中的溶液。各孔用200μl/孔的洗滌緩沖液(25mMTris-HCl(pH7.5)、150mMNaCl、1%BSA、0.05%Tween20)洗滌兩次。隨后,向各孔加入100μl含有雜交溶液中2μg/ml濃度的過氧化物酶標記的抗FITC兔抗體(Chemicon)的溶液。讓混合物于室溫反應20分鐘。反應后,棄去混合物,各孔用200μl/孔的洗滌緩沖液洗滌4次,向各孔加入100μl發(fā)光底物SuperSignalELISAPicoSubstrate(Pierce)。立即用發(fā)光平板讀出儀(Labsystems)對所述板測量相對發(fā)光強度。(5)檢測靈敏度的測量用含有相當于0、10或100個拷貝的衣原體基因組的DNA的樣品,如上所述檢測衣原體DNA。結果,對于含有10個拷貝所述基因組的樣品,可以檢測到S/N比約為30的強發(fā)光,如表8所示。用含有相當于0、10或100個拷貝的淋病球菌基因組的DNA的樣品,如上所述檢測淋病球菌DNA。結果,對于含有10個拷貝所述基因組的樣品,可以檢測到S/N比約為300的強發(fā)光,如表9所示。表8基因組發(fā)光強度(RLU)0拷貝1110個拷貝347100個拷貝3961表9基因組發(fā)光強度(RLU)0拷貝1110個拷貝3026100個拷貝3840如上所述,證明本發(fā)明使得能夠快速而高度靈敏地檢驗衣原體和淋病球菌。實施例7依照實施例1中所述的程序,從懷疑具有衣原體和淋病球菌混合感染的12個試樣中同時擴增和檢測衣原體DNA和淋病球菌DNA。結果如下僅衣原體陽性(5個病例);僅淋病球菌陽性(1個病例);衣原體和淋病球菌均為陽性(3個病例);以及衣原體和淋病球菌均為陰性(3個病例)。這些結果與用常規(guī)PCR試劑盒(AmplicorSTD(Roche))獲得的結果一致。實施例8引物和探針的制備基于HCV基因組的核苷酸序列,合成嵌合寡核苷酸引物HCV-F(SEQIDNO30)和HCV-R1(SEQIDNO31)以及逆轉錄反應的寡核苷酸引物(SEQIDNO32和33)。另外,合成寡核苷酸探針(SEQIDNO34和35)。用DNA自動合成儀,制備在5’端具有TAMRA(N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基-羅丹明,ABI)的寡核苷酸探針,并且將其用作熒光標記探針。(2)合成RNA的制備對于在征得同意后獲得的HCV-RNA陽性血清,用AmplicorHCVMonitor試劑盒(Roche)檢測到一個拷貝數(shù)。用所述試劑盒所附的試樣稀釋溶液制備濃度范圍為1拷貝/μl至1×107拷貝/μl的10倍連續(xù)稀釋液,將其用作HCV-RNA。(3)逆轉錄反應用以上(1)中制備的逆轉錄反應引物和第一鏈cDNA合成試劑盒(TakaraShuzo),從以上(2)中制備的HCV-RNA,合成cDNA。(4)ICAN反應混合物的制備用所述cDNA溶液進行ICAN反應。一個試管中的反應混合物的組成示于表10中。表10(5)均相檢測向每個試管中加入47μl反應混合物。向其中加入3μl在(4)中制備的cDNA溶液。將試管于56℃保溫30分鐘。反應后,加入在以上(1)中制備的熒光標記探針至反應混合物中,終濃度為300nM。于98℃處理2分鐘后,用冰冷卻將混合物冷卻至25℃,然后于室溫保溫。用熒光檢測器Fluoroscan(Labsystems),對所述反應混合物測量熒光強度。另外,用市售的基于PCR的AmplicorHCV試劑盒(Roche),測量相同的試樣作為對照。結果示于圖1。圖1是一幅曲線圖,說明熒光強度的變化以及當用不同HCV-RNA濃度下進行測定時與所述常規(guī)方法測量范圍的比較。左邊的縱軸代表OD450值;右邊縱軸代表熒光強度(SN比);橫軸代表HCV-RNA量。在圖1中,實心方框代表用本發(fā)明的方法獲得的結果,實心圓代表用AmplicorHCV試劑盒獲得的結果。如圖1所示,證明由于依照本發(fā)明的方法,HCV-RNA的拷貝數(shù)被增加,所以觀察到更強的熒光強度(SN比)。本發(fā)明方法檢測HCV所需的總時間是45分鐘。另一方面,作為對照的AmplicorHCV試劑盒需要約5小時。關于HCV-RNA檢測范圍,證明由于用AmplicorHCV試劑盒增加了HCV-RNA的拷貝數(shù),所以吸光度增加,如圖1所示。然而,其測量范圍為2個數(shù)量級,并且對于含有105拷貝或更多拷貝的樣品不能定量測定。另一方面,證明本發(fā)明的方法導致3個數(shù)量級的寬的檢測范圍。此外,證明本發(fā)明的方法就便捷和快速而論有優(yōu)勢,因此所述方法適合于處理大量的試樣。實施例9(1)從患者血清中制備HCV-RNA檢查對臨床試樣的HCV的檢測。用AmplicorHCV試劑盒(Roche)所附的HCV-RNA提取試劑,從在征得同意后所獲得的患有HCV的28位患者血清試樣各100μl,制備RNA。(2)患者血清中HCV-RNA的檢測依照實施例1(3)和(4)中所述的程序擴增HCV-RNA,對其進行本發(fā)明的檢測法。在該實施例中,截留值定義為用作為對照的無HCV-RNA樣品從10個陰性對照實驗獲得的平均熒光強度值±3SD(3倍標準偏差)。產生高于截留值的熒光強度的試樣被確定為陽性。另一方面,用市售的AmplicorHCV試劑盒依照試劑盒所附的說明對相同的試樣進行測量,以確定所述樣品是陽性還是陰性。本發(fā)明檢測方法和作為常規(guī)方法的AmplicorHCV試劑盒之間比較的結果示于表11中。表11如表11所示,證明用本發(fā)明的方法獲得的測量結果與用所述常規(guī)方法獲得的結果相關性很好。進一步證明,與依照所述常規(guī)方法相比,依照本發(fā)明方法的測量更為靈敏,更快速并且更便捷。工業(yè)實用性本發(fā)明提供了使得能夠靈敏、特異性、快速且便捷地測量致病微生物、并且可以用來在限定的時間內處理大量試樣而無需應用專門設備的方法、引物和探針以及試劑盒。序列表的獨立文本SEQIDNO2PCR引物1650Nde,用于從激烈熱球菌克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。SEQIDNO3PCR引物1650Bam,用于從激烈熱球菌克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。SEQIDNO7PCR引物AfuNde,用于從閃爍古生球菌克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。SEQIDNO8PCR引物AfuBam,用于從閃爍古生球菌克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。SEQIDNO11寡核苷酸探針,用于檢測得自結核分枝桿菌的DNA。SEQIDNO13嵌合寡核苷酸引物,用于擴增得自結核分枝桿菌的IS6110基因的DNA片段。“核苷酸16-18是核糖核苷酸,其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”SEQIDNO14嵌合寡核苷酸引物,用于擴增得自結核分枝桿菌的IS6110基因的DNA片段?!昂塑账?9-21是核糖核苷酸,其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”SEQIDNO15嵌合寡核苷酸引物,用于擴增得自結核分枝桿菌的IS6110基因的DNA片段?!昂塑账?9-21是核糖核苷酸,其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”SEQIDNO16嵌合寡核苷酸引物,用于擴增得自結核分枝桿菌的IS6110基因的DNA片段?!