專利名稱：一種控制植物花芽著生位置的方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用生物工程手段對植物花芽著生位置進行控制的方法以及該方法的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
高等植物開花是其生活周期中的重要環(huán)節(jié)，花的數(shù)量與農(nóng)作物的產(chǎn)量密切相關(guān)，對于花卉植物來講，花的著生位置、花器官的數(shù)目對其觀賞價值有決定性的作用。
植株地上部分是在生長的過程中由莖尖分生組織(the shoot apical meristem，SAM)逐漸分化而來，莖尖分生組織是地上部分各器官發(fā)育的源泉。莖尖分生組織為一個半球型的結(jié)構(gòu)，其中心區(qū)域(也叫中央帶)(central zone，CZ)由有絲分裂活動不旺盛的干細(xì)胞組成，是頂端生長所必需的；分生組織周邊(也叫周圍帶)(peripheralzone，PZ)由分裂速度較快的細(xì)胞組成，器官原基由此產(chǎn)生。中央帶中的干細(xì)胞分裂后產(chǎn)生兩部分細(xì)胞，一部分仍然保留在分生組織的中央，稱為干細(xì)胞后裔(progeny ofstem cells)，保持多潛能性，另一部分叫子代細(xì)胞(daughter cells)，將離開中央帶逐漸向分生組織周邊移動，在周邊分化成為新的器官原基。
在植物的發(fā)育生長過程中，隨著內(nèi)、外因子的誘導(dǎo)(開花決定)，分生組織內(nèi)相關(guān)基因有序地表達，使植物由營養(yǎng)生長向生殖生長狀態(tài)轉(zhuǎn)化，營養(yǎng)型的莖尖分生組織轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄐ蚍稚M織(inflorescence meristem)，在花序分生組織的周邊產(chǎn)生花分生組織(floral meristem)，花分生組織又產(chǎn)生一輪輪呈同心圓排列的花器官(Doerner，2001，Curr.Biol.11R785-R787)。
突變體wus是在1996年被分離出來的，其主要表型為莖尖平坦，花以中央雄蕊的形式提前終止，萼片花瓣正常。雙突變分析表明，不論花的第三輪是什么器官，只要是WUS突變就會以第三輪器官終止，缺少第四輪器官(Laux et al.，1996，Development，12287-96)。隨著對該基因的克隆和其表達模式的研究，發(fā)現(xiàn)WUS編碼一個由291個氨基酸殘基組成的轉(zhuǎn)錄因子，它的功能是在莖尖分生組織中決定干細(xì)胞的命運(Mayer et al.，1998，Cell，95805-815)，限制莖尖分生組織和花分生組織的大小。WUS是干細(xì)胞促進途徑(stem cell-promoting pathway)中的組份。研究發(fā)現(xiàn)，讓W(xué)US異位過量表達時，植株莖尖分生組織膨大，同時，CLV3的表達區(qū)域也變大，說明異位表達的WUS激活了CLV3的表達。在35S∷CLV3轉(zhuǎn)化植株中，CLV3的超表達使WUS的表達量嚴(yán)重下降。在clv突變體中WUS有更廣的表達區(qū)域，表明野生型中CLV限制WUS的表達范圍。CLV通過限制WUS的表達量和表達區(qū)域控制著分生組織中干細(xì)胞群的大小，WUS通過激活CLV而有效地將自己所決定的干細(xì)胞分化為器官原基(Schoof et al，2000，Cell，100635-644；Brand et al，2000，Science，289617-619)。
在決定干細(xì)胞數(shù)方面，除上述WUS和CLV之間的反饋環(huán)之外，在WUS和AG之間也有一個類似的反饋環(huán)WUS+LFY激活A(yù)G，AG抑制WUS的表達。該環(huán)的存在既為花器官的正常啟動奠定了基礎(chǔ)，同時也為正常的生殖生長提供了保證。該調(diào)節(jié)環(huán)負(fù)責(zé)花分生組織中細(xì)胞的分裂與分化之間的平衡，WUS和AG之間關(guān)系的重要性在于明確地把分生組織的組織者和花特征因子LFY放在了一起，自分子水平解答了造成花分生組織與花序分生組織之間差別的機理(Lenhard et al.，2001，Cell，105805-814；Lohmannet al.，2001，Cell，105793-803)。
WUS/AG環(huán)不能替代WUS/CLV、但能互補WUS/CLV環(huán)，事實上這兩個調(diào)節(jié)環(huán)存在明顯的不同WUS/CLV環(huán)中的抑制、激活是在同一時間不同地點時刻在發(fā)生著的兩個過程；(WUS+LFY)/(AG+？)環(huán)中對AG的激活、抑制是在同一地點不同時間先后發(fā)生，先激活，再抑制，在時間上是分離的。
