專利名稱：Rna探針的制備方法、靶核酸的檢測方法以及rna探針的制備試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及RNA探針的制備方法、靶核酸的檢測方法以及RNA探針的制備試劑盒。
背景技術(shù)：
基因診斷、病原菌的鑒定或單核苷酸多態(tài)性的檢測等以檢測某種核酸(靶核酸)為目的使用核酸探針。將核酸探針與靶核酸混合后，對核酸探針是否與靶核酸雜交，例如可用具有核酸探針的熒光標(biāo)記等標(biāo)記進行檢測。
作為上述核酸探針，由于用DNA合成儀很容易合成，因此主要是采用DNA探針。此外，從容易檢測與靶核酸雜交的核酸探針的觀點考慮，大多采用熒光標(biāo)記，但是除熒光標(biāo)記以外，有時也采用RI等。
近年來，很多將靶核酸固定在基材上的DNA芯片、DNA微陣列已經(jīng)實際應(yīng)用，并有希望提供操作簡便且靈敏度高的、采用核酸探針的靶核酸檢測技術(shù)。
對于采用核酸探針的靶核酸檢測技術(shù)，由于與未雜交的核酸探針處于共存的狀態(tài)，因此必須檢測出只與靶核酸雜交的核酸探針。已知只檢測出與靶核酸雜交的核酸探針的方法之一如以下所述。即，核酸探針與靶核酸各自分別有不同的激發(fā)波長和發(fā)射波長，附加一方的激發(fā)波長與另一方的發(fā)光波長相同的熒光標(biāo)記后，用只激發(fā)一方熒光標(biāo)記的波長的激光照射，此時只有在雜交的情況下，激發(fā)能量才能轉(zhuǎn)移到另一方的熒光標(biāo)記，而使另一方的熒光標(biāo)記發(fā)光，從而只檢測出與靶核酸雜交的核酸探針。但采用這種方法時，靶核酸也必須加入熒光標(biāo)記，因此比較繁瑣。
作為解決上述問題的方法，將1種核酸探針分成兩份，在每份探針中附加與上述同樣組合的兩種熒光標(biāo)記，只有在與兩種探針都雜交的情況下，才能得到預(yù)定的熒光。但采用這種方法，存在的問題是必須準(zhǔn)備2種探針。
目前，采用DNA微陣列檢測靶核酸方面，多采用摻入花菁(Cyanine，以下略作Cy)3-dUTP和Cy5-dUTP的熒光標(biāo)記探針。此時，作為信號強度至少有一些提高的探針的制備方法，有采用隨機引物的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(崗崎康司等，應(yīng)用小鼠cDNA微陣列的表達譜解析，細胞工學(xué)Vol.18，No.6，1999)。
采用核酸探針檢測靶核酸的方法，特別是采用DNA芯片、DNA微陣列方法時，希望有高的檢測靈敏度(高的S/N比)。這是由于，對DNA芯片、DNA微陣列來說，必須根椐與1分子靶核酸雜交的1分子核酸探針?biāo)l(fā)出的信號(例如，發(fā)光)來探測是否雜交。為了提高核酸探針發(fā)出信號的S/N比，提高核酸探針發(fā)出的信號的絕對量是有效的。
但是，上述的任何一種方法都是采用DNA探針的方法。與此相比，采用熒光標(biāo)記RNA探針檢測靶核酸的方法也已有報道(Hughes，T.R.等，Nature Biotechnol.19(2001)342-347)。與用DNA探針的靶核酸檢測方法相比，用RNA探針的靶核酸檢測方法的優(yōu)點是可以用RNA酶除去未雜交的探針。此外，由于RNA/DNA雜交的嚴(yán)格性(Stringency)高于DNA/DNA，所以可得到高的S/N比。再者，與DNA探針相比，能夠獲得長久穩(wěn)定且可明確定義的信號，這也是用RNA探針檢測靶核酸的方法所具有的優(yōu)點。但上述熒光標(biāo)記RNA探針是以cDNA為模板，用RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄得到RNA探針后，通過兩步化學(xué)合成法加入熒光標(biāo)記而制成的探針。
從RNA的穩(wěn)定性考慮，通過化學(xué)合成法附加熒光標(biāo)記的操作終究是附加的工藝，而如果用RNA聚合酶，通過轉(zhuǎn)錄直接得到熒光標(biāo)記的探針則是理想的。作為具有熒光標(biāo)記的核苷酸試劑已有市售，因此可以考慮將該熒光標(biāo)記的核苷酸作為一部分底物，用RNA聚合酶通過轉(zhuǎn)錄直接得到熒光標(biāo)記的RNA探針。然而，本發(fā)明人用熒光標(biāo)記的核苷酸Cy3-UTP、Cy5-UTP作為底物，試圖通過T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄RNA探針時，未能得到熒光標(biāo)記的RNA探針(參照下述實施例中所示的數(shù)據(jù))。可以認(rèn)為，這是由于RNA聚合酶不能識別Cy3-UTP、Cy5-UTP之類的熒光標(biāo)記核苷酸底物，因此不能將其摻入RNA鏈中。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種通過RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備標(biāo)記RNA探針的方法，該標(biāo)記RNA探針含有Cy3-UTP、Cy5-UTP之類的熒光標(biāo)記且與靶核酸雜交，在進行核酸的檢測時，可得到高的S/N比。本發(fā)明還提供利用上述RNA探針制備方法的RNA探針制備試劑盒。此外，本發(fā)明另一目的是提供一種采用由上述方法所得的標(biāo)記RNA探針檢測靶核酸的方法。

