專利名稱：牙鲆淋巴囊腫病毒毒株及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及淡、海水魚類疾病病原及分離、擴(kuò)增與鑒定技術(shù)，特別涉及海洋養(yǎng)殖魚類虹彩病毒的體外增殖、檢測(cè)診斷技術(shù)及其材料來(lái)源，更具體涉及一種牙鮃淋巴囊腫病毒毒株，同時(shí)，還涉及一種牙鲆淋巴囊腫病毒毒株的制備方法和在魚類淋巴囊腫病毒檢測(cè)與診斷及在海水魚虹彩病毒在細(xì)胞工程疫苗制備中的用途。
背景技術(shù)：
牙鲆(Paralichthys olivaceus，Japanese flounder)是深受消費(fèi)者歡迎、市場(chǎng)前景非?？春玫暮ＫB(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類。但隨著海水養(yǎng)殖業(yè)集約化和快速發(fā)展，由淋巴囊腫病毒(Lymphocystis disease virus，LCDV)引起的牙鲆淋巴囊腫病呈急劇蔓延的態(tài)勢(shì)。在患有這種病的魚體表、頭、軀干、吻、尾鰭的皮膚上，有白色水泡和囊狀物形成，淋巴細(xì)胞大量聚積而成，呈腫瘤狀，病情嚴(yán)重的魚，在腮乃至腸道中也會(huì)出現(xiàn)散在或成群的囊腫。病魚攝食不便，生長(zhǎng)緩慢，使原本名貴的牙鲆喪失其經(jīng)濟(jì)和食用價(jià)值。
病毒性淋巴囊腫是一種常見于魚類皮膚和鰭上出現(xiàn)腫瘤樣病變的疾病，淡、海水魚類均可發(fā)生。因與患病魚接觸，或當(dāng)病魚囊腫破潰時(shí)，病毒逸出水中而使正常魚感染發(fā)病。LCDV是虹彩病毒的成員，由虹彩病毒引起的爬行動(dòng)物、兩棲動(dòng)物和魚類疾病已在美洲、歐洲、亞洲和澳洲等地普遍流行[Ahne W，Bremont M，Hedrick R P，et al.Special topicreviewiridoviruses associated with epizootic haematopoietic necrosis virus(EHNV)in aquaculture.World J Micro Biotech，1997，13367-373]。淋巴囊腫病毒呈球形，其直徑大小為200±50nm。19世紀(jì)開始，人們就已知淋巴囊腫病毒在世界各地流行，對(duì)淡、海水魚造成危害。多年來(lái)，對(duì)淋巴囊腫病的病原學(xué)、病理學(xué)、流行病學(xué)等方面進(jìn)行了研究，國(guó)內(nèi)也有相關(guān)報(bào)道[張永嘉等，海洋與湖沼，1997，28(4)406]。近年，又對(duì)該病的病原LCDV進(jìn)行了分子生物學(xué)、快速檢測(cè)、病原分離純化等研究，并取得了明顯的進(jìn)展[林清龍，陳秀男，養(yǎng)魚世界，1995，4844；劉允坤等，高技術(shù)通訊，2002，692-95]。但該病毒的體外擴(kuò)增尚未有突破。
盡管關(guān)于魚類淋巴囊腫病毒的分離培養(yǎng)始于20世紀(jì)60年代[Wolf et al，1966，Science1511004-1005]，歷時(shí)約40年，但這種病毒株的體外培養(yǎng)十分困難，僅觀察到LCDV可在少數(shù)海水魚細(xì)胞中引起病變，而且所需時(shí)間較長(zhǎng)，多數(shù)在一周以上[Walker et al，1980，J Gen.Virol.51385-395；Perez-Prieto et al，1999，Dis Aquar Org 35149-153；Chang et al，2001，Aquaculture 192133-145]。迄今國(guó)內(nèi)外尚未建立牙鮃淋巴囊腫病毒經(jīng)濟(jì)實(shí)用的生物學(xué)檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在提供一種牙鲆淋巴囊腫病毒毒株，通過(guò)LCDV011126的體外擴(kuò)增，建立LCDV復(fù)制與感染系統(tǒng)，解決了LCDV在淡水魚細(xì)胞系中增殖的技術(shù)問(wèn)題。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種制備牙鲆淋巴囊腫病毒毒株的方法，該方法過(guò)程簡(jiǎn)單，易于人工調(diào)節(jié)和控制，成本低。
