專利名稱：降低血磷水平的人fgf23蛋白質(zhì)突變體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及降低血磷水平的FGF23蛋白質(zhì)突變體及這些突變體的用途。
背景技術：
FGF23是一種由Ito等在Kyoto大學克隆的基因，其在腦中表達已被確認(Yamashita T.et al.(2000)Biochem.Biophy.Res.Commun.277494-498；WO01/66596)。進一步地，Luethy等已克隆FGF23基因以生產(chǎn)可表達此基因的轉(zhuǎn)基因小鼠并分析該小鼠的表型(WO01/61007)另外，基于對患有佝僂病(一種先天性低磷酸鹽血癥)的病人的基因譜分析，報道此病是由于FGF23的突變(R176Q，R179Q，R179W)造成(The ADHRConsortium(2000)Nat.Genet 26345-348)。
然而，此報道既未提及獲得了蛋白質(zhì)或全長cDNA，也未提及前述觀察到的FGF23基因突變與低磷酸鹽血癥之間的因果聯(lián)系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是鑒于前述觀察資料完成的。本發(fā)明的目的特別包括了提供降低血磷水平的FGF23蛋白質(zhì)突變體，編碼這些突變體的DNA和這些突變體及DNA的用途。
本發(fā)明者為達到前述目的進行了廣泛的研究，目的在于獲得希望降低血磷水平的FGF23蛋白質(zhì)的突變體。首先分離人FGF23基因的全長cDNA，然后用PCR技術合成編碼突變體的DNA并克隆入表達載體。經(jīng)由靜脈內(nèi)給藥將此表達載體導入小鼠以在其體內(nèi)表達此突變體，其后檢測小鼠的血磷水平。結(jié)果表明由于FGF23突變體的表達，小鼠的血磷水平顯著降低。
特別是，除成功制備出FGF23蛋白質(zhì)突變體外，本發(fā)明者還用這些突變體成功降低了小鼠的血磷水平，最后達到了本發(fā)明的目的。因為本發(fā)明的FGF23蛋白質(zhì)突變體能如前述降低血磷水平，所以人們十分希望它們可用做治療高磷酸鹽血癥的藥物。
本發(fā)明涉及降低血磷水平的FGF23蛋白質(zhì)的突變體，編碼這些突變體的DNA和這些突變體及DNA的用途。更為具體地，本發(fā)明提供了(1)一種DNA，編碼含有氨基酸序列為SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)，此氨基酸序列含有選自如下的突變位置176的精氨酸突變?yōu)楣劝滨０罚恢?79的精氨酸突變?yōu)楣劝滨０坊蛭恢?79的精氨酸突變?yōu)樯彼帷?br> (2)一種編碼包含蛋白質(zhì)的至少1到190位氨基酸序列的片段的DNA，該蛋白質(zhì)含有氨基酸序列SEQ ID NO2，該序列含有選自如下的突變位置176的精氨酸突變?yōu)楣劝滨０?，位?79的精氨酸突變?yōu)楣劝滨０坊蛭恢?79的精氨酸突變?yōu)樯彼帷?br> (3)一種載體，其中插入了根據(jù)權(quán)利要求1或2的DNA。
(4)一種轉(zhuǎn)化細胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求1或2的DNA或根據(jù)權(quán)利要求3的載體。
(5)一種含有氨基酸序列為SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)，該序列含有選自如下的突變位置176的精氨酸突變?yōu)楣劝滨０罚恢?79的精氨酸突變?yōu)楣劝滨０坊蛭恢?79的精氨酸突變?yōu)樯彼帷?br> (6)一種含有蛋白質(zhì)至少其位置1到190的氨基酸序列的片段，該蛋白質(zhì)含有氨基酸序列SEQ ID NO2，該序列包含選自如下的突變位置176的精氨酸突變?yōu)楣劝滨０罚恢?79的精氨酸突變?yōu)楣劝滨０坊蛭恢?79的精氨酸突變?yōu)樯彼帷?br> (7)一種制備根據(jù)權(quán)利要求5或6的蛋白質(zhì)的方法，其包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)化細胞的步驟和從此轉(zhuǎn)化細胞或其培養(yǎng)上清收集表達蛋白質(zhì)的步驟。
(8)一種降低血磷水平的藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1或2的DNA，根據(jù)權(quán)利要求3的載體或根據(jù)權(quán)利要求5或6的蛋白質(zhì)。
(9)權(quán)利要求8的藥物組合物，其不影響血鈣水平。
(10)權(quán)利要求8或9的藥物組合物，用于治療高磷酸鹽血癥。
(11)一種治療高磷酸鹽血癥的方法，包括向患者給藥根據(jù)權(quán)利要求1或2的DNA的步驟。
本發(fā)明提供編碼降低血磷水平的FGF23蛋白質(zhì)突變體的DNA。本發(fā)明DNA所編碼的這些突變體包含SEQ ID NO2的人FGF23蛋白質(zhì)氨基酸序列上位置176上的精氨酸為谷氨酰胺取代的突變體，位置179上的精氨酸為谷氨酰胺取代的突變體和位置179上的精氨酸為色氨酸取代的突變體(在下文中，這些突變體分別被稱為“R176Q突變體”，“R179Q突變體”和“R179W突變體”，并且它們所有都被稱為“FGF突變體”)。在這些突變體中，R176Q突變體和R179Q突變體是優(yōu)選的，并且R179Q突變體是最優(yōu)選的。
本發(fā)明也提供了這些FGF突變體的片段。優(yōu)選片段至少含有從FGF突變體位置1到190的氨基酸序列。
本發(fā)明的這些FGF23突變體能夠降低血磷水平。因此，人們希望能用這些FGF23突變體對由于血液中磷水平高而引起的疾病起到治療和預防的效果。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，F(xiàn)GF23突變體不會影響血鈣水平。
人們期待能夠?qū)Υ税l(fā)揮治療和預防效果的疾病實例是高磷酸鹽血癥。高磷酸鹽血癥通常由于腎臟分泌的PO4降低而發(fā)生。進行性(advanced)腎衰(腎小球濾過率(GFR)低于20mL/min)會造成足以導致血漿PO4升高的分泌降低。即使沒有腎衰的病因，假性甲狀旁腺功能衰退或甲狀旁腺功能衰退也可能會引發(fā)腎臟PO4分泌紊亂。由于口服用藥PO4過量或有時含磷酸鹽的灌腸劑的應用過量同樣會造成高磷酸鹽血癥。而且，高磷酸鹽血癥會作為細胞內(nèi)PO4遷移到細胞外的結(jié)果出現(xiàn)。此種遷移常在糖尿病酮癥酸中毒(不考慮全身PO4丟失)，瘀傷，無創(chuàng)傷性橫紋肌溶解，全身感染和腫瘤溶解綜合癥中出現(xiàn)。并且，高磷酸鹽血癥在繼發(fā)性甲狀旁腺功能衰退的發(fā)作和長時間接受透析治療的病人其腎性骨營養(yǎng)不良的發(fā)作中起到重要作用。
本發(fā)明的DNA用于體內(nèi)和體外制備本發(fā)明下面所描述的突變體。另外，它們可用于基因治療由于血磷水平高引起的疾病。本發(fā)明的DNA可呈現(xiàn)任何形式，只要它們編碼本發(fā)明的突變體。例如，DNA可為由mRNA合成的cDNA，為基因組DNA或經(jīng)由化學合成。而且，基于遺傳密碼簡并性而具有主觀核苷酸序列的DNA包含在本發(fā)明的DNA中，只要它們編碼出此發(fā)明的突變體。
本發(fā)明的DNA可通過修飾人FGF23 cDNA而制成。此種人FGF23cDNA可以用業(yè)內(nèi)人士已知的方法來制備。例如，其可通過從表達FGF23的細胞制備cDNA文庫再用FGF23 cDNA序列(SEQ ID NO1))的部分作為探針進行雜交。例如，cDNA文庫可用文獻(Sambrook，J.et al.，MolecularCloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))描述的方法制備，或應用商品化的DNA文庫。進一步，文庫可如下制備(1)從表達FGF23的細胞制備RNA；(2)用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA(3)合成一段基于FGF23 cDNA序列(SEQ ID NO1)的寡DNA；并且(4)用此寡DNA作為引物進行PCR以擴增編碼本發(fā)明多肽的cDNA。
更為具體地，mRNA可以首先從表達FGF23的細胞，組織或器官中分離，已知方法可用于分離mRNA。例如，總RNA可用胍超速離心(ChirgwinJ.M.et al.，Biochemistry 185294-5299(1979))或用AGPC法(Comczynski P.和Sacchi n.，Anal.Biochem.162156-159(1987)制備，mRNA則可用一種mRNA純化試劑盒(Pharmacia)純化自總RNA，等等?；蛘?，mRNA可以直接用一種QuickPrep mRNA純化試劑盒(Pharmacia)來制備。