發(fā)明內(nèi)容
解決上述課題的本發(fā)明如下所述。
RNA探針的制備方法，該方法是使RNA聚合酶在含有該RNA聚合酶相應(yīng)啟動子序列的DNA片段，以及該RNA聚合酶的底物存在下進行反應(yīng)，制備具有標(biāo)記的RNA探針的方法；其特征在于，上述底物中至少一種有上述標(biāo)記，且上述RNA聚合酶是將野生型RNA聚合酶中的至少一個氨基酸進行修飾的變異型RNA聚合酶，該變異型RNA聚合酶可使具有上述標(biāo)記的底物摻入，或者可改善具有上述標(biāo)記的底物的摻入。
上述RNA探針的制備方法中，優(yōu)選以下形式。
上述底物是ATP、GTP、CTP、UTP或由它們的衍生物所形成的核苷-5′-三磷酸類(以下稱為NTP衍生物)，且這些NTP衍生物中1種或2種以上的一部分或全部是具有上述標(biāo)記的形式。
上述標(biāo)記為熒光標(biāo)記，特別是上述熒光標(biāo)記為Cy3或Cy5的形式。
變異型RNA聚合酶是野生型RNA聚合酶的核苷酸結(jié)合位點中至少一個氨基酸產(chǎn)生置換、插入、或缺失的RNA聚合酶的形式。
變異型RNA聚合酶是野生型RNA聚合酶的核苷酸結(jié)合位點中至少一個氨基酸置換為酪氨酸的RNA聚合酶的形式，特別是被置換的氨基酸是苯丙氨酸的形式。
在核苷酸結(jié)合位點的氨基酸是在螺旋Y和螺旋Z之間的環(huán)中的氨基酸，和/或是在螺旋Z和螺旋AA之間的環(huán)中的氨基酸的形式。
變異型RNA聚合酶是來源于T7噬菌體、T3噬菌體、SP6噬菌體和K11噬菌體的形式。
變異型RNA聚合酶是在相應(yīng)于T7噬菌體RNA聚合酶的641～667位氨基酸殘基的選擇區(qū)域內(nèi)，至少有1個氨基酸被修飾的野生型RNA聚合酶的形式。
變異型RNA聚合酶是來源于T7噬菌體的RNA聚合酶，其644位或667位氨基酸殘基為酪氨酸的RNA聚合酶的形式。
變異型RNA聚合酶是將野生型T7RNA聚合酶中的644位氨基酸殘基苯丙氨酸置換為酪氨酸的RNA聚合酶的形式。
變異型RNA聚合酶是將野生型T7RNA聚合酶中的667位氨基酸殘基苯丙氨酸置換為酪氨酸的RNA聚合酶的形式。
變異型RNA聚合酶是進一步將野生型T7RNA聚合酶中的665位氨基酸殘基亮氨酸置換為脯氨酸的RNA聚合酶的形式。
變異型RNA聚合酶是將野生型T7RNA聚合酶中的644位氨基酸殘基苯丙氨酸置換為酪氨酸，并且還將667位氨基酸殘基苯丙氨酸置換為酪氨酸的RNA聚合酶的形式。
變異型RNA聚合酶是進一步將野生型T7RNA聚合酶中的665位氨基酸殘基亮氨酸置換為脯氨酸的RNA聚合酶的形式。
變異型RNA聚合酶是來源于T3噬菌體的RNA聚合酶，其645或668位氨基酸殘基為酪氨酸的RNA聚合酶的形式。
變異型RNA聚合酶是來源于K11噬菌體的RNA聚合酶，其663～668位之間或690位氨基酸殘基中具有酪氨酸的RNA聚合酶的形式，以及變異型RNA聚合酶是來源于SP6噬菌體的RNA聚合酶，其633～638位之間或670位氨基酸殘基中具有酪氨酸的RNA聚合酶的形式。
本發(fā)明還涉及檢測靶核酸的方法，該方法是將靶核酸與按上述本發(fā)明的方法制成的具有標(biāo)記的RNA探針混合，并選擇性地檢測與上述靶核酸雜交的RNA探針的方法。
在該靶核酸的檢測方法中，優(yōu)選以下形式。
在上述的混合和雜交之后，用RNA酶處理混合物，然后通過檢測殘留的靶核酸與RNA探針的雜交體而進行上述選擇性檢測的形式。
靶核酸固定在基材上的形式。
靶核酸為DNA、肽核酸或RNA的形式。以及靶核酸為寡核苷酸陣列或cDNA微陣列狀態(tài)的形式。
本發(fā)明還涉及一種試劑盒，該試劑盒為含有以下(1)～(4)組成部分，具有標(biāo)記的RNA探針的制備試劑盒，(1)RNA聚合酶，(2)含有上述RNA聚合酶相應(yīng)啟動子序列的DNA，(3)上述RNA聚合酶的底物，以及(4)說明書；其特征在于，上述底物中至少有一種具有標(biāo)記，且上述RNA聚合酶是將野生型RNA聚合酶中的至少一個氨基酸進行修飾的變異型RNA聚合酶，該變異型RNA聚合酶可促使具有上述標(biāo)記的底物摻入，或者可改善具有上述標(biāo)記的底物的摻入。
上述試劑盒優(yōu)選以下形式。
進一步包含連接含有啟動子序列的DNA與制備探針的模板DNA的手段的形式。
連接含有啟動子序列的DNA與制備探針的模板DNA的手段為使用DNA聚合酶，或DNA聚合酶及反轉(zhuǎn)錄酶的形式。
含有ATP、GTP、CTP、UTP或由它們的衍生物所形成的核苷-5′-三磷酸類(以下稱為NTP衍生物)的一部分或全部作為上述底物，且除了上述NTP衍生物以外，至少還含有1種一部分或全部具有標(biāo)記的NTP衍生物的形式，特別是含有2種以上一部分或全部具有標(biāo)記的NTP衍生物的形式。以及上述標(biāo)記為熒光標(biāo)記的形式，特別是上述熒光標(biāo)記是Cy3或Cy5的形式。術(shù)語的定義(1)RNA探針RNA探針指與靶核酸雜交的RNA。RNA探針中包括與寡核苷酸陣列、cDNA微陣列等形態(tài)的靶DNA雜交的RNA。
