專利名稱：提高南方紅豆杉紫杉醇產(chǎn)率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用特定的培養(yǎng)基提高南方紅豆杉植物紫杉醇產(chǎn)率的方法。
背景技術(shù)：
紫杉醇(taxol)是從紅豆杉屬植物中提取的一種萜類化合物，是當(dāng)今公認(rèn)的最有效的抗癌制劑之一。自1967年被首次分離以來，已證明其對(duì)白血病、轉(zhuǎn)移性乳腺癌、卵巢癌、惡性黑色素瘤、腦癌、頸癌和肺癌均有療效，對(duì)睪丸癌、膀胱癌和食道癌的治療也有一定幫助。被美國(guó)國(guó)立癌癥研究所譽(yù)為過去十五年內(nèi)開發(fā)的“最好的抗癌制劑”，預(yù)計(jì)全球每年需要紫杉醇200-300Kg。然而，紫杉醇主要是從紅豆杉類植物的樹皮中制備，它在原植物中的含量非常之低，一般僅為干重的0.005％-0.07％；另外，紅豆杉類植物多屬珍稀物種，全世界現(xiàn)存紅豆杉屬植物的數(shù)量很少，加之其生長(zhǎng)又十分緩慢，這就造成紫杉醇生產(chǎn)的原料供應(yīng)極度匱乏。由于供不應(yīng)求，目前紫杉醇的價(jià)格非常昂貴，售價(jià)高達(dá)4000美元/g。因此，建立新的獲取紫杉醇的方法已成為受到高度重視的研究領(lǐng)域，也是當(dāng)今各國(guó)在植物生物技術(shù)領(lǐng)域爭(zhēng)奪的一個(gè)焦點(diǎn)。
南方紅豆杉是分布在廣東的陽(yáng)春、乳源和連山的珍貴裸子植物。目前紅豆杉屬植物通過組織培養(yǎng)的方法提高紫杉醇的含量通常是以1-2年生的枝條、葉、幼嫩莖段為外植體，進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)，但效果不是特別理想.一方面是愈傷組織中紫杉醇的含量較原材料提高的比例不是太大，例如，以南方紅豆杉莖段和葉片為外植體誘導(dǎo)形成的愈傷組織的生長(zhǎng)，并且愈傷組織中紫杉醇的含量為提取后干重的0.008％。另一方面，紅豆杉屬植物組織細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞在脫分化或分化過程中，經(jīng)常會(huì)分泌一些紅褐色色素或酚類物質(zhì)到培養(yǎng)基中，造成整個(gè)培養(yǎng)基褐變，另外由于紫杉醇是次生代謝物，次生代謝途徑與植物褐變反應(yīng)的一部分途徑相重疊，從而進(jìn)一步加重褐變的程度，因而嚴(yán)重影響紫杉醇生物合成的穩(wěn)定性。所以，選擇合適的外植體和適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件是克服褐變最重要的手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提高南方紅豆杉紫杉醇產(chǎn)率的方法。該方法通過選擇合適的培養(yǎng)基，并以南方紅豆杉芽為外植體進(jìn)行培養(yǎng)，使其紫杉醇的產(chǎn)率明顯提高。
本發(fā)明的方法是以南方紅豆杉芽為外植體，去除少部分外鱗后接入添加有2，4-D 0.5-2.0mg/L和/或NAA 0.5-3.0mg/L的改良MS培養(yǎng)基，23-25℃黑暗培養(yǎng)35-40天后，選取疏松、淺綠色或白色的愈傷組織；轉(zhuǎn)入添加有2，4-D 0.5-2.0mg/L、NAA 0.5-3.0mg/L和KT 0.2-1.0mg/L或其中的任意兩種的改良B5培養(yǎng)基，23-25℃黑暗培養(yǎng)35-40天。即可收集愈傷組織，供提取紫杉醇。
上述方法中，最好先將作為外植體的南方紅豆杉芽用70％乙醇浸泡3-10秒，再用無菌水沖洗5-6次后，再接入改良MS培養(yǎng)基培養(yǎng)。所用的改良MS培養(yǎng)基為MS+2，4-D 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L。所用改良B5培養(yǎng)基為B5+2，4-D 0.5mg/L+NAA 1.0mg/L+KT 0.5mg/L，或B5+NAA 0.5mg/L+KT 1.0 mg/L。
本發(fā)明以南方紅豆杉芽為外植體，經(jīng)過改良的MS和B5培養(yǎng)基的誘導(dǎo)、增殖和馴化，紫杉醇含量最大能達(dá)到0.013％，比以南方紅豆杉莖段和葉片為外植體誘導(dǎo)形成的愈傷組織中紫杉醇的含量提高了62.5％。并且污染率低、褐變率低，有利于紫杉醇含量的積累。
具體實(shí)施例方式
以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
