專利名稱：對致病微生物的生長具有抑制能力和抗變應(yīng)性作用的新的耐酸性沙克乳酸桿菌益生菌-65的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新乳酸菌，即沙克乳酸桿菌益生菌-65及其用途。更特別的是，本發(fā)明涉及耐酸、耐膽汁酸和耐抗生素以及有效抑制有害致病微生物生長和具有抗變應(yīng)性活性的沙克乳酸桿菌益生菌-65 (Lactobacillus sakei Probio-65 )和包含此微生物或其培養(yǎng)物的藥物、飼料、食品和化妝品組合物。
背景技術(shù)：
特應(yīng)性皮炎是一種炎性皮膚病，其特征是嚴重瘙癢和濕瘆性皮膚病損且主要影響嬰 兒和兒童。特別是在慢性案例中，特應(yīng)性皮炎常常在冬天復發(fā)。如此發(fā)生的特應(yīng)性皮炎 常常發(fā)展為支氣管哮喘或變應(yīng)性鼻炎，并且它有時在成人中復發(fā)。使特應(yīng)性皮炎患者十 分痛苦的瘙癢可能導致降低適應(yīng)新環(huán)境、體力活動和工作效率的能力、失眠和情緒障礙。 伴有色素沉著的濕疹性皮膚病損引起丑陋的外觀，可能會妨礙正常的人際關(guān)系和社會活 動。而且，干燥和刺激性敏感的皮膚還常常發(fā)展為刺激性接觸性皮炎，可能成為尋找工 作時的限制因素。近年來全世界特應(yīng)性皮炎的發(fā)病率增加，在韓國也在隨同變應(yīng)性疾病 的快速增加一起增加。根據(jù)韓國變應(yīng)性和呼吸系統(tǒng)疾病科學院(Korean Academy of Allergy and Respratory Disease) 2000年對43,045名小學和中學生進行的全國性調(diào)查， 24.9%的小學生和12.8%的中學生經(jīng)診斷患有特應(yīng)性皮炎。在韓國，特應(yīng)性皮炎的發(fā)病 率在過去十年增長了 50%,這個增長率比老年人高很多。也就是說，在成年人中觀察 到特應(yīng)性皮炎大約17%的高發(fā)病率。特應(yīng)性皮炎被認為是遺傳、免疫和環(huán)境因素相互作用引起的。遺傳因素包括特應(yīng)性 相關(guān)基因，主要是免疫基因。目前確認的特應(yīng)性相關(guān)基因包括人白細胞抗原(HLA)分子 和染色體6p、 T細胞受體(TCR)和染色體7p、 IgE高親和性受體(FcsRI-p)和染色體llq、 和IL-4和染色體5q。環(huán)境因素可能是家庭螨、家庭灰塵、真菌、從建筑材料或油漆釋 放至空氣中的有害物質(zhì)例如福爾馬林和曱苯、或用作食品添加劑的化學物質(zhì)或食品本 身。作為環(huán)境因素，金黃色葡萄球菌是特應(yīng)性皮炎惡化的繼發(fā)性原因。在特應(yīng)性皮炎病
人的濕滲性病損部位80-100%發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌集落。這遠遠高于健康皮膚上大約 5-30%的發(fā)生率。金黃色葡萄球菌使特應(yīng)性皮炎皮膚病損惡化，例如，逐漸增多的小膿 皰滲并且傳至其他人從而使他們易受導致特應(yīng)性皮炎的感染。有證據(jù)支持金黃色葡萄球 菌產(chǎn)生的外毒素在特應(yīng)性皮炎的惡化中作為超級抗原的觀點。此外毒素包括葡萄球菌腸 毒素A-D(SEA-D)和中毒性休克綜合征毒素-1(TSST-1),增加大約8倍IgE生成。特應(yīng)性皮炎患者通常用抗生素療法、抗組胺劑療法、類固醇療法、免疫療法等等治 療?？股丿煼ㄓ脕碜钄嗬^發(fā)性微生物感染例如如上所述的金黃色葡萄球菌。但是，抗 生素療法是有問題的，這是由于抗生素不適合的使用以及抗生素耐藥性金黃色葡萄球菌 系近來逐漸增加。全世界主要抗生素耐藥性菌林包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (MRSA)和耐曱氣西林凝固酶陰性金黃色葡萄球菌(MRCNS)。