專利名稱：通過大腸桿菌屬細菌生產(chǎn)l－氨基酸的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術，具體地涉及通過發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的方法且更具體的涉及獲自大腸桿菌的基因。這些基因?qū)τ谔岣週-氨基酸生產(chǎn)能力是有用的，例如L-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸和L-精氨酸。
已經(jīng)公開了很多提高L-氨基酸生產(chǎn)能力的技術，例如通過重組DNA轉(zhuǎn)化微生物(參見例如US4,278,765)。這些技術的基礎是提高在氨基酸生物合成中的酶活性和/或使被L-氨基酸產(chǎn)物反饋抑制的酶脫敏(參見例如，日本專利申請No56-18596(1981)，WO95/16042或美國專利No.5,661,012和6,040,160)。
在另一方面，提高的氨基酸分泌可以增強L-氨基酸生產(chǎn)菌株的生產(chǎn)能力，擁有增強表達L-賴氨酸分泌基因(lysE基因)的大腸桿菌屬細菌菌株已被公開(WO 9723597A2)。另外，編碼適合于L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰絲氨酸或四氫噻唑衍生物的分泌蛋白的編碼基因也已經(jīng)公開(美國專利No.5,972,663)。
現(xiàn)在，一些編碼能提高L-氨基酸生產(chǎn)的推定的膜蛋白的大腸桿菌基因被公開。rhtB基因的額外的拷貝使細菌具有優(yōu)選的對L-高絲氨酸的抗性并提高L-高絲氨酸、L-蘇氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸和L-異亮氨酸的生產(chǎn)(歐洲專利申請EP994190A2)。此外，rhtC基因的額外的拷貝使細菌具有優(yōu)選的對L-高絲氨酸和L-蘇氨酸的抗性并提高L-高絲氨酸、L-蘇氨酸和L-亮氨酸的生產(chǎn)(歐洲專利申請EP1013765A1)。此外，yahN，yeaS，yfiK和yggA基因的額外的拷貝提高L-谷氨酸、L-賴氨酸、L-蘇氨酸和L-丙氨酸、L-組氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-纈氨酸和L-異亮氨酸的生產(chǎn)(歐洲專利申請EP1016710A2)。盡管，大腸桿菌K-12菌株的全長基因組序列已經(jīng)描述(Blattner F.R.，Plunkett G.，Bloch C.A.et al.，Science，227，1453-1474，1997；ftp.genetics.wisc.edu/pub/sequence/ecolim52.seq.gz)，但其中的很多ORFs，它們的功能尚不清楚。
此目的是通過識別編碼蛋白質(zhì)的基因而達到的，這些基因并不參預目標L-氨基酸的生物合成途徑中但能提高其產(chǎn)量。一個例子是這種蛋白質(zhì)是一種具有L-氨基酸分泌活性的膜蛋白。在大腸桿菌全長基因組序列分析的基礎上，擁有4或更多個推定的跨膜片段(TMS)的蛋白質(zhì)被選擇。努力篩選的結果，本發(fā)明人從中識別了幾個基因，它們是b2682，b2683，b1242和b3434，并進行了全面的研究?；騜2682和b2683已被認為是被推定的CDS，它可以編碼功能未知的蛋白質(zhì)(分別為GENE BANK登記號AE000353 U00096序列的核苷酸數(shù)92到829和819到1154)?；騜2683也認為是ygaH。基因b1242已被認為是推定的CDS，它可以編碼功能未知的蛋白質(zhì)(GENE BANK登記號AE000222U00096序列的核苷酸數(shù)8432到9079)?；騜1242也認為是ychE。基因b3434已被認為是推定的CDS，它可以編碼功能未知的蛋白質(zhì)(GENE BANK登記號AE000420 U00096序列的核苷酸數(shù)1463到2056)?；騜3434也認為是yhgN。
本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)通過提高b2682，b2683，b1242或b3434基因編碼的蛋白質(zhì)的活性，菌株的L-氨基酸生產(chǎn)能力也被提高，因此，本發(fā)明已經(jīng)完成。
本發(fā)明如下1)一種L-氨基酸生產(chǎn)細菌，該細菌屬于大腸桿菌屬(Escherichia)，該細菌經(jīng)過修飾以致于該細菌的L-氨基酸生產(chǎn)可以通過提高以下A)或B)，和C)或D)定義的蛋白質(zhì)在細菌細胞中的活性來提高A)一種包含序列表中SEQ ID NO3所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；B)一種包含在序列表中SEQ ID NO3所示氨基酸序列上缺失、置換、插入、添加一個或多個氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，它有使細菌增加對L-氨基酸和/或其類似物的抗性的活性；C)一種包含序列表中SEQ ID NO5所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；D)一種包含在序列表中SEQ ID NO5所示氨基酸序列上缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，它有使細菌增加對L-氨基酸和/或其類似物的抗性的活性；。
(在下文中，如上述A)或B)和C)或D)定義的蛋白質(zhì)被稱為“本發(fā)明第一實施方案的的蛋白質(zhì)”，能提高上述蛋白質(zhì)活性的大腸桿菌屬細菌被稱為“本發(fā)明第一實施方案的細菌”)2)根據(jù)上述的細菌，A)或B)和C)或D)定義的蛋白質(zhì)的活性可以通過將編碼A)或B)和C)或D)定義的蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)化進細菌，或通過改變細菌染色體DNA上的表達調(diào)控序列而提高。
3)根據(jù)上述的細菌，其中的轉(zhuǎn)化是使用多拷貝載體進行的。
4)一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述細菌并從培養(yǎng)基中收集產(chǎn)生并積累的L-氨基酸。
5)根據(jù)上述方法，所述的L-氨基酸是L-蘇氨酸。
6)根據(jù)上述方法，所述的細菌已經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細菌可以提高蘇氨酸操縱子的表達。
7)根據(jù)上述方法，所述的L-氨基酸是L-纈氨酸。
8)根據(jù)上述方法，所述的細菌已經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細菌可以提高ilv操縱子的表達。
9)根據(jù)上述方法，所述的L-氨基酸是L-脯氨酸。
10)根據(jù)上述方法，所述的細菌已經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細菌可以提高脯氨酸生物合成基因的表達。
11)根據(jù)上述方法，所述的L-氨基酸是L-亮氨酸。
12)根據(jù)上述方法，所述的細菌已經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細菌可以提高leu操縱子的表達。
13)根據(jù)上述方法，所述的L-氨基酸是L-甲硫氨酸。
14)根據(jù)上述方法，所述的細菌已經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細菌可以提高met操縱子的表達。
15)一種L-氨基酸生產(chǎn)細菌，該細菌屬于大腸桿菌屬，該細菌經(jīng)過修飾以致于該細菌的L-氨基酸生產(chǎn)可以通過提高以下E)或F)定義的蛋白質(zhì)在細菌細胞中的活性來提高E)一種包含序列表中SEQ ID NO11所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；
F)一種包含在序列表中SEQ ID NO11所示氨基酸序列上缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，它有使細菌增加對L-氨基酸和/或其類似物的抗性的活性；(在下文中，如上述E)或F)定義的蛋白質(zhì)有時被稱做“本發(fā)明第二實施方案的蛋白質(zhì)”，能提高上述蛋白質(zhì)活性的大腸桿菌屬細菌是指“本發(fā)明第二實施方案的細菌”)16)根據(jù)上述的細菌，E)或F)定義的蛋白質(zhì)的活性可以通過將編碼E)或F)定義的蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)化進細菌，或通過改變細菌染色體DNA上的表達調(diào)控序列而提高。
17)根據(jù)上述的細菌，轉(zhuǎn)化是使用多拷貝載體進行的。
18)一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述細菌并從培養(yǎng)基中收集產(chǎn)生并積累的L-氨基酸。
19)根據(jù)上述方法，所述的L-氨基酸是L-蘇氨酸。
20)根據(jù)上述方法，所述的細菌已經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細菌可以提高蘇氨酸操縱子的表達。
21)根據(jù)上述方法，所述的L-氨基酸是L-纈氨酸。
22)根據(jù)上述方法，所述的細菌已經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細菌可以提高ilv操縱子的表達。