(2)靶DNA靶DNA指與探針雜交的DNA。包括固定在基材上的與RNA探針雜交的DNA。靶DNA可采取寡核苷酸陣列、cDNA微陣列的形態(tài)。
(3)寡核苷酸陣列寡核苷酸陣列指將寡核苷酸在載玻片等基材上，通過化學(xué)合成高密度地制成的核酸陣列。
(4)cDNA微陣列cDNA微陣列指將用PCR等擴增的cDNA文庫固定在載玻片等基材上而制成的微陣列。RNA探針的制備方法本發(fā)明的RNA探針制備方法如下所述。即，用RNA聚合酶，在含有該RNA聚合酶相應(yīng)啟動子序列的DNA片段、以及該RNA聚合酶的底物存在下進行反應(yīng)，制成具有標(biāo)記的RNA探針。該方法的特征在于，上述底物中至少一種具有標(biāo)記，且上述RNA聚合酶是將野生型RNA聚合酶中的至少一個氨基酸進行修飾的變異型RNA聚合酶，該變異型RNA聚合酶可使具有上述標(biāo)記的底物摻入，或者可改善具有上述標(biāo)記的底物的摻入。
本發(fā)明中的RNA探針是在通常的核酸雜交條件(例如Southern法、Northern法中所采用的條件)下，能與靶核酸雜交的RNA片段；本發(fā)明的RNA探針只要是在上述規(guī)定的條件下，能與靶核酸雜交并具有標(biāo)記的RNA片段，則對堿基數(shù)和序列(堿基的排列方向和順序)等無特別的限制。
(含有標(biāo)記的底物)作為具有標(biāo)記的底物中的標(biāo)記物質(zhì)，例如熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、放射線同位素(RI)、穩(wěn)定同位素等。作為熒光物質(zhì)，例如芘、香豆素、二乙基氨基香豆素、氯三嗪基熒光素、熒光素、5-FAM(5-羧基熒光素)、曙紅、6-JOE(6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基熒光素)、R6G(若丹明6G)、四甲基若丹明、5-TAMRA(5-羧基四甲基若丹明)、R110(若丹明110)、利薩明綠(Lissamine)、5-ROX(5-羧基X-若丹明)、萘熒光素、得克薩斯紅、藻紅蛋白、若丹明、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、熒光劑X(Fluor X)、4，4-二氯-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-苯并二茚-3-丙酸(BODIPY FL)等。以下所述的靶核酸檢測方法中，通常采用具有不同熒光標(biāo)記的2種以上的探針，但優(yōu)選能夠清楚地區(qū)分各種探針?biāo)哂械臒晒鈽?biāo)記的熒光顏色。
作為RNA聚合酶的底物，而且是具有標(biāo)記的底物，同時在市場上又容易購得的產(chǎn)品，例如用熒光素、香豆素、四甲基若丹明、得克薩斯紅、利薩明綠、萘熒光素、氯三嗪基熒光素、芘、Cy3和Cy5標(biāo)記的產(chǎn)品。這些產(chǎn)品可作為市售產(chǎn)品購得(例如，NENTMLife Science Products，Inc.等)。但是，不限于這些產(chǎn)品。
(變異型RNA聚合酶)本發(fā)明的RNA探針制備方法中所使用的變異型RNA聚合物是對野生型RNA聚合酶中的至少一個氨基酸進行修飾后獲得的，經(jīng)過這種修飾后，可促使具有上述標(biāo)記的底物摻入。以下，對變異型RNA聚合酶進行詳細的描述。
作為變異型RNA聚合酶，已記載在特開平11-75867號公報中。該變異型RNA聚合酶是將對應(yīng)的野生型RNA聚合酶中至少1個氨基酸進行修飾后所得的RNA聚合酶，經(jīng)過這種修飾后，使變異型RNA聚合酶與對應(yīng)的野生型RNA聚合酶相比，增加了摻入3′脫氧核苷酸或其衍生物的能力。開發(fā)該變異型RNA聚合酶的主要目的在于，用于測定以3′脫氧核苷酸或其衍生物作為終止子的DNA序列。已知3′脫氧核苷酸或其衍生物也可作為野生型RNA聚合酶識別的底物，并用于RNA合成中，但其摻入效率很低，而上述變異型RNA聚合酶可改善此缺點。
對此，本發(fā)明人等對可將具有標(biāo)記的底物(標(biāo)記NTP(NTP＝ATP、GTP、CTP、UTP))作為底物的RNA聚合酶進行了研究，而這種具有標(biāo)記的底物實際上不能被野生型RNA聚合酶作為底物摻入到RNA鏈中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述特開平11-75867號公報中記載的變異型RNA聚合酶能滿足此要求。
即，本發(fā)明中所使用的變異型RNA聚合酶可以是上述特開平11-75867號公報中記載的變異型RNA聚合酶。
更具體而言，變異型RNA聚合酶可以是野生型RNA聚合酶的核苷酸結(jié)合位點中至少1個氨基酸產(chǎn)生置換、插入或缺失的RNA聚合酶。
變異型RNA聚合酶可以是野生型RNA聚合酶的核苷酸結(jié)合位點中至少一個氨基酸置換為酪氨酸的RNA聚合酶，更具體而言，被置換的氨基酸可以是苯丙氨酸。
在核苷酸結(jié)合位點的氨基酸可以是在螺旋Y和螺旋Z之間的環(huán)中的氨基酸，和/或在螺旋Z和螺旋AA之間的環(huán)中的氨基酸。
變異型RNA聚合酶可以來源于T7噬菌體、T3噬菌體、SP6噬菌體和K11噬菌體。