因此，由于世界性趨向是 避免抗生素濫用、抗生素的副作用和抗性抹的出現(xiàn)，迫切需要發(fā)展代替抗生素和其它藥 物的物質(zhì)。此外，已知為腸道菌群的多種微生物居住于人和動物腸內(nèi)。 一些微生物例如乳酸菌 已知對宿主動物有益，而其它微生物例如大腸桿菌、沙門氏菌或葡萄球菌對宿主有直接 或潛在的有害作用。在人和動物中，應(yīng)激增高、有害細菌的感染和外界環(huán)境的變化可能 破壞腸道菌群的平衡，導致有害微生物的快速生長。在此情況下，宿主動物的健康狀態(tài) 惡化。腸道菌群的此種變化引起變應(yīng)性疾病。如上所述，長期使用抗生素的療法使有害 微生物耐受抗生素，從而不能有效治療。作為此抗生素療法的選擇食物療法，當前益生菌越來越多引起人們的興趣。益生菌 是通過分離居住在人或動物腸道內(nèi)的有益微生物并將其制成劑型來制備。使用需氧菌、 厭氧菌、乳酸菌和酵母，主要使用乳酸菌。在傳統(tǒng)食品發(fā)酵和加工中乳酸菌有多種應(yīng)用。 乳酸菌還已知為長期安全的，并且一些菌抹被美國FDA列為"普遍公認安全(GRAS)"。 因此，用乳酸菌制備的益生菌具有以下多種優(yōu)點。它沒有抗生素濫用引起的副作用，并 且通過抑制有害腸內(nèi)微生物的異常發(fā)酵保持腸道菌群穩(wěn)定。益生菌還降低有害微生物感 染引起的疾病和通過增強免疫系統(tǒng)預防或治療變應(yīng)性疾病。在乳酸菌中，進行純?nèi)樗岚l(fā) 酵和雜乳酸發(fā)酵的乳酸桿菌是在動物包括人的腸道內(nèi)和乳制品和植物的發(fā)酵中天然發(fā) 現(xiàn)的。乳酸桿菌在腸道內(nèi)建立酸性環(huán)境，有助于抑制有害細菌例如大腸桿菌或梭狀芽孢 桿菌的增殖，緩解腹瀉和便秘，并且還提供其它健康益處包括免疫系統(tǒng)的增強、維生素 合成、抗癌保護和血清膽固醇水平降低。乳酸桿菌產(chǎn)生的Acidophillin被發(fā)現(xiàn)能抑制有 害微生物例如志賀氏桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌和大腸桿菌的生長。Acidophillin還能 通過抑制引起腹瀉的細菌的增殖和使腸道菌群正?；瘉硗Ｖ垢篂a。近來使用乳酸桿菌種的前述特征來開發(fā)益生菌和動物飼料的研究開展的十分活躍。 細菌性腹瀉51起體重增加的降低和飼養(yǎng)動物的死亡。為了預防細菌性腹瀉和增加飼養(yǎng)動 物的生產(chǎn)力，動物飼料通常補充抗生素物質(zhì)。但是，由于抗生素耐藥性細菌的出現(xiàn)和畜 產(chǎn)品中的殘余抗生素，許多國家的當前規(guī)定限制了抗生素在動物飼料中的使用而強調(diào)有 機飼養(yǎng)計劃。目前，使用益生菌作為使用抗生素的取代方法被強烈推薦。歐洲專利 0861905公開了一種新乳酸桿菌菌抹和包含此新菌抹的藥物組合物和用來治療胃腸道 病癥的乳制品。國際專利W099/29833公開了在食品和理療藥物中作為益生菌有效的副 干酪乳酸菌(Lactobacillus paracasei )。韓國專利提前公開的1998-78353公開了 一種屬 于乳酸菌屬的具有抑制有害微生物的活性的新耐酸微生物和包含此新微生物的用于家 畜的益生菌。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明者篩選出 一種能夠比常規(guī)益生菌更有效抑制有害微生物并且耐酸和耐膽汁 酸的益生菌4效生物。所以，本發(fā)明者從韓國泡菜(Kimchi)中分離且鑒定能夠有效抑制 使特應(yīng)性疾病惡化的因素金黃色葡萄球菌增殖的沙克乳酸桿菌益生菌-65 (Lactobacillus sakei Probio-65 )。此微生物發(fā)現(xiàn)對人和動物無毒因此是非常安全的，顯 示了對多種抗生素的抗藥性，并顯示了抑制廣語致病微生物包括致病菌金黃色葡萄球菌 生長、調(diào)節(jié)異常腸發(fā)酵和增強免疫系統(tǒng)的作用。因此，此微生物在藥物、飼料、食品和 化妝品組合物中潛在有效。因此本發(fā)明的目的是提供一種新微生物Lactobacillus sakei Probio-65。 