酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酶偶聯(lián)核酸?銀納米探針，用下述方法制成：(1)分別用磷酸鹽緩沖溶液為溶劑配制寡聚核苷酸溶液，硝酸銀溶液，和硼氫化鈉溶液；(2)取寡聚核苷酸溶液和硝酸銀溶液，混合均勻，加入磷酸鹽緩沖溶液，攪拌，加入硼氫化鈉溶液，攪拌，(3)向步驟(2)獲得的液體中加入FeSO4水溶液，加入D?氨基酸氧化酶水溶液，震蕩混勻；所述寡聚核苷酸為5ˊ–CCCTTAATCCCC–3ˊ，本發(fā)明的探針用于熒光分析法，對食品中的D?氨基酸進(jìn)行檢測，檢測下線可達(dá)到10nM；具有分析靈敏度高、選擇性強(qiáng)和使用簡便等優(yōu)點；與傳統(tǒng)的檢測方法相比，樣品無需進(jìn)行衍生化，操作簡單、成本低，實現(xiàn)D?氨基酸的快捷、方便的檢測。
【專利說明】
酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種識別手性D-氨基酸的酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針。
【背景技術(shù)】
[0002]氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單元，與生命活動密切相關(guān)。大部分氨基酸均存在手性對映異構(gòu)體，L-氨基酸和D-氨基酸(甘氨酸除外)ο絕大多數(shù)存在于地球上的生命體均以L-氨基酸合成蛋白質(zhì)，僅少數(shù)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)存在L-氨基酸的肽鏈。雖然D-氨基酸不參與人體蛋白質(zhì)的合成，但其具有特殊的生理功能，少而適量的D-氨基酸是生命所必需的。
[0003]過量的D-氨基酸可被D-氨基酸氧化酶代謝，能夠產(chǎn)生過氧化氫，對人的機(jī)體造成一定的損害，另外，D-氨基酸的大量進(jìn)入機(jī)體，將可能引起生命活動的異常甚至死亡。例如，在肌萎縮性側(cè)索硬化癥患者的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中含濃度較高的D-Ser。因此，手性識別在生命過程中極為重要，在食品中若含有過多的D-氨基酸，一旦吸收進(jìn)入人體，會對人體產(chǎn)生毒理性。
[0004]目前，手性異構(gòu)體的分析，尤其是小分子異構(gòu)體氨基酸的檢測仍然較為繁瑣。D-氨基酸檢測方法主要包括高壓液相色譜法，氣相色譜法，圓二色譜法，電化學(xué)檢測法，酶法和微流控芯片法等。但上述方法步驟繁瑣、操作復(fù)雜、成本高、需要大型設(shè)備及專業(yè)人員等不足。目前，以納米銀為熒光探針檢測D-氨基酸的工作尚未報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種酶偶聯(lián)核酸/銀納米的探針。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0007]—種酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針，用下述方法制成:
[0008](I)分別用磷酸鹽緩沖溶液為溶劑配制0.1-0.5mM寡聚核苷酸溶液，配制0.7_
3.5mM的硝酸銀溶液，和配制0.7-3.5mM硼氫化鈉溶液；
[0009](2)取50yL所述寡聚核苷酸溶液和50yL硝酸銀溶液，混合均勻，加入4.85mL的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌15_25min，加入50yL硼氫化鈉溶液，攪拌50-90min;其中寡聚核苷酸、硝酸銀和硼氫化鈉的摩爾比為:1:7:7；
[0010](3)向步驟(2)獲得的液體中加入0.56mL的0.5-5.0mM的FeSO4水溶液，加入25_40μL的100000U/L D-氨基酸氧化酶水溶液，震蕩混勻;所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為20mM，pH為 6.8。
[0011 ] 寡聚核苷酸的序列優(yōu)選為5Z-CCCTTAATCCCC-3Z。
[0012]本發(fā)明的優(yōu)點:
[0013](I)酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針用于熒光分析法，對食品中的D-氨基酸進(jìn)行檢測，檢測下線可達(dá)到1nM;具有分析靈敏度高、選擇性強(qiáng)和使用簡便等優(yōu)點；
[0014](2)與傳統(tǒng)的檢測方法相比，樣品無需進(jìn)行衍生化，操作簡單、成本低，實現(xiàn)D-氨基酸的快捷、方便的檢測。
【附圖說明】
[0015]圖1為酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針的熒光照片；
[0016]圖2為酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針的熒光光譜圖；
[0017]圖3為酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針對D-丙氨酸識別的熒光光譜圖；
[0018]圖4.為酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針對D-精氨酸識別的熒光光譜圖；
[0019]圖5為酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針對D-苯丙氨酸識別的熒光光譜圖。
【具體實施方式】
[0020]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0021 ]本發(fā)明各實施例所作用的D-氨基酸氧化酶為市售豬腎D-氨基酸氧化酶。
[0022]本發(fā)明的實施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，若在本申請寡聚核苷酸5 ~CCCTTAATCCCC-3 z的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，并與D-氨基酸氧化酶結(jié)合用于制備酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針，也屬于本發(fā)明的范圍。
[0023]實施例1
[0024]—種酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針，用下述方法制成:
[0025](I)分別用磷酸鹽緩沖溶液為溶劑配制0.3mM寡聚核苷酸溶液，配制2.1mM的硝酸銀溶液，和配制2.1mM硼氫化鈉溶液；
[0026](2)取50yL所述寡聚核苷酸溶液和50yL硝酸銀溶液，混合均勻，加入4.85mL磷酸鹽緩沖溶液，攪拌20min，加入50yL硼氫化鈉溶液，攪拌70min;
[0027](3)向步驟(2)獲得的液體中加入0.56mL的I.0mM的FeSO4水溶液，加入35yL的100000U/L D-氨基酸氧化酶水溶液，震蕩混勻;所述寡聚核苷酸為5'CCCTTAATCCCC-3z。
[0028]所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為20mM，pH為6.8。
[0029]酶偶聯(lián)核酸/銀納米的探針的熒光照片見圖1。
[0030]熒光譜圖為圖2。
[0031]實施例2
[0032]—種酶偶聯(lián)核酸/銀納米探針，用下述方法制成:
[0033](I)分別用磷酸鹽緩沖溶液為溶劑配制0.1mM寡聚核苷酸溶液，配制0.7mM的硝酸銀溶液，和配制0.7mM硼氫化鈉溶液；
[0034](2)取50yL所述寡聚核苷酸溶液和50yL硝酸銀溶液，混合均勻，加入4.85mL的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌15min，加入50yL硼氫化鈉溶液，攪拌50min;
[0035](3)向步驟(2)獲得的液體中加入0.56mL的0.5mM的FeSO4水溶液，加入25yL的100000U/L D-氨基酸氧化酶水溶液，震蕩混勻;所述寡聚核苷酸為5'CCCTTAATCCCC-3z。
[0036]所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為20mM，pH為6.8。
[0037]熒光譜圖為圖2。
[0038]實施例3
[0039]—種酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針，用下述方法制成:
[0040](I)分別用磷酸鹽緩沖溶液為溶劑配制0.5mM寡聚核苷酸溶液，配制3.5mM的硝酸銀溶液，和配制3.5mM硼氫化鈉溶液；
[0041 ] (2)取50yL所述寡聚核苷酸溶液和50yL硝酸銀溶液，混合均勻，加入4.85mL的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌25min，加入50yL硼氫化鈉溶液，攪拌90min;
[0042](3)向步驟(2)獲得的液體中加入0.56mL的5.0mM的FeSO4水溶液，加入40yL的100000U/L D-氨基酸氧化酶水溶液，震蕩混勻;所述寡聚核苷酸為5'CCCTTAATCCCC-3z。
[0043]所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為20mM，pH為6.8。
[0044]熒光譜圖為圖2。
[0045]實施例4
[0046]用實施例1制備的酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針對D-丙氨酸的手性識別檢測:
[0047]在三支離心管中，均加入90yL的酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針，再分別加入1yL的超純水(空白)，1yL的10—2M的L-丙氨酸和1yL的10—2M的D-丙氨酸，水浴37°C30min，使用熒光分光光度計在568nm激發(fā)，620nm發(fā)射測定。見圖3。
[0048]實施例5
[0049]用實施例2制備的酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針對D-氨基酸的手性識別檢測:
[0050]在三支離心管中，均加入90yL的酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針，再分別加入1yL的超純水(空白)，1yL的10—2M的L-精氨酸和1yL的10—2M的D-精氨酸，水浴37°C30min，使用熒光分光光度計在568nm激發(fā)，620nm發(fā)射測定。見圖4。
[0051 ] 實施例6
[0052]用實施例3制備的酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針對D-氨基酸的手性識別檢測，在三支離心管中，均加入90yL的酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針，再分別加入1yL的超純水(空白)，10—2M的L-苯丙氨酸和1yL的10—2M的D-苯丙氨酸，水浴37°C30min，使用熒光分光光度計在568nm激發(fā)，620]11]1發(fā)射測定。見圖50
[0053]實驗證明:用本發(fā)明的酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針可以對D-丙氨酸，D-精氨酸，D-苯丙氨酸，D-組氨酸，D-賴氨酸，D-絲氨酸，D-蘇氨酸等進(jìn)行識別。
【主權(quán)項】
1.一種酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針，其特征是用下述方法制成: (1)分別用磷酸鹽緩沖溶液為溶劑配制0.1-0.5mM寡聚核苷酸溶液，配制0.7-3.5mM的硝酸銀溶液和配制0.7-3.5mM硼氫化鈉溶液； (2)取50yL所述寡聚核苷酸溶液和50yL硝酸銀溶液，混合均勻，加入4.85mL的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌15-25min，加入50yL硼氫化鈉溶液，攪拌50_90min;所述寡聚核苷酸、硝酸銀和硼氫化鈉的摩爾比為:1:7:7; (3)向步驟(2)獲得的液體中加入0.56mL的0.5_5.0mM的FeSO4水溶液，加入25_40yL的100000U/L D-氨基酸氧化酶水溶液，震蕩混勻;所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為20mM，pH為6.8ο2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種酶偶聯(lián)核酸-銀納米探針，其特征是所述寡聚核苷酸的序列為5,-CCCTTAATCCCC-3,。
【文檔編號】G01N21/64GK106018371SQ201610526250
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月6日
【發(fā)明人】仰大勇, 張志昆, 劉陽, 楊璐
【申請人】天津大學(xué)