更具體而言，變異型RNA聚合酶可以是在相應(yīng)于T7噬菌體RNA聚合酶641～667位氨基酸殘基區(qū)域的選擇區(qū)域內(nèi)，至少有1個氨基酸被修飾的野生型RNA聚合酶。更具體而言，變異型RNA聚合酶可以是T7噬菌體RNA聚合酶中644位或667位的氨基酸殘基為酪氨酸的RNA聚合酶，野生型T7RNA聚合酶中644位氨基酸殘基苯丙氨酸置換為酪氨酸的RNA聚合酶，野生型T7RNA聚合酶中667位氨基酸殘基苯丙氨酸置換為酪氨酸的RNA聚合酶。這些野生型T7RNA聚合酶也可以是665位氨基酸殘基亮氨酸進一步置換為脯氨酸的RNA聚合酶。
變異型RNA聚合酶可以是野生型T7RNA聚合酶中644位氨基酸殘基苯丙氨酸置換為酪氨酸，且667位氨基酸殘基苯丙氨酸置換為酪氨酸的RNA聚合酶，進一步還可以是野生型T7RNA聚合酶中665位氨基酸殘基亮氨酸進一步置換為脯氨酸的RNA聚合酶。
變異型RNA聚合酶也可以是(1)T3噬菌體來源的RNA聚合酶中645或668位氨基酸殘基為酪氨酸的RNA聚合酶；(2)K11噬菌體來源的RNA聚合酶中663～668位之間或690位氨基酸殘基中具有酪氨酸的RNA聚合酶；(3)SP6噬菌體來源的RNA聚合酶中633～638位之間或670位氨基酸殘基中具有酪氨酸的RNA聚合酶。
所謂“野生型RNA聚合酶”指的是天然存在的完整的RNA聚合酶。此外，“野生型RNA聚合酶”也可以是野生型RNA聚合酶產(chǎn)生氨基酸的置換、插入或缺失的RNA聚合酶，但這種修飾的目的不在于摻入具有上述標(biāo)記的底物。即，以上述以外的目的，人為地對野生型RNA聚合酶進行修飾后所得的RNA聚合酶也屬于“野生型RNA聚合酶”。但這樣的氨基酸置換、插入或缺失，宜于在保持RNA聚合酶活性的范圍內(nèi)進行。
變異型RNA聚合酶的制備方法如以下所述。即，制備編碼RNA聚合酶的核酸分子，并使核苷酸堿基序列內(nèi)1個或1個以上位點的1個或1個以上的堿基變異，從而使該核酸分子產(chǎn)生突變，隨后回收由變異的核酸分子表達的修飾RNA聚合酶。編碼RNA聚合酶的核酸分子的制備，將突變導(dǎo)入核酸分子，回收經(jīng)修飾的RNA聚合酶都可采用公知的方法進行。
變異型T7RNA聚合酶可以用以下的方法構(gòu)建。即，以插入了T7RNA聚合酶基因的表達載體為模板，構(gòu)建通過PCR方法在相當(dāng)于T7RNA聚合酶基因C末端一側(cè)的限制性內(nèi)切酶HpaI、NcoI位點之間的區(qū)域?qū)肓俗儺惖谋磉_質(zhì)粒。然后，用此表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，則可使變異型T7RNA聚合酶蛋白大量表達。
(RNA探針的制備)由上述標(biāo)記底物和非標(biāo)記底物，用變異型RNA聚合酶制備標(biāo)記RNA探針的方法如下。即，以含有上述變異型RNA聚合酶相應(yīng)啟動子序列的DNA片段為模板，酶法合成核酸轉(zhuǎn)錄物。
例如，用5′端有RNA聚合酶啟動子位點的寡聚dT引物，由mRNA通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，再通過DNA聚合酶反應(yīng)制備雙鏈cDNA。以所得DNA為模板，用變異型T7RNA聚合酶(例如，644位的苯丙氨酸置換為酪氨酸的RNA聚合酶)，摻入普通NTP以外的Cy3-UTP或Cy5-UTP(標(biāo)記底物)，結(jié)果獲得含有Cy3-UTP或Cy5-UTP的RNA生成物。標(biāo)記NTP不限于標(biāo)記UTP，有時也可采用標(biāo)記ATP、標(biāo)記GTP、標(biāo)記CTP。這些利用RNA聚合酶的合成反應(yīng)可按上述同樣方法進行。另外，1次RNA聚合酶合成反應(yīng)中，也可使用2種以上的標(biāo)記NTP(但標(biāo)記的種類要相同)作為底物。由此，可提高RNA探針中所具有的標(biāo)記的密度。
根據(jù)本發(fā)明的方法，用RNA聚合酶合成的具有標(biāo)記的RNA探針，可直接用于與靶核酸的雜交反應(yīng)中?；蛘?，也可以將按照本發(fā)明的方法用RNA聚合酶合成的具有標(biāo)記的RNA探針片斷化(將鏈切斷，使其變成短鏈)后，再用于與靶核酸的雜交。具有標(biāo)記的RNA探針的片斷化可在Zn2+等2價金屬離子的存在下，通過加溫(例如，60℃30分鐘)進行。靶核酸的檢測方法本發(fā)明的靶核酸檢測方法的特征在于，將靶核酸與按本發(fā)明的方法用RNA聚合酶合成的具有標(biāo)記的RNA探針混合，選擇性地檢測與上述靶核酸雜交的RNA探針。
RNA探針與靶核酸的雜交條件可根據(jù)靶核酸的種類、RNA探針的種類適宜確定。例如，將含有RNA探針的雜交液滴在如固定了靶核酸的寡核苷酸陣列、cDNA微陣列上，放置一定時間來進行。
在上述的混合和雜交后，用RNA酶處理混合物，通過檢測殘留的靶核酸與RNA探針的雜交體，進行上述的選擇性檢測。
作為上述混合物的RNA酶處理方法，例如用溶于適當(dāng)緩沖液中的RNA酶溶液，在雜交后處理固定了靶核酸的寡核苷酸陣列、cDNA微陣列來進行。
靶核酸與RNA探針雜交的檢測可根據(jù)RNA探針含有的標(biāo)記種類，用公知的方法適當(dāng)?shù)剡M行。