23)一種L-氨基酸生產(chǎn)細菌，該細菌屬于大腸桿菌屬，該細菌經(jīng)過修飾以致于該細菌的L-氨基酸生產(chǎn)可以通過提高以下G)或H)定義的蛋白質(zhì)在細菌細胞中的活性來提高G)一種包含序列表中SEQ ID NO15所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；H)一種包含在序列表中SEQ ID NO15所示氨基酸序列上缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，它有使細菌增加對L-氨基酸和/或其類似物的抗性的活性，例如；DL-O-甲基絲氨酸，6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸和DL-β-羥基-正纈氨酸，對S-(2-氨乙基)半胱氨酸敏感性增加；(在下文中，如上述G)或H)定義的蛋白質(zhì)有時被稱做“本發(fā)明第三實施方案的蛋白質(zhì)”，能提高E)或F)蛋白質(zhì)活性的大腸桿菌屬細菌是指“本發(fā)明第三實施方案的細菌”)
24)根據(jù)上述的細菌，G)或H)定義的蛋白質(zhì)的活性可以通過將編碼(G)或(H)定義的蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)化進細菌，或通過改變細菌染色體DNA上的表達調(diào)控序列來提高。
25)根據(jù)上述的細菌，其中的轉(zhuǎn)化是使用多拷貝載體進行的。
26)一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述細菌并從培養(yǎng)基中收集產(chǎn)生并積累的L-氨基酸。
27)根據(jù)上述方法，所述的L-氨基酸是L-精氨酸。
28)根據(jù)上述方法，所述的細菌已經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細菌可以增強精氨酸調(diào)節(jié)子的表達。
29)根據(jù)上述方法，所述的L-氨基酸是L-脯氨酸。
30)根據(jù)上述方法，所述的細菌已經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細菌可以增強脯氨酸生物合成基因的表達。
生產(chǎn)L-氨基酸的方法包括使用含有SEQ ID NO3和SEQ ID NO5所示氨基酸序列的本發(fā)明提高了的蛋白質(zhì)活性的L-蘇氨酸生產(chǎn)細菌生產(chǎn)L-蘇氨酸。一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法包括使用含有SEQ ID NO3和SEQ ID NO5所示氨基酸序列的本發(fā)明提高的蛋白質(zhì)活性的L-纈氨酸生產(chǎn)細菌生產(chǎn)L-纈氨酸。此外，生產(chǎn)L-氨基酸的方法包括使用含有SEQ ID NO3和SEQ ID NO5所示氨基酸序列的本發(fā)明提高的蛋白質(zhì)活性的L-脯氨酸生產(chǎn)細菌來生產(chǎn)L-脯氨酸。此外，生產(chǎn)L-氨基酸的方法包括使用含有SEQ ID NO3和SEQ ID NO5所示氨基酸序列的本發(fā)明提高的蛋白質(zhì)活性的L-亮氨酸生產(chǎn)細菌生產(chǎn)L-亮氨酸。生產(chǎn)L-氨基酸的方法包括使用含有SEQ ID NO3和SEQ ID NO5所示氨基酸序列的本發(fā)明提高的蛋白質(zhì)活性的L-甲硫氨酸生產(chǎn)細菌生產(chǎn)L-甲硫氨酸。
進一步的，生產(chǎn)L-氨基酸的方法包括使用含有SEQ ID NO11所示氨基酸序列的本發(fā)明提高的蛋白質(zhì)活性的L-蘇氨酸生產(chǎn)細菌生產(chǎn)L-蘇氨酸。一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法包括使用含有SEQ ID NO11所示氨基酸序列的本發(fā)明提高的蛋白質(zhì)活性的L-纈氨酸生產(chǎn)細菌生產(chǎn)L-纈氨酸。
更進一步的，生產(chǎn)L-氨基酸的方法包括使用含有SEQ ID NO15所示氨基酸序列的本發(fā)明提高的蛋白質(zhì)活性的L-精氨酸生產(chǎn)細菌生產(chǎn)L-精氨酸。此外，生產(chǎn)L-氨基酸的方法包括使用含有SEQ ID NO15所示氨基酸序列的本發(fā)明提高的蛋白質(zhì)活性的L-脯氨酸生產(chǎn)細菌生產(chǎn)L-脯氨酸。
下面將詳細解釋本發(fā)明本發(fā)明的細菌是一種L-氨基酸生產(chǎn)細菌，該細菌屬于大腸桿菌屬，該細菌經(jīng)過修飾以致于該細菌的L-氨基酸生產(chǎn)可以通過提高本發(fā)明的蛋白質(zhì)在細菌細胞中的活性來提高。
來本發(fā)明中“L-氨基酸生產(chǎn)細菌”是指細菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)時有能力在培養(yǎng)基中積累L-氨基酸的細菌，這種L-氨基酸生產(chǎn)能力可以是細菌的野生菌株具有的特性也可以是通過培育而獲得或提高的。
本發(fā)明的細菌是一種L-氨基酸生產(chǎn)細菌，該細菌屬于大腸桿菌屬，該細菌具有提高的蛋白質(zhì)活性，它可以提高目標L-氨基酸的生產(chǎn)能力，具體的，本發(fā)明的細菌是一種L-氨基酸生產(chǎn)細菌，該細菌屬于大腸桿菌屬，該細菌具有提高的至少一種或兩種的蛋白質(zhì)活性。
術語“提高的蛋白質(zhì)活性”，是指每個細胞的活性要高于未經(jīng)修飾的菌株，例如，一種野生型大腸桿菌屬細菌。例如，將提到一個每個細胞的蛋白質(zhì)分子數(shù)增加的例子，每個蛋白質(zhì)分子特定活性增加的一個例子等等。進一步，一種野生型大腸桿菌屬細菌被用做對照，例如，野生型大腸桿菌菌株將被提到。
具體的，本發(fā)明第一實施方案的細菌載有在細菌的染色體DNA或質(zhì)粒上至少有b2682和b2683兩個基因優(yōu)選二者超表達的DNA，且具有增強的生產(chǎn)L-氨基酸的能力，例如，L-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸和L-甲硫氨酸。本發(fā)明的第二實施方案的細菌在細菌的染色體DNA或質(zhì)粒上載有DNA，該DNA上有b1242基因過量表達，并提高生產(chǎn)L-氨基酸的能力，例如，L-蘇氨酸和/或L-纈氨酸。本發(fā)明的第三實施方案的細菌停泊在細菌的染色體DNA或質(zhì)粒上超表達b3434基因的DNA，并具有增強的生產(chǎn)L-氨基酸的能力，例如，L-精氨酸和/或L-脯氨酸。
本發(fā)明第一實施方案的蛋白質(zhì)包括以下A)或B)和C)或D)定義的蛋白質(zhì)中的任一個A)一種包含序列表中SEQ ID NO3所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；B)一種包含在序列表中SEQ ID NO3所示氨基酸序列上缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，它有使細菌增加對L-氨基酸和/或其類似物的抗性的活性；
C)一種包含序列表中SEQ ID NO5所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；D)一種包含在序列表中SEQ ID NO5所示氨基酸序列上缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，它有使細菌增加對L-氨基酸和/或其類似物的抗性的活性；。
“幾個”氨基酸的數(shù)目根據(jù)位點或蛋白質(zhì)三級結構中氨基酸殘基的類型而不同。分別來講，對蛋白質(zhì)(A)來講是可以是2-24，優(yōu)選是2-12，更優(yōu)選是2-5，對蛋白質(zhì)(C)來講是可以2-11，優(yōu)選是2-7，更優(yōu)選為2-5。
本發(fā)明第二實施方案的蛋白質(zhì)包括以下E)或F)定義的蛋白質(zhì)中的任一個E)一種包含序列表中SEQ ID NO11所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；F)一種包含在序列表中SEQ ID NO11所示氨基酸序列上缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，它有使細菌增加對L-氨基酸和/或其類似物的抗性的活性；“幾個”氨基酸的數(shù)目根據(jù)位點或蛋白質(zhì)三級結構中氨基酸殘基的類型而不同。對蛋白質(zhì)(E)來講是可以是2-22，優(yōu)選是2-11，更優(yōu)選是2-5。
本發(fā)明第三實施方案的蛋白質(zhì)包括以下G)或H)定義的蛋白質(zhì)中的任一個G)一種包含序列表中SEQ ID NO15所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；H)一種包含在序列表中SEQ ID NO15所示氨基酸序列上缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，它有使細菌增加對L-氨基酸和/或其類似物的抗性的活性，例如；DL-o-甲基絲氨酸，6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸和DL-b-羥基-去甲纈氨酸，對S-(2-氨乙基)半胱氨酸敏感性增加；“幾個”氨基酸的數(shù)目根據(jù)位點或蛋白質(zhì)三級結構中氨基酸殘基的類型而不同。對蛋白質(zhì)(G)來講是可以是2-20，優(yōu)選是2-10，更優(yōu)選是2-5。
增加的對L-氨基酸和/或其類似物的抗性意味著具有在未修飾的菌株，或野生菌株，或本細菌的親本菌株不能生長的，含有L-氨基酸和/或其類似物最低濃度的培養(yǎng)基上生長的能力?；蛘咭馕吨斜任葱揎椀木辏蛞吧?，或本細菌的親本菌株在含有L-氨基酸和/或其類似物的培養(yǎng)基上生長更快的能力。