昂塑账?0-22是核糖核苷酸,其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”SEQIDNO17寡核苷酸引物C4-MT2F-S100,用于從人類擴增metaroprotease基因的DNA片段SEQIDNO18寡核苷酸引物C4-MT2R-A,用于從人類擴增metaroprotease基因的DNA片段SEQIDNO19寡核苷酸探針,用于檢測內部對照DNASEQIDNO20寡核苷酸探針CT1234,用于檢測所述衣原體隱蔽性質粒SEQIDNO21寡核苷酸探針CppB3,用于檢測淋病奈瑟氏球菌cppB基因SEQIDNO23嵌合寡核苷酸引物,用于擴增衣原體隱蔽性質粒的DNA片段。“核苷酸20-22是核糖核苷酸,其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”SEQIDNO24嵌合寡核苷酸引物,用于擴增衣原體隱蔽性質粒的DNA片段?!昂塑账?0-22是核糖核苷酸,其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”SEQIDNO25嵌合寡核苷酸引物,用于擴增衣原體隱蔽性質粒的DNA片段?!昂塑账?0-22是核糖核苷酸,其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”SEQIDNO26嵌合寡核苷酸引物,用于擴增衣原體隱蔽性質粒的DNA片段。“核苷酸20-22是核糖核苷酸,其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”SEQIDNO28嵌合寡核苷酸引物,用于擴增淋病奈瑟氏球菌cppB基因的DNA片段?!昂塑账?8-20是核糖核苷酸,其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”SEQIDNO29嵌合寡核苷酸引物,用于擴增淋病奈瑟氏球菌cppB基因的DNA片段。“核苷酸15-17是核糖核苷酸,其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”SEQIDNO30設計的嵌合寡核苷酸引物,名為HCV-F,用于擴增HCV的一部分?!昂塑账?9-21是核糖核苷酸,其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”SEQIDNO31設計的嵌合寡核苷酸引物,名為HCV-R3,用于擴增HCV的一部分?!昂塑账?6-18是核糖核苷酸,其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”SEQIDNO32設計的寡核苷酸引物,用于合成HCV的cDNA。SEQIDNO33設計的寡核苷酸引物,用于合成HCV的cDNA。SEQIDNO34設計的寡核苷酸探針,用于檢測擴增HCV一部分的DNA片段。SEQIDNO35設計的寡核苷酸探針,用于檢測擴增HCV一部分的DNA片段。SEQIDNO36寡核苷酸引物,用于擴增得自結核分枝桿菌的IS6110基因的DNA片段。SEQIDNO37寡核苷酸引物,用于擴增得自結核分枝桿菌的IS6110基因的DNA片段。SEQIDNO41引物區(qū),用于擴增HCV的一部分。SEQIDNO42引物區(qū),用于擴增HCV的一部分。SEQIDNO43探針區(qū),用于檢測擴增HCV一部分的DNA片段。序列表&lt;110&gt;寶酒造株式會社(TakaraShuzoCo.,Ltd.)&lt;120&gt;毒性微生物的檢測方法&lt;130&gt;662981&lt;150&gt;JP2000-396321&lt;151&gt;2000-12-26&lt;150&gt;JP2000-396222&lt;151&gt;2000-12-26&lt;150&gt;JP2001-199552&lt;151&gt;2001-06-29&lt;150&gt;JP2001-278920&lt;151&gt;2001-09-13&lt;160&gt;44&lt;210&gt;1&lt;211&gt;663&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;Pyrococcushorikoshii&lt;400&gt;1atgaaggttgctggagttgatgaagcggggagggggccggtaattggcccgttagtaatt60ggagtagccgttatagatgagaaaaatattgagaggttacgtgacattggggttaaagac120tccaaacaattaactcctgggcaacgtgaaaaactatttagcaaattaatagatatccta180gacgattattatgttcttctcgttacccccaaggaaatagatgagaggcatcattctatg240aatgaactagaagctgagaaattcgttgtagccttgaattctttaaggatcaagccgcag300aagatatatgtggactctgccgatgtagatcctaagaggtttgctagtctaataaaggct360gggttgaaatatgaagccacggttatcgccgagcataaagccgatgcaaagtatgagata420gtatcggcagcatcaataattgcaaaggtcactagggatagagagatagagaagctaaag480caaaagtatggggaatttggttctggctatccgagtgatccgagaactaaggagtggctt540gaagaatattacaaacaatatggtgactttcctccaatagttaggagaacttgggaaacc600gctaggaagatagaggaaaggtttagaaaaaatcagctaacgcttgataaattccttaag660tga663&lt;210&gt;2&lt;211&gt;33&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;PCR引物1650Nde,用于從激烈熱球菌(Pyrococcusfuriosus)克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因&lt;400&gt;2caggaggagagacatatgaaaatagggggaatt33&lt;210&gt;3&lt;211&gt;33&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;PCR引物1650Bam,用于從激烈熱球菌(Pyrococcusfuriosus)克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因&lt;400&gt;3gaaggttgtggatccactttctaaggtttctta33&lt;210&gt;4&lt;211&gt;672&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;激烈熱球菌(Pyrococcusfuriosus)&lt;400&gt;4atgaaaatagggggaattgacgaagcaggaagaggaccagcgatagggccattagtagta60gctactgtcgtcgttgatgagaaaaacattgagaagctcagaaacattggagtaaaagac120tccaaacaactaacaccccatgaaaggaagaatttattttcccagataacctcaatagcg180gatgattacaaaatagtgatagtatccccagaagaaatcgacaatagatcaggaacaatg240aacgagttagaggtagagaagtttgctctcgccttaaattcgcttcagataaaaccagct300cttatatacgctgatgcagcggatgtagatgccaatagatttgcaagcttgatagagaga360agactcaattataaggcgaagattattgccgaacacaaggccgatgcaaagtatccagta420gtttcagcagcttcaatacttgcaaaggttgttagggatgaggaaattgaaaaattaaaa480aagcaatatggagactttggctctgggtatccaagtgatccaaaaaccaagaaatggctt540gaagagtactacaaaaaacacaactctttccctccaatagtcagacgaacctgggaaact600gtaagaaaaatagaggaaagcattaaagccaaaaaatcccagctaacgcttgataaattc660tttaagaaacct672&lt;210&gt;5&lt;211&gt;224&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;激烈熱球菌(Pyrococcusfuriosus)&lt;400&gt;5MetLysIleGlyGlyIleAspGluAlaGlyArgGlyProAlaIle151015GlyProLeuValValAlaThrValValValAspGluLysAsnIle202530GluLysLeuArgAsnIleGlyValLysAspSerLysGlnLeuThr354045ProHisGluArgLysAsnLeuPheSerGlnIleThrSerIleAla505560AspAspTyrLysIleValIleValSerProGluGluIleAspAsn657075ArgSerGlyThrMetAsnGluLeuGluValGluLysPheAlaLeu808590AlaLeuAsnSerLeuGlnIleLysProAlaLeuIleTyrAlaAsp95100105AlaAlaAspValAspAlaAsnArgPheAlaSerLeuIleGluArg110115120ArgLeuAsnTyrLysAlaLysIleIleAlaGluHisLysAlaAsp125130135AlaLysTyrProValValSerAlaAlaSerIleLeuAlaLysVal140145150ValArgAspGluGluIleGluLysLeuLysLysGlnTyrGlyAsp155160165PheGlySerGlyTyrProSerAspProLysThrLysLysTrpLeu170175180GluGluTyrTyrLysLysHisAsnSerPheProProIleValArg185190195ArgThrTrpGluThrValArgLysIleGluGluSerIleLysAla200205210LysLysSerGlnLeuThrLeuAspLysPhePheLysLysPro215220&lt;210&gt;6&lt;211&gt;626&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;閃爍古生球菌(Archaeoglobusfulgidus)&lt;400&gt;6atgaaggcaggcatcgatgaggctggaaagggctgcgtcatcggcccactggttgttgca60ggagtggcttgcagcgatgaggataggctgagaaagcttggtgtgaaagactccaaaaag120ctaagtcaggggaggagagaggaactagccgaggaaataaggaaaatctgcagaacggag180gttttgaaagtttctcccgaaaatctcgacgaaaggatggctgctaaaaccataaacgag240attttgaaggagtgctacgctgaaataattctcaggctgaagccggaaattgcttatgtt300gacagtcctgatgtgattcccgagagactttcgagggagcttgaggagattacggggttg360agagttgtggccgagcacaaggcggacgagaagtatcccctggtagctgcggcttcaatc420atcgcaaaggtggaaagggagcgggagattgagaggctgaaagaaaaattcggggatttc480ggcagcggctatgcgagcgatccgaggacaagagaagtgctgaaggagtggatagcttca540ggcagaattccgagctgcgtgagaatgcgctggaagacggtgtcaaatctgaggcagaag600acgcttgacgatttctaaacgaaacc626&lt;210&gt;7&lt;211&gt;30&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;PCR引物AfuNde,用于從閃爍古生球菌(Archaeoglobusfulgidus)克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因&lt;400&gt;7aagctgggtttcatatgaaggcaggcatcg30&lt;210&gt;8&lt;211&gt;30&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;PCR引物AfuBam,用于從閃爍古生球菌(Archaeoglobusfulgidus)克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因&lt;400&gt;8tggtaataacggatccgtttagaaatcgtc30&lt;210&gt;9&lt;211&gt;638&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;閃爍古生球菌(Archaeoglobusfulgidus)&lt;400&gt;9catatgaaggcaggcatcgatgaggctggaaagggctgcgtcatcggcccactggttgtt60gcaggagtggcttgcagcgatgaggataggctgagaaagcttggtgtgaaagactccaaa120aagctaagtcaggggaggagagaggaactagccgaggaaataaggaaaatctgcagaacg180gaggttttgaaagtttctcccgaaaatctcgacgaaaggatggctgctaaaaccataaac240gagattttgaaggagtgctacgctgaaataattctcaggctgaagccggaaattgcttat300gttgacagtcctgatgtgattcccgagagactttcgagggagcttgaggagattacgggg360ttgagagttgtggccgagcacaaggcggacgagaagtatcccctggtagctgcggcttca420atcatcgcaaaggtggaaagggagcgggagattgagaggctgaaagaaaaattcggggat480ttcggcagcggctatgcgagcgatccgaggacaagagaagtgctgaaggagtggatagct540tcaggcagaattccgagctgcgtgagaatgcgctggaagacggtgtcaaatctgaggcag600aagacgcttgacgatttctaaacggatccccgggtacc638&lt;210&gt;10&lt;211&gt;205&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;閃爍古生球菌(Archaeoglobusfulgidus)&lt;400&gt;10MetLysAlaGlyIleAspGluAlaGlyLysGlyCysValIleGly151015ProLeuValValAlaGlyValAlaCysSerAspGluAspArgLeu202530ArgLysLeuGlyValLysAspSerLysLysLeuSerGlnGlyArg354045ArgGluGluLeuAlaGluGluIleArgLysIleCysArgThrGlu505560ValLeuLysValSerProGluAsnLeuAspGluArgMetAlaAla657075LysThrIleAsnGluIleLeuLysGluCysTyrAlaGluIleIle808590LeuArgLeuLysProGluIleAlaTyrValAspSerProAspVal95100105IleProGluArgLeuSerArgGluLeuGluGluIleThrGlyLeu110115120ArgValValAlaGluHisLysAlaAspGluLysTyrProLeuVal125130135AlaAlaAlaSerIleIleAlaLysValGluArgGluArgGluIle140145150GluArgLeuLysGluLysPheGlyAspPheGlySerGlyTyrAla155160165SerAspProArgThrArgGluValLeuLysGluTrpIleAlaSer170175180GlyArgIleProSerCysValArgMetArgTrpLysThrValSer185190195AsnLeuArgGlnLysThrLeuAspAspPhe200205&lt;210&gt;11&lt;211&gt;20&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;寡核苷酸探針,用于檢測得自結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的DNA。&lt;400&gt;11gacctcacctatgtgtcgac20&lt;210&gt;12&lt;211&gt;1378&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)&lt;400&gt;12aggtcggcaacctgaaccgccccggcatgtccggagactccagttcttggaaaggatggg60gtcatgtcaggtggttcatcgaggaggtacccgccggagctgcgtgagcgggcggtgcgg120atggtcgcagagatccgcggtcagcacgattcggagtgggcagcgatcagtgagatcgcc180cgtctacttggtgttgctgcgcggagacggtgcgtaagtgggtgcgccaggcgcaggtcg240atgccggcgcacggcccgggaccacgaccgaagaatccgctgagataaagcgcttgcggc300gggacaacgccgaattgcgaagggcgaacgcgattttaaagaccgcgtcggctttcttcg360cggccgagctcgaccggccagcacgctaattacccggttcatcgccgatcatcagggcca420ccgcgagggccccgatggtttgcggtggggtgtcgagtcgatctgcacacagctgaccga480gctgggtgtgccgatcgccccatcgacctactacgaccacatcaaccgggagcccagccg540ccgcgagctgcgcgatggcgaactcaaggagcacatcagccgcgtccacgccgccaacta600cggtgtttacggtgcccgcaaagtgtggctaaccctgaaccgtgagggcatcgaggtggc660cagatgcaccgtcgaacggctgatgaccaaactcggcctgtccgggaccacccgcggcaa720agcccgcaggaccacgatcgctgatccggccacagcccgtcccgccgatctcgtccagcg780ccgcttcggaccaccagcacctaaccggctgtgggtagcagacctcacctatgtgtcgac840ctgggcagggttcgcctacgtggcctttgtcaccgacgcctacgctcgcaggatcctggg900ctggcgggtcgcttccacgatggccacctccatggtcctcgacgcgatcgagcaagccat960ctggacccgccaacaagaaggcgtactcgacctgaaagacgttatccaccatacggatag1020gggatctcagtacacatcgatccggttcagcgagcggctcgccgaggcaggcatccaacc1080gtcggtcggagcggtcggaagctcctatgacaatgcactagccgagacgatcaacggcct1140atacaagaccgagctgatcaaacccggcaagccctggcggtccatcgaggatgtcgagtt1200ggccaccgcgcgctgggtcgactggttcaaccatcgccgcctctaccagtactgcggcga1260cgtcccgccggtcgaactcgaggctgcctactacgctcaacgccagagaccagccgccgg1320ctgaggtctcagatcagagagtctccggactcaccggggcggttcaggccccgatggt1378&lt;210&gt;13&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;嵌合寡核苷酸引物,用于擴增得自結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的IS6110基因的DNA片段?!昂塑账?6-18是核糖核苷酸,其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”&lt;400&gt;13tctcgtccagcgccgcuu18&lt;210&gt;14&lt;211&gt;21&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;嵌合寡核苷酸引物,用于擴增得自結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的IS6110基因的DNA片段?!