得到的mRNA可用逆轉(zhuǎn)錄酶來合成cDNA。cDNA可用一種試劑盒如AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA合成試劑盒(Seikagaku Kogyo)來合成?；蛘遚DNA可按照5’-RACE法(Frohman M.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.858998-9002(1988)；Belyavsky A.et al.，Nucleic Acids Res.172919-2932(1989))來合成并擴增，其所用引物是基于SEQ ID NO1，5’-Ampli FINDER RACE試劑盒(Clontech)和聚合酶鏈式反應(PCR)中描述的序列來制備的。
所要的DNA片段是由PCR產(chǎn)物制備并連接到載體DNA上。重組載體用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌等。而且想要的重組載體是從選擇的菌落來制備的。此所要的DNA的核苷酸序列可用傳統(tǒng)方法來驗證，如雙脫氧核苷酸鏈終止法。
具體地，可以獲得人FGF23 cDNA，例如，用如下例1介紹的方法。
用于制備本發(fā)明FGF23突變體時對人FGF23 cDNA所做的修飾可以用業(yè)內(nèi)人士通常使用的DNA誘變方法來進行。例如，所述修飾可用如下例2中的方法。
本發(fā)明也提供由本發(fā)明前述DNA編碼的突變體。本發(fā)明的這些突變體可能在它們的氨基酸，分子量，等電點，或糖鏈的存在或形式上有所不同，此不同依賴于生產(chǎn)突變體的細胞或宿主，或如下所述制備方法的不同。然而，只要得到的突變體能降低血磷水平，它們都包括在本發(fā)明中。例如，當本發(fā)明的突變體在一種原核細胞如大腸桿菌中表達時，原來突變體的氨基酸序列N末端就會被添加上一個蛋氨酸殘基。此種突變體也被包括在本發(fā)明中。
本發(fā)明的突變體可用業(yè)內(nèi)人士已知的方法制備成重組多肽。這種重組多肽可經(jīng)如下過程來制備將編碼本發(fā)明突變體的DNA插入適宜的表達載體，收集將載體轉(zhuǎn)染入適宜宿主細胞得到的轉(zhuǎn)化子，并在得到提取物后用層析法來純化多肽，如離子交換層析法，反相層析法，凝膠過濾層析法或親和層析法。在親和層析法中，抗本發(fā)明突變體的抗體可固定在一個層析柱上或?qū)⒍鄠€這樣的層析柱進行組合。
而且，當本發(fā)明的突變體在一種宿主細胞(例如，動物細胞，大腸桿菌等)中表達為一種與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)融合的多肽或一種添加了多個組氨酸的重組多肽時，此表達重組多肽可以用谷胱甘肽柱或鎳柱來純化。純化融合多肽后，如果必要可以用凝血酶，凝血因子Xa等將非所需的突變體區(qū)域從融合多肽上切除。
本發(fā)明也提供其中插入了本發(fā)明DNA的載體。本發(fā)明的載體用于在宿主細胞內(nèi)維持本發(fā)明的DNA或表達本發(fā)明的突變體。
當大腸桿菌用作宿主細胞時，除了載體應有一個“ori”和一個標記基因外沒有其它限制。此“ori”用于擴增并大規(guī)模制備大腸桿菌內(nèi)載體(例如，JM109，DH5α，HB101，或XL1Blue)。標記基因用于選擇轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(例如，通過藥物如氨芐青霉素，四環(huán)素，卡那霉素，或氯霉素選擇的抗性基因)。例如，可用M13-系列載體，pUC系列載體，pBR322，pBluescript，pCR-Script等等。除上述載體外，pGEM-T，pDIRECT，pT7等也可用做cDNA的亞克隆和切割。在一種載體用于制備本發(fā)明突變體時，尤其有用的是表達載體。當表達載體在大腸桿菌內(nèi)表達時，此表達載體應具有上述特征以在大腸桿菌中擴增。而且，在大腸桿菌，如JM109，DH5α，HB101，或XL1Blue用做宿主細胞時，載體應具有啟動子，例如lacZ啟動子(Wizard etal.(1989)Nature 341544-546；(1992)FASEB J.62422-2427)，araB啟動子(Better et al.(1988)Science 2401041-1043)，或能有效促進所需基因在大腸桿菌內(nèi)表達的T7啟動子。其它載體的例子為pGEX-5X-1(Pharmacia)，“QIAexpress系統(tǒng)”(QIAGEN)，pEGFP和pET(對此種載體，一種表達T7RNA聚合酶的菌株BL21優(yōu)選作為宿主使用)。
而且，載體可包含一段分泌多肽的信號序列。為將多肽制備到大腸桿菌周質(zhì)中，pelB信號序列(Lei，S.P.et al.(1987)J.Bacteriol.1694379)可用作多肽分泌的信號序列。例如，氯化鈣法或電穿孔法可以用來將載體導入宿主細胞。
作為用于制備本發(fā)明突變體的載體，本文提及來自哺乳動物的表達載體(如pCDNA3(Invitrogen)，pEGF-BOS (Nucleic Acids Res.(1990)18(17)5322)，pEF，pCDM8)，來自昆蟲細胞的表達載體(如“Bac-to-BAC桿狀病毒表達系統(tǒng)”(GIBCO-BRL)，pBacPAK8)，來自植物的表達載體(如pMH1，pMH2)，來自動物病毒的表達載體(如pHSV，pMV，pAdexLcw)，來自逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達載體(如pZIPneo)，來自酵母的表達載體(如“畢赤氏酵母表達試劑盒”(Invitrogen)，pNV11，SP-Q01)和來自枯草芽孢桿菌的表達載體(如pPL608，pKTH50)，而來自大腸桿菌的那些表達載體未提及。
為在動物細胞如CHO，COS，和NIH3T3細胞中表達蛋白質(zhì)，載體必須具有在所述細胞中用于表達所必需的啟動子(例如SV40啟動子(Mulliganet al.(1979)Nature 277108)，MMLV-LTR啟動子，EF1α啟動子(Mizushima etal.(1990)Nucleic Acids Res.185322)，CMV啟動子等)。如果載體另外還有一個用于選擇轉(zhuǎn)化子的標記基因就更優(yōu)選(例如，一種由藥物(如新霉素，G418等)選擇的抗藥基因)。具有此種特征的載體例子可包括pMAM，pDR2，pBK-RSV，pBK-CMV，pOPRSV，pOP13等。
而且，為了穩(wěn)定表達基因并在細胞內(nèi)增加其拷貝數(shù)，可采用如下方法將核酸合成途徑缺陷的CHO細胞用作宿主，向此CHO細胞中導入一種含有DHFR基因以彌補此細胞缺陷的載體(如pCHOI)，并用氨甲蝶呤(MTX)來擴增載體。而且為了瞬間表達一種基因，可用如下方法用含有SV40復制起始點的載體(如pcD)，轉(zhuǎn)化染色體上有SV40 T抗原基因的COS細胞。所述復制起始點可以是多瘤病毒，腺病毒，牛乳頭瘤病毒(BPV)等的復制起始點。另外，為增加宿主細胞內(nèi)的基因拷貝數(shù)，選擇性標記如氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶(APH)基因，胸腺嘧啶激酶(TK)基因，大腸桿菌黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Ecogpt)基因，及二氫葉酸還原酶(dhfr)基因可導入表達載體。
在動物體內(nèi)表達本發(fā)明的DNA的例子包括將此發(fā)明DNA插入適宜載體，并用逆轉(zhuǎn)錄病毒法、脂質(zhì)體法、陽離子脂質(zhì)體法、腺病毒法等將此載體導入活體。因此，可用于基因治療由于血磷水平高而引發(fā)的疾病。這些方法中所用載體包括但不局限于腺病毒載體(如pAdexlcw)、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(如pZIPneo)等?；虿僮鞯囊话慵夹g，如將本發(fā)明的DNA插入一種載體可根據(jù)傳統(tǒng)方法(Molecular Cloning，5.61-5.63)進行操作。對于活體的給藥可根據(jù)回體(ex vivo)方法或體內(nèi)方法進行操作。
本發(fā)明也提供了該發(fā)明載體所導入的宿主細胞。此發(fā)明載體導入的宿主細胞不受特殊限制。例如，大腸桿菌和多種動物就可以被應用。本發(fā)明宿主細胞可用作，例如，制備和表達本發(fā)明蛋白質(zhì)的制備系統(tǒng)。蛋白質(zhì)制備系統(tǒng)包括體外和體內(nèi)系統(tǒng)。應用真核細胞或原核細胞的這些制備系統(tǒng)用作體外制備系統(tǒng)。