更具體的，大腸桿菌菌株在37℃含有合適條件的L-氨基酸和/或其類似物瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，如果大腸桿菌菌株形成了一個比37℃，大腸桿菌菌株在固體Adams培養(yǎng)基上經(jīng)過2-4天培養(yǎng)后形成的未修飾菌株或野生型菌株大的菌落，則可以說大腸桿菌菌株已經(jīng)增加了對L-氨基酸和/或其類似物的抗性。術語“合適的條件”是指溫度、pH、供氣或基本營養(yǎng)或其它的選擇。
L-氨基酸類似物通過3，4-二氫脯氨酸，DL-硫代異亮氨酸，DL-o-甲基絲氨酸，4-氮雜亮氨酸，正亮氨酸，L-o-氟代苯丙氨酸和DL-o-氟代苯丙氨酸，高絲氨酸，6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸和DL-β-羥基-正纈氨酸來例證。
上面提及到L-氨基酸或它們的類似物存在的條件下，未修飾的菌株或野生型菌株不能生長時的濃度，依據(jù)使用的化合物的結構不同進行變化是值得注意的(從DL-硫代異亮氨酸的0.5μg/ml到DL-o-甲基絲氨酸的9600μg/ml)。例如，假設是3，4-二氫脯氨酸，一般濃度是7-70μg/ml，優(yōu)選是20-25μg/ml；假設是DL-硫代異亮氨酸，一般濃度是0.5-5μg/ml，優(yōu)選是0.9-1.1μg/ml；假設是DL-o-甲基絲氨酸，一般濃度是1100-9600μg/ml，優(yōu)選是3000-3500μg/ml；假設是4-氮雜亮氨酸，一般濃度是15-150μg/ml，優(yōu)選是40-50μg/ml；假設是正亮氨酸，一般濃度是150-1500μg/ml，優(yōu)選是450-550μg/ml；假設是L-o-氟代苯丙氨酸，一般濃度是0.6-6μg/ml，優(yōu)選是1.5-2μg/ml；假設是DL-o-氟代苯丙氨酸，一般濃度是2-20μg/ml，優(yōu)選是5-7μg/ml；假設是高絲氨酸，一般濃度是330-3300μg/ml，優(yōu)選是900-1100μg/ml；假設是6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸，一般濃度是5-50μg/ml，優(yōu)選是12-18μg/ml；假設是DL-β-羥基-正纈氨酸，一般濃度是25-250μg/ml，優(yōu)選是70-90μg/ml。
對L-氨基酸或它們的類似物敏感意味著細菌有比它的未經(jīng)修飾菌株或野生菌株在含有最低濃度的L-氨基酸或它們的類似物的培養(yǎng)基上擁有更長增殖期的能力。或者是，對L-氨基酸或它們的類似物敏感意味著細菌在它的未經(jīng)修飾菌株或野生菌株能生長的，含有最低濃度的L-氨基酸或它們的類似物的培養(yǎng)基上不能生長。這種L-氨基酸類似物是通過S-(2-氨乙基)半胱氨酸來例證的。上面提及的濃度假設是對于S-(2-氨乙基)半胱氨酸，一般濃度是0.2-2.0μg/ml，優(yōu)選是0.5-1.0μg/ml。
本發(fā)明的細菌也包括通過將編碼A)或B)，和C)或D)，或E)或F)，或G)或H)蛋白的DNA轉(zhuǎn)入細菌或通過改變細菌染色體DNA上的表達調(diào)控序列而將本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)的活性提高的菌株。所述的在本發(fā)明中對細菌進行修飾的DNA編碼推定的膜蛋白質(zhì)。進一步，該DNA編碼具有4個或更多個跨膜節(jié)段的蛋白質(zhì)。這樣的DNA可以編碼具有L-氨基酸分泌活性的蛋白質(zhì)。更進一步，該DNA通過b2683，b2683，b1242和b3434基因表示。必須要注意的是b2682基因的編碼區(qū)728-738和b2683基因的編碼區(qū)1-11是部分重疊的。這兩個基因可以通過例如使用SEQ ID NO1和SEQ ID NO2公開的核苷酸作為引物進行PCR而獲得，為一個PCR產(chǎn)物?；騜1242可以通過例如使用SEQ ID NO9和SEQ ID NO10公開的核苷酸作為引物進行PCR而獲得?；騜3434可以通過例如使用SEQ ID NO13和SEQ ID NO14公開的核苷酸作為引物進行PCR而獲得。
對大腸桿菌全基因組序列分析可以篩選出編碼具有4個或更多個推定的TMS蛋白質(zhì)的基因。已知功能的蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)運蛋白在Paulsen I.T.，Sliwinski M.I.，Saier M.H.的文章中描述(J.Mol.Biol.，1998，227，537)Linton K.J和HigginsC.F.(Molecular Microbiology，1998，28(1)，5)也對它進行了排除篩選，在其余的基因篩選的結果中，幾個編碼推定膜輸出蛋白的基因關閉了。發(fā)現(xiàn)b2682和b2682基因超表達，或b1242或b3434基因超表達提高了L-氨基酸生產(chǎn)菌的L-氨基酸生成。
本發(fā)明的DNA包括編碼在蛋白質(zhì)A)或C)的序列上的一個或更多個位置上的缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，只要它們沒有失去蛋白質(zhì)的活性。“幾個”氨基酸的數(shù)目根據(jù)位點或蛋白質(zhì)三級結構中氨基酸殘基的類型而不同。分別來講，對蛋白質(zhì)(A)來講是可以是2-24，優(yōu)選的是2-12，更優(yōu)選是2-5，對蛋白質(zhì)(C)來講是可以2-11，優(yōu)選的是2-7，更優(yōu)選是2-5。
進一步，本發(fā)明的DNA包括編碼在蛋白質(zhì)A)的序列上的一個或更多個位置上的缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，只要它們沒有失去蛋白質(zhì)的活性?！皫讉€”氨基酸的數(shù)目根據(jù)位點或蛋白質(zhì)三級結構中氨基酸殘基的類型而不同。對蛋白質(zhì)(E)來講是可以是2-22，優(yōu)選的是2-11，更優(yōu)選是2-5。更進一步，本發(fā)明的DNA包括編碼在蛋白質(zhì)E)的序列上的一個或更多個位置上的缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，只要它們沒有失去蛋白質(zhì)的活性?！皫讉€”氨基酸的數(shù)目根據(jù)位點或蛋白質(zhì)三級結構中氨基酸殘基的類型而不同。對蛋白質(zhì)(G)來講是可以是2-20，優(yōu)選的是2-10，更優(yōu)選是2-5。
編碼與A)，C)，E)或G)定義的蛋白質(zhì)在實質(zhì)上相同的蛋白質(zhì)的DNA可以通過例如對編碼A)，C)，E)或G)定義的蛋白質(zhì)核苷酸序列進行定向位點誘變而獲得，所以一個或更多氨基酸殘基會被缺失、置換、插入、增加。這種修飾的DNA可以通過常規(guī)的試劑處理和條件生成突變的方法獲得。這種處理包括使用羥胺處理編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA或用紫外線輻射或例如N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍或亞硝酸處理細菌含的DNA。
本發(fā)明的DNA包括在不同菌株中和在大腸桿菌屬細菌天然多樣的菌株中分離的突變體。編碼這些突變體的DNA可以通過分離DNA而獲得，它們可以與基因b2862，b2863，b1242或b3434雜交，或在嚴謹條件下部分雜交，并且它們編碼的蛋白質(zhì)可以提高L-氨基酸的生產(chǎn)，術語“嚴謹條件”是指可以形成所謂的特異的雜交時，而非特異的雜交沒有形成時的條件。例如，嚴謹條件包括DNA有高度同源性時的雜交條件，例如DNAs相互之間擁有70％同源性時?；蛘?，嚴謹條件可以通過構成Southern雜交清洗時的普通條件來例證，例如，60℃，1×SSC，0.1％SDS，優(yōu)選的是0.1×SSC，0.1％SDS。使用編碼突變體的，并能與基因b2862，b2863，b1242或b3434雜交的DNA作為探針，含有部分SEQ ID NO3或SEQ ID NO5的核苷酸序列的DNA也可以作為探針。這樣的探針可以通過使用基于SEQ ID NO3、5、11、15而生產(chǎn)的寡聚核苷酸作為引物，使用含有SEQ ID NO3、5、11、15的核苷酸的DNA片段作為模板進行PCR而制備。當長度約為300bp的DNA片段被用做探針時，雜交的沖洗條件為，例如，50℃，2×SSC和0.1％SDS。
用編碼蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)化細菌意味著將DNA傳入細菌細胞，例如通過傳統(tǒng)的方法來提高本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達并提高細菌細胞中該蛋白質(zhì)的活性。
提高基因表達的技術包括增加基因拷貝數(shù)。在大腸桿菌屬細菌中傳入一個含有基因的載體能起到增加該基因拷貝數(shù)的功能。為此目的，最好使用多拷貝載體。多拷貝載體是通過pBr322，pMW119，pUC19，pET22b或其它相似的載體來例證的。
此外，也可以通過例如同源重組或相似方法來在細菌染色體上引入基因的多拷貝，而達到提高基因表達的目的。
為了提高了兩個或多個基因的表達，基因可以一起位于同一個質(zhì)粒上，也可以位于不同的質(zhì)粒上。一個基因位于染色體上，而另一個位于質(zhì)粒上也是可以的。
在另一方面，可以通過改變基因的表達調(diào)控序列而提高基因表達。改變基因的表達調(diào)控序列包括在基因原有的表達調(diào)控序列例如啟動子中引入突變，而使基因表達提高(WO00/18935)，也可以將本發(fā)明的DNA置于強啟動子的控制下。例如lac啟動子，trp啟動子，trc啟動子，λ噬菌體中被認為是強啟動子的PL啟動子，強啟動子可以與多拷貝基因聯(lián)合使用。