昂塑账?9-21是核糖核苷酸,其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”&lt;400&gt;14gacaaaggccacgtaggcgaa21&lt;210&gt;15&lt;211&gt;21&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;嵌合寡核苷酸引物,用于擴增得自結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的IS6110基因的DNA片段?!昂塑账?9-21是核糖核苷酸,其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”&lt;400&gt;15cagtacacatcgatccgguuc21&lt;210&gt;16&lt;211&gt;22&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;嵌合寡核苷酸引物,用于擴增得自結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的IS6110基因的DNA片段?!昂塑账?0-22是核糖核苷酸,其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”&lt;400&gt;16gatcgtctcggctagtgcauug22&lt;210&gt;17&lt;211&gt;46&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;寡核苷酸引物C4-MT2F-S100,用于從人類擴增metaroprotease基因的DNA片段&lt;400&gt;17gatcgtctcgtccagcgccgcttgataagcactgttcctccactcc46&lt;210&gt;18&lt;211&gt;47&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;寡核苷酸引物C4-MT2R-A,用于從人類擴增metaroprotease基因的DNA片段&lt;400&gt;18gatcggacaaaggccacgtaggcgaagacacagtcacaccataaagg47&lt;210&gt;19&lt;211&gt;20&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;寡核苷酸探針,用于檢測內部對照DNA&lt;400&gt;19gcactgttcctccactccat20&lt;210&gt;20&lt;211&gt;19&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;寡核苷酸探針CT1234,用于檢測所述衣原體隱蔽性質粒&lt;400&gt;20tcggagtctgagcacccta19&lt;210&gt;21&lt;211&gt;20&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;寡核苷酸探針CppB3,用于檢測淋病奈瑟氏球菌cppB基因&lt;400&gt;21tccgtaacgtctctaagtct20&lt;210&gt;22&lt;211&gt;218&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;衣原體隱蔽性質粒&lt;400&gt;22ttgtcttctcgagaagatttatcgtacgcaaatatcatctttgcggttgcgtgtcctgtg60accttcattatgtcggagtctgagcaccctaggcgtttgtactccgtcacagcggttgct120cgaagcacgtgcggggttatcttaaaagggattgcagcttgtagtcctgcttgagagaac180gtgcgggcgatttgccttaaccccaccatttttccgga218&lt;210&gt;23&lt;211&gt;22&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;嵌合寡核苷酸引物,用于擴增衣原體隱蔽性質粒的DNA片段?!昂塑账?0-22是核糖核苷酸,其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”&lt;400&gt;23gtgtcctgtgaccttcattaug22&lt;210&gt;24&lt;211&gt;22&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;嵌合寡核苷酸引物,用于擴增衣原體隱蔽性質粒的DNA片段?!昂塑账?0-22是核糖核苷酸,其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”&lt;400&gt;24ttgtcttctcgagaagattuau22&lt;210&gt;25&lt;211&gt;22&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;嵌合寡核苷酸引物,用于擴增衣原體隱蔽性質粒的DNA片段。“核苷酸20-22是核糖核苷酸,其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”&lt;400&gt;25tgtgacggagtacaaacgccua22&lt;210&gt;26&lt;211&gt;22&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;嵌合寡核苷酸引物,用于擴增衣原體隱蔽性質粒的DNA片段。“核苷酸20-22是核糖核苷酸,其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”&lt;400&gt;26tccggaaaaatggtggggtuaa22&lt;210&gt;27&lt;211&gt;107&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)&lt;400&gt;27tctgctcgctttgcttcaatgcctcgttgatatttttccgtaacgtctctaagtctgctt60tcgtttgttgctctatgctggcggcttcggtgcgtgatgtctgctcg107&lt;210&gt;28&lt;211&gt;20&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;嵌合寡核苷酸引物,用于擴增淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoae)cppB基因的DNA片段?!昂塑账?8-20是核糖核苷酸,其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”&lt;400&gt;28ctttgcttcaatgcctcguu20&lt;210&gt;29&lt;211&gt;17&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;嵌合寡核苷酸引物,用于擴增淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)cppB基因的DNA片段?!