研究發(fā)現(xiàn)，WUS除了限制莖尖分生組織和花分生組織的大小之外，還可控制蓮座葉的形態(tài)(Hamada et al.，2000，Plant J，2491-101)，促使正常的體細(xì)胞向胚性細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，從而誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的發(fā)生(Zuo et al.，2002，Plant J.，30349-59)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種控制植物花芽著生位置的方法，以實現(xiàn)對花著生位置的人為控制。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種控制植物花芽著生位置的方法，是在內(nèi)源WUS基因的調(diào)控區(qū)插入至少一個增強子或者是將連接有至少一個增強子的外源WUS基因?qū)胧荏w植物中。
所述的增強子位于WUS基因閱讀框之前是較優(yōu)選的情況。
所述增強子可以是一個，也可以是幾個，其中較為優(yōu)選的是35S增強子。
為了便于操作和識別，所述插入的增強子序列還可以連接有適當(dāng)?shù)腄NA標(biāo)簽，例如T-DNA邊界序列，序列已知的轉(zhuǎn)座子等。
一般情況下，利用DNA的體外重組技術(shù)，將35S增強子序列連接在WUS基因附近，插入在T-DNA的左右邊界之中，借助農(nóng)桿菌的侵染，將連接有增強子序列的WUS基因整合在植物染色體上。
由于增強子的存在，使WUS表達會增強，使植物在其正常的花序以外的其它位置異位啟動新的花分生組織。
本發(fā)明巧妙地利用T-DNA插入的辦法，通過現(xiàn)有的任意轉(zhuǎn)化手段，將增強子序列插入到WUS基因閱讀框附近，使其在原有位置過量表達，得到功能增強(gain-of-function)突變體，從而在分生組織過剩的同時讓花分生組織在植物的莖(花序軸)表面等位置異位產(chǎn)生，改變莖的生長方式，使植物體表多處出現(xiàn)花結(jié)構(gòu)，并可使花期延長，提高花卉的可觀賞性。本發(fā)明的方法在培育欲改變花結(jié)構(gòu)位置的品種，或在培育欲延長花期的植物品種中將得到廣泛應(yīng)用。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。


圖1顯示在花序軸表面有花芽異位出現(xiàn)。
具體實施例方式
本發(fā)明的實驗均以模式植物擬南芥為材料，將模式植物擬南芥純合突變體bril-5種子吸脹后，置于濕室中4℃春化3天，栽培于含有1/3蛭石的腐質(zhì)土中，在每天16小時光照、21±1℃條件下生長。
實施例1、內(nèi)源WUS基因超表達1、T-DNA轉(zhuǎn)化利用質(zhì)粒pSKIO15作為插入激活標(biāo)簽(Weigel et al.，2000，Plant Physiol.122，1003-1013.)，借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)(Clough & Bent，1998，Plant J.16，735-743.)，將攜帶有4個35S增強子的T-DNA引入擬南芥中，從功能增強(gain-of-function)突變?nèi)后w中篩選到花序軸彎曲、生長緩慢、花器官異常、花序軸上出現(xiàn)愈傷狀結(jié)構(gòu)的個體(如圖1所示)，即轉(zhuǎn)化體。
2、WUS超表達質(zhì)粒的構(gòu)建人為地將35S增強子置于WUS基因的調(diào)控區(qū)，完成在體外的構(gòu)建，借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，將攜帶有35S增強子、WUS基因的調(diào)控區(qū)和編碼區(qū)的重組DNA整合到植物染色體上，從而使WUS在其自己啟動子調(diào)控之下超表達。
實施例2、插入位點鑒定用EcoRI對轉(zhuǎn)化體的基因組DNA進行完全消化，加熱失活EcoRI，酶切產(chǎn)物自身連接環(huán)化，用pSKIO15中T3啟動子附近的序列和RB邊界附近的序列為引物，反向PCR擴增，擴增產(chǎn)物進行DNA序列分析。
通過與已知序列比較，確定包含增強子的T-DNA所插入位置是在WUS基因上游。
實施例3、表達模式分析
1、定量RT-PCR收集突變體莖上含有花芽的部分100mg，在1ml TRIZOL試劑(GIBCIRBL)中研磨，室溫放置20min，加入0.2ml氯仿，搖15min后12000g離心取水相，加0.5ml異丙醇沉淀RNA。按照RT-PCR試劑盒說明，以寡聚dT為引物，在54℃下反轉(zhuǎn)錄40min得到第一鏈cDNA。選用包含KpnI識別序列和起始密碼子的序列(5’TTCTGGTACCATGGAGCCGCCAC AGCATCAG)作為5’端引物、選用包含SacI識別序列和終止密碼子的序列(5’TCTTG GAGCTCCTAGTTCAGACGTAGCTCAAG)為3’端引物，在下列條件下擴增雙鏈cDNA94℃變性2min，94℃ 30 Sec→60℃ 30 Sec→72℃ 60 Sec，30個循環(huán)后，72℃延伸5min，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 擴增產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上電泳分析，證實在突變體莖上可以長出愈傷組織狀結(jié)構(gòu)的節(jié)間部分，有高水平WUS表達。