本發(fā)明所述的細菌可以通過向本身能產(chǎn)生L-氨基酸的細菌中引入上述DNA而獲得。也可以通過賦予已經(jīng)含有DNA的細菌這種產(chǎn)生L-氨基酸能力而獲得所述的細菌。已經(jīng)被提高了本發(fā)明所述蛋白質(zhì)活性的親本菌株，L-蘇氨酸產(chǎn)生菌株屬于大腸桿菌屬，例如，菌株VL2054(VKPM B-8067)，VNIIGenetika472T23(美國專利NO5,631,157)，VKPMB-3996(美國專利NO5,175,107和NO5,976,843)，KCCM-10132(WO009660A1)，KCCM-10133(WO009661A1)或類似的菌株可以使用。已經(jīng)被提高了本發(fā)明所述蛋白質(zhì)活性的親本菌株，L-纈氨酸產(chǎn)生菌株屬于大腸桿菌屬，例如，菌株H-81(VKPM B-8066)，NRRLB-12287和NRRL B-12288(美國專利NO4,391,907)，VKPM B-4411(美國專利NO5,658,766)，VKPM B-7707(歐洲專利申請EP1016710A2)或類似的菌株可以使用。此外，已經(jīng)被提高了本發(fā)明所述蛋白質(zhì)活性的親本菌株，L-脯氨酸產(chǎn)生菌株屬于大腸桿菌屬，例如，菌株NRRL B-12403和NRRL B-12404(GB2075056)，VKPM B-8012(俄羅斯專利申請NO2000124295)，專利DE3127361中描述的突變質(zhì)粒，Bloom F.R.et al描述的突變質(zhì)粒(The 15th Miamiwinter symposium，1983，p.34)或類似的菌株可以使用。已經(jīng)被提高了本發(fā)明所述蛋白質(zhì)活性的親本菌株，L-亮氨酸產(chǎn)生菌株屬于大腸桿菌屬，例如，菌株H-9070(FERM BP-4704)和H-9072(FERM BP-4706)(US5744331)，VKPM B-7368和VKPM B-7388(RU2140450)，W1485atpA401/pMWdAR6，W1485lip2/pMWdAR6和AJ12631/pMWdAR6(EP0872547)或類似的菌株可以使用。已經(jīng)被提高了本發(fā)明所述蛋白質(zhì)活性的親本菌株，L-甲硫氨酸產(chǎn)生菌株屬于大腸桿菌屬，例如，菌株AJ11539(NRRL B-12399)，AJ11540(NRRLB-12400)，AJ11541(NRRLB-12401)AJ11542(NRRLB-12402)(GB2075055)，或類似的菌株可以使用。
進一步，已經(jīng)被提高了本發(fā)明所述蛋白質(zhì)活性的親本菌株，L-精氨酸產(chǎn)生菌株屬于大腸桿菌屬，例如，菌株AJ11531和AJ11538(JP56106598A2)，AJ11593(FERM P-5616)和AJ11594(FERM P-5617)(日本專利公開NO575693)或類似的菌株可以使用。
本發(fā)明所述的細菌可以進一步提高包括在L-氨基酸生物合成中一個或更多個基因的表達。對于L-蘇氨酸產(chǎn)生菌株，這種基因是通過蘇氨酸操縱子來例證的，它最好包含一個編碼被L-蘇氨酸反饋抑制的門冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶基因(日本專利公開NO.1-29559)。對于L-纈氨酸產(chǎn)生菌株，這種基因是通過ilv操縱子，不很好表達蘇氨酸脫氨基氫酶，其弱化作用被抑制的ilvGMEDA操縱子來例證的(日本專利公開NO.8-47397)。對于L-脯氨酸產(chǎn)生菌株，這種基因是通過L-脯氨酸生物合成基因來例證的，它優(yōu)選用被L-脯氨酸反饋抑制的谷氨酸激酶基因proB表示(DE3127361)。對于L-亮氨酸產(chǎn)生菌株，這種基因是通過亮氨酸操縱子，也就是leu操縱子來例證的，它最好包含一個編碼被L-亮氨酸反饋抑制的異丙基蘋果酸合成酶基因(俄羅斯專利公開99114325)。對于L-甲硫氨酸產(chǎn)生菌株，這種基因是通過甲硫氨酸調(diào)節(jié)子來例證的。甲硫氨酸調(diào)節(jié)子含有編碼抑制氨基酸生物合成的活性減低的蛋白質(zhì)的突變基因。這種基因是通過編碼從大腸桿菌中得到的L-甲硫氨酸生物合成相關抑制蛋白，在抑制甲硫氨酸生物合成的活性上減低的變異型基因metJ來例證的(JP2000-157267A2)。進一步，這一基因為精氨酸調(diào)節(jié)子例證，其優(yōu)選包含其L-精氨酸反饋抑制被脫敏的N-乙?；劝彼岷铣擅富?Rajagopal B.S.等Apple.Environ.Microbiol.1998，U.64.No.5，P1805-1811)。
本發(fā)明所述的生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)本發(fā)明第一實施方案的細菌，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-蘇氨酸，從培養(yǎng)基中收集L-蘇氨酸的步驟。本發(fā)明所述的生產(chǎn)L-纈氨酸的方法包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)本發(fā)明所述的細菌，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-纈氨酸，從培養(yǎng)基中收集L-纈氨酸的步驟。此外，本發(fā)明所述的生產(chǎn)L-脯氨酸的方法包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)本發(fā)明所述的細菌，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-脯氨酸，從培養(yǎng)基中收集L-脯氨酸的步驟。本發(fā)明所述的生產(chǎn)L-亮氨酸的方法包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)本發(fā)明所述的細菌，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-亮氨酸，從培養(yǎng)基中收集L-亮氨酸的步驟。本發(fā)明所述的生產(chǎn)L-甲硫氨酸的方法包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)本發(fā)明所述的細菌，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-甲硫氨酸，從培養(yǎng)基中收集L-甲硫氨酸的步驟。
本發(fā)明所述的生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)本發(fā)明第二實施方案的細菌，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-蘇氨酸，從培養(yǎng)基中收集L-蘇氨酸的步驟。本發(fā)明所述的生產(chǎn)L-纈氨酸的方法包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)本發(fā)明所述的細菌，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-纈氨酸，從培養(yǎng)基中收集L-纈氨酸的步驟。
本發(fā)明所述的生產(chǎn)L-精氨酸的方法包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)本發(fā)明第三實施方案的細菌，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-精氨酸，從培養(yǎng)基中收集L-精氨酸的步驟。本發(fā)明所述的生產(chǎn)L-脯氨酸的方法包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)本發(fā)明所述的細菌，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-脯氨酸，從培養(yǎng)基中收集L-脯氨酸的步驟。
本發(fā)明所述的在培養(yǎng)基及相似物中培養(yǎng)、分離純化L-氨基酸，在使用微生物進行氨基酸生產(chǎn)時，可以使用與傳統(tǒng)發(fā)酵方法中相同的方法進行。用來培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以時合成培養(yǎng)基也可以是天然培養(yǎng)基，只要培養(yǎng)基包括碳源、氮源和礦物質(zhì)，如果必要，還可以包括微生物生長需要的合適數(shù)目的營養(yǎng)物質(zhì)。碳源可以包括各種碳水化合物，例如葡萄糖和蔗糖，和各種有機酸。取決于所用微生物的同化方式，包括乙醇和甘油的醇也可以使用。至于氮源，各種胺鹽，例如氨和硫酸胺，包括例如胺的其他氮，天然氮源例如蛋白胨，大豆水解物和微生物發(fā)酵的消化物都可以使用。
培養(yǎng)最好在例如振蕩培養(yǎng)，有氧攪拌培養(yǎng)等有氧條件下進行，溫度在20-40℃，最好在30-38℃。培養(yǎng)時的pH值一般在5-9，最好在6.5-7.2。pH值可以用氨水，碳酸鈣，各種酸，各種堿和緩沖液進行調(diào)節(jié)。通常，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-5天導致目的氨基酸在培養(yǎng)基中積累。
在培養(yǎng)后，可以通過離心或膜過濾的方法將培養(yǎng)基中的固體出去，例如細胞。然后可以通過離子交換，濃縮和結晶的方法收集和純化目的氨基酸。
附圖的簡要說明

圖1顯示了質(zhì)粒pΔlacZ的結構本發(fā)明最佳實施方式下面將通過實施例更具體的解釋本發(fā)明，在下例中如未說明，氨基酸是L-構型。