昂塑账?5-17是核糖核苷酸,其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”&lt;400&gt;29catcacgcaccgaagcc17&lt;210&gt;30&lt;211&gt;21&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;設計的嵌合寡核苷酸引物,名為HCV-F,用于擴增HCV的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸,其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”&lt;400&gt;30ctgtgaggaactactgtcuuc21&lt;210&gt;31&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;設計的嵌合寡核苷酸引物,名為HCV-R3,用于擴增HCV的一部分。“核苷酸16-18是核糖核苷酸,其它核苷酸為脫氧核糖核苷酸”&lt;400&gt;31gcagaccactatggcucu18&lt;210&gt;32&lt;211&gt;19&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;設計的寡核苷酸引物,用于合成HCV的cDNA。&lt;400&gt;32cactccaccatgaatcact19&lt;210&gt;33&lt;211&gt;20&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;設計的寡核苷酸引物,用于合成HCV的cDNA。&lt;400&gt;33ggtgcacggtctacgagacc20&lt;210&gt;34&lt;211&gt;24&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;設計的寡核苷酸探針,用于檢測擴增HCV一部分的DNA片段。&lt;400&gt;34gccaaagcgtctagccatggcggg24&lt;210&gt;35&lt;211&gt;36&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;設計的寡核苷酸探針,用于檢測擴增HCV一部分的DNA片段。&lt;400&gt;35gcgagcaaagcgtctagccatggcgttagtgctcgc36&lt;210&gt;36&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;寡核苷酸引物,用于擴增得自結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的IS6110基因的DNA片段。&lt;400&gt;36tctcgtccagcgccgctt18&lt;210&gt;37&lt;211&gt;21&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;寡核苷酸引物,用于擴增得自結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的IS6110基因的DNA片段。&lt;400&gt;37gacaaaggccacgtaggcgaa21&lt;210&gt;38&lt;211&gt;103&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;可供從結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)擴增用的IS6110基因的一部分&lt;400&gt;38tctcgtccagcgccgcttcggaccaccagcacctaaccggctgtgggtagcagacctcac60ctatgtgtcgacctgggcagggttcgcctacgtggcctttgtc103&lt;210&gt;39&lt;211&gt;410&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;可供從結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)擴增用的IS6110基因的一部分&lt;400&gt;39cacagcccgtcccgccgatctcgtccagcgccgcttcggaccaccagcacctaaccggct60gtgggtagcagacctcacctatgtgtcgacctgggcagggttcgcctacgtggcctttgt120caccgacgcctacgctcgcaggatcctgggctggcgggtcgcttccacgatggccacctc180catggtcctcgacgcgatcgagcaagccatctggacccgccaacaagaaggcgtactcga240cctgaaagacgttatccaccatacggataggggatctcagtacacatcgatccggttcag300cgagcggctcgccgaggcaggcatccaaccgtcggtcggagcggtcggaagctcctatga360caatgcactagccgagacgatcaacggcctatacaagaccgagctgatca410&lt;210&gt;40&lt;211&gt;367&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;可供從結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)擴增用的IS6110基因的一部分&lt;400&gt;40tctcgtccagcgccgcttcggaccaccagcacctaaccggctgtgggtagcagacctcac60ctatgtgtcgacctgggcagggttcgcctacgtggcctttgtcaccgacgcctacgctcg120caggatcctgggctggcgggtcgcttccacgatggccacctccatggtcctcgacgcgat180cgagcaagccatctggacccgccaacaagaaggcgtactcgacctgaaagacgttatcca240ccatacggataggggatctcagtacacatcgatccggttcagcgagcggctcgccgaggc300aggcatccaaccgtcggtcggagcggtcggaagctcctatgacaatgcactagccgagac360gatcaac367&lt;210&gt;41&lt;211&gt;73&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;引物區(qū),用于擴增HCV的一部分。&lt;400&gt;41cactccaccatgaatcactcccctgtgaggaactactgtcttcacgcagaaagcgtctag60ccatggcgttagt73&lt;210&gt;42&lt;211&gt;41&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;引物區(qū),用于擴增HCV的一部分。&lt;400&gt;42attccggtgtactcaccggttccgcagaccactatggctct41&lt;210&gt;43&lt;211&gt;53&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;探針區(qū),用于檢測擴增HCV一部分的DNA片段。