作為靶核酸，例如可以是DNA、肽核酸、RNA等。還可以將靶核酸固定在基材上，例如靶核酸可以是芯片或微陣列的形式。固定靶核酸的基材以不溶于溶液的基材為好，例如可以是板、珠子、纖維、凝膠、膜、陶瓷等。更具體的例子是在所謂DNA芯片的基材上，高密度地合成寡核苷酸而形成的寡核苷酸陣列，或?qū)CR擴增的cDNA固定在基材上而形成的cDNA微陣列。
作為DNA微陣列的制備方法，例如以靶核酸(例如，小鼠cDNA文庫各克隆的質(zhì)粒DNA)為模板進行PCR反應(yīng)，將得到的PCR產(chǎn)物固定在聚L-賴氨酸涂層的載玻片上。肽核酸、RNA的微陣列的制備方法也可以與DNA微陣列的制備方法相同。
通常，在采用寡核苷酸陣列時，固定在基材上的寡核苷酸量的均一性和重現(xiàn)性高。因此，用探針檢測靶核酸時，用一種標(biāo)記探針即可得到有一定重現(xiàn)性的數(shù)據(jù)。
與此相比，在采用cDNA微陣列時，cDNA庫中所含有的各種cDNA群體有所差別，不能由與靶核酸雜交的探針的熒光強度等對cDNA量進行定量。因此，在采用cDNA微陣列時，優(yōu)選使用二種顏色的熒光標(biāo)記探針的雙熒光標(biāo)記法檢測靶DNA。
用探針檢測靶DNA時，可按常規(guī)方法進行。
例如，對于用小鼠cDNA文庫各克隆的質(zhì)粒DNA作為靶核酸制成的DNA微陣列，可將出生后第10天的小鼠頭部mRNA來源的Cy3標(biāo)記RNA探針與17.5天小鼠胚胎mRNA來源的Cy5標(biāo)記RNA探針等量混合后，用于檢測微陣列上的靶DNA信號。此時，例如用17.5天小鼠胚胎mRNA來源的Cy5標(biāo)記RNA探針作為參照物，則可以知道DNA微陣列上各cDNA與出生后第10天的小鼠頭部mRNA之間的關(guān)系(定性和定量)。RNA探針的制備試劑盒本發(fā)明的RNA探針制備試劑盒是具有標(biāo)記的RNA探針制備試劑盒，該試劑盒包括以下組成部分(1)RNA聚合酶，
(2)含有上述RNA聚合酶相應(yīng)啟動子序列的DNA，(3)上述RNA聚合酶的底物，以及(4)說明書。
再者，該試劑盒的特征在于，上述底物中至少一種具有標(biāo)記，且上述RNA聚合酶是野生型RNA聚合酶中至少一個氨基酸經(jīng)修飾所得的變異型RNA聚合酶，修飾后的RNA聚合酶可促使具有上述標(biāo)記的底物的摻入。
具有標(biāo)記的底物和變異型RNA聚合酶如前所述。
含有變異型RNA聚合酶相應(yīng)啟動子序列的DNA是至少含有上述試劑盒中所包含的RNA聚合酶相應(yīng)啟動子序列的DNA。作為變異型RNA聚合酶，例如來源于T7噬菌體、T3噬菌體、SP6噬菌體或K11噬菌體的RNA聚合酶，因此可采用含有其中任一RNA聚合酶相應(yīng)啟動子序列的DNA。
本發(fā)明的試劑盒還可包含連接含上述啟動子序列的DNA與制備RNA探針的DNA的手段。作為連接含啟動子序列的DNA與制備RNA探針的DNA的手段，例如可以采用DNA聚合酶，或DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶。用DNA聚合酶或反轉(zhuǎn)錄酶連接含有啟動子序列的DNA與制備RNA探針的DNA時，以含啟動子序列的DNA作為引物，通過DNA或RNA的合成，可得到含啟動子序列的制備RNA探針的DNA。
本發(fā)明的試劑盒含有ATP、GTP、CTP、UTP或是由其衍生物形成的核苷-5′-三磷酸類(以下稱為NTP衍生物)作為RNA聚合酶的底物。優(yōu)選該四種NTP的衍生物均包含在內(nèi)。但考慮到與具有標(biāo)記的NTP衍生物的組合，具有與具有標(biāo)記的NTP衍生物相應(yīng)的堿基的NTP衍生物也可不包含在內(nèi)。此外，本發(fā)明的試劑盒中除了上述NTP衍生物外，至少包含1種以上一部分或全部具有標(biāo)記的NTP衍生物。一部分具有標(biāo)記的NTP衍生物是指具有標(biāo)記的NTP衍生物與未標(biāo)記的NTP衍生物的混合物。此時，具有標(biāo)記的NTP衍生物與未標(biāo)記的NTP衍生物的混合比，應(yīng)考慮所得RNA探針中標(biāo)記的持有量而適宜確定。全部具有標(biāo)記的NTP衍生物是指全部的NTP衍生物都具有標(biāo)記的NTP衍生物。本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選包含2種～4種一部分或全部具有標(biāo)記的NTP衍生物。通過至少包含2種一部分或全部具有標(biāo)記的NTP衍生物，可以制備具有不同標(biāo)記的2種RNA探針。上述標(biāo)記的種類及具體例子與上述RNA制備方法中的說明相同。
本發(fā)明的試劑盒中，作為試劑盒中含有的底物，例如可以是以下的組合。但并不限定于這些組合。
(1)ATP、GTP、CTP和UTP(未標(biāo)記的NTP)以及具有相同標(biāo)記的ATP、GTP、CTP和UTP(標(biāo)記的NTP)。