本發(fā)明的另 一個目的是提供用來抑制有害致病微生物生長的包含新微生物或其培 養(yǎng)物的組合物。本發(fā)明的另 一個目的是提供用來預防和治療腸內(nèi)異常發(fā)酵的包含新微生物或其培 養(yǎng)物的組合物。本發(fā)明的另 一個目的是提供用來預防和治療變應(yīng)性相關(guān)疾病的包含新微生物或其 培養(yǎng)物的組合物。本發(fā)明的另 一個目的是提供包含新微生物或其培養(yǎng)物的飼料組合物。 本發(fā)明的另一個目的是提供包含新微生物或其培養(yǎng)物的食品組合物。 本發(fā)明的另一個目的是提供包含新微生物的培養(yǎng)物的化妝品組合物。
附圖簡述本發(fā)明的上述和其它目的、特征和其它優(yōu)點將通過以下詳述和附圖來更清楚的了 解，其中

圖1是顯示了 Lactobacillus sakei Probio-65對DNCB致敏誘導接觸性皮炎的小鼠的 血清IgE濃度的作用的圖；圖2是顯示了 Lactobacillus sakei Probio-65對TDI致敏誘導接觸性皮炎的小鼠的血 清IgE濃度的作用的圖；圖3是顯示了 Lactobacillus sakei Probio-65對DNCB致敏誘導接觸性皮炎的小鼠的 IL-4濃度的作用的圖；圖4是顯示了 Lactobacillus sakei Probio-65對TDI致敏誘導接觸性皮炎的小鼠的 IL-4濃度的作用的圖；圖5是顯示了 Lactobacillus sakei Probio-65對金黃色葡萄球菌的生長抑制作用的圖， 其中標出了亮區(qū)；和圖6是Lactobacillus sakei Probio-65的電子顯微鏡觀測圖。實施本發(fā)明的最佳方式一方面，本發(fā)明提供了屬于乳酸桿菌屬的新微生物。根據(jù)本發(fā)明的乳酸桿菌菌林是 沙克乳酸桿菌益生菌-65 (Lactobacillus sakei Probio-65 )，它具有耐酸、耐膽汁酸、抑 制有害致病微生物特別是作為使特應(yīng)性疾病惡化的因素的金黃色葡萄球菌生長、調(diào)節(jié)異 常腸發(fā)酵和增強免疫系統(tǒng)的優(yōu)秀性質(zhì)。乳酸桿菌在自然界中廣泛分布，并且厭氧代謝碳水化合物來產(chǎn)生乳酸。特別是已知 當乳酸菌例如乳酸桿菌直接或間接加入食品中時，它們的代謝產(chǎn)物乳酸改善了食品的保 存穩(wěn)定性、風^^未和質(zhì)地。而且，當乳酸菌與發(fā)酵食品一起攝入時，它們進入腸道并且附 著在腸上皮細胞上對宿主動物提供多種有益作用例如抑制和對抗致病微生物、增強免疫 功能、降低癌癥發(fā)病率和減少致癌的酶。因此，在西方國家和東方國家，乳酸菌都用作 乳制品、肉制品、泡菜和多種腌制和發(fā)酵海鮮加工中的輔助成分，并且它們還用作益生 菌。為了使用乳酸菌作為益生菌，乳酸菌應(yīng)當符合以下要求它們應(yīng)當對胃酸或膽汁酸 耐受從而以高密度到達腸道；它們應(yīng)當附著于腸上皮細胞或粘膜且沉積在那里；它們應(yīng) 當優(yōu)選分泌抗菌物質(zhì)以抑制有害細菌從而穩(wěn)定腸道和防止有害細菌進入腸道；并且它們 應(yīng)當安全可用于食品。本發(fā)明的沙克乳酸桿菌菌林(Lactobacillus sakei Probio-65 )是符 合所有上述要求的新微生物。本發(fā)明的新益生菌孩i生物Lactobacillus sakei Probio-65菌4朱能夠附著于腸道細胞且 具有以下益生菌性質(zhì)。首先，此微生物具有在多種pH值的需氧或厭氧環(huán)境下存活的能力。此性質(zhì)使本發(fā) 明的微生物能良好適應(yīng)胃腸道中不同的生理學和病理學條件。其次，本發(fā)明的微生物耐受胃酸和膽汁酸且凍千時具有益生菌活性。第三，本發(fā)明的微生物具有抑制有害致病微生物生長的能力。