實施例1將b2682，b2683，b1242和b3434基因克隆至pΔlacZ上為了克隆b2682，b2683，b1242和b3434基因使用了pΔlacZ質(zhì)粒。質(zhì)粒pΔlacZ衍生自質(zhì)粒pET-22b(+)(Novagen，Madison。WI，USA)。用酶BglII和Xba I處理pET-22b(+)質(zhì)粒，將其與質(zhì)粒pMB9-lac(Fuller F.，Gene，19，43-54，1982)用相同內(nèi)切酶處理帶有PlacUV5啟動子的PCR產(chǎn)物的片段連接。對于擴增PlacUV5啟動子片段可以使用SEQ ID NO7和SEQ ID NO8描述的PCR引物。通過克隆質(zhì)粒pJEL250的Sal I-BamH I的片段(DymakovaE.et al.，Gene，19，43-54，1982)，最后的質(zhì)粒增加了lacZ基因的部分結構(237bp，沒有啟動子)。獲得的質(zhì)粒pΔlacZ的圖譜在附圖1中表示。
克隆大腸桿菌b2682和b2683推定閱讀框(b2682和b2683基因)的起始物質(zhì)是PCR片段，該片段是通過使用大腸桿菌菌株TG1的DNA作為模板而得到的，擴增片段用到的兩個引物在SEQ ID NO1和2中已經(jīng)描述。PCR反應在PE-2400上，以40sec.95℃，40sec.47℃40sec.72℃，30循環(huán)的條件下進行。如此，1158bp的包含了b2682和b2683基因的線形DNA片段就獲得了。將該片段用Xba I和BamH I內(nèi)切酶處理并插入到已經(jīng)用相同的酶處理了的多拷貝載體質(zhì)粒pΔlacZ上。
得到的含有PCR片段的質(zhì)粒被稱為pYGAZH，攜帶的b2682和b2683兩個基因處于乳糖啟動子(PlacUV5)的控制下。
類似的，克隆大腸桿菌b1242推定閱讀框(b1242基因)的起始物質(zhì)是PCR片段，該片段是通過使用大腸桿菌菌株TG1的DNA作為模板而得到的，擴增片段用到的兩個引物在SEQ ID NO9和10中已經(jīng)描述。得到的含有PCR片段的質(zhì)粒被稱為pYCHE，攜帶的b1242基因處于乳糖啟動子(PlacUV5)的控制下?？寺〈竽c桿菌b3434推定閱讀框(b3434基因)的起始物質(zhì)是PCR片段，該片段是通過使用大腸桿菌菌株TG1的DNA作為模板而得到的，擴增片段用到的兩個引物在SEQ ID NO13和14中已經(jīng)描述。得到的含有PCR片段的質(zhì)粒被稱為pYHGN，攜帶的b1242基因處于乳糖啟動子(PlacUV5)的控制下。
實施例2擴增的b2862，b2683基因?qū)Υ竽c桿菌菌株TG1對氨基酸及其類似物抗性的影響。
大腸桿菌菌株TG1(pYGAZH)TG1(pYCHE)，TG1(pYHGN)和含有未插入片段質(zhì)粒的TG1菌株(對照菌株)在附加100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜。所有菌株的過夜后的培養(yǎng)物用附加100μg/ml氨芐青霉素和IPTG0.5mM的新鮮LB培養(yǎng)基稀釋25倍，在37℃有氧培養(yǎng)2小時。對數(shù)生長期的培養(yǎng)物用0.9％的NaCl溶液稀釋使在附加100μg/ml氨芐青霉素和IPTG0.5mM和氨基酸或其類似物的Adams固體培養(yǎng)基平板上大約有1000個細胞接種。在37℃培養(yǎng)2-4天后，記錄擁有雜種質(zhì)粒的TG1菌株和對照TG1菌株之間在形成菌落的數(shù)目和菌落大小上的不同。實驗結果如表1。表1

No-與對照菌株沒有不同R-有更多的菌落或菌落更大S-與對照菌株相比具有更少的菌落或菌落更小實施例3用含有質(zhì)粒pYGAZH的菌株生產(chǎn)蘇氨酸蘇氨酸生產(chǎn)菌株VL2054是通過將含有處于PlacUV5啟動子控制下的b2682和b2683基因的質(zhì)粒pYGAZH轉(zhuǎn)入而得到的。獲得的菌株被命名為VL2054(pYGAZH)。菌株VL2054是菌株VKPMB-3996的衍生物，在染色體上a)目標蘇氨酸操縱子位于PR啟動子的控制下。
b)野生型rhtA基因c)染色體上沉默的編碼轉(zhuǎn)氫酶的基因(tdh基因)和Tn5(tdhTn5，Kans)上沉默的編碼卡那霉素抗性基因(kan)d)突變體ilvA442菌株VL2054已經(jīng)于2001年1月30日在俄羅斯國家工業(yè)微生物收集中心(VKPM)保藏(Russia 113545，Moscow，1 Dorozhny proezd，1)，保藏號為VKPMB-8067，并于2002年根據(jù)布達佩斯條約由最初的保藏轉(zhuǎn)為國際保藏。
將作為對照的含有未插入部分的質(zhì)粒的菌株VL2054(pΔlacZ)和菌株VL2054(pYGAZH)各取5個菌落，在20-ml的試管中懸浮于2ml最小培養(yǎng)基上((NH4)2SO4-11g/l；NaCl-0.4g/l；MgSO4-0.4g/l；K2HPO3-1g/l；FeSO4-10mg/l；MnSO4-10mg/l；硫胺-0.1mg/l；酵母提取物-0.5g/l；蔗糖-40g/l；如果必要的話氨芐青霉素-300mg/l)，在32℃通風條件下培養(yǎng)過夜。每個培養(yǎng)物的0.2ml菌液轉(zhuǎn)移到三個20ml的試管中，加入2ml加或不加IPTG的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，在32℃轉(zhuǎn)動振蕩培養(yǎng)48或72小時。
發(fā)酵培養(yǎng)基成分(NH4)2SO4-22g/l；NaCl-0.8g/l；MgSO4-0.8g/l；K2HPO3-2g/l；FeSO4-20mg/l；MnSO4-20mg/l；硫胺-0.2mg/l；
酵母提取物-1g/l；CaCO3-30g/l；蔗糖-80g/l；氨芐青霉素-300mg/l，如果必要的話；IPTG-0.5mM，如果必要的話；在培養(yǎng)后，通過傳統(tǒng)的方法測得菌液在540nm處光吸收值確定質(zhì)粒的穩(wěn)定。可以通過薄層色譜法測定培養(yǎng)基中蘇氨酸的積累量。薄層色譜法的液相如下異丙醇-50ml，丙酮-50ml，NH4OH(30％)-12ml，水-8ml。結果見表2。正如看見的，雜合質(zhì)粒pYGAZH提高了蘇氨酸產(chǎn)生菌株VL2054的蘇氨酸積累量。
表2

實施例4用含有質(zhì)粒pYGAZH的菌株生產(chǎn)纈氨酸纈氨酸生產(chǎn)菌株H-81是通過將含有處于PlacUV5啟動子控制下的b2682和b2683基因的質(zhì)粒pYGAZH轉(zhuǎn)入而得到的。獲得的菌株已經(jīng)于2001年1月30日在俄羅斯國家工業(yè)微生物收集中心(VKPM)保藏(Russia 113545，Moscow，1Dorozhny proezd，1)，保藏號為VKPM B-8066，并于2002年根據(jù)布達佩斯條約由最初的保藏轉(zhuǎn)為國際保藏。
將作為對照的含有未插入部分的質(zhì)粒的菌株H-81(pΔlacZ)和菌株H-81(pYGAZH)各取5個菌落，在20-ml的試管中懸浮于2ml最小培養(yǎng)基上((NH4)2SO4-18g/l；K2HPO4-1.8g/l；MgSO4-1.2g/l；硫胺-0.1mg/l；酵母提取物-0.5g/l；蔗糖-60g/l；如果必要的話氨芐青霉素-300mg/l)，在通風條件下培養(yǎng)過夜。每個培養(yǎng)物的0.2ml菌液轉(zhuǎn)移到三個20ml的試管中，加入2ml加或不加IPTG的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，在32℃轉(zhuǎn)動振蕩培養(yǎng)48或72小時。
發(fā)酵培養(yǎng)基成分(NH4)2SO4-18g/l；K2HPO4-1.8g/l；MgSO4-1.2g/l；CaCO3-20g/l；硫胺-0.1mg/l；蔗糖-60g/l；氨芐青霉素-300mg/l，如果必要的話；IPTG-0.5mM，如果必要的話；在培養(yǎng)后，通過傳統(tǒng)的方法測得菌液在540nm處光吸收值確定質(zhì)粒的穩(wěn)定?？梢酝ㄟ^薄層色譜法測定培養(yǎng)基中纈氨酸的積累量。薄層色譜法的液相如下異丙醇-80ml，乙酸乙酯-80ml，NH4OH(30％)-15ml，水-45ml。結果見表3。正如看見的，雜合質(zhì)粒pYGAZH提高了纈氨酸產(chǎn)生菌株H-81的纈氨酸積累量。
表3

參考實施1通過ilvA缺陷型L-脯氨酸菌株生產(chǎn)L-脯氨酸野生型大腸桿菌K12菌株(VKPM B-7)細胞，在37℃經(jīng)過誘變劑N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(0.1mg/ml)處理后20分鐘，清洗后涂布在附加1.25mg/ml蛋白胨，10mg/mlL-脯氨酸，0.05mg/l 2，3，5-氯化三苯基四唑的低瓊脂M9培養(yǎng)基上。在37℃經(jīng)過3天培養(yǎng)后大多數(shù)生長出的菌落是紅色。少數(shù)不能氧化L-脯氨酸的菌落為白色。其中的一個菌落被用親本來獲得對(3，4-二氫脯氨酸和氮雜環(huán)丁烷-2-羧化物)有抗性的突變體，氨基酸類似物被以2mg/ml的濃度加入到M9瓊脂培養(yǎng)基中。
生成的突變體中的一些菌株能生產(chǎn)L-脯氨酸。最好的L-脯氨酸產(chǎn)生菌株702是用在ilvA基因被插入的氯霉素(Cm)抗性基因(Cmr)打斷的菌株TG1上生長的噬菌體P1處理的。獲得的Cm抗性轉(zhuǎn)導體，702ilvA，變成了L-異亮氨酸缺陷型，比L-異亮氨酸營養(yǎng)型的親本702具有更高的L-脯氨酸生產(chǎn)能力(見表4)。發(fā)酵培養(yǎng)基成分包括60g/l 蔗糖，25g/l 硫酸胺，2g/lK2HPO4，1g/lMgSO4，0.1mg/l硫胺，50mg/L1-異亮氨酸和25g/l白堊(pH7.2)，蔗糖和白堊單獨滅菌。在試管內(nèi)放入2ml培養(yǎng)基，接種一環(huán)被測試的微生物，在37℃振蕩培養(yǎng)2天。
表4

菌株702和菌株702ilvA已經(jīng)分別于2000年6月25日在俄羅斯國家工業(yè)微生物收集中心(VKPM)保藏(Russia 113545，Moscow，1 Dorozhny proezd，l)，保藏號為VKPM B-8011和VKPM B-8012。