本發(fā)明還涉及一種準(zhǔn)確有效的牙鲆淋巴囊腫病毒毒株在魚類淋巴囊腫病毒檢測(cè)和診斷中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及一種牙鲆淋巴囊腫病毒毒株在生物學(xué)在鑒定魚類淋巴囊腫病毒中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及一種牙鲆淋巴囊腫病毒毒株在細(xì)胞工程疫苗制備中的應(yīng)用。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案將被牙鲆淋巴囊腫病毒株(LCDV011126)侵染魚的病變組織(如皮膚表面的腫瘤)取出后，剪碎、加入1-2倍體積的磷酸緩沖液(PBS)進(jìn)行勻漿，再加入雙抗，置冰箱—20℃冰凍過(guò)夜，次日取出待其融化后，以1000-2000轉(zhuǎn)/分的速度離心10分鐘，獲LCDV011126病毒粗提液。將制備好的LCDV011126病毒粗提液經(jīng)過(guò)濾后，分別接種到已長(zhǎng)成單層的草魚腎CO011126細(xì)胞(上皮樣)和CIK011126細(xì)胞(成纖維樣)等十多種不同的淡、海水魚類細(xì)胞中。同時(shí)設(shè)有相應(yīng)的正常細(xì)胞對(duì)照，并置溫度為20℃的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。利用光學(xué)顯微鏡，定時(shí)觀察已接種了LCDV011126病毒粗提液的細(xì)胞變化情況，并與相應(yīng)的正常細(xì)胞作比較。連續(xù)傳代3次，每次都持續(xù)觀察2周以上。在接種了LCDV011126病毒粗提液的這些淡、海水魚類細(xì)胞中，多數(shù)種類的細(xì)胞單層未出現(xiàn)病理變化，這些細(xì)胞是LCDV011126病毒不敏感的細(xì)胞。
通過(guò)光鏡可觀察到在接種了LCDV011126病毒并繼續(xù)培養(yǎng)了24-36小時(shí)的CO011126細(xì)胞和CIK011126細(xì)胞單層細(xì)胞上出現(xiàn)補(bǔ)疤樣病變，病變斑中局部有細(xì)胞量增多、堆積，類似燒、燙傷的皮膚表面，凸凹不平。這不同于其它多數(shù)水生動(dòng)物病毒引起的細(xì)胞產(chǎn)生裂解、出現(xiàn)脫落，并在單層細(xì)胞中形成大小不同的空洞(空斑)樣病變。接種了LCDV011126病毒粗提液的CO011126細(xì)胞和CIK011126細(xì)胞出現(xiàn)了特有的病變斑——補(bǔ)疤樣病變，故被確定為對(duì)LCDV011126敏感的細(xì)胞。
牙鲆淋巴囊腫病毒毒株LCDV011126(Paralichthys olivaceus lymphocysitis diseasevius，LCDV011126)，通過(guò)電鏡觀察可見，在病變細(xì)胞中有LCDV011126顆粒，呈球形，直徑大小130-260nm。宿主細(xì)胞也出現(xiàn)了產(chǎn)生空泡、腫脹膨大、細(xì)胞器破壞等超微病變。LCDV011126已交中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢)，保藏號(hào)為CCTCC-V202007。
本發(fā)明提供的牙鮃淋巴囊腫病毒體外增殖系統(tǒng)和方法能有效進(jìn)行LCDV的生物學(xué)檢測(cè)與診斷，通過(guò)LCDV011126的體外擴(kuò)增，建立LCDV復(fù)制與感染機(jī)理研究的體外模型。同時(shí)由于體外擴(kuò)增條件易于人工調(diào)節(jié)和控制、且經(jīng)濟(jì)、省時(shí)，制備材料均一。因?yàn)椴⒎峭ㄟ^(guò)感染魚體來(lái)收集病料，可在不污染水體和環(huán)境的前提下，就可提供淋巴囊腫病毒疫苗研制及生產(chǎn)所需的原料。
已知LCDV的生物學(xué)鑒定方法是通過(guò)魚體回接感染或海水魚細(xì)胞接種，這兩種生物學(xué)鑒定LCDV的方法與本發(fā)明比較，前者成本較高，后者時(shí)間較長(zhǎng)。
由于感染了病毒的魚組織勻漿液中含有LCDV011126，接種到CO011126細(xì)胞和CIK011126細(xì)胞上，在2-3天內(nèi)，會(huì)引起細(xì)胞產(chǎn)生特有的病變斑——補(bǔ)疤樣病變，因此本發(fā)明可運(yùn)用于LCDV的檢測(cè)和診斷。
通過(guò)培養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)增病毒的條件易于人工控制、不會(huì)受到來(lái)自宿主動(dòng)物機(jī)體免疫作用的干擾。擴(kuò)增出的病毒會(huì)直接用于細(xì)胞工程疫苗的生產(chǎn)，或通過(guò)基因工程的方法，制備病毒核酸疫苗。
其步驟如下A、以患有淋巴囊腫病的牙鲆腫瘤組織作為材料；B、將病魚組織(如皮膚表面的腫瘤)取出后，剪碎、加入1-2倍體積的PBS進(jìn)行勻漿，加入雙抗后，置冰箱-20℃冰凍過(guò)夜，次日取出待其融化后，以1000-2000轉(zhuǎn)/分的速度離心10