有害微生物包括但是 不限于大腸桿菌KCTC 2441、肺炎克雷伯氏桿菌KCTC 2208、金黃色葡萄球菌KCTC 1621、表皮葡萄球菌KCTC 1917、弗氏志賀氏菌KCTC 2008、雞沙門氏菌、陰溝腸桿 菌KCTC 2361、鼠傷寒沙門氏菌、弗氏檸檬酸桿菌KCTC 2006和絲孢曱烷彎菌KCTC 2591。特別是本發(fā)明的^f鼓生物抑制特應(yīng)性皮炎惡化的主要原因金黃色葡萄球菌生長。第四，本發(fā)明的微生物具有優(yōu)秀的抗生素耐藥性。這些抗生素的實例包括氨千西林、 羧千西林、克林霉素、多西環(huán)素、紅霉素、慶大霉素、卡那霉素、林可霉素、二曱胺四 環(huán)素、新霉素、青霉素G、鏈霉素、sulfisoxzazole和四環(huán)素。第五，本發(fā)明的微生物對人安全且沒有例如生物毒性的副作用。根據(jù)本發(fā)明的乳酸桿菌菌抹根據(jù)以下程序分離和鑒定。首先，韓國泡菜汁(發(fā)酵的) 連續(xù)稀釋且在選擇乳酸菌的培養(yǎng)基上培養(yǎng)僅分離出乳酸菌。選擇微球菌和桿菌并在 MRS培養(yǎng)基上培養(yǎng)。最后，分離得到抑制特應(yīng)性皮炎惡化因素的金黃色葡萄球菌增殖 的微生物。根據(jù)本發(fā)明從韓國泡菜中分離出來的Lactobacillus sakei Probio-65具有以下形態(tài) 學、物理和生物化學特性。Lactobacillus sakei Probio-65是革蘭氏陽性菌，在需氧和厭 氧條件下均能生長，不形成芽孢，不動且是桿菌類型。該菌抹的最適溫度范圍是30°C -37°C。本發(fā)明的微生物不產(chǎn)生氣體和吲哚，沒有顯示溶解性質(zhì)且不能使硝酸還原?；?6S rDNA的系統(tǒng)進化分析法發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的微生物具有SEQ ID No.l的16S rDNA序列。屬于乳酸桿菌屬的本發(fā)明微生物被鑒定為這樣一個菌抹，該菌抹顯示與沙 克乳酸桿菌(Lactobacillus sakei)的標準菌林具有最近種系關(guān)系，與16S rDNA有99.6% 的序列同源性。基于此結(jié)果，本發(fā)明的微生物被鑒定為Lactobacillus sakei的新菌抹，即Lactobacillus sakei Probio-65,于2004年12月23日保藏于KCTC(韓國典型菌種保藏中心；遺傳資源
中心，KRIBB， 52, Oun-dong, Yusong-ku, Taejon, Korea),指定的保藏號為KCTC 10755BP。本發(fā)明的微生物可根據(jù)培養(yǎng)乳酸桿菌的普通方法大規(guī)模培養(yǎng)。由碳源、氮源、維生 素和礦物質(zhì)組成的培養(yǎng)基可用作培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的實例可包括MRS肉湯培養(yǎng)基(de Man-Rogosa-Sharp broth)和補充乳(milk - supplement)的肉湯培養(yǎng)基。微生物培養(yǎng)可在 乳酸菌的普通培養(yǎng)條件下進行，例如，溫度范圍是15°C-45。C,時間范圍是10小時-40 小時。如果需要，為了從得到的培養(yǎng)物中除去培養(yǎng)基和以濃縮狀態(tài)收獲培養(yǎng)細胞本領(lǐng)域 技術(shù)人員可以進行離心或過濾。濃縮的細胞群可根據(jù)普通方法冷凍或凍干以在不損失活 性的情況下保存細胞。本發(fā)明的微生物優(yōu)選與甘油混合并保存于-80 。C或混懸于無菌 10%脫脂乳中并凍干以穩(wěn)定長期保存。改良以在保持同樣活性時獲得優(yōu)秀的穩(wěn)定性或更高的抗菌活性。在另一方面，本發(fā)明的微生物提供了一種抑制有害致病微生物包含Lactobacillus sakei Probio-65或其培養(yǎng)物的組合物。如本文所用的術(shù)語"益生菌"涉及一種活的微生物或其培養(yǎng)物，該微生物或其培養(yǎng) 物通過改善宿主動物的胃腸道中腸道微生物平衡從而有益影響宿主動物包括人，還可能 指能夠改善體內(nèi)或體外及胃腸道的微生物平衡的微生物或其培養(yǎng)物。