實施例5用含有質(zhì)粒pYGAZH的菌株生產(chǎn)脯氨酸脯氨酸生產(chǎn)菌株702ilvA是通過將含有處于PlacUV5啟動子控制下的b2682和b2683基因的質(zhì)粒pYGAZH轉(zhuǎn)入而得到的。
將菌株702ilvA，作為對照的含有未插入部分的質(zhì)粒的菌株702ilvA(pΔlacZ)和菌株702ilvA(pYGAZH)各取5個菌落，在20-ml的試管中懸浮于2ml最小培養(yǎng)基上((NH4)2SO4-18g/l；K2HPO3-1.8g/l；MgSO4-1.2g/l；硫胺-0.1mg/l；酵母提取物-0.5g/l；蔗糖-60g/l；異亮氨酸-50mg/l；如果必要的話氨芐青霉素-300mg/l)，在32℃通風條件下培養(yǎng)過夜。每個培養(yǎng)物的0.2ml菌液轉(zhuǎn)移到三個20ml的試管中，加入2ml加或不加IPTG的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，在32℃轉(zhuǎn)動振蕩培養(yǎng)40小時。
發(fā)酵培養(yǎng)基成分(NH4)2SO4-18g/l；K2HPO4-1.8g/l；MgSO4-1.2g/l；CaCO3-20mg/l；硫胺-0.1mg/l；蔗糖-60g/l；異亮氨酸-50mg/l；氨芐青霉素-300mg/l，如果必要的話；IPTG-0.5mM，如果必要的話；在培養(yǎng)后，通過傳統(tǒng)的方法測得菌液在540nm處光吸收值確定質(zhì)粒的穩(wěn)定?？梢酝ㄟ^薄層色譜法測定培養(yǎng)基中脯氨酸的積累量。薄層色譜法的液相如下異丙醇-80ml，NH4OH(30％)-5ml，水-25ml。結果見表5。正如看見的，雜合質(zhì)粒pYGAZH提高了脯氨酸產(chǎn)生菌株702ilvA的脯氨酸積累量。
表5

參考實施2通過ilvE缺陷型L-亮氨酸菌株生產(chǎn)L-亮氨酸野生型大腸桿菌K12菌株(VKPM B-7)細胞，在37℃經(jīng)過誘變劑N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(0.05mg/ml)處理后20分鐘，用生理溶液清洗4次后后涂布在附加4.0 DL-氮雜亮氨酸的低瓊脂M9培養(yǎng)基上。在37℃經(jīng)過5天培養(yǎng)后，挑出生長出的菌落在L-瓊脂平板上劃線純化。獲得的能抵抗DL-氮雜亮氨酸的突變體中的一個菌落被用來誘導L-異亮氨酸和L-纈氨酸的雙營養(yǎng)缺陷型。獲得的菌株大多數(shù)需要L-異亮氨酸和L-纈氨酸才能生長，這表明，雙營養(yǎng)缺陷型菌株是依賴與ilvE基因的突變才形成的。在獲得的雙營養(yǎng)缺陷型菌株中，選出了最好L-亮氨酸生產(chǎn)菌株505，產(chǎn)量為1.8g/Ll-亮氨酸。發(fā)酵培養(yǎng)基成分包括60g/l蔗糖，25g/l硫酸胺，2g/lK2HPO4，1g/lMgSO4，0.1mg/l硫胺，100mg/Ll-異亮氨酸，100mg/Ll-纈氨酸和25g/l白堊(pH7.2)，蔗糖和白堊單獨滅菌。在試管內(nèi)放入2ml培養(yǎng)基，接種一環(huán)被測試的微生物，在37℃振蕩培養(yǎng)2天。
大腸桿菌菌株505已經(jīng)分別于2001年5月14日在俄羅斯國家工業(yè)微生物收集中心(VKPM)保藏，(Russia 113545，Moscow，1 Dorozhny proezd，1)，保藏號為VKPM B-8011和VKPM B-8124，并于2002年根據(jù)布達佩斯條約由最初的保藏轉(zhuǎn)為國際保藏。
實施例6用含有質(zhì)粒pYGAZH的菌株生產(chǎn)亮氨酸亮氨酸生產(chǎn)菌株大腸桿菌505是通過將含有處于PlacUV5啟動子控制下的b2682和b2683基因的質(zhì)粒pYGAZH轉(zhuǎn)入而得到的。
將菌株505，作為對照的含有未插入部分的質(zhì)粒的菌株505(pΔlacZ)和菌株505(pYGAZH)各取20個菌落接種一環(huán)于加有附加或未附加氨芐青霉素的L-肉湯培養(yǎng)的20-ml的試管中，在32℃通風條件下培養(yǎng)過夜。每個培養(yǎng)物的0.1ml菌液轉(zhuǎn)移到三個20ml的試管中(內(nèi)徑22mm)，加入2ml加或不加IPTG的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，在32℃轉(zhuǎn)動振蕩培養(yǎng)72小時。發(fā)酵培養(yǎng)基成分(NH4)2SO4-15g/l；K2HPO4-1.5g/l；MgSO4X7H2O-1.0g/l；CaCO3-20g/l；(單獨滅菌)硫胺-0.1mg/l；蔗糖-60g/l；(單獨滅菌)異亮氨酸-0.3g/l；纈氨酸-0.3g/l；
氨芐青霉素-150mg/l，如果必要的話；IPTG-0.5mM，如果必要的話；在培養(yǎng)后，通過傳統(tǒng)的方法測得菌液在540nm處光吸收值確定質(zhì)粒的穩(wěn)定?？梢酝ㄟ^薄層色譜法測定培養(yǎng)基中亮氨酸的積累量。薄層色譜法的液相如下異丙醇-80ml，乙酸乙酯-80ml，NH4OH(30％)-25ml，水-50ml。結果見表6。正如看見的，雜合質(zhì)粒pYGAZH提高了亮氨酸產(chǎn)生菌株505的亮氨酸積累量。
表6

參考實施3通過對正亮氨酸有抗性的L-甲硫氨酸菌株生產(chǎn)L-甲硫氨酸無質(zhì)粒的蘇氨酸和亮氨酸缺陷性菌株大腸桿菌C600被作為親本菌株，首先，大腸桿菌C600菌株的亮氨酸突變體可以通過將在大腸桿菌K12菌株上生長的P1噬菌體的轉(zhuǎn)導得到，在37℃經(jīng)過誘變劑N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍處理后，得到了可以抵抗8g/lL-高絲氨酸的突變體菌株44。突變體菌株44是L-蘇氨酸缺陷型，突變體菌株44已經(jīng)在俄羅斯國家工業(yè)微生物收集中心(VKPM)保藏，保藏號為VKPM B-2175。
從菌株44中用N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍誘變出的菌株對甲硫氨酸類似物，正亮氨酸具有抗性。L-肉湯培養(yǎng)基的過夜培養(yǎng)物中的細胞被離心下來，用含有50μg/mlN-甲基N-硝基-N-亞硝基胍的生理溶液(0.9％NaCl)重新懸浮，細胞在37℃，N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍中暴露30分鐘后離心，用生理溶液清洗4次后后涂布在附加0.5mg/ml蘇氨酸和2.5mg/ml或5mg/ml正亮氨酸的低瓊脂M9培養(yǎng)基上。在37℃經(jīng)過5天培養(yǎng)后，挑出生長出的菌落在L-瓊脂平板上劃線純化。其中最好的L-甲硫氨酸生產(chǎn)菌株是菌株218。菌株218的試管培養(yǎng)在32℃振蕩培養(yǎng)3天，培養(yǎng)基中L-甲硫氨酸達到了1g/l。作為發(fā)酵培養(yǎng)基的最低M9培養(yǎng)基包括蔗糖(4％)，硫酸胺(2.5％)，蘇氨酸(0.5g/l)，CaCO3(25g/l)。蔗糖和白堊單獨滅菌。
菌株218已經(jīng)于2001年5月14日在俄羅斯國家工業(yè)微生物收集中心(VKPM)保藏，保藏號為VKPM B-8125，并于2002年根據(jù)布達佩斯條約由最初的保藏轉(zhuǎn)為國際保藏。
進一步，通過整合來源于枯草芽孢桿菌屬的pycA基因(俄羅斯專利申請99121636)將噬菌體P1介導的ppc基因缺失引入到菌株218，結果菌株218pycA失去了對正亮氨酸的抗性。所以，可以用上述方法重新給予菌株對正亮氨酸的抗性。在獲得的菌株中，最好L-甲硫氨酸生產(chǎn)菌株大腸桿菌菌株73，在上述條件下，產(chǎn)量約為1.0g/lL-甲硫氨酸。
大腸桿菌菌株73已經(jīng)于2001年5月14日在俄羅斯國家工業(yè)微生物收集中心(VKPM)保藏，保藏號為VKPM B-8126，并于2002年根據(jù)布達佩斯條約由最初的保藏轉(zhuǎn)為國際保藏。
實施例7用含有質(zhì)粒pYGAZH的菌株生產(chǎn)甲硫氨酸甲硫氨酸生產(chǎn)菌株大腸桿菌73是通過將含有處于PlacUV5啟動子控制下的b2682和b2683基因的質(zhì)粒pYGAZH轉(zhuǎn)入而得到的。
將菌株73，作為對照的含有未插入部分的質(zhì)粒的菌株73(pΔlacZ)和菌株73(pYGAZH)各取5個菌落，在20-ml的試管中懸浮于2ml最小培養(yǎng)基上((NH4)2SO4-18g/l；K2HPO3-1.8g/l；MgSO4-1.2g/l；硫胺-0.1mg/l；酵母提取物-10g/l；蔗糖-60g/l；蘇氨酸-400mg/l；如果必要的話氨芐青霉素-300mg/l)，在32℃通風條件下培養(yǎng)過夜。每個培養(yǎng)物的0.2ml菌液轉(zhuǎn)移到三個20ml的試管中，加入2ml加或不加IPTG的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，在32℃轉(zhuǎn)動振蕩培養(yǎng)48小時。
發(fā)酵培養(yǎng)基成分(NHX)2SO4-18g/l；K2HPO4-1.8g/l；MgSO4-1.2g/l；CaCO3-20mg/l；硫胺-0.1mg/l；
蔗糖-60g/l；蘇氨酸-400mg/l；酵母提取物-10g/l；氨芐青霉素-300mg/l，如果必要的話；IPTG-0.5mM，如果必要的話；在培養(yǎng)后，通過傳統(tǒng)的方法測得菌液在540nm處光吸收值確定質(zhì)粒的穩(wěn)定?？梢酝ㄟ^薄層色譜法測定培養(yǎng)基中甲硫氨酸的積累量。薄層色譜法的液相如下異丙醇-80ml，乙酸乙酯-80ml，NH4OH(30％)-15ml，水-45ml。結果見表7。正如看見的，雜合質(zhì)粒pYGAZH提高了甲硫氨酸產(chǎn)生菌株73的甲硫氨酸積累量。