表1是本發(fā)明實(shí)施例1至4所用培養(yǎng)基及愈傷組織誘導(dǎo)率和紫杉醇產(chǎn)率。表中所示的2，4-D2.0，NAA0.5，KT0.2等的下標(biāo)數(shù)字分別表示該成分在培養(yǎng)基中的濃度(mg/L)。
各實(shí)施例的方法如下1.材料南方紅豆杉(Taxus chinensis var.mairei)的芽。
2.培養(yǎng)方法取南方紅豆杉的芽用70％乙醇浸泡約3秒，無菌水沖洗5次；去除少部分外鱗后接入改良的MS培養(yǎng)基，25℃黑暗培養(yǎng)40天；選取疏松、淺綠色或白色的愈傷組織在改良的B5培養(yǎng)基上23-25℃黑暗繼代培養(yǎng)40天。收集愈傷組織，計(jì)算南方紅豆杉芽的紫杉醇含量。結(jié)果列于表1中。從表1可知，本發(fā)明方法中南方紅豆杉的芽愈傷組織的出愈時(shí)間為5-9天，誘導(dǎo)率可達(dá)100％；經(jīng)本發(fā)明改良的B5培養(yǎng)基培養(yǎng)后的南方紅豆杉的芽愈傷組織中紫杉醇含量達(dá)到0.0084-0.013％。以實(shí)施例2的MS(培養(yǎng)基)添加2，4-D 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L誘導(dǎo)率最高，出愈時(shí)間最早。以實(shí)施例3的B5(培養(yǎng)基)添加2，4-D 0.5mg/L+NAA 1.0mg/L+KT 0.5mg/L，紫杉醇含量最大，達(dá)到0.013％。
表1各實(shí)施例所用培養(yǎng)基及愈傷組織誘導(dǎo)率和紫杉醇產(chǎn)率

3.誘導(dǎo)率的計(jì)算及紫杉醇含量的測(cè)定誘導(dǎo)率的計(jì)算誘導(dǎo)率＝愈傷組織的塊數(shù)/接種的芽個(gè)數(shù)紫杉醇提取愈傷組織培養(yǎng)物在40℃干燥至恒重，研碎后，精確稱重，150ml氯仿80℃索氏提取4小時(shí)?；厥章确?，用甲醇定容至10ml，濾膜(孔徑0.45um)過濾備用。
標(biāo)準(zhǔn)品紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品(taxol)購(gòu)自Sigma公司。
采用表2中HPLC條件定量分析紫杉醇產(chǎn)量。
表2紫杉醇的定量分析條件

權(quán)利要求
1.一種提高南方紅豆杉紫杉醇產(chǎn)率的方法，以南方紅豆杉芽為外植體，去除少部分外鱗后接入添加有2，4-D 0.5-2.0mg/L和/或NAA 0.5-3.0mg/L的改良MS培養(yǎng)基，23-25℃黑暗培養(yǎng)35-40天后，選取疏松、淺綠色或白色的愈傷組織；轉(zhuǎn)入添加有2，4-D 0.5-2.0mg/L、NAA 0.5-3.0mg/L和KT0.2-1.0mg/L或其中的任意兩種的改良B5培養(yǎng)基，23-25℃黑暗培養(yǎng)35-40天。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是先將作為外植體的南方紅豆杉芽用70％乙醇浸泡3-10秒，再用無菌水沖洗5-6次后，再接入改良MS培養(yǎng)基培養(yǎng)。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是所用的改良MS培養(yǎng)基為MS+2，4-D 2.0mg/L+NAA0.5mg/L。
4.按照權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是所用改良B5培養(yǎng)基為B5+2，4-D 0.5mg/L+NAA1.0mg/L+KT 0.5mg/L，或B5+NAA 0.5mg/L+KT 1.0mg/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高紫杉醇產(chǎn)率的方法,以南方紅豆杉芽為外植體,去除少部分外鱗后接入添加有2,4－D0.5－2.0mg/L和/或NAA0.5－3.0mg/L的改良MS培養(yǎng)基,23－25℃黑暗培養(yǎng)35－40天后,選取疏松、淺綠色或白色的愈傷組織;轉(zhuǎn)入添加有2,4－D0.5－2.0mg/L、NAA0.5－3.0mg/L和KT0.2－1.0mg/L或其中的任意兩種的改良B
文檔編號(hào)C12N5/04GK1388245SQ0213421
公開日2003年1月1日 申請(qǐng)日期2002年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月21日
發(fā)明者蘇應(yīng)娟, 王艇, 吳惠勤, 葛發(fā)歡 申請(qǐng)人:中山大學(xué)