例如，可以應用真核宿主細胞，動物細胞，植物細胞和真菌細胞。哺乳動物細胞，例如CHO(J.Exp.Med.(1995)108945)，COS，3T3，骨髓瘤，BHK(幼年倉鼠腎)，Hela，Vero，兩棲動物細胞(如滑爪蟾卵母細胞(Valle et al.(1981)Nature 291358-340))及昆蟲細胞(如Sf9，Sf21，Tn5)均已知為動物細胞。CHO細胞中，那些具有DHFR基因缺陷的細胞、dhfr-CHO(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)774216-4220)和CHO K-1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1968)601275)的特別優(yōu)選。在動物細胞中，CHO細胞特別優(yōu)選做大規(guī)模表達。一種載體可以被導入宿主細胞通過，例如磷酸鈣法、DEAE-dextran法、用陽離子脂質(zhì)體DOTAP(Boehringer-Mannheim)的方法、電穿孔法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法等。
已知來自煙草(Nicotiana tabacum)的植物細胞為多肽制備系統(tǒng)，其可用作胼胝體(callus)培養(yǎng)物。作為真菌細胞，酵母細胞如酵母屬包括釀酒酵母(Saccharomeyces cerevisiae)，或絲狀真菌如曲霉屬，包括黑曲霉(Aspergillusniger)是已知的。
用作多肽制備的有用原核細胞包括細菌細胞。細菌細胞如大腸桿菌(例如JM109，DH5α，HB101等)和枯草芽孢桿菌已知可用于多肽制備。
這些細胞用理想的DNA轉(zhuǎn)化，得到的轉(zhuǎn)化子在體外培養(yǎng)以得到多肽。轉(zhuǎn)化子可用已知方法培養(yǎng)。例如，培養(yǎng)基如添加或不添加血清如胚胎小牛血清(FCS)的DMEM、MEM、RPMI1640或IMDM可用作動物細胞的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選在大約6到大約8。這些細胞通常在大約30℃到大約40℃孵育大約15到大約200個小時，且如果必要，培養(yǎng)基可以置換、通氣或攪動。
動物和植物宿主可以用作體內(nèi)多肽制備。例如，編碼本發(fā)明突變體的DNA可以導入一種動物或者植物宿主。此突變體可在體內(nèi)制備再回收。這些動物和植物宿主包括在本發(fā)明的宿主中。
前述制備系統(tǒng)中所用的動物包括哺乳動物和昆蟲。哺乳動物如羊、豬、綿羊、小鼠和牛是可用的(Vicki Glaser(1993)SPECTRUM BiotechnologyApplications)?；蛘卟溉閯游锟蔀檗D(zhuǎn)基因動物。
例如，編碼本發(fā)明突變體的DNA可以與基因如羊β酪蛋白基因(編碼特異地進入奶中的多肽)形成融合基因以此為制備。含有融合基因的DNA片段注入羊胚胎，其可再返回導入母羊。此發(fā)明突變體可以從轉(zhuǎn)基因羊(即那些接受了修飾胚胎的羊所娩出的羊)產(chǎn)的奶中得到或從它們的后代得到。為提高含有轉(zhuǎn)基因羊制造的多肽的奶量，可給藥適當?shù)募に?Ebert，K.M.etal.，(1994)Bio/Technology 12699-702)。
或者，昆蟲如蠶(silkworm)可以應用。編碼本發(fā)明突變體的DNA所插入的桿狀病毒可用來感染蠶，并且突變體可以從體液中回收(Susumu M.etal.，(1985)Nature 315592-594)。
在植物細胞中，煙草可以應用。當應用煙草時，編碼本發(fā)明突變體的DNA可插入植物表達載體中，如pMON530，其可導入細菌，如根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)。因而，用細菌感染煙草如煙草(Nicotianatabacum)，可從葉片中回收想要的突變體(Julian K.-C.Ma et al.，(1994)Eur.J.Immunol.24131-138)。
如前獲得的本發(fā)明突變體可從宿主細胞內(nèi)部或外部(如培養(yǎng)基)分離得到，且純化成為基本純的均一多肽。此種多肽分離純化的方法不限于任何特定方法。事實上，可用任何標準方法。例如柱層析法、過濾法、超濾法、鹽析法、溶劑沉淀法、溶劑萃取法、蒸餾法、免疫沉淀法、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法、等電點電泳法、透析法和重結(jié)晶法，可從其中適當選擇并組合方法以分離純化多肽。
對于層析、例如親和層析，離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾層析、反相層析、吸附層析等都可以應用(Strategies for Protein Purification andCharacterizationa Laboratory Course Manual.Ed.Daniel R.Marshak et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。這些層析可用液相層析如HPLC和FPLC來操作。因此，本發(fā)明依前法制作可提供高純度的突變體。
本發(fā)明突變體可在純化前后用合適的蛋白質(zhì)修飾酶處理，從而被選擇性修飾或部分去除。例如，胰蛋白質(zhì)酶、胰凝乳蛋白質(zhì)酶、賴氨酰內(nèi)肽酶、蛋白質(zhì)激酶、葡萄糖苷酶等可用作蛋白質(zhì)修飾酶。
本發(fā)明進一步提供了藥用化合物以降低血磷水平，此種化合物包含本發(fā)明的突變體、編碼突變體的DNA或DNA導入的載體。
當本發(fā)明突變體作為藥物用于人體和其他動物如小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、雞、貓、狗、綿羊、豬、牛、猴子、狒狒(baboons)和黑猩猩時，突變體可直接或作為用已知藥物制備方法配制的藥用化合物用藥給受試者。例如，根據(jù)預期的應用，藥物可作為糖衣藥片、膠囊、酏劑和微膠囊口服或以水或其它可藥用液體制成的無菌溶液、懸液的注射劑形式非口服給藥。例如，化合物可以以通常接受的使用藥物所需的單位劑量形式，與藥學上可接受的載體或介質(zhì)混合，具體是無菌水、生理鹽水、植物油、乳化劑、溶劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、調(diào)味劑、賦形劑、載體(vehicles)、防腐劑和粘合劑。這些制劑中活性成分的量為在指定要求范圍內(nèi)適宜的量。
可與之混合制成藥片或膠囊的添加劑的例子是粘合劑如明膠、玉米淀粉、西黃蓍膠和阿拉伯膠；賦形劑如結(jié)晶纖維素；膨脹劑如玉米淀粉、明膠和褐藻酸；潤滑劑如硬脂酸鎂；增甜劑如蔗糖、乳糖或糖精；調(diào)味劑如薄荷油、白株樹腺毛油(Gaultheria adenothrix oil)和櫻桃(cherry)。當單位劑量形式為膠囊、液體載體，如油也可包括在上述成分中。無菌注射用組合物按通常的藥物配制方法，應用載體如注射用蒸餾水來配制。
生理鹽水、葡萄糖和其他等滲液體包括佐劑，如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化鈉可用作注射用水溶液。這些可與適宜增溶劑如醇、尤其是乙醇，多元醇如丙二醇和聚乙二醇，非離子表面活性劑如Polysor bate 80TM和HCO-50聯(lián)合應用。
芝麻油或大豆油可用作油質(zhì)液體，并可與苯甲基安息香酸酯或苯甲基乙醇聯(lián)合用作增溶劑；其可與緩沖液如磷酸鹽緩沖液和乙酸鈉緩沖液來配制；可與止痛劑如鹽酸普魯卡因；穩(wěn)定劑如苯甲基乙醇、苯酚；以及抗氧化劑配制。制備好的注射劑注入合適的安瓿中。
業(yè)內(nèi)人員已知的方法可用于向病人給藥此藥物化合物。例子包括動脈內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、皮下注射、鼻內(nèi)給藥、經(jīng)氣管給藥、肌肉內(nèi)給藥、經(jīng)皮給藥和口服用藥。劑量可根據(jù)病人體重和年齡及用藥方法而有所變化。
本發(fā)明突變體的劑量可根據(jù)個體、靶器官、癥狀和用藥方法而不同，但通常一個成年人(體重60kg)每天大約100μg到大約20mg。
盡管會隨個體、靶器官、癥狀和用藥方法變化，腸胃外給藥的化合物的單次劑量，在靜脈內(nèi)注射給藥正常成年人(60kg體重)時每天優(yōu)選在大約0.01mg到大約30mg的范圍，優(yōu)選在約0.1mg到約20mg的范圍，更優(yōu)選在約0.1mg到約10mg的范圍。轉(zhuǎn)換成60kg體重或單位體表面積的劑量可以給藥其它動物。
而且，當本發(fā)明DNA用作藥物組合物時，其可插入載體以確保前述本發(fā)明DNA的體內(nèi)表達，并通過例如逆轉(zhuǎn)錄病毒法、脂質(zhì)體法、陽離子脂質(zhì)體法、腺病毒法等導入活的個體。用此方法，可以進行針對由高血磷水平引發(fā)的疾病的基因治療。回體方法和體內(nèi)方法可用于向活的個體內(nèi)給藥。
附圖簡述

圖1此圖顯示FGF23突變體對于血清無機磷水平的作用。血清無機磷水平在導入DNA載體4天后檢測。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示。柱體數(shù)字為動物數(shù)量。與模擬對照相比*P＜0.05(不對稱t-檢驗)。
