專利名稱：人神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)方法，尤其是涉及一種人神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
對于一般的胚胎干細(xì)胞而言，在適宜環(huán)境下可以分化生長成各種不同的組織細(xì)胞，故人們可用胚胎干細(xì)胞培育出各種新組織甚至器官進(jìn)行移植。而對于神經(jīng)干細(xì)胞而言，主要焦點(diǎn)在于成功地從不同途徑培養(yǎng)、獲得足夠數(shù)量的神經(jīng)前體細(xì)胞，以供移植治療、或進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作攻擊腫瘤的生長、觀察某些合成/天然化合物的神經(jīng)活性等。比如，若能從病員自體抽得骨髓組織作為神經(jīng)干細(xì)胞的種子細(xì)胞，在一定條件下誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細(xì)胞、進(jìn)而回輸于病員自體體內(nèi)，并在局部微環(huán)境作用下產(chǎn)生多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞，就可用于治療其帕金森癥。而令這種技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵前提，是能否使骨髓源等種子細(xì)胞在特定環(huán)境中培養(yǎng)成所需的神經(jīng)干細(xì)胞。而現(xiàn)有采用的合成細(xì)胞培養(yǎng)基主要作用是為不同種類組織細(xì)胞提供一般生存生長的微環(huán)境，如Eagle，DMEM，F(xiàn)12，RPMI1640，CMRL1066，L15，199，MB752/1等，其主要含有成份為氨基酸、維生素、無機(jī)鹽、糖類等，利用這些合成培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞的方法是不能將不同來源的種子細(xì)胞(如骨髓組織細(xì)胞等)培養(yǎng)成所需的神經(jīng)干細(xì)胞。
本發(fā)明的目的在于提供一種能使人類骨髓組織等不同來源種子細(xì)胞定向發(fā)育分化為人神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，可隨時(shí)準(zhǔn)確無誤地為醫(yī)學(xué)科研教學(xué)及臨床應(yīng)用提供相關(guān)需要的神經(jīng)干細(xì)胞。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明包括以下步驟1、配制人神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的配制步驟為a、取DMEM和F12按1∶1混合而成的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，加純凈水至濃度為10～25g/L，并充分?jǐn)嚢枞芙?，制得?xì)胞的一般基礎(chǔ)培養(yǎng)液；b、再取胰島素(Insulin)、L-谷氨酰胺(L-Glutamine)、鹽酸丁二胺(Putrescine)、硒化鈉(Sodium Selenide)、人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin)、氫化可的松(Hydrocortisone)、黃體酮(Progesterone)依次加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，充分?jǐn)嚢杈鶆?；c、以1～10當(dāng)量濃度的氫氧化鈉調(diào)pH為7.4～8.0；d、層流細(xì)胞培養(yǎng)室抽濾消毒，4℃儲存?zhèn)溆谩?br> 2、即時(shí)采集病員本人自體血清，采集步驟為a、準(zhǔn)備玻璃離心管、一次性無菌注射器、酒精棉；b、常規(guī)消毒、前臂靜脈取血，不加任何抗凝劑；c、將靜脈血置于無菌玻璃離心管中，室溫或4℃條件下，離心1500～1800rmp，10分鐘，可得到病員自體血清，收集血清；3、取步驟1配制出的人神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基，取步驟2即時(shí)采集病員本人自體血清加入培養(yǎng)基中，血清的含量為培養(yǎng)基的5～20％；將加入血清的培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱，在35℃～38℃、加3～7％的CO2溫箱孵育11～21天。
本發(fā)明步驟1中所述培養(yǎng)基所包含各組分的重量配比為DMEM和F12按1∶1混合而成的基礎(chǔ)培養(yǎng)液 10000～25000胰島素(Insulin) 4.5～12.5L-谷氨酰胺(L-Glutamine) 3.5～12.5鹽酸丁二胺(Putrescine)9.2～35.6硒化鈉(Sodium Selenide) 0.01～0.51人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin) 50.0～150.0氫化可的松(Hydrocortisone) 5.0～35.0黃體酮(Progesterone)0.01～0.55
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的優(yōu)點(diǎn)1、由于本發(fā)明中的DMEM和F12混合而成的基礎(chǔ)培養(yǎng)液作為一般種子細(xì)胞生長發(fā)育的基本微環(huán)境；胰島素可通過促進(jìn)細(xì)胞攝取葡萄糖和氨基酸，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖分裂，特別是促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞生長；L-谷氨酰胺可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育生長期間核酸、蛋白質(zhì)的合成；鹽酸丁二胺能刺激、誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞增殖；硒化鈉參與、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞代謝；人轉(zhuǎn)鐵蛋白可結(jié)合鐵離子，減少其毒性和被細(xì)胞所利用，同時(shí)使神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量增多、減少成纖維細(xì)胞數(shù)；氫化可的松促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞生長發(fā)育；黃體酮促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞生長。