專利名稱：神經(jīng)細(xì)胞分化促進(jìn)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的神經(jīng)細(xì)胞分化促進(jìn)劑，它包含生理學(xué)活性物質(zhì)NK175203或其可藥用的鹽作為活性組分并且預(yù)計(jì)例如，它可用作治療癡呆的藥物，神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)性藥物或治療外周神經(jīng)病的藥物。
生理學(xué)活性物質(zhì)NK175203是在國際專利公開號(hào)WO94/05679中所描述的，公開的已知化合物。
據(jù)報(bào)道，該化合物具有作為骨髓細(xì)胞增殖促進(jìn)劑的活性。
體外證明，神經(jīng)生長因子(下文稱NGF)延長軸突，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生并對年老動(dòng)物神經(jīng)細(xì)胞的再生發(fā)揮作用〔Age，8，19(1985)〕。另一方面，已知，當(dāng)將NGF加到已從鼠嗜鉻細(xì)胞瘤上克隆化的新建立的細(xì)胞至PC12中時(shí)，PC12細(xì)胞停止增殖和分化成具有軸突的神經(jīng)元細(xì)胞。由于這些作用，近來，NGF作為一種治療癡呆的藥物已引起人們的注意。通過使用這些細(xì)胞，已弄清楚，與NGF類似，成纖維細(xì)胞生長因子和白細(xì)胞介素6引起軸突的延長。近來，據(jù)報(bào)道，由微生物衍生的低分子量物質(zhì)、Staurosporine也引起軸突的延長〔Shinkei Kagaku，26，200-220(1987)〕。
上述Stuurosporine在內(nèi)科治療中是非常有價(jià)值的，因?yàn)樗cNGF不同，是低分子量物質(zhì)。然而，令人遺憾的是，由于具有較高的毒性，它的實(shí)際應(yīng)用受到限制。
在這種情況下，在內(nèi)科治療中，提供在低濃度下具有較低毒性并表現(xiàn)延長軸突作用的低分子量物質(zhì)是非常重要的。
作為廣泛研究的結(jié)果，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，生理學(xué)活性物質(zhì)NK175203或其可藥用鹽具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化的活性。
在此發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)上已完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明涉及神經(jīng)細(xì)胞分化促進(jìn)劑，它包含作為活性組分的生理活性物質(zhì)NK175203或其可藥用鹽以及可藥用賦形劑或載體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及治療癡呆的藥物，神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)性藥物和治療外周神經(jīng)病的藥物，它包含作為活性組分的生理活性物質(zhì)NK175203或其可藥用鹽以及可藥用賦形劑或載體。
簡要說明繪1顯示NK175203對改善由給予抗癌劑增加的尾神經(jīng)潛伏期的作用。
圖2顯示NK175203對改善由給予何霉素(ADM)抑制的感覺神經(jīng)功能(熱敏感性)的作用。
圖2a顯示實(shí)驗(yàn)開始后第72天的試驗(yàn)結(jié)果，而圖2b顯示實(shí)驗(yàn)開始后第85天的試驗(yàn)結(jié)果。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的最佳方法按照國際專利公開號(hào)WO94/05679中所描述的方法可制備和獲得本發(fā)明中所使用的生理活性物質(zhì)NK175203。