&lt;400&gt;43cgcagaaagcgtctagccatggcgttagtatgagtgtcgtgcagcctccagga53&lt;210&gt;44&lt;211&gt;60&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;衣原體隱蔽性質粒&lt;400&gt;44gtgtcctgtgaccttcattatgtcggagtctgagcaccctaggcgtttgtactccgtcac60權利要求1.一種含有SEQIDNO39的核苷酸序列或其部分的探針,所述探針可以用來檢測結核分枝桿菌復合體結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)BCG、非洲分枝桿菌(Mycobacteriumafricanum)、田鼠分枝桿菌(Mycobacteriummicroti)和/或Mycobacteriumcanetti。2.一種由SEQIDNO11的核苷酸序列組成的探針,所述探針可以用來檢測結核分枝桿菌復合體結核分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌和/或Mycobacteriumcanetti。3.一種含有SEQIDNO27的核苷酸序列或其部分的探針,所述探針可以用來檢測淋病球菌-淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)。4.一種由SEQIDNO21的核苷酸序列組成的探針,所述探針可以用來檢測淋病球菌-淋病奈瑟氏球菌。5.一種含有SEQIDNO22的核苷酸序列或其部分的探針,所述探針可以用來檢測衣原體-沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)。6.一種由SEQIDNO20的核苷酸序列組成的探針,所述探針可以用來檢測衣原體-沙眼衣原體。7.一種由SEQIDNO34或35的核苷酸序列組成的探針,所述探針可以用來檢測丙型肝炎病毒(HCV)。8.一種可以在堿性pH下與得自致病微生物的靶核酸雜交的探針。9.權利要求8的探針,所述探針可以在8-14的堿性pH下與得自致病微生物的靶核酸雜交。10.權利要求8或9的探針,其中所述致病微生物是結核分枝桿菌復合體、淋病球菌、衣原體或HCV。11.權利要求10的探針,其中所述得自致病微生物的靶核酸選自來自結核分枝桿菌復合體的IS6110基因的核苷酸序列、來自淋病球菌的cppB基因的核苷酸序列、來自衣原體的pLGV440的核苷酸序列或者來自HCV的5’非翻譯區(qū)的核苷酸序列。12.權利要求11的探針,所述探針含有SEQIDNO39的核苷酸序列或其部分,其中所述SEQIDNO39的核苷酸序列存在于來自結核分枝桿菌復合體的IS6110基因中。13.權利要求12的探針,所述探針由SEQIDNO11的核苷酸序列組成。14.權利要求11的探針,所述探針含有SEQIDNO27的核苷酸序列或其部分,其中所述SEQIDNO27的核苷酸序列存在于來自淋病球菌的cppB基因中。15.權利要求14的探針,所述探針由SEQIDNO21的核苷酸序列組成。16.權利要求11的探針,所述探針含有SEQIDNO22的核苷酸序列或其部分,其中所述SEQIDNO22的核苷酸序列存在于來自衣原體的pLGV440中。17.權利要求16的探針,所述探針由SEQIDNO20的核苷酸序列組成。18.權利要求11的探針,所述探針含有SEQIDNO34或35的核苷酸序列或其部分,其中所述SEQIDNO34和35的核苷酸序列存在于來自HCV的5’非翻譯區(qū)中。19.權利要求18的探針,所述探針由SEQIDNO34或35的核苷酸序列組成。20.權利要求1-19中任一項的探針,所述探針被標記。21.權利要求20的探針,所述探針是具有來自SEQIDNO11、20、21、34或35的核苷酸序列的8-53個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列的寡核苷酸,并且所述探針被熒光標記,使得所述熒光強度在所述探針與所述靶核酸雜交時不受抑制,而所述熒光強度在所述探針不與所述靶核酸雜交時受到抑制。22.權利要求21的探針,所述探針由來自SEQIDNO11、20、21、34或35的核苷酸序列的8個或8個以上連續(xù)核苷酸的序列組成。23.權利要求22的探針,所述探針用羅丹明型熒光染料或者噁嗪型熒光染料在5’端標記,并且所述探針由來自SEQIDNO34的核苷酸序列的8個或8個以上連續(xù)核苷酸的序列組成。24.權利要求22的探針,所述探針具有報道熒光染料和作為熒光染料的猝滅染料以供標記,并且所述探針由來自SEQIDNO11、20、21、34或35的核苷酸序列的8個或8個以上連續(xù)核苷酸的序列組成。25.權利要求24的探針,其中所述報道染料是熒光素型染料,而所述猝滅染料是DABCYL型染料。26.權利要求20的探針,所述探針具有選自熒光物質、染料、酶、生物素、膠體金和放射性同位素的標記。27.一種檢測致病微生物的方法,所述方法包括進行權利要求1-26中任一項所限定的探針與得自致病微生物的靶核酸的雜交。28.權利要求27的方法,其中所述與得自致病微生物的靶核酸的雜交在堿性pH下進行。29.權利要求27或28的方法,其中所述致病微生物是結核分枝桿菌復合體、淋病球菌、衣原體或HCV。30.權利要求29的方法,其中所述得自致病微生物的靶核酸是來自結核分枝桿菌復合體的IS6110基因或其片段。31.權利要求30的方法,其中進行權利要求1、2、9-11、12、13和20-26中任一項所限定的探針與得自結核分枝桿菌復合體的擴增的IS6110基因和/或其片段的雜交。32.權利要求31的方法,其中用具有SEQIDNO36或37的核苷酸序列或與所述序列部分重疊的序列的引物,擴增得自結核分枝桿菌復合體的IS6110基因和/或其片段。33.權利要求29的方法,其中所述得自致病微生物的靶核酸是來自淋病球菌的cppB基因或其片段。34.權利要求33的方法,其中進行權利要求3、4、9-11、14、15和20-26中任一項所限定的探針與得自淋病球菌的擴增的cppB基因和/或其片段的雜交。35.權利要求34的方法,其中用具有SEQIDNO28或29的核苷酸序列或與所述序列部分重疊的序列的引物,擴增得自淋病球菌的cppB基因和/或其片段。36.權利要求29的方法,其中所述得自致病微生物的靶核酸是來自衣原體的pLGV440或其片段。37.權利要求36的方法,其中進行權利要求5、6、9-11、16、17和20-26中任一項所限定的探針與得自衣原體的擴增的pLGV440和/或其片段的雜交。38.權利要求37的方法,其中用具有SEQIDNO23-26中的任一核苷酸序列或與所述序列部分重疊的序列的引物,擴增得自衣原體的pLGV440和/或其片段。39.權利要求29的方法,其中所述靶核酸是得自HCV的5’非翻譯區(qū)或其片段。40.權利要求39的方法,其中進行權利要求7、8、9-11、18、19和20-26中任一項所限定的探針與得自HCV的擴增的5’非翻譯區(qū)和/或其片段的雜交。41.權利要求40的方法,其中用具有SEQIDNO30-33中的任一核苷酸序列或與所述序列部分重疊的序列的引物,擴增得自HCV的5’非翻譯區(qū)和/或其片段。42.一種檢測致病微生物的方法,所述方法包括用權利要求27-41中任一項所限定的方法,檢測得自結核分枝桿菌復合體、淋病球菌、衣原體或HCV的核酸。