上述(1)是制備具有單一標(biāo)記的RNA探針的試劑盒。上述(1)中，標(biāo)記NTP為1種或2種均可。作為2種標(biāo)記NTP時的例子，例如Cy3-UTP和Cy3-ATP。此外，可以包含也可不包含由與標(biāo)記NTP同樣的核苷酸形成的未標(biāo)記NTP。上述各種底物可以按1次聚合酶反應(yīng)所需的量加入到1個反應(yīng)用容器(試管)內(nèi)，或者也可按說明書稱取所需的量加入到不同的容器內(nèi)使用。
(2)ATP、GTP、CTP和UTP(未標(biāo)記的NTP)以及分別具有不同標(biāo)記的ATP、GTP、CTP和UTP(標(biāo)記的NTP)。
上述(2)是制備具有不同標(biāo)記的2種以上RNA探針的試劑盒。上述(2)中，標(biāo)記NTP含有標(biāo)記不同的2種以上的NTP。此時，標(biāo)記雖然不同，但核苷酸的種類也可以相同。例如標(biāo)記NTP可以是Cy3-UTP和Cy5-UTP。此外，可以包含也可不包含由與標(biāo)記NTP相同的核苷酸形成的未標(biāo)記NTP。上述各種底物可以按1次聚合酶反應(yīng)所需的量加入到1個反應(yīng)用容器(試管)內(nèi)，或者也可按說明書稱取所需的量加入到不同的容器內(nèi)使用。但標(biāo)記不同的2種以上的標(biāo)記NTP在制備具有單一標(biāo)記的RNA探針時，必須加入到不同的容器內(nèi)。
實施例以下，結(jié)合實施例對本發(fā)明作更詳細的說明。
模板DNA***(0.1μg/ml)1μl5×緩沖液*4μlBSA(2mg/ml) 0.8μl10mM ATP 1μl10mM GTP 1μl10mM CTP 1μl2mM UTP**1～5μl2mM Cy3(或Cy5)-UTP**0～4μlT7 RNA聚合酶****(200U/μl) 0.5μl0.1M DTT 2μl
水3.6～7.7μl合計 20μl*)0.2M Tris-HCL(pH 8.0)，40mM MgCl2，1mM亞精胺-3(HCl)，125mM NaCl**)未用熒光標(biāo)記的普通UTP與Cy3(或Cy5)-UTP的比例按摩爾比為1∶2、1∶1、2∶1、4∶1，兩者合并后的UTP濃度為恒定值(最終濃度為0.5mM)。***)所用的模板DNA為理研cDNA克隆[GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)(理研克隆ID3000002C10)]。****)用F644Y(特開平11-75867號)作為變異型RNA聚合酶。
在37℃反應(yīng)1小時，70℃進行10分鐘的熱處理后，用ClonetechCHROMA SPIN-30柱分離反應(yīng)生成物，取其中的2μl進行電泳(電泳條件在16％v/v甲酰胺/1％瓊脂糖凝膠電泳)分析。

圖1為用溴化乙錠對電泳后的凝膠進行染色的電泳結(jié)果。圖1和圖2分別表示用變異型和野生型作為RNA聚合酶的結(jié)果?；厥帐Ｓ嗟臉悠凡⑾♂?0倍，用BeckmanDU-600，在260mμ、550mμ、650mμ下進行測定，對RNA、Cy3以及Cy5分別進行定量。其結(jié)果如表1所示。此外，圖2的Cy3、Cy5的濃度為0.17mM(Cy-UTP和未標(biāo)記UTP的比例相當(dāng)于1∶2)。
表1

*)不含Cy3-UTP、Cy5-UTP；**)表示Cy3-UTP和UTP的添加比例(摩爾比)為1∶2；***)表示Cy5-UTP和UTP的添加比例(摩爾比)為1∶2；****)表示僅含水時的吸光度。
由圖1所示的結(jié)果可知，用變異型的RNA聚合酶合成摻入Cy3-UTP及Cy5-UTP的RNA的過程中，Cy的濃度高時，可看到對RNA的合成有抑制，但其濃度達到非標(biāo)記UTP的2倍左右時，也不會過于抑制RNA合成，Cy同樣可摻入到合成產(chǎn)物中。與此相比，采用野生型RNA聚合酶時，如圖2所示，Cy3-UTP和Cy5-UTP的添加比例相對于非標(biāo)記UTP為1∶2時，也會對RNA合成有明顯的抑制。
在該反應(yīng)液中加入1.25μl ExTaq(1×ExTaq緩沖液中6.25U)，進行PCR反應(yīng)(95℃3分鐘→95℃1分鐘/60℃30秒/72℃3分鐘共30次循環(huán)→72℃3分鐘)。一部分反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳，對PCR產(chǎn)物進行確定(擴增及污染的檢驗)后，將PCR產(chǎn)物純化、濃縮并溶于3×SSC中(參照文獻1～2、文獻3的第3章)。(b)微陣列的制備在用聚-L-賴氨酸(poly-L-lysine)涂層的載玻片上，用DNA排列器，將(a)中得到的PCR產(chǎn)物進行點印(參照文獻1～2、文獻3第4章)。點的直徑通常為100μm，在每片載玻片上點21168個cDNA樣品。(c)探針RNA的制備將實施例1所述的條件中Cy？UTP和非標(biāo)記UTP的比例(摩爾比)定為1∶2，用反轉(zhuǎn)錄由小鼠組織制備的mRNA所得的cDNA作為模板。用變異型RNA聚合酶進行RNA合成，并按與實施例1同樣的方法進行純化和回收。為了與以往的方法進行比較，還按照文獻1制備了DNA探針。即，將由組織提取的mRNA作為模板，用隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，制備摻入了Cy3-UTP和Cy5-UTP的cDNA。