尤其，可通過培養(yǎng)屬于鏈霉菌屬的微生物并在介質(zhì)中制備上述生理活性物質(zhì)NK175203(例如，F(xiàn)ERM BP-4372)，在培養(yǎng)基中聚積生理活性物質(zhì)NK175203，然后收集它們來獲得。
本發(fā)明中所使用的化合物，生理活性物質(zhì)NK175203可以是其藥用鹽的形式。該鹽的實(shí)例包括與堿金屬如納和鉀的鹽和與堿土金屬如鈣的鹽。
包含生理活性物質(zhì)NK175203作為活性組分的本發(fā)明神經(jīng)細(xì)胞分化促進(jìn)劑促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的分化，并因此有效地用于修復(fù)和治療神經(jīng)細(xì)胞的各種損傷。因此預(yù)計(jì)，例如，該促進(jìn)劑可用作治療癡呆的藥物，治療由抗癌劑，糖尿病等所引起的外周神經(jīng)病的藥物或神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)性藥物。
當(dāng)本發(fā)明化合物用作神經(jīng)細(xì)胞分化促進(jìn)劑時(shí)，單獨(dú)或作為與賦形劑或載體的混合物，以注射劑，口服制劑，栓劑等的形式給予。就賦形劑和載體而言，選擇可藥用的賦形劑和載體，并且根據(jù)給藥途徑和給藥方法來確定其種類和組成。例如，就液體載體而言，可使用水，醇，動(dòng)物和植物油如豆油，花生油，芝麻油和礦物油，以及合成的油。例如，就固體載體而言，可使用糖如麥芽糖和蔗糖，氨基酸，纖維素衍生物如羥丙基纖維素，和有機(jī)酸鹽如硬脂酸鎂。
在注射劑中，通常需要使用生理鹽水，各種緩沖劑，糖溶液如葡萄糖，肌醇和甘露糖醇溶液或醇如乙二醇，丙二醇和聚乙二醇。也可能在給藥前，將本發(fā)明化合物與賦形劑如糖，例如肌醇，甘露糖醇，葡萄糖，甘露糖，麥芽糖或蔗糖，或者氨基酸，例如苯丙氨酸一起溶解在適宜的注射用溶劑(例如，靜脈給藥的液體如滅菌注射用水，生理鹽水，葡萄糖溶液，電解質(zhì)溶液或氨基酸溶液)中。
通常，在制劑中，該化合物的含量為重量的0.1-100％，優(yōu)選為重量的1-98％，盡管在每個(gè)制劑中，該含量廣泛變化。例如，在注射劑中，活性組分的含量通常為重量的0.1-30％，優(yōu)選為重量的1-10％。當(dāng)口服給藥時(shí)，將化合物與上述固體或液體載體一起配制成片劑，膠囊劑、粉劑，顆粒劑，溶液，干糖漿等。通常膠囊劑，片劑，顆粒劑和粉劑含有的活性組分為重量的5-100％，優(yōu)選為重量的25-98％。
根據(jù)病人的年令，體重和狀況，治療的目的等，可以確定劑量。通常當(dāng)非腸道給藥時(shí)，治療劑量為1-100mg/kg·天，并且當(dāng)口服給藥時(shí)，治療劑量為5-500mg/kg·天。
本發(fā)明化合物的特點(diǎn)為具有較低的毒性并且當(dāng)連續(xù)給藥時(shí)，只顯示較小的蓄積毒性。當(dāng)以500mg/kg的劑量，一次腹膜內(nèi)給小鼠該藥時(shí)，本發(fā)明化合物未顯示毒性癥狀。
為了進(jìn)一步更詳細(xì)地說明本發(fā)明，給出下列實(shí)施例。然而，應(yīng)該知道，本發(fā)明并非只限制于此，只要不遠(yuǎn)離本發(fā)明的精神和范圍都包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。實(shí)施例1由生理活性物質(zhì)NK175203引起的PC12細(xì)胞的軸突延長試驗(yàn)按照Green等，Ann.Rev.Neurosi.，3，353(1980)的方法，根據(jù)形態(tài)的改變來判斷結(jié)果。
尤其，在該方法中，將PC12細(xì)胞接種到含10％胎兒牛血清和10％馬血清的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基中，以便提供1×104/ml的細(xì)胞密度，并且在37℃和5％CO2存在下，在膠原蛋覆蓋的96孔多孔板中孵育過夜。接著，加入樣品，并在一天后通過顯微鏡觀察形態(tài)的改變。