用本發(fā)明方法培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)過免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定表達(dá)特有的高親和力抗原NESTIN；表達(dá)NESTIN抗原的神經(jīng)干細(xì)胞可進(jìn)一步分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，證明本發(fā)明方法能有效地誘導(dǎo)包括骨髓組織種子細(xì)胞在內(nèi)的各種來源組織細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞，其誘導(dǎo)時(shí)間為11～21天；2、將本發(fā)明方法培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞移植至脊髓損傷患者的病灶周圍，移植3個(gè)月后患者的臨床癥狀有明顯改善，表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)功能、知覺功能、代謝功能等不同程度的恢復(fù)，最理想者可由原來的長期臥位到能扶物體站立；3、以病員自體血清成份維持神經(jīng)干細(xì)胞生長，效果佳，且不存在移植細(xì)胞異種血清蛋白免疫排斥的可能；4、本發(fā)明方法簡單，可重復(fù)性強(qiáng)，操作簡便易行；為有關(guān)神經(jīng)干細(xì)胞及其應(yīng)用的科研、教學(xué)、臨床應(yīng)用等能起到不可估量的作用，同時(shí)也孕育著巨大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。
2、即時(shí)采集病員本人自體血清，采集步驟為a、準(zhǔn)備10ml規(guī)格玻璃離心管、一次性無菌注射器、酒精棉；b、常規(guī)消毒、前臂靜脈取血10毫升，不加任何抗凝劑；c、將靜脈血置于無菌玻璃離心管中，室溫或4℃條件下，離心1500～1800rmp，10分鐘，可得到3～6ml病員自體血清，收集血清；3、取步驟1配制出的人神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基10g，取步驟2即時(shí)采集病員本人自體血清1g加入培養(yǎng)基中；將加入血清的培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱，在37℃、加5％的CO2溫箱孵育15天。
權(quán)利要求
1.一種人神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟(1)配制人神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的配制步驟為a、取DMEM和F12按1∶1混合而成的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，加純凈水至濃度為10～25g/L，并充分?jǐn)嚢枞芙猓频眉?xì)胞的一般基礎(chǔ)培養(yǎng)液；b、再取胰島素(Insulin)、L-谷氨酰胺(L-Glutamine)、鹽酸丁二胺(Putrescine)、硒化鈉(Sodium Selenide)、人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin)、氫化可的松(Hydrocortisone)、黃體酮(Progesterone)依次加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，充分?jǐn)嚢杈鶆颍籧、以1～10當(dāng)量濃度的氫氧化鈉調(diào)pH為7.4～8.0；d、層流細(xì)胞培養(yǎng)室抽濾消毒，4℃儲存?zhèn)溆谩?2)即時(shí)采集病員本人自體血清，采集步驟為a、準(zhǔn)備玻璃離心管、一次性無菌注射器、酒精棉；b、常規(guī)消毒、前臂靜脈取血，不加任何抗凝劑；c、將靜脈血置于無菌玻璃離心管中，室溫或4℃條件下，離心1500～1800rmp，10分鐘，可得到病員自體血清，收集血清；(3)取步驟1配制出的人神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基，取步驟2即時(shí)采集病員本人自體血清加入培養(yǎng)基中，血清的含量為培養(yǎng)基的5～20％；將加入血清的培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱，在35℃～38℃、加3～7％的CO2溫箱孵育11～21天。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于步驟1中所述培養(yǎng)基所包含各組分的重量配比為DMEM和F12按1∶1混合而成的基礎(chǔ)培養(yǎng)液 10000～25000胰島素(Insulin) 4.5～12.5L-谷氨酰胺(L-Glutamine) 3.5～12.5鹽酸丁二胺(Putrescine) 9.2～35.6硒化鈉(Sodium Selenide) 0.01～0.51人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin) 50.0～150.0氫化可的松(Hydrocortisone) 5.0～35.0黃體酮(Progesterone)0.01～0.5全文摘要
本發(fā)明公開了一種人神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法,包括以下步驟:1、配制由DMEM和F12以1∶1混合而成的基礎(chǔ)培養(yǎng)液、胰島素、鹽酸丁二胺、硒化鈉、氫化可的松、L－谷氨酰胺、人轉(zhuǎn)鐵蛋白和黃體酮組成的人神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基;2、即時(shí)采集病員本人自體血清;3、將采集的病員本人自體血清加入配制出的人神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中,在35℃～38℃、加3～7%的CO
文檔編號C12N5/08GK1389565SQ0213431
公開日2003年1月8日 申請日期2002年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月8日
發(fā)明者徐如祥, 姜曉丹 申請人:徐如祥, 姜曉丹