圖2此圖顯示FGF23對于血清無機磷水平的作用。血清無機磷水平在導入DNA載體4天后檢測。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示。柱體數(shù)字為動物數(shù)量。與模擬對照相比*P＜0.05(不對稱t-檢驗)。
圖3此圖顯示FGF23和FGF23突變體對于血清1α，25(OH)2D3水平的作用。血清1α，25(OH)2D3水平在導入DNA載體4天后檢測?；旌?只動物所得血清用于檢測(n＝2，6只動物/組)。其數(shù)據(jù)以均值表示。
圖4此圖顯示FGF23突變體對于自腎分離的刷狀緣膜囊泡磷轉(zhuǎn)運活性的作用。檢測腎刷狀緣膜囊泡對導入小鼠的裸DNA載體的Pi攝取量(導入4天后)。取2只動物的腎用于檢測(n＝3，6動物/組)。其數(shù)據(jù)以均值表示。
圖5此照片顯示FGF-23(突變體)M2-F的SDS-PAGE(考馬斯亮藍(CBB)染色)分析的結(jié)果。M表示分子量標記(BIO-RAD Laboratories，寬范圍的分子量標記)。
圖6此圖顯示C末端缺失的M2FGF23突變體對血清磷水平的降低作用。“模擬”表示導入親代載體pCAGGS的小鼠?！癗ormal”表示的正常小鼠。
圖7此圖顯示PTH(1-34)和M2FGF23降低TPTX大鼠血清磷的作用。
圖8此圖顯示PTH(1-34)和M2FGF23對TPTX大鼠血清鈣的作用。
圖9此圖顯示PTH(1-34)和M2FGF23對TPTX大鼠腎臟磷酸分泌的作用。
具體實施方案在下文中，本發(fā)明參考實施例進行具體闡述，但這些實施例不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
實施例1克隆人FGF23的全長cDNA(ORF部分)克隆FGF23全長cDNA(ORF部分)采用PCR法。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)，向序列(5’ggAATTCTCgAgCCACCATgTTgggggCCCgCCTCAggCTCTg-3’/SEQ ID NO3；和5’ggAATTCTCgAgCTACTAgATgAACTTggCgAAgg-3’/SEQ ID NO4)添加EcoR I位點和Xho I位點以設計引物(登錄號AB037973)。之后，對于5’引物將Kozak序列(CCACC)添加至其ATG起始密碼子上游，并且兩個TGA終止子被添加到3’端序列。引物承包給Sawady Technology構(gòu)建。人心臟cDNA(Multiple cDNA試劑盒，Cat.No.CH-1101，OriGene)用作模板，QIAGEN PCR試劑盒(Cat.No.201223，QIAGEN)用于PCR反應。更為具體的是，0.75μl人心臟cDNA(Multiple cDNA試劑盒，OriGene)，2.5μl QIAGEN10×PCR緩沖液，0.5μl dNTP混合物(200mM)，0.25μl QIAGEN Taq DNA聚合酶，5.0μl 5×Q-溶液，0.5μl特定正向PCR引物(50μM，SEQ ID NO3)，0.5μl特定反向PCR引物(50μM，SEQ ID NO4)和15μl去離子蒸餾水(DDW)混合至PCR反應總體積為25μl。此PCR反應是用熱循環(huán)儀ABI2400按如下條件進行初次變性95℃2分鐘，2步穿梭(shuttle)PCR的35輪循環(huán)(94℃40秒，然后60℃1分鐘)，延伸反應72℃7分鐘以完成PCR反應。之后用1.0％瓊脂糖凝膠電泳確認PCR反應擴增產(chǎn)物。結(jié)果呈現(xiàn)為一條特異性條帶位于750bp附近。再用TOPO TA克隆試劑盒(Cat.No.K45000-01，Invitrogen)，用2μl PCR反應溶液將擴增的DNA亞克隆至TA載體pCR2.1。其后步驟根據(jù)試劑盒提供的流程。然后，對用TA克隆的克隆#3進行核苷酸序列分析，該分析是來用M13的M4引物(Cat.No.3832A，TaKaRa)，M13的RV引物(Cat.No.3830A，TaKaRa)，引物SEQ ID NO5(5’CgCACCCCATCAgACCATCT-3’) 和引物SEQ ID NO6(5’gCAgTTCTCCgggTCgAAATA-3’)在ABI377DNA測序儀上進行的。結(jié)果是克隆#3的內(nèi)部序列與人FGF23的完全吻合。最后完成FGF23的克隆。
實施例2人FGF突變體(R176Q，R179Q，R179W，R176Q+R179Q和R176Q+R179W)的制備以人FGF23作為模板，F(xiàn)GF突變體R176Q(M1)，R179Q(M2)，R179W(M3)，R176Q+R179Q(M4)和R176Q+R179W(M5)得以制備。根據(jù)文獻(“常染色體顯性低磷酸鹽血佝僂病與FGF23的突變之間的關聯(lián)”，NatureGenetics.Vol.26，p345-348，November 2000)，三種突變體527G？A(R176Q)，536G-A(R179Q)和535C-T(R179W)，以及它們的組合，M4(R176Q+R179Q)和M5(R176Q+R179W)可自人FGF23制備。引物合成承包給SawadyTechnology。所用引物的核苷酸序列如下5’CACggCAgCACACCCggAgC-3’(SEQ ID NO7)；5’CACggCggCACACCCAgAgC-3’(SEQ ID NO8)；5’CACggCggCACACCTggAgC-3’(SEQ ID NO9)；5’CACggCAgCACACCCAgAgC-3’(SEQ ID NO10)；和5’-CACggCAgCACACCTggAgC-3’(SEQ ID NO11)。
誘變用包含如下3個步驟的方法進行經(jīng)過第一次PCR制備用于誘變的部分片段，制備含第二次PCR中的突變的全長突變體的模板，最后在第三次PCR中得到完全的突變體。具體為0.2μl人FGF23克隆#3(40ng/μl)，5μl TaKaRa EX 10×PCR緩沖液，4μl dNTP混合物(50μM)，0.5μl TaKaRaExTaq DNA聚合酶，0.5μl特定突變體引物(50μM，SEQ ID NOs7，8，9，10或11)，0.5μl特定反向PCR引物(50μM，SEQ ID NO4)和39.3μl DDW混合至總體積50μl，以在熱循環(huán)儀ABI2400上進行PCR反應。反應條件如下初次變性95℃2分鐘，2步穿梭PCR的35輪循環(huán)(94℃40秒，然后60℃30秒)，最后延伸反應72℃4分鐘以完成反應。之后用1.0％瓊脂糖凝膠電泳確認PCR反應擴增產(chǎn)物。結(jié)果呈現(xiàn)為一條特異性條帶位于200bp附近。用QIAquick Gel Extraction Kit(Cat.No.28704，QIAGEN)按試劑盒提供的流程從膠中純化每條特異性擴增的片段。之后，用該純化片段(突變體部分序列)，進行第二次PCR反應(制備全長突變體模板)。用1μl純化片段作為引物，0.1μl人FGF23克隆#3(40ng/μl)，2.5μl TaKaRa EX 10×PCR緩沖液，2μldNTP混合物(50μM)，0.25μl TaKaRa ExTaq DNA聚合酶，和18.15μl DDW混合至總體積24μL，以在熱循環(huán)儀ABI2400上進行第二次PCR反應。反應條件如下初次變性95℃2分鐘，3步循環(huán)PCR的5輪循環(huán)(94℃1分鐘，60℃1分鐘，然后72℃1分鐘)以完成第二次PCR反應。之后，將0.5μl特定正向PCR引物(50μM，SEQ ID NO3)和0.5μl特定反向PCR引物(50μM，SEQID NO4)加入此反應溶液達到總體積25μl，在熱循環(huán)儀ABI2400上以如下反應條件進行第三次PCR反應初次變性95℃2分鐘，2步穿梭PCR的35輪循環(huán)(94℃40秒，然后60℃1分鐘)，最后延伸反應72℃7分鐘以完成PCR反應。之后用1.0％瓊脂糖凝膠電泳確認PCR反應的最終擴增產(chǎn)物，其顯示為一條特異性擴增的條帶位于750bp附近。
根據(jù)類似實施例1的方法進行其后的分析。具體為在內(nèi)部序列的TA克隆之后進行內(nèi)部序列的核苷酸序列分析。其結(jié)果為成功獲得各自含有所需突變的突變體克隆。
實施例3表達載體制備每個克隆的表達載體都是通過將FGF23的各自的內(nèi)部序列和每種突變體(M1到M5)插入到pCAGGS3制備。具體為每個克隆都用EcoRI限制性酶切割，得到的EcoRI片段用QIAquick Gel Extraction Kit(Cat.No.28704，QIAGEN)純化以插入到EcoRI切割的pCAGGS3。載體分別稱為pCGF23和pCGFM1到pCGFM5。
實施例4無內(nèi)毒素的質(zhì)粒的制備為直接體內(nèi)用藥質(zhì)粒DNA，進行質(zhì)粒純化時添加了內(nèi)毒素去除處理。更具體地，pCGF23和pCGFM1到pCGFM5可用Endofree plasmid MaxiKit(Cat.No.12362，QIAGEN)根據(jù)其提供的流程純化成無內(nèi)毒素型質(zhì)粒。