表7

實施例8用含有質(zhì)粒pYCHE的菌株生產(chǎn)蘇氨酸蘇氨酸生產(chǎn)菌株大腸桿菌VL2054是通過將含有處于PlacUV5啟動子控制下的b1242基因的質(zhì)粒pYCHE轉(zhuǎn)入而得到的。得到的菌株被命名為VL2054pYCHE。
將菌株VL2054，作為對照的含有未插入部分的質(zhì)粒的菌株VL2054(pΔlacZ)和菌株VL2054(pYCHE)各取5個菌落，在20-ml的試管中懸浮于2ml最小培養(yǎng)基上((NH4)2SO4-11g/l；NaCl-0.4g/l；MgSO4-0.4g/l；K2HPO3-1g/l；FeSO4-10mg/l；MnSO4-10mg/l；硫胺-0.1mg/l；酵母提取物-0.5g/l；蔗糖-40g/l；如果必要的話氨芐青霉素-300mg/l)，在32℃通風條件下培養(yǎng)過夜。每個培養(yǎng)物的0.2ml菌液轉(zhuǎn)移到三個20ml的試管中，加入2ml加或不加IPTG的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，在32℃轉(zhuǎn)動振蕩培養(yǎng)45小時。
發(fā)酵培養(yǎng)基成分(NH4)2SO4-22g/l；NaCl-0.8g/l；MgSO4-0.8g/l；K2HPO3-2g/l；FeSO4-20mg/l；MnSO4-20mg/l；硫胺-0.2mg/l；酵母提取物-1g/l；CaCO3-30g/l；蔗糖-80g/l；氨芐青霉素-300mg/l，如果必要的話；IPTG-0.5mM，如果必要的話；在培養(yǎng)后，通過傳統(tǒng)的方法測得菌液在540nm處光吸收值確定質(zhì)粒的穩(wěn)定?？梢酝ㄟ^薄層色譜法測定培養(yǎng)基中蘇氨酸的積累量。薄層色譜法的液相如下異丙醇-50ml，丙酮-50ml，NH4OH(30％)-12ml，水-8ml。結果見表8。正如看見的，雜合質(zhì)粒pYCHE提高了蘇氨酸產(chǎn)生菌株VL2054的蘇氨酸積累量。
表8

實施例9用含有質(zhì)粒pYCHE的菌株生產(chǎn)纈氨酸纈氨酸生產(chǎn)菌株H-81是通過將含有處于PlacUV5啟動子控制下的b1242基因的質(zhì)粒pYCHE轉(zhuǎn)入而得到的。
將作為對照的含有未插入部分的質(zhì)粒的菌株H-81(pΔlacZ)和菌株H-81(pYCHE)各取5個菌落，在20-ml的試管中懸浮于2ml最小培養(yǎng)基上((NH4)2SO4-18g/l；K2HPO4-1.8g/l；MgSO4-1.2g/l；硫胺-0.1mg/l；酵母提取物-0.5g/l；蔗糖-60g/l；如果必要的話氨芐青霉素-300mg/l)，在通風條件下培養(yǎng)過夜。每個培養(yǎng)物的0.2ml菌液轉(zhuǎn)移到三個20ml的試管中，加入2ml加或不加IPTG的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，在32℃轉(zhuǎn)動振蕩培養(yǎng)45小時。
發(fā)酵培養(yǎng)基成分(NH4)2SO4-18g/l；K2HPO4-1.8g/l；MgSO4-1.2g/l；CaCO3-20g/l；硫胺-0.1mg/l；蔗糖-60g/l；氨芐青霉素-300mg/l，如果必要的話；IPTG-0.5mM，如果必要的話；在培養(yǎng)后，通過傳統(tǒng)的方法測得菌液在540nm處光吸收值確定質(zhì)粒的穩(wěn)定?？梢酝ㄟ^薄層色譜法測定培養(yǎng)基中纈氨酸的積累量。薄層色譜法的液相如下異丙醇-80ml，乙酸乙醇-80ml，，NH4OH(30％)-15ml，水-45ml。結果見表9。正如看見的，雜合質(zhì)粒pYCHE提高了纈氨酸產(chǎn)生菌株H-81的纈氨酸積累量。
表9

實施例10用含有質(zhì)粒pYHGN的菌株生產(chǎn)精氨酸精氨酸生產(chǎn)菌株382是通過將含有處于PlacUV5啟動子控制下的b3434基因的質(zhì)粒pYHGN轉(zhuǎn)入而得到的。獲得的菌株382已經(jīng)于2000年4月10日在俄羅斯國家工業(yè)微生物收集中心(VKPM)保藏，(Russia 113545，Moscow，1Dorozhnyproezd，1)，保藏號為VKPMB-7962。
將菌株382，作為對照的含有未插入部分的質(zhì)粒的菌株382(pΔlacZ)和菌株382(pYHGN)各取5個菌落，在20-ml的試管中懸浮于2ml最小培養(yǎng)基上((NH4)2SO4-25g/l；K2HPO4-2.0g/l；MgSO47H2O-1.0g/l；硫胺-0.2mg/l；酵母提取物-5g/l；蔗糖-60g/l；如果必要的話氨芐青霉素-300mg/l)，在通風條件下培養(yǎng)過夜。每個培養(yǎng)物的0.2ml菌液轉(zhuǎn)移到三個20ml的試管中，加入2ml加或不加IPTG的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，在32℃轉(zhuǎn)動振蕩培養(yǎng)72小時。
發(fā)酵培養(yǎng)基成分(NH4)2SO4-25g/l；K2HPO4-2.0g/l；MgSO47H2O-1.0g/l；硫胺-0.2mg/l；酵母提取物-5g/l；蔗糖-60g/l；CaCO3-20g/l；氨芐青霉素-100mg/l，如果必要的話；IPTG-0.5mM，如果必要的話；在培養(yǎng)后，通過傳統(tǒng)的方法測得菌液在540nm處光吸收值確定質(zhì)粒的穩(wěn)定。可以通過薄層色譜法測定培養(yǎng)基中精氨酸的積累量。薄層色譜法的液相如下異丙醇-80ml，乙酸乙酯-40ml，，NH4OH(30％)-25ml，水-50ml。結果見表10。正如看見的，雜合質(zhì)粒pYHGN提高了纈氨酸產(chǎn)生菌株382的纈氨酸積累量。
表10

實施例11用含有質(zhì)粒pYHGN的菌株生產(chǎn)脯氨酸脯氨酸生產(chǎn)菌株702ilvA是通過將含有處于PlacUV5啟動子控制下的b3434基因的質(zhì)粒pYHGN轉(zhuǎn)入而得到的。
將菌株702ilvA，作為對照的含有未插入部分的質(zhì)粒的菌株702ilvA(pΔlacZ)和菌株702ilvA(pYHGN)各取5個菌落，在20-ml的試管中懸浮于2ml最小培養(yǎng)基上((NH4)2SO4-18g/l；K2HPO3-1.8g/l；MgSO4-1.2g/l；硫胺-0.1mg/l；酵母提取物-0.5g/l；蔗糖-60g/l；異亮氨酸-50mg/l；如果必要的話氨芐青霉素-300mg/l)，在32℃通風條件下培養(yǎng)過夜。每個培養(yǎng)物的0.2ml菌液轉(zhuǎn)移到三個20ml的試管中，加入2ml加或不加IPTG的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，在32℃轉(zhuǎn)動振蕩培養(yǎng)40小時。
發(fā)酵培養(yǎng)基成分(NH4)2SO4-18g/l；K2HPO4-1.8g/l；MgSO4-1.2g/l；CaCO3-20mg/l；硫胺-0.1mg/l；蔗糖-60g/l；異亮氨酸-50mg/l；氨芐青霉素-300mg/l，如果必要的話；IPTG-0.5mM，如果必要的話；
在培養(yǎng)后，通過傳統(tǒng)的方法測得菌液在540nm處光吸收值確定質(zhì)粒的穩(wěn)定?？梢酝ㄟ^薄層色譜法測定培養(yǎng)基中脯氨酸的積累量。薄層色譜法的液相如下異丙醇-80ml，NH4OH(30％)-5ml，水-25ml。結果見表11。正如看見的，雜合質(zhì)粒pYHGN提高了脯氨酸產(chǎn)生菌株702ilvA的脯氨酸積累量。
表11

序列表<110>Ajinomoto Co..Inc.<120>通過大腸桿菌屬細菌生產(chǎn)L-氨基酸的方法<130>P-8206F<140><141>2002--<150>RU 2001103865<151>2001-02-13<150>RU 2001104998<151>2001-02-26<150>RU 2001104999<151>2001-02-26<150>RU 2001117632<151>2001-06-28<150>RU 2001117633<151>2001-06-28<160>16<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>1ggtctagaca atcgttaagc gtacac 26<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>2ccggatccga tatagtaacg acagtg 26<210>3<211>738<212>DNA<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<220><221>CDS<222>(1)..