對于Cy3標(biāo)記，采用從出生后第10天的小鼠頭部制備的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA，并在反轉(zhuǎn)錄所用的引物中插入了T7RNA聚合酶的啟動子序列。對于Cy5標(biāo)記，采用從17.5天的小鼠胚胎制備的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA，并在反轉(zhuǎn)錄所用的引物中插入了T7RNA聚合酶的啟動子序列。(d)雜交和信號的檢測將分別混合了Cy3和Cy5探針(按體積比為1∶1)的雜交液在70℃熱處理5分鐘(采用DNA探針時，為95℃1分鐘)，室溫冷卻后，取30μl加在用蓋玻片覆蓋的載玻片上。使其處于防止干燥的狀態(tài)，在雜交室內(nèi)進行雜交，并用掃描儀檢測信號(參照文獻3第7章和第8章)。
采用RNA探針時，雜交后用RNA酶進行處理(在洗滌緩沖液III(0.2×SSC)中加入4μg RNA酶A，37℃反應(yīng)10分鐘)。其結(jié)果，穩(wěn)定得到的微陣列模式如圖3所示。但是，圖3所示的是有16個區(qū)塊的微陣列中的1個區(qū)塊。
用DNA探針替代RNA探針時，有時也能得到可明確定義的信號，但不能經(jīng)常得到克明確定義的信號。即，采用RNA探針時，通過RNA酶的處理可使噪聲降低，并且由于RNA/DNA雜交體比DNA/DNA雜交體的嚴(yán)格性高，因此可得到高S/N比的信號。并且與DNA探針相比，通?？煞€(wěn)定地得到的可明確定義的信號。
附圖的簡單說明圖1是用變異型RNA聚合酶制備的RNA經(jīng)溴化乙錠染色后的電泳凝膠照片。
圖2是用野生型RNA聚合酶制備的RNA經(jīng)溴化乙錠染色后的電泳凝膠照片。
圖3是應(yīng)用由變異型RNA聚合酶制備的標(biāo)記RNA探針，在實施例2中所得的微陣列模式。
文獻(1)MiKi，R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.98(2001)2199-2204(2)三木理雅他，細胞工學(xué)18卷877-885(1999)(3)DNA微陣列-實踐指南(林崎良英監(jiān)修，岡崎康司編著，羊土社2000)
序列表<110>RIKEN，Yoshihide Hayashizaki<120>RNA探針的制備方法，檢測靶核酸的方法和制備RNA探針的試劑盒<160>2<210>1<211>23<212>DNA<213>M13噬菌體(M13 bacteriophage)<400>cgccagggttttcccagtcacga<210>2<211>23<212>DNA<2l3>M13噬菌體(M13 bacteriophage)<400>agcggataacaatttcacacagga
權(quán)利要求
1.一種制備RNA探針的方法，該方法是使RNA聚合酶在含有該RNA聚合酶相應(yīng)啟動子序列的DNA片段，以及該RNA聚合酶的底物存在下進行反應(yīng)，制備具有標(biāo)記的RNA探針的方法；其特征在于，上述底物中至少一種有上述標(biāo)記，且上述RNA聚合酶是將野生型RNA聚合酶中的至少一個氨基酸進行修飾的變異型RNA聚合酶，該變異型RNA聚合酶可使具有上述標(biāo)記的底物摻入，或者可改善具有上述標(biāo)記的底物的摻入。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中，上述底物是ATP、GTP、CTP、UTP或由它們的衍生物所形成的核苷-5′-三磷酸類(以下稱為NTP衍生物)，且這些NTP衍生物中1種或2種以上的一部分或全部具有上述標(biāo)記。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，上述標(biāo)記為熒光標(biāo)記。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中，上述熒光標(biāo)記為花菁3或花菁5。
5.權(quán)利要求1～4任一項所述的方法，其中，變異型RNA聚合酶是野生型RNA聚合酶的核苷酸結(jié)合位點中存在的至少一個氨基酸產(chǎn)生置換、插入或缺失的RNA聚合酶。
6.權(quán)利要求1～4任一項所述的方法，其中，變異型RNA聚合酶是野生型RNA聚合酶的核苷酸結(jié)合位點中存在的至少一個氨基酸置換為酪氨酸的RNA聚合酶。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中，被置換的氨基酸為苯丙氨酸。
8.權(quán)利要求4～7任一項所述的方法，其中，存在于核苷酸結(jié)合位點的氨基酸是在螺旋Y和螺旋Z之間的環(huán)中的氨基酸，和/或螺旋Z和螺旋AA之間的環(huán)中的氨基酸。
9.權(quán)利要求1～8任一項所述的方法，其中，變異型RNA聚合酶來源于T7噬菌體、T3噬菌體、SP6噬菌體、K11噬菌體。
10.權(quán)利要求1～4任一項所述的方法，其中，變異型RNA聚合酶是在相應(yīng)于T7噬菌體RNA聚合酶的641～667位氨基酸殘基的選擇區(qū)域內(nèi)，至少有1個氨基酸被修飾的野生型RNA聚合酶。