實施例5添加C末端FLAG-標記至FGF-23和M2(R179Q)在C末端含有FLAG序列的突變體可用模板為pCGF23和pCGFM2，引物為含有SEQ ID NO3序列和FLAG序列的SEQ ID NO12來制備。更具體地，1μl pCGF23或pCGFM2(30ng/μL)，2.5μl TaKaRa EX 10×PCR緩沖液，2μl dNTP混合物(50μM)，0.25μl TaKaRa ExTaq DNA聚合酶，0.5μl特定正向PCR引物(50μM，SEQ ID NO11)，0.5μl特定反向PCR引物(50μM，5’ggATCCgAATTCATATgTCACTTATCgTCgTCATCCTTgTAATCgATGAACTTggCgAAgg-3’/SEQ ID NO12)和18.5μl DDW混合至總體積25μl，以在熱循環(huán)儀ABI2400上進行PCR反應。反應條件如下初次變性95℃2分鐘，2步穿梭PCR的30輪循環(huán)(94℃30秒，然后60℃1分鐘)，最后延伸反應72℃7分鐘以完成PCR反應。之后用1.0％瓊脂糖凝膠電泳確認PCR反應的最終擴增產(chǎn)物，其顯示為一條特異性擴增的條帶位于800bp附近。其后的分析用類似實施例1到4的方法進行，最后制備pCGF23-F和pCGFM2-F表達載體。
實施例6添加N末端FLAG-標記至FGF-23和M2(R179Q)含N末端FLAG標記的FGF23表達載體用如下PCR法構(gòu)建。第一階段PCR反應(25個循環(huán)即96℃15秒，55℃15秒，然后72℃2分鐘)用3ngpCG23作模板，100pmol每種特定的正向PCR引物和23N FLAG R(GCCCTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGGCTCTGAGGACGCTC/SEQ IDNO13)或23NR1(GGCTCGAGTCAGATGAACTTGGCGAAGG/ SEQ IDNO14)與23NFLAGF(GATGACGACGATAAGGGCGGAGGTTCCAGAGCCTATCCCAATG/SEQ ID NO15)作為引物組，并用此處提供的TaKaRa ExTaq及其緩沖液來進行。在通過Microcon-30(Millipore)過濾從PCR反應產(chǎn)物中除去引物后，得每種PCR反應產(chǎn)物的混合物用作模板，F(xiàn)GFF與23R1作為引物組，在與第一階段同樣的條件下進行第二階段的PCR反應。反應完成后，用瓊脂糖電泳純化PCR反應產(chǎn)物。然后用TOPO Cloning Kit(Invitrogen)來克隆片段，測定其DNA序列以確認導入了所需的突變而非不需要的突變。制備含有確認序列的質(zhì)粒，用EcoRI切割，收集所得片段用于插入到已經(jīng)EcoRI切割的pCAGGS3中。最后，確認片段插入的方向后，此表達載體被稱為pCGF23NF。
攜帶N末端FLAG標記的FGF23M2載體可用上述同種方法制備。不同的是在第一階段PCRpCGFM2用作模板，該載體稱為pCGFM23NF。
實施例7制造表達載體用于裸DNA注入的動物實驗使用裸DNA注射法，檢測FGF23及其突變體能否直接或間接影響成年小鼠磷代謝。
所用材料如下FGF23表達載體(pCGF23)R176Q FGF23突變體表達載體((pCGFM1))R179Q FGF23突變體表達載體(pCGFM2)R179W FGF23突變體表達載體(pCGFM3)R176QR179Q FGF23突變體表達載體(pCGFM4)
R176QR179WFGF23突變體表達載體(pCGFM5)<對照物(陰性對照物)>
模擬載體(pCAGGS)劑型10mMTris/1mMEDTA(pH8.0)溶液保存-20℃，避光保存<制備方法>
劑型為溶液，制備方法依照TransIT In Vivo Gene Delivery System(Pan Vera)(TransITIn Vivo Gene Delivery System(Pan Vera)標準流程)。10μg模擬載體，F(xiàn)GF23表達載體或FGF23突變體表達載體用于給藥每只動物。10μl TransIT聚合物溶液及適量無菌水在50mL Falcon試管中混合至終體積200μl。室溫放置5分鐘后，2.8mL 1×Delivery溶液加至上述200μl混合溶液以達到給藥溶液總體積3.0mL。如給藥6只動物，制備用于7只動物即21mL的溶液量。給藥溶液在制備的當天用完。
本實驗所用動物及其居住條件如下<所用動物>
動物種類小鼠譜系JclCD-1(ICR)或CrjCD-1(ICR)性別雄性體重35g到40g年齡給藥時為8到9周提供者CLEA日本或Charles River日本安樂死方法麻醉下放血順應時間大約2周分組方法隨機分配<繁殖環(huán)境>
室溫24±2℃相對濕度55±10％通風頻率10到30次/小時照明時間5:00到19:00飼養(yǎng)CE-2(CLEA日本)隨意飲水自來水
<實驗方法>
靜脈內(nèi)給藥每劑3mL，8秒鐘內(nèi)給藥總劑量。
<樣本收集>
(1)血清在給藥后第4天，醚麻醉狀態(tài)下從腹主動脈收集全血。收集血液置于Separapid tube mini(Sekisui chemical)中，離心(1,400×g，10分鐘，4℃)以分離血清。此血清儲存于設置為-20℃的冰箱直到檢測。
(2)尿在給藥后第3天，將小鼠置于玻璃代謝籠(METABOLICA，SUGIYAMA-GEN IRIKI)，匯聚第四天24小時尿收集物。檢測前將此尿一直儲存于設置為-20℃的冰箱。
(3)腎收集血清后，雙腎摘除，去被膜，并對刷狀緣膜囊泡進行純化。
<各項指標檢測>
血清和尿中無機磷(Pi)，鈣(Ca)，尿素氮(UN)和肌酸酐(CRE)用自動分析儀檢測(Hitachi 7170E型)。25-羥基維生素D和24，25-二羥基維生素D用競爭性蛋白質(zhì)結(jié)合試驗(CPBA)來檢測，而1α，25-二羥基維生素D則用RIA2抗體法來檢測。
<統(tǒng)計分析方法>
不對稱t-檢驗在模擬載體給藥組和FGF23表達載體給藥組或每個FGF23突變體表達載體給藥組之間進行。顯著性水平為5％(雙尾)。SASVer.6.12在此用作分析軟件。
其結(jié)果如圖1所示，對血清生化作用方面，與模擬給藥組比較，不考慮突變體類型，給藥3種FGF23突變體表達載體(它們導入了從常染色體顯性低磷酸鹽血佝僂病(ADHR)病人鑒定出的點突變)中任何一種(即FGF23-M1，F(xiàn)GF23-M2或FF23-M3)的給藥組，血磷水平可見顯著下降。然而，在給藥具有這些點突變的組合的兩種突變體表達載體中任何一種(即FGF23-M4或FGF23-M5)的給藥組，盡管可見類似的血清磷水平降低作用，但不能確定由于點突變的組合帶來了累加或協(xié)同作用。野生型FGF23(FGF23-Wild)給藥組，無血清磷水平降低作用(圖2)。
表1所示，比較模擬組和野生型FGF23組或FGF23-M2組，其它血清生化指標(鈣，肌酸酐和尿素氮)無明顯差異。
表1

而且，關于突變體對于尿生化的作用結(jié)果，如表2所示，比較FGF23-M2給藥組和模擬組，在FGF23-M2給藥組可見每天磷分泌水平升高的趨勢，然而差異不明顯。
表2

而且，關于突變體對于血清1α，25(OH)2D3的作用結(jié)果，如圖3所示，與模擬給藥組相比，F(xiàn)GF23-M2給藥組和野生型FGF23組可見1α，25(OH)2D3水平顯著下降。在野生型FGF23組，1α，25(OH)2D3水平降至大約一半，而在FGF23-M2給藥組，1α，25(OH)2D3水平降低到檢測靈敏度以下。
另一方面，在模擬給藥組，野生型FGF23給藥組和FGF23-M2給藥組中，體內(nèi)前體25(OH)D3水平無明顯差異。然而，盡管在野生型FGF23給藥組和模擬給藥組之間24，25(OH)2D3水平無差異，但在FGF23-M2給藥組觀察到其水平明顯下降(表3)。
表3

<刷狀緣膜囊泡純化>
刷狀緣膜囊泡純化是用鎂沉淀法進行的。更具體為將冰浴MET緩沖液(60mM甘露醇，1mM EGTA，2.5mM Tris/HCl，pH7.1)加至收集的腎中，用PHYSCOTRON在18,000rpm下均化1分鐘后，加入1/10體積的1M MgCl2，攪拌并置于冰上15分鐘。通過低速離心(2,000×g，15分鐘，4℃)去除未均化成分，高速離心上清(24,000×g，30分鐘，4℃)以取得沉淀。將MET緩沖液加到沉淀中，進一步將其用Teflon均漿器(1,000rpm，10擊(Strokes))均化。再次加入1/10體積的1M MgCl2，攪拌并置于冰上15分鐘，低速離心此混合物(2,000×g，15分鐘，4℃)后，高速離心(24,000×g，30分鐘，4℃)上清。將Transport緩沖液-K(100mM甘露醇，20mMHEPES/Trs，pH7.4)加至得到的沉淀，用塑料針筒(20G和27G針)反復抽取推放以此得到刷狀緣膜囊泡。
<磷轉(zhuǎn)運活性測定>