(735)<400>3atg gaa agc cct act cca cag cct gct cct ggt tcg gcg acc ttc atg 48Met Glu Ser Pro Thr Pro Gln Pro Ala Pro Gly Ser Ala Thr Phe Met1 5 10 15gaa gga tgc aaa gac agt tta ccg att gtt att agt tat att ccg gtg 96Glu Gly Cys Lys Asp Ser Leu Pro Ile Val Ile Ser Tyr Ile Pro Val20 25 30gcc ttt gcg ttc ggt ctg aat gcg acc cgt ctg gga ttc tct cct ctc 144Ala Phe Ala Phe Gly Leu Asn Ala Thr Arg Leu Gly Phe Ser Pro Leu35 40 45gaa agc gtt ttt ttc tcc tgc atc att tat gca ggc gcg agc 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Ala Val Leu Leu Ile Leu Ile Met Asp1 5 10 15Pro Leu Gly Asn Leu Pro Ile Phe Met Ser Val Leu Lys His Thr Glu20 25 30Pro Lys Arg Arg Arg Ala Ile Met Val Arg Glu Leu Leu Ile Ala Leu35 40 45Leu Val Met Leu Val Phe Leu Phe Ala Gly Glu Lys Ile Leu Ala Phe50 55 60Leu Ser Leu Arg Ala Glu Thr Val Ser Ile Ser Gly Gly Ile Ile Leu65 70 75 80Phe Leu Ile Ala Ile Lys Met Ile Phe Pro Ser Ala Ser Gly Asn Ser85 90 95Ser Gly Leu Pro Ala Gly Glu Glu Pro Phe Ile Val Pro Leu Ala Ile100 105 110Pro Leu Val Ala Gly Pro Thr Ile Leu Ala Thr Leu Met Leu Leu Ser115 120 125His Gln Tyr Pro Asn Gln Met Gly His Leu Val Ile Ala Leu Leu Leu130 135 140Ala Trp Gly Gly Thr Phe Val Ile Leu Leu Gln Ser Ser Leu Phe Leu145 150 155 160Arg Leu Leu Gly Glu Lys Gly Val Asn Ala Leu Glu Arg Leu Met Gly165 170 175Leu Ile Leu Val Met Met Ala Thr Gln Met Phe Leu Asp Gly Ile Arg180 185 190Met Trp Met Lys Gly19權利要求
1.一種屬于大腸桿菌屬的L-氨基酸生產(chǎn)細菌，該細菌經(jīng)過修飾以致于該細菌的L-氨基酸生產(chǎn)可以通過提高以下A)或B)，和C)或D)定義的蛋白質(zhì)在所述細菌細胞中的活性來提高A)一種包含序列表中SEQ ID NO3所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；B)一種包含在序列表中SEQ ID NO3所示氨基酸序列上缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，它有使細菌增加對L-氨基酸和/或其類似物的抗性的活性；C)一種包含序列表中SEQ ID NO5所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；D)一種包含在序列表中SEQ ID NO5所示氨基酸序列上缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，它有使細菌增加對L-氨基酸和/或其類似物的抗性的活性；。
2.根據(jù)權利要求1的細菌，A)或B)和C)或D)定義的蛋白質(zhì)的活性可以通過將編碼A)或B)和C)或D)定義的蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)化進細菌，或通過改變細菌染色體DNA上的表達調(diào)控序列來提高。
3.根據(jù)權利要求2的細菌，其中的轉(zhuǎn)化是通過多拷貝載體進行的。
4.一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權利要求1-3的細菌并從培養(yǎng)基中收集產(chǎn)生并積累的L-氨基酸。
5.根據(jù)權利要求4的方法，所述的L-氨基酸是L-蘇氨酸。
6.根據(jù)權利要求5的方法，所述的細菌已經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細菌具有蘇氨酸操縱子的增強的表達。
7.根據(jù)權利要求4方法，所述的L-氨基酸是L-纈氨酸。
8.根據(jù)權利要求7方法，所述的細菌已經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細菌可以提高ilv操縱子的表達。
9.根據(jù)權利要求4方法，所述的L-氨基酸是L-脯氨酸。
10.根據(jù)權利要求9方法，所述的細菌已經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細菌可以增強脯氨酸生物合成基因的表達。
11.根據(jù)權利要求4方法，所述的L-氨基酸是L-亮氨酸。
12.根據(jù)權利要求11方法，所述的細菌已經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細菌可以提高leu操縱子的表達。
13.根據(jù)權利要求4方法，所述的L-氨基酸是L-甲硫氨酸。
14.根據(jù)權利要求13方法，所述的細菌已經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細菌可以具有met操縱子的提高的表達。
15.一種L-氨基酸生產(chǎn)細菌，該細菌屬于大腸桿菌屬，該細菌經(jīng)過修飾以致于該細菌的L-氨基酸生產(chǎn)可以通過提高以下E)或F)定義的蛋白質(zhì)在所述細菌細胞中的活性來提高E)一種包含序列表中SEQ ID NO11所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；F)一種包含在序列表中SEQ ID NO11所示氨基酸序列上缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，它有使細菌增加對L-氨基酸和/或其類似物的抗性的活性；
16.根據(jù)權利要求15的細菌，E)或F)定義的蛋白質(zhì)的活性可以通過將編碼E)或F)定義的蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)化進細菌，或通過改變細菌染色體DNA上的表達調(diào)控序列而提高。
17.根據(jù)權利要求16的細菌，其中的轉(zhuǎn)化是通過多拷貝載體進行的。
18.一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權利要求15-17的細菌并從培養(yǎng)基中收集產(chǎn)生并積累的L-氨基酸。
19.根據(jù)權利要求18方法，所述的L-氨基酸是L-蘇氨酸。
20.根據(jù)權利要求19方法，所述的細菌已經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細菌具有蘇氨酸操縱子的提高的表達。
21.根據(jù)權利要求18方法，所述的L-氨基酸是L-纈氨酸。
22.根據(jù)權利要求21方法，所述的細菌已經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細菌具有ilv操縱子的提高的表達。
23.一種L-氨基酸生產(chǎn)細菌，該細菌屬于大腸桿菌屬，該細菌經(jīng)過修飾以致于該細菌的L-氨基酸生產(chǎn)可以通過以下G)或H)定義的蛋白質(zhì)在細菌細胞中的活性來提高G)一種包含序列表中SEQ ID NO15所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；H)一種包含在序列表中SEQ ID NO15所示氨基酸序列上缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，它有使細菌增加對L-氨基酸和/或其類似物的抗性的活性，例如；DL-o-甲基絲氨酸，6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸和DL-β-羥基-正纈氨酸，對S-(2-氨乙基)半胱氨酸敏感性增加。
24.根據(jù)權利要求23的細菌，G)或H)定義的蛋白質(zhì)的活性可以通過將編碼G)或H)定義的蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)化進細菌，或通過改變細菌染色體DNA上的表達調(diào)控序列而提高。
25.根據(jù)權利要求24的細菌，其中的轉(zhuǎn)化是通過多拷貝載體進行的。
26.一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權利要求23-25中任一細菌并從培養(yǎng)基中收集產(chǎn)生并積累的L-氨基酸。
27.根據(jù)權利要求26方法，所述的L-氨基酸是L-精氨酸。
28.根據(jù)權利要求27方法，所述的細菌已經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細菌可以提高精氨酸調(diào)節(jié)子的表達。
29.根據(jù)權利要求26的方法，所述的L-氨基酸是L-脯氨酸。
30.根據(jù)權利要求9的方法，所述的細菌已經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細菌可以提高脯氨酸生物合成基因的表達。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種使用大腸桿菌屬細菌生產(chǎn)L－蘇氨酸,L－纈氨酸,L－脯氨酸,L－亮氨酸,L－甲硫氨酸和L－精氨酸的生產(chǎn)方法。所述細菌的L－氨基酸生產(chǎn)能力通過提高b2682和b2683基因,或b1242基因,或b3434基因編碼的蛋白質(zhì)的活性被提高。
文檔編號C12P13/08GK1373226SQ0210808
公開日2002年10月9日 申請日期2002年2月13日 優(yōu)先權日2001年2月13日
發(fā)明者E·A·塔波利納, K·V·賴巴克, E·M·霍爾格斯, E·B·沃羅施洛瓦, M·M·古斯亞蒂納 申請人:味之素株式會社