結(jié)果，引起PC12細(xì)胞軸突延長的生理活性物質(zhì)NK175203的有效濃度在20-2.0μg/ml范圍內(nèi)廣泛變化。
在上述方法中，由于生理活性物質(zhì)在50μg/ml下的細(xì)胞毒性，一天后，消滅PC12細(xì)胞。該濃度比促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化的物質(zhì)的濃度高2.5-25倍，這意味著生理活性物質(zhì)NK175203具有相對低的毒性。實(shí)施例2生理活性物質(zhì)NK175203對抗癌劑引起的外周神經(jīng)病模型作用的試驗(yàn)測定生理活性物質(zhì)NK175203對改善由抗癌劑引起的外周神經(jīng)病模型的作用。用五周大小的雄性CDF1鼠作為試驗(yàn)動(dòng)物。由順鉑(下文簡稱CDDP)或阿霉素(下文簡稱ADM)誘導(dǎo)神經(jīng)病。在實(shí)驗(yàn)開始的0，第7，14，21，28和32天，以5mg/kg的劑量經(jīng)腹膜內(nèi)給予CDDP，同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)開始的0，第4，和14天，以10mg/kg的劑量，經(jīng)尾靜脈給予ADM。用NK175203作為一種藥物來檢測改善作用。每周給予NK175203三次(周一，三和五)共六周。實(shí)驗(yàn)開始的那天(即第0天)為周一。在使用前，將藥物各自溶解在生理鹽水中，表1概括了每組的劑量和給藥途徑。在實(shí)驗(yàn)開始的第0-42天，測定尾神經(jīng)潛伏期。在第72和85天，進(jìn)行擺尾試驗(yàn)(tail-flick test)(熱敏感性檢測)。
表1CDDP-或ADM-誘導(dǎo)的外周神經(jīng)病模型組
(i)尾神經(jīng)潛伏期的測定用下列方法測定尾神經(jīng)潛伏期。將小鼠輕度乙醚化并且面朝上固定在軟木板上。作為記錄電極，將同心電極插入尾部距離根部2cm處的外側(cè)。進(jìn)一步，將兩個(gè)針狀電極插入相距4cm的部位作為刺激電極。通過刺激裝置(SEN-7203型，由Nippon Konden Corporation生產(chǎn))和絕緣體(SS-320丁型，由Nippon Kohden Corporation生產(chǎn))在5-10V電壓下，通過刺激電極輸入刺激，持續(xù)時(shí)間0.05秒。將通過記錄電極和放大器(EI-601G型，由Nippon Kohden Corporation)得到的20-50次刺激的作用電壓加起來。然后計(jì)算平均值并用X-Y記錄儀(WX-2400型，由Graphtec Corp生產(chǎn))記錄。將由此得到的作用電位的潛伏時(shí)間被刺激部位和記錄部位之間的距離除，得到傳導(dǎo)速度。
在開始實(shí)驗(yàn)的第42天，測定尾神經(jīng)潛伏期。

圖1顯示結(jié)果。與未受損組比較，單獨(dú)給予CDDP組顯示出明顯減少傳導(dǎo)速度，這表明已誘發(fā)神經(jīng)病。另一方面，合并使用CDDP和NK175203的組顯示出，與單獨(dú)給予CDDP的組相比，每個(gè)試驗(yàn)對象都明顯增加傳導(dǎo)速度。當(dāng)所記錄的由于給予CDDP而相起的傳導(dǎo)速度的減小為100％時(shí)，合并使用CDDP與10和40mg/kg NK175203的組顯示，改善作用以劑量依賴方式分別為45和60％。(ii)擺尾試驗(yàn)(熱敏感性測定)用下列方法進(jìn)行擺尾試驗(yàn)。用6V的Natsume Thermal Counter(由Natsume生產(chǎn))熱燈照射。通過用燈照射30秒，將測定木板預(yù)熱后，將燈關(guān)閉。然后，用相距大約10cm高的熱燈照射鼠尾，并測定小鼠感受到熱并擺尾時(shí)所需要的時(shí)間。