快速過濾法適用于用刷狀緣膜測定磷轉(zhuǎn)運活性。更具體地，20μL刷狀緣膜囊泡和80μL反應液(100mM甘露醇，20mM HEPES/Tris，pH7.4，125mMNaCl，125nM32P-KH2PO4)在25℃反應1分鐘，再加入1mL淬滅溶液(100mM甘露醇，100mM氯化膽堿，20mM MgSO4，5mM KH2PO4，20mM HEPES/Tris，pH7.4)以終止反應。然后將反應溶液通過硝酸纖維素濾膜(孔徑0.45μm，2.5cm直徑)抽吸過濾，此硝酸纖維素濾膜先用5mL淬滅溶液清洗。再用液體閃爍計數(shù)器TRI-CARB2700TR(Beckman)檢測誘捕在濾膜上的放射性作為總體磷轉(zhuǎn)運活性。鈉不依賴性磷轉(zhuǎn)運活性通過在反應溶液中用125mM KCl替代125mM NaCl來檢測。鈉依賴性磷轉(zhuǎn)運活性作為總體磷轉(zhuǎn)運活性和鈉不依賴性磷轉(zhuǎn)運活性的差來計算。此兩種活性都用每分鐘每單位蛋白質(zhì)吸收的磷量來表示(pmoles/mg蛋白質(zhì)/分鐘)，在刷狀緣膜囊泡的蛋白質(zhì)量用BCA蛋白質(zhì)檢測試劑(PIERCE)來檢測。
其結(jié)果如圖4所示，與模擬給藥組相比，F(xiàn)GF23-M2給藥組的腎鈉依賴性磷轉(zhuǎn)運載體(Na/Pi)活性顯著降低。另一方面，鈉不依賴性磷轉(zhuǎn)運活性無變化。
實施例8構(gòu)建C末端缺失型M2FGF23突變體表達載體C末端缺失型M2FGF23突變體表達載體如下所述用PCR法來構(gòu)建。PCR反應(25循環(huán)96℃15秒，55℃15秒，然后72℃2分鐘)用TaKaRa ExTaq及其提供的緩沖液來進行。此反應用3ng pCGFM2NF作為模板，100pmol每種特異性正向PCR引物和dC188(GGCTCGAGTCAGTCCCGCTCCGAGTC/SEQ ID NO16)，dC194(GGCTCGAGTCACTTCAGCACGTTCAGGGG/SEQ ID NO17)，dC200(GGCTCGAGTCAGGTCATCCGGGCCCGGGG/SEQ ID NO18)，dC210(GGCTCGAGTCAGAGCTCCTGTGAACAGGA/SEQ ID NO19)，dC217(GGCTCGAGTCAGCTGTTGTCCTCGGCGCT/SEQ ID NO20)，dC223(GGCTCGAGTCAGTCACTGGCCATCGGGCT/SEQ ID NO21)，dC240(GGCTCGAGTCAGCCCGTTCCCCCAGCGTG/SEQ ID NO22)，或dC245(GGCTCGAGTCAGCGGCAGCCTTCCGGGCC/SEQ ID NO23)作為引物組。反應終止后，PCR反應產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳純化，所得片段用TOPO Cloning Kit(Invitrogen)來克隆。然后測定他們的DNA序列以確認導入的為需要的突變而非不需要的突變。制備有確認序列的質(zhì)粒，之后用EcoRI切割，收集片段再插入已用EcoRI切割的pCAG GS3。由此獲得的表達載體被分別稱為pCGdC188(dC188)，pCGdC194(dC194)，pCGdC200(dC200)，pCGdC210(dC210)，pCGdC217(dC217)，pCGdC223(dC233)，pCGdC240(dC240)和pCGdC245(dC245)。
實施例9C末端缺失型M2FGF23突變體蛋白質(zhì)的表達1×105COS細胞懸浮在1mL DMEM(10％FCS)培養(yǎng)基(GIBCO)中，并鋪板于一個6孔平板上。過夜培養(yǎng)后，1μg此種表達載體(實施例8中所示的pCGdC188到pCGdC245)通過3μLFuGene(Boeringer)轉(zhuǎn)染至細胞中并繼續(xù)過夜培養(yǎng)。第二天，將培養(yǎng)基置換為CHO-S-SFMII，繼續(xù)培養(yǎng)2天。兩天之后，收集培養(yǎng)基，用Western Blotting法用抗FLAG抗體(M2)(SIGMA)來分析培養(yǎng)基中表達的突變體蛋白質(zhì)，以此確認突變體蛋白質(zhì)的表達。
實施例10重組FGF-23突變體(M2)在COS細胞中的瞬時表達5×106細胞懸浮在400μLDMEM(10％)FCS培養(yǎng)基(GIBCO)中，加入10μgpCGFM2-F表達載體后移至一0.4cm電穿孔管(BIO-RAD Laboratories)中。用Gene-pulser(BIO-RAD Laboratories)在0.26kV，電阻8，且960mF的條件下進行電穿孔。之后，在30mLDMEM(10％FCS)培養(yǎng)基中懸浮細胞溶液，移至一175cm2的細胞培養(yǎng)瓶(FALCON)中，在CO2孵箱于37℃靜置一日夜。第二天，將培養(yǎng)基置換為30mL CHO-S-SFMII培養(yǎng)基(GIBCO)，繼續(xù)培養(yǎng)細胞3天。收集的培養(yǎng)基在3,000rpm離心15分鐘，以去除細胞，再用Western Blotting法用抗FLAG抗體(M2)(SIGMA)來分析培養(yǎng)基以確認重組FGF-23突變體(M2)-F的表達。
實施例11用親和柱純化重組FGF-23(M2)-F純化重組FGF-23(M2)-F是用抗FLAG抗體親和柱(SIGMA)來進行的。此層析法是用GradiFrac系統(tǒng)(Pharmacia)來執(zhí)行的。用PBS-T平衡親和柱后，上樣含實施例10制備的表達重組FGF-23突變體(M2)-F的培養(yǎng)基，并用甘氨酸鹽酸緩沖液(pH3.5)洗脫。然后分級分離主峰并用SDS-PAGE分析對其進行。因為一條位于所需分子量附近的接近單一的條帶用考馬斯亮藍(CBB)染色被確認，重組體的制備結(jié)束(圖5)。
實施例12缺失突變的動物實驗給藥制劑的制備是根據(jù)TransIT In VIvo Gene Delivery System(PanVera)的流程。將10μL TransIT溶液及適量無菌水加入10μg圖6所示的不同表達載體中(模擬與實施例7同)，總體積達200μL?；旌洗巳芤翰⑹覝叵蚂o置5分鐘，每200μL添加2.8mL1×Delivery溶液，從而獲得每只動物的給藥溶液量為3.0mL。當給藥6只動物時，需制備量達7只動物即21mL的溶液。給藥溶液僅限當天使用。
自Charles River日本購買的8到9周齡的雌性小鼠CD-1(ICR)(35g到40g)在1周順應期后接受實驗。含有表達載體的總量3mL的給藥制劑通過尾靜脈在8秒內(nèi)給藥。給藥4天后，醚麻醉下從腹主動脈收集全血。將收集的血置于Separapid tube mini(Sekisui Chemical)并離心(1,400×g，10分鐘，4℃)以分離血清。
血清中無機磷(Pi)，鈣(Ca)，尿素氮(UN)，和肌酸酐(CRE)用自動分析儀(Hitachi 7170E型)來檢測。
結(jié)果如圖6所示。
M2FGF23突變體由251個氨基酸構(gòu)成。當此突變體C末端部分縮短時，含氨基酸至位置200的突變體dC200也具有同樣的降低血清磷的作用。然而，當C末端進一步縮短到dC194(含氨基酸至位置194)時，或dC188(含氨基酸至位置188)時，此作用被削弱或喪失。在此推測，在ADHR病人，氨基酸在位置176或位置179的突變使FGF23不易受蛋白質(zhì)水解的調(diào)節(jié)作用，其結(jié)果為血中過量的FGF23存在導致低磷酸血癥。所以，根據(jù)本發(fā)明結(jié)果，我們認為氨基酸位置179到200包括對于血清磷降低作用至關重要的位點。
實施例13FGF23對甲狀腺-甲狀旁腺切除大鼠的作用一8周齡的雄性大鼠Sprague-Dawley(SD)接受甲狀腺-甲狀旁腺-切除術(TPTX)。幾天后，測定其離子鈣以確認手術是否成功。然后，向大鼠股靜脈中插入導管，連接尿袋，將其限制在Ballman籠中。
用Harvard灌注泵，將PTH(1-34)(0.3nmol/mL)，具有C-FLAG標記的M2FGF23蛋白質(zhì)(6μg/mL)，或載體(0.05％Tween80/鹽水)以1mL/小時的速度灌注給藥6小時。在開始灌注4小時到6小時內(nèi)收集尿直至給藥結(jié)束。終止給藥后從腹主動脈收集全血。此收集的血液于3,000rpm離心10分鐘。將血清和尿的不可溶級分分離并用Hitachi7170型自動分析儀檢測無機磷、鈣和肌酸酐。結(jié)果如圖7到圖9所示。
根據(jù)圖7，因TPTX而升高的大鼠血清磷濃度已因給藥PTH(1-34)而正常。而且，通過給藥M2FGF23也同樣獲得正常。另一方面，雖然給藥PTH(1-34)可糾正因TPTX造成的血清鈣濃度下降，但給藥M2FGF23對其幾乎無作用(圖8)。這表明M2FGF23對血清磷水平的作用并非由PTH引起，因此不影響血清鈣水平。既然尿中無機磷/肌酸酐比值會隨PTH(1-34)給藥而升高，因此人們認為血清磷被分泌到尿中。另一方面，無機磷/肌酸酐比值不因給藥M2FGF23而變化。因此，血清磷可能已返回骨形成了羥基磷灰石(圖9)。