2、WUS cDNA的克隆參照上述RT-PCR，將擴增產(chǎn)物克隆在pGEM-T vector上。根據(jù)RT-RCR產(chǎn)物和克隆載體的大小及濃度，按照插入片段∶載體≈5∶1的比例，將連接酶0.5μl、10倍連接緩沖液1μl與適當(dāng)體積的PCR產(chǎn)物、克隆載體pGEM-T vector混合，以無菌水調(diào)整體積至10μl，在4℃過夜，完成連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并由此得到含有WUS cDNA的陽性克隆。
3、原位表達分析借助克隆載體pGEM-T上的SP6和T7啟動子，體外合成地高辛標(biāo)記的正義和反義RNA探針，通過堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體進行免疫學(xué)檢測，NBT/BCIP為底物進行顯色反應(yīng)，根據(jù)成色反應(yīng)部位確定WUS轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的分布(XU YunYuan et al.，2001，Acta Bot Sin，43871-873)，分析WUS在不同組織內(nèi)的表達模式。結(jié)果表明在花序軸上異位出現(xiàn)的花芽內(nèi)，有WUS的表達，證明轉(zhuǎn)化體中干細(xì)胞組織中心易位出現(xiàn)。
實施例4、雜交實驗為了消除BRI突變可能對WUS所產(chǎn)生的效應(yīng)，進行以下雜交實驗在野生型Ws-2(BRI/BRI BRE/BRE)開花之前(大約花發(fā)育至12期，用肉眼剛剛可見花頂端有將要開放的花瓣)(Smyth et al.，1990 Plant Cell，2755-767)，用鑷子剝?nèi)ポ嗥突ò?，去雄，套袋，次日觀察裸露的心皮是否成活，以用本發(fā)明的方法獲得的突變體bre(bri/bri bre/BRE)的雄蕊與之授粉，繼續(xù)套袋，收種。
由于bri1-5為一隱性弱突變，F(xiàn)1代植株中未見典型的bri1-5表型(矮化)，而只出現(xiàn)兩種表型花序軸彎曲(bri/BRI bre/BRE)和花序軸不彎曲(bri/BRI BRE/BRE)。在花序軸彎曲的個體中，仍然表現(xiàn)為花芽異位出現(xiàn)，開花較晚。說明35S增強子在基因WUS前的插入，確實使花分生組織出現(xiàn)了異位。
權(quán)利要求
1.一種控制植物花芽著生位置的方法，是在內(nèi)源WUS基因的調(diào)控區(qū)插入至少一個增強子或者是將連接有至少一個增強子的外源WUS基因?qū)胧荏w植物中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的控制植物花芽著生位置的方法，其特征在于所述方法是在內(nèi)源WUS基因附近插入一個足以使WUS基因表達增強的增強子序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的控制植物花芽著生位置的方法，其特征在于所述方法是將在閱讀框之前插入至少一個增強子的WUS基因?qū)胧荏w植物中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的控制植物花芽著生位置的方法，其特征在于所述增強子為35S增強子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的控制植物花芽著生位置的方法，其特征在于所述在內(nèi)源WUS基因的調(diào)控區(qū)插入增強子或者是將連接有增強子的外源WUS基因?qū)胧荏w植物中是利用T-DNA進行的。
6.權(quán)利要求1所述方法在培育欲改變花結(jié)構(gòu)位置的植物品種中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述方法在培育花期延長的植物品種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種控制植物花芽著生位置的方法及應(yīng)用，目的是提供一種控制植物花芽著生位置的方法，以實現(xiàn)對花著生位置的人為控制。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是是在內(nèi)源WUS基因的調(diào)控區(qū)插入至少一個增強子或者是將連接有至少一個增強子的外源WUS基因?qū)胧荏w植物中。所述增強子可以是一個，也可以是幾個，其中較為優(yōu)選的是35S增強子。一般情況下，是利用T－DNA在內(nèi)源WUS基因的調(diào)控區(qū)插入增強子或者是將連接有增強子的外源WUS基因?qū)胧荏w植物中。本發(fā)明的方法在培育欲改變花結(jié)構(gòu)位置的品種，或在培育欲延長花期的植物品種中將得到廣泛應(yīng)用。
文檔編號C12N15/09GK1483819SQ02130750
公開日2004年3月24日 申請日期2002年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月20日
發(fā)明者種康, 徐云遠(yuǎn), 黎家, 王孝民, 約翰·C·沃克, 許智宏, 譚克輝, C 沃克, 種 康 申請人:中國科學(xué)院植物研究所