在開始實(shí)驗(yàn)的第72天，用ADM誘導(dǎo)組進(jìn)行第一次擺尾試驗(yàn)。用熱燈照射距離尾根部4cm部位。圖2a顯示結(jié)果。與單獨(dú)給予ADM組比較，聯(lián)合給予ADM與40mg/kg NK175203的組顯示出明顯縮短的擺尾時(shí)間，由此表明改善了對熱刺激的反應(yīng)。
接著，在第85天，進(jìn)行第二次試驗(yàn)。用熱燈照射距離尾根部3cm的部位。圖2b顯示結(jié)果。與未受損組比較，給予ADM的組顯示出明顯延遲的擺尾時(shí)間，由此表明通過給予ADM，抑制了對熱刺激的反應(yīng)。進(jìn)一步，聯(lián)合給予ADM和NK175203的組顯示出與未受損組類似的擺尾時(shí)間，由此表明，明顯改善了由給予ADM所抑制的感覺神經(jīng)功能。
根據(jù)這些結(jié)果證明，NK175203具有改善由鼠抗癌劑誘導(dǎo)的外周神經(jīng)病模型的作用。實(shí)施例3(實(shí)施例1的制劑)制備顆粒將50份重的生理活性物質(zhì)NK175203的鈉鹽，600份重的乳糖，300份重的結(jié)晶纖維素和20份重的羥丙基纖維素充分混合。然后，通過使用滾動(dòng)壓片機(jī)(Roller CompactorTM)將得到的混合物壓片，經(jīng)16目和19目篩研磨并包裹，得到顆粒。實(shí)施例4(實(shí)施例2的制劑)制備片劑在V形混合器中，將100份重的生理活性物質(zhì)NK175203的鈉鹽，90份重的結(jié)晶乳糖，107份重的結(jié)晶纖維素和3份重的硬脂酸鎂混合并將得到的混合物成型為片劑，每片重300mg，實(shí)施例5(實(shí)施例3的制劑)制備注射劑向50份重的生理活性物質(zhì)NK175203的鈉鹽和120份重的甘露糖醇中加入蒸餾水，得到總體積為2000份。溶解后，通過GS型毫孔濾器，將溶液無菌過濾。將濾液引入10ml小瓶中并冷凍干燥，得到每小瓶含50mg本發(fā)明化合物鹽的凍干注射粉針。
如上所述，生理活性物質(zhì)NK175203或其可藥用鹽具有促進(jìn)PC12細(xì)胞軸突延長的活性和相對低的毒性。因此用作細(xì)胞分化促進(jìn)劑并預(yù)計(jì)，例如可用作治療癡呆的藥物，治療由抗癌劑，糖尿病等引起的外周神經(jīng)病的藥物或神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)性藥物。
權(quán)利要求
1.神經(jīng)細(xì)胞分化促進(jìn)劑，它包含作為活性組分的生理活性物質(zhì)NK175203或其可藥用鹽以及可藥用賦形劑或載體。
2.治療癡呆的藥物，它包含作為活性組分的權(quán)利要求1物質(zhì)或其鹽以及賦形劑或載體。
3.神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)性藥物，它包含作為性組分的權(quán)利要求1物質(zhì)或其鹽以及賦形劑或載體。
4.治療外周神經(jīng)病的藥物，它包含作為活性組分的權(quán)利要求1的物質(zhì)以及賦形劑或載體。
全文摘要
本發(fā)明提供神經(jīng)細(xì)胞分化促進(jìn)劑，它包含作為活性組分的生理活性物質(zhì)NK175 203或其可藥用鹽。預(yù)計(jì)本發(fā)明神經(jīng)細(xì)胞分化促進(jìn)劑可用作治療癡呆的藥物，神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)性藥物或治療由抗癌劑所引起的外周神經(jīng)病的藥物。
文檔編號(hào)A61K35/74GK1149256SQ95193237
公開日1997年5月7日 申請日期1995年5月15日 優(yōu)先權(quán)日1994年5月23日
發(fā)明者駒形大介, 森野富夫 申請人:日本化藥株式會(huì)社