工業(yè)實用性本發(fā)明提供FGF23蛋白質(zhì)突變體。既然本發(fā)明的FGF23突變體具有降低血磷水平的作用，人們期望它們能用作高磷酸鹽血癥的治療和預防制劑。而且，編碼本發(fā)明FGF23突變體的DNA通過導入體內(nèi)并在體內(nèi)表達可降低血磷水平。因此，人們希望這些DNA可應用于抗高磷酸鹽血癥的基因治療。
序列表<110>中外制藥株式會社(CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISYA)<120>降低血磷水平的人FGF23蛋白突變體<130>C1-A0019Y1P<140>
<141>
<150>JP2000-396316<151>2000-12-26<150>JP2001-161370<151>2001-05-29<160>23<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>756<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(753)<400>1atg ttg ggg gcc cgc ctc agg ctc tgg gtc tgt gcc ttg tgc agc gtc 48Met Leu Gly Ala Arg Leu Arg Leu Trp Val Cys Ala Leu Cys Ser Val1 5 10 15tgc agc atg agc gtc ctc aga gcc tat ccc aat gcc tcc cca ctg ctc 96Cys Ser Met Ser Val Leu Arg Ala Tyr Pro Asn Ala Ser Pro Leu Leu20 25 30ggc tcc agc tgg ggt ggc ctg atc cac ctg tac aca gcc aca gcc agg 144Gly Ser Ser Trp Gly Gly Leu Ile His Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg35 40 45aac agc tac cac ctg cag atc cac aag aat ggc cat gtg gat ggc gca 192
Asn Ser Tyr His Leu Gln Ile His Lys Asn Gly His Val Asp Gly Ala50 55 60ccc cat cag acc atc tac agt gcc ctg atg atc aga tca gag gat gct 240Pro His Gln Thr Ile Tyr Ser Ala Leu Met Ile Arg Ser Glu Asp Ala65 70 75 80ggc ttt gtg gtg att aca ggt gtg atg agc aga aga tac ctc tgc atg 288Gly Phe Val Val Ile Thr Gly Val Met Ser Arg Arg Tyr Leu Cys Met85 90 95gat ttc aga ggc aac att ttt gga tca cac tat ttc gac ccg gag aac 336Asp Phe Arg Gly Asn Ile Phe Gly Ser His Tyr Phe Asp Pro Glu Asn100 105 110tgc agg ttc caa cac cag acg ctg gaa aac ggg tac gac gtc tac cac 384Cys Arg Phe Gln His Gln Thr Leu Glu Asn Gly Tyr Asp Val Tyr His115 120 125tct cct cag tat cac ttc ctg gtc agt ctg ggc cgg gcg aag aga gcc 432Ser Pro Gln Tyr His Phe Leu Val Ser Leu Gly Arg Ala Lys Arg Ala130 135 140ttc ctg cca ggc atg aac cca ccc ccg tac tcc cag ttc ctg tcc cgg 480Phe Leu Pro Gly Met Asn Pro Pro Pro Tyr Ser Gln Phe Leu Ser Arg145 150 155 160agg aac gag atc ccc cta att cac ttc aac acc ccc ata cca cgg cgg 528Arg Asn Glu Ile Pro Leu Ile His Phe Asn Thr Pro Ile Pro Arg Arg165 170 175cac acc cgg agc gcc gag gac gac tcg gag cgg gac ccc ctg aac gtg 576His Thr Arg Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val180 185190ctg aag ccc cgg gcc cgg atg acc ccg gcc ccg gcc tcc tgt tca cag 624Leu Lys Pro Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Cys Ser Gln195 200 205gag ctc ccg agc gcc gag gac aac agc ccg atg gcc agt gac cca tta 672Glu Leu Pro Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu210 215 220ggg gtg gtc agg ggc ggt cga gtg aac acg cac gct ggg gga acg ggc 720
Gly Val Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly Gly Thr Gly225 230 235 240ccg gaa ggc tgc cgc ccc ttc gcc aag ttc atc tag 756Pro Glu Gly Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe Ile245 250<210>2<211>251<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Met Leu Gly Ala Arg Leu Arg Leu Trp Val Cys Ala Leu Cys Ser Val1 5 10 15Cys Ser Met Ser Val Leu Arg Ala Tyr Pro Asn Ala Ser Pro Leu Leu20 25 30Gly Ser Ser Trp Gly Gly Leu Ile His Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg35 40 45Asn Ser Tyr His Leu Gln Ile His Lys Asn Gly His Val Asp Gly Ala50 55 60Pro His Gln Thr Ile Tyr Ser Ala Leu Met Ile Arg Ser Glu Asp Ala65 70 75 80Gly Phe Val Val Ile Thr Gly Val Met Ser Arg Arg Tyr Leu Cys Met85 90 95Asp Phe Arg Gly Asn Ile Phe Gly Ser His Tyr Phe Asp Pro Glu Asn100 105 110Cys Arg Phe Gln His Gln Thr Leu Glu Asn Gly Tyr Asp Val Tyr His115 120 125Ser Pro Gln Tyr His Phe Leu Val Ser Leu Gly Arg Ala Lys Arg Ala130 135 140Phe Leu Pro Gly Met Asn Pro Pro Pro Tyr Ser Gln Phe Leu Ser Arg145 150 155 160
Arg Asn Glu Ile Pro Leu Ile His Phe Asn Thr Pro Ile Pro Arg Arg165 170 175His Thr Arg Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val180 185 190Leu Lys Pro Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Cys Ser Gln195 200 205Glu Leu Pro Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu210 215 220Gly Val Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly Gly Thr Gly225 230 235 240Pro Glu Gly Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe Ile245 250<210>3<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對人工序列的描述人工合成的引物序列<400>3ggaattctcg agccaccatg ttgggggccc gcctcaggct ctg 43<210>4<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對人工序列的描述人工合成的引物序列<400>4ggaattctcg agctactaga tgaacttggc gaagg 35<210>5