如本文所用的術(shù)語 "培養(yǎng)物"涉及從其培養(yǎng)液中收集的微生物或用提取劑從含有微生物的培養(yǎng)液中提取的 物質(zhì)。微生物可以通過離心、有機溶劑處理等等從其培養(yǎng)液中收集。有效活性成分可通 過超聲處理細胞或用溶劑例如曱醇和丙酮處理細胞和濃縮細胞裂解產(chǎn)物來提取。為了確定本發(fā)明的Lactobacillus sakei Probio-65是否對有害致病微生物具有生長抑 制活性，本發(fā)明者根據(jù)Kuroiwa，s法(Kuroiwa等人，Journal of Infections, 64， 257, 1990) 的改良管碟法檢測了初級分離的^f敖生物對有害微生物的生長抑制作用(實施例3)。在這 個方法中，Lactobacillus sakei Probio-65抑制有害微生物的最適溫度范圍優(yōu)選30°C-37 °C 。測量培養(yǎng)后出現(xiàn)的生長抑制的亮區(qū)的直徑，初級分離的菌林間互相比較對致病微生 物的生長抑制活性。用于抗生素活性評價的十種有害微生物從韓國生命工學研究院 (KRIBB)獲得，它們是大腸桿菌KCTC 1917、肺炎克雷伯氏桿菌KCTC 2208、金黃色 葡萄球菌KCTC 1621、表皮葡萄球菌KCTC 1917、弗氏志賀氏菌KCTC 2008、雞沙門 氏菌、陰溝腸桿菌KCTC 2361、鼠傷寒沙門氏菌、弗氏檸檬酸桿菌KCTC 2006和絲孢 曱烷彎菌KCTC 2591。有害微生物分別于37。C在營養(yǎng)肉湯(NB)上培養(yǎng)18小時。0.1ml
每個培養(yǎng)液涂布在營養(yǎng)瓊脂(NA)平板上且風干，每個平板上放置一個直徑8mm的圓筒。 初級分離微生物分別各自在MRS肉湯培養(yǎng)基上于需氧條件下37。C培養(yǎng)18小時。為了 提取分離微生物產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)，每個分離微生物的培養(yǎng)液與相同體積的預冷丙酮混合且反應(yīng)24小時。然后離心反應(yīng)混合物，加壓濃縮上清液用于隨后的微生物抗菌活性評 價。然后30^1每個濃縮物接種至NA平板上放置的8mm直徑圓筒上，37'C培養(yǎng)24小 時。測量生長抑制形成亮區(qū)的直徑并與對照比較。選擇對有害致病微生物顯示最高生長 抑制活性的菌林并命名為"Probio-65"。本發(fā)明的Lactobacillus sakei Probio-65菌株形成對有害致病微生物的生長抑制亮 區(qū)，亮區(qū)直徑如下對大腸桿菌KCTC2441是27mm、對肺炎克雷伯氏桿菌KCTC 2208 是41mm、對金黃色葡萄球菌KCTC 1621是28mm、對表皮葡萄球菌KCTC 1917是 24mm、對雞沙門氏菌是31mm、對陰溝腸桿菌KCTC 2361是28mm、對鼠傷寒沙門氏 菌是28mm、對弗氏檸檬酸桿菌KCTC 2006是28mm、對弗氏志賀氏菌KCTC 2008是 26mm和對絲孢曱烷彎菌KCTC 2591是16mm(表3)。特別是，本發(fā)明的微生物Lactobacillus sakei Probio-65如上所述顯示了對已知為特 應(yīng)性皮炎惡化因素的金黃色葡萄球菌優(yōu)秀的生長抑制作用，且因此對預防和治療特應(yīng)性 皮炎的組合物的制備潛在有用。此外，此Lactobacillus sakei Probio-65菌抹發(fā)現(xiàn)具有抗生素耐藥性，因此可對人或 動物作為常規(guī)抗生素代用品單獨使用或與常規(guī)抗生素聯(lián)用來抑制有害腸道微生物的生 長。具體來"i兌，才艮才居描述于Microbiology Procedures Handbook巻1 (Henry D. Isenberg, ASM)和韓國專利
發(fā)明者姜國熙, 樸勇河, 李仁善, 金鴻翼 申請人:普洛巴生物有限公司