11.權(quán)利要求1～4任一項所述的方法，其中，變異型RNA聚合酶是來源于T7噬菌體的RNA聚合酶，并且是644位或667位的氨基酸殘基為酪氨酸的RNA聚合酶。
12.權(quán)利要求1～4任一項所述的方法，其中，變異型RNA聚合酶是野生型T7RNA聚合酶中的644位氨基酸殘基苯丙氨酸置換為酪氨酸的RNA聚合酶。
13.權(quán)利要求1～4任一項所述的方法，其中，變異型RNA聚合酶是野生型T7RNA聚合酶中的667位氨基酸殘基苯丙氨酸置換為酪氨酸的RNA聚合酶。
14.權(quán)利要求13或14所述的方法，其中，變異型RNA聚合酶是進一步將野生型T7RNA聚合酶中的665位氨基酸殘基亮氨酸置換為脯氨酸的RNA聚合酶。
15.權(quán)利要求1～4任一項所述的方法，其中，變異型RNA聚合酶是野生型T7RNA聚合酶中的644位氨基酸殘基苯丙氨酸置換為酪氨酸，并且還將667位氨基酸殘基苯丙氨酸置換為酪氨酸的RNA聚合酶。
16.權(quán)利要求16所述的方法，其中，變異型RNA聚合酶是進一步將野生型T7RNA聚合酶中的665位氨基酸殘基亮氨酸置換為脯氨酸的RNA聚合酶。
17.權(quán)利要求1～4任一項所述的方法，其中，變異型RNA聚合酶是來源于T3噬菌體的RNA聚合酶，并且是645位或668位氨基酸殘基為酪氨酸的RNA聚合酶。
18.權(quán)利要求1～4任一項所述的方法，其中，變異型RNA聚合酶是來源于K11噬菌體的RNA聚合酶，并且是663～668位之間或690位氨基酸殘基中具有酪氨酸的RNA聚合酶。
19.權(quán)利要求1～4任一項所述的方法，其中，變異型RNA聚合酶是來源與SP6噬菌體的RNA聚合酶，并且是633～638位之間或670位氨基酸殘基中具有酪氨酸的RNA聚合酶。
20.一種檢測靶核酸的方法，該方法是將靶核酸與按權(quán)利要求1～19任一項所述的方法制備的具有標(biāo)記的RNA探針混合，并選擇性地檢測與上述靶核酸雜交的RNA探針的方法。
21.權(quán)利要求20所述的方法，其中，在上述混合和雜交之后，用RNA酶處理混合物，然后通過檢測殘留的靶核酸與RNA探針的雜交體進行上述選擇性檢測。
22.權(quán)利要求20或21所述的檢測方法，其中，靶核酸固定在基材上。
23.權(quán)利要求21～23任一項所述的檢測方法，其中，靶核酸為DNA、肽核酸或RNA。
24.權(quán)利要求20～22任一項所述的檢測方法，其中，靶核酸是寡核苷酸陣列或cDNA微陣列的形式。
25.一種試劑盒，該試劑盒為含有以下(1)～(4)組成部分，具有標(biāo)記的RNA探針的制備試劑盒，(1)RNA聚合酶，(2)含有上述RNA聚合酶相應(yīng)啟動子序列的DNA，(3)上述RNA聚合酶的底物，以及(4)說明書；其特征在于，上述底物中至少一種具有標(biāo)記，且上述RNA聚合酶是將野生型RNA聚合酶中的至少一個氨基酸進行修飾的變異型RNA聚合酶，該變異型RNA聚合酶可促使具有上述標(biāo)記的底物摻入，或者可改善具有上述標(biāo)記的底物的摻入
26.權(quán)利要求25所述的試劑盒，其中，進一步包含連接含有啟動子序列的DNA與制備探針的模板DNA的手段。
27.權(quán)利要求26所述的試劑盒，其中，連接含有啟動子序列的DNA與制備探針的模板DNA的手段為使用DNA聚合酶，或DNA聚合酶及反轉(zhuǎn)錄酶。
28.權(quán)利要求25～27任一項所述的試劑盒，其中，含有ATP、GTP、CTP、UTP或由它們的衍生物所形成的核苷-5′-三磷酸類(以下稱為NTP衍生物)的一部分或全部作為上述底物，且除了上述NTP衍生物以外，至少還含有1種一部分或全部具有標(biāo)記的NTP衍生物。
29.權(quán)利要求28所述的試劑盒，其中，含有2種以上一部分或全部具有標(biāo)記的NTP衍生物。
30.權(quán)利要求25～29任一項所述的試劑盒，其中，上述標(biāo)記為熒光標(biāo)記。
31.權(quán)利要求30所述的試劑盒，其中，上述熒光標(biāo)記為花菁3或花菁5。
全文摘要
使RNA聚合酶在含有該RNA聚合酶相應(yīng)啟動子的DNA片段、以及該RNA聚合酶的底物存在下進行反應(yīng)，制備具有標(biāo)記的RNA探針的方法。上述的底物中至少一種具有上述標(biāo)記，且上述RNA聚合酶是將野生型RNA聚合酶中至少一個氨基酸進行修飾的變異型RNA聚合酶，該變異型RNA聚合酶可促使具有上述標(biāo)記的底物摻入，或者可改善具有上述標(biāo)記的底物的摻入。將靶核酸與按上述方法制備的具有標(biāo)記的RNA探針混合，并選擇性地檢測與上述靶核酸雜交的RNA探針的檢測靶核酸的方法。RNA探針的制備試制盒。提供含有熒光標(biāo)記并可獲得高S/N比的標(biāo)記RNA探針的制備方法，靶核酸的檢測方法，以及RNA探針的制備試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK1405325SQ0212226
公開日2003年3月26日 申請日期2002年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月4日
發(fā)明者林崎良英, 岡崎康司 申請人:理化學(xué)研究所, 林崎良英