43.一種檢測致病微生物的方法,所述方法包括檢測依照包括下述步驟的核酸擴增法擴增的核酸(a)通過將作為模板的核酸、脫氧核糖核苷酸三磷酸、具有鏈置換活性的DNA聚合酶、至少一種引物和RNA酶H混合,制備反應混合物,其中所述引物是一種與作為模板的所述核酸的核苷酸序列基本互補的嵌合寡核苷酸引物,并且含有核糖核苷酸以及至少一種選自脫氧核糖核苷酸和核苷酸類似物的物質,所述核糖核苷酸位于所述引物的3’端或者位于3’端一側;以及(b)將所述反應混合物保溫足夠的時間,以產生反應產物。44.權利要求43的方法,其中所述反應混合物還包含一種其序列與作為模板的所述核酸的核苷酸序列基本同源的嵌合寡核苷酸引物。45.權利要求44的方法,其中所述嵌合寡核苷酸引物由以下通式表示通式5’-dNa-Nb-dNc-3’(a11或11以上的整數(shù);b1或1以上的整數(shù);c0或者1或1以上的整數(shù);dN脫氧核糖核苷酸和/或核苷酸類似物;N未經修飾的核糖核苷酸和/或經修飾的核糖核苷酸,其中dNa中的某些dN可以被N取代)。46.權利要求45的方法,其中c為0。47.權利要求45的方法,其中所述核苷酸類似物是脫氧核糖肌苷核苷酸或者脫氧核糖尿嘧啶核苷酸,而所述經修飾的核糖核苷酸是(α-S)核糖核苷酸。48.權利要求43的方法,其中所述嵌合寡核苷酸引物由SEQIDNO13-16、23-26和28-31中的任一核苷酸序列組成。49.權利要求27-42中任一項的方法,所述方法包括使用由權利要求1-26中任一項所限定的探針檢測擴增的核酸。50.一種由以下通式所示的、用于檢測致病微生物的嵌合寡核苷酸引物通式5’-dNa-Nb-dNc-3’(a11或11以上的整數(shù);b1或1以上的整數(shù);c0或者1或1以上的整數(shù);dN脫氧核糖核苷酸和/或核苷酸類似物;N未經修飾的核糖核苷酸和/或經修飾的核糖核苷酸,其中dNa中的某些dN可以被N取代)。51.權利要求50的嵌合寡核苷酸引物,其中c為0。52.權利要求50的嵌合寡核苷酸引物,其中所述核苷酸類似物是脫氧核糖肌苷核苷酸或脫氧核糖尿嘧啶核苷酸,而所述經修飾的核糖核苷酸是(α-S)核糖核苷酸。53.權利要求52的嵌合寡核苷酸引物,所述嵌合寡核苷酸引物由SEQIDNO13-16、23-26和28-31中的任一個表示。54.一種用于從結核分枝桿菌復合體擴增IS6110基因和/或其片段的引物,所述引物具有SEQIDNO36或37的核苷酸序列或與所述序列部分重疊的序列。55.一種用于從淋病球菌擴增cppB基因和/或其片段的引物,所述引物具有SEQIDNO27的核苷酸序列或與所述序列部分重疊的序列。56.一種用于從衣原體擴增pLGV440和/或其片段的引物,所述引物具有SEQIDNO22的核苷酸序列或與所述序列部分重疊的序列。57.一種用于從HCV擴增5’非翻譯區(qū)和/或其片段的引物,所述引物具有SEQIDNO41-43中的任一核苷酸序列或與所述序列部分重疊的序列。58.權利要求54-57中任一項的引物,所述引物是其中所述核苷酸序列中的一部分被核糖核苷酸取代的嵌合寡核苷酸引物。59.一種選自以下的標記引物(i)一種用于檢測致病微生物、由以下通式表示的嵌合寡核苷酸引物通式5’-dNa-Nb-dNc-3’(a11或11以上的整數(shù);b1或1以上的整數(shù);c0或者1或1以上的整數(shù);dN脫氧核糖核苷酸和/或核苷酸類似物;N未經修飾的核糖核苷酸和/或經修飾的核糖核苷酸,其中dNa中的某些dN可以被N取代);(ii)(i)的嵌合寡核苷酸引物,其中c為0;(iii)(i)的嵌合寡核苷酸引物,其中所述核苷酸類似物是脫氧核糖肌苷核苷酸或脫氧核糖尿嘧啶核苷酸,而所述經修飾的核糖核苷酸是(α-S)核糖核苷酸;(iv)由SEQIDNO13-16、23-26和28-31中的任一個表示的(iii)的嵌合寡核苷酸引物;(v)一種用于從結核分枝桿菌復合體擴增IS6110基因和/或其片段的引物,所述引物具有SEQIDNO36或37的核苷酸序列或與所述序列部分重疊的序列;(vi)一種用于從淋病球菌擴增cppB基因和/或其片段的引物,所述引物具有SEQIDNO27的核苷酸序列或與所述序列部分重疊的序列;(vii)一種用于從衣原體擴增pLGV440和/或其片段的引物,所述引物具有SEQIDNO22的核苷酸序列或與所述序列部分重疊的序列;(viii)一種用于從HCV擴增5’非翻譯區(qū)和/或其片段的引物,所述引物具有SEQIDNO41-43中的任一核苷酸序列或與所述序列部分重疊的序列;和(ix)(v)-(viii)中任一項的引物,所述引物是其中所述核苷酸序列中的一部分被核糖核苷酸取代的嵌合寡核苷酸引物。60.權利要求59的引物,所述引物具有選自熒光物質、染料、酶、生物素和膠體金的標記。61.一種用于檢測靶核酸的組合物,所述組合物含有權利要求1-26中任一項所限定的探針。62.一種用于檢測靶核酸的組合物,所述組合物含有權利要求50-60中任一項所限定的引物。63.權利要求61或62的組合物,所述組合物用于檢測致病微生物。64.一種用于檢測致病微生物的組合物,所述組合物用于權利要求43所限定的檢測致病微生物的方法,并且所述組合物含有至少一種用于擴增靶核酸的試劑。65.權利要求64的組合物,所述組合物含有選自具有鏈置換活性的DNA聚合酶、RNA酶H和脫氧核糖核苷酸三磷酸的一種試劑。66.權利要求65的組合物,其中所述DNA聚合酶是得自熱堅芽孢桿菌(Bacilluscaldotenax)的缺乏5’→3’外切核酸酶的BcaDNA聚合酶。67.權利要求65的組合物,其中所述RNA酶H是得自屬于熱球菌屬(Pyrococcus)細菌和/或屬于古生球菌屬(Archaeoglobus)細菌的II型RNA酶H。68.一種用于檢測致病微生物的試劑盒,所述試劑盒含有權利要求1-26中任一項所限定的探針。69.一種用于檢測致病微生物的試劑盒,所述試劑盒含有權利要求50-60中任一項所限定的引物。70.權利要求68或69的試劑盒,其中所述致病微生物是結核分枝桿菌復合體、淋病球菌、衣原體或HCV。71.一種用于檢測致病微生物的試劑盒,所述試劑盒用于權利要求27所限定的檢測致病微生物的方法,并且所述試劑盒含有至少一種用于擴增靶核酸的試劑。72.權利要求71的試劑盒,所述試劑盒含有選自具有鏈置換活性的DNA聚合酶、RNA酶H和脫氧核糖核苷酸三磷酸的一種試劑。73.權利要求72的試劑盒,其中所述DNA聚合酶是得自熱堅芽孢桿菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的BcaDNA聚合酶。74.權利要求72的試劑盒,其中所述RNA酶H是得自屬于熱球菌屬細菌和/或屬于古生球菌屬細菌的II型RNA酶H。75.權利要求72的試劑盒,所述試劑盒含有一種用于捕獲擴增產物的支持體。76.權利要求75的試劑盒,其中所述支持體選自微量滴定板、微珠、磁珠、膜和玻璃。77.一種檢測結核分枝桿菌復合體的方法,所述方法包括用胞壁質酶處理含結核分枝桿菌復合體的試樣,以提取核酸。全文摘要本發(fā)明公開了可用于檢測致病微生物的寡核苷酸探針和引物;使用所述探針和引物檢測致病微生物的方法;以及用于所述方法的試劑盒。文檔編號C12Q1/70GK1491285SQ01822774公開日2004年4月21日申請日期2001年12月26日優(yōu)先權日2000年12月26日發(fā)明者蔦田雅光,日野文嗣,加藤郁之進,之進,嗣申請人:寶生物工程株式會社
      網友詢問留言 已有0條留言
      • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
      1