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對人工序列的描述人工合成的引物序列<400>5cgcaccccat cagaccatct20<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對人工序列的描述人工合成的引物序列<400>6gcagttctcc gggtcgaaat a 21<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對人工序列的描述人工合成的引物序列<400>7cacggcagca cacccggagc20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對人工序列的描述人工合成的引物序列<400>8cacggcggca cacccagagc20
<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對人工序列的描述人工合成的引物序列<400>9cacggcggca cacctggagc 20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對人工序列的描述人工合成的引物序列<400>10cacggcagca cacccagagc 20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對人工序列的描述人工合成的引物序列<400>11cacggcagca cacctggagc 20<210>12<211>61<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對人工序列的描述人工合成的引物序列<400>12ggatccgaat tcatatgtca cttatcgtcg tcatccttgt aatcgatgaa cttggcgaag 60g 61<210>13<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對人工序列的描述人工合成的引物序列<400>13gcccttatcg tcgtcatcct tgtaatcggc tctgaggacg ctc 43<210>14<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對人工序列的描述人工合成的引物序列<400>14ggctcgagtc agatgaactt ggcgaagg28<210>15<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對人工序列的描述人工合成的引物序列<400>15gatgacgacg ataagggcgg aggttccaga gcctatccca atg 43<210>16
<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對人工序列的描述人工合成的引物序列<400>16ggctcgagtc agtcccgctc cgagtc26<210>17<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對人工序列的描述人工合成的引物序列<400>17ggctcgagtc acttcagcac gttcagggg 29<210>18<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對人工序列的描述人工合成的引物序列<400>18ggctcgagtc aggtcatccg ggcccgggg29<210>19<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對人工序列的描述人工合成的引物序列<400>19
ggctcgagtc agagctcctg tgaacagga 29<210>20<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對人工序列的描述人工合成的引物序列<400>20ggctcgagtc agctgttgtc ctcggcgct29<210>21<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對人工序列的描述人工合成的引物序列<400>21ggctcgagtc agtcactggc catcgggct 29<210>22<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>對人工序列的描述人工合成的引物序列<400>22ggctcgagtc agcccgttcc cccagcgtg 29<210>23<211>29<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述人工合成的引物序列<400>23ggctcgagtc agcggcagcc ttccgggcc 29
權(quán)利要求
1.一種DNA，編碼含有氨基酸序列為SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)，此氨基酸序列含有選自如下的突變位置176的精氨酸突變?yōu)楣劝滨０?，位?79的精氨酸突變?yōu)楣劝滨０坊蛭恢?79的精氨酸突變?yōu)樯彼帷?br> 2.一種編碼包含蛋白質(zhì)的至少1到190位氨基酸序列的片段的DNA，該蛋白質(zhì)含有氨基酸序列SEQ ID NO2，該序列含有選自如下的突變位置176的精氨酸突變?yōu)楣劝滨０罚恢?79的精氨酸突變?yōu)楣劝滨０坊蛭恢?79的精氨酸突變?yōu)樯彼帷?br> 3.一種載體，其中插入了根據(jù)權(quán)利要求1或2的DNA。
4.一種轉(zhuǎn)化細胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求1或2的DNA或根據(jù)權(quán)利要求3的載體。
5.一種含有氨基酸序列為SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)，該序列含有選自如下的突變位置176的精氨酸突變?yōu)楣劝滨０?，位?79的精氨酸突變?yōu)楣劝滨０坊蛭恢?79的精氨酸突變?yōu)樯彼帷?br> 6.一種含有蛋白質(zhì)至少其位置1到190的氨基酸序列的片段，該蛋白質(zhì)含有氨基酸序列SEQ ID NO2，該序列包含選自如下的突變位置176的精氨酸突變?yōu)楣劝滨０?，位?79的精氨酸突變?yōu)楣劝滨０坊蛭恢?79的精氨酸突變?yōu)樯彼帷?br> 7.一種制備根據(jù)權(quán)利要求5或6的蛋白質(zhì)的方法，其包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)化細胞的步驟和從此轉(zhuǎn)化細胞或其培養(yǎng)上清收集表達蛋白質(zhì)的步驟。
8.一種降低血磷水平的藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1或2的DNA，根據(jù)權(quán)利要求3的載體或根據(jù)權(quán)利要求5或6的蛋白質(zhì)。
9.權(quán)利要求8的藥物組合物，其不影響血鈣水平。
10.權(quán)利要求8或9的藥物組合物，用于治療高磷酸鹽血癥。
11.一種治療高磷酸鹽血癥的方法，包括向患者給藥根據(jù)權(quán)利要求1或2的DNA的步驟。
全文摘要
分離編碼人FGF23蛋白質(zhì)的全長cDNA，在此cDNA上有單個氨基酸替代的突變體，其為誘變法所構(gòu)建。這些突變體于體內(nèi)表達時，具有降低血磷水平的作用。人們希望這些突變體及其編碼DNA可作為高磷酸鹽血癥的藥物治療劑，或其基因治療的藥物治療劑。
文檔編號C12N15/12GK1492927SQ0182283
公開日2004年4月28日 申請日期2001年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月26日
發(fā)明者伊藤浩孝, 福島直, 齋藤一史, 草野健一郎, 一郎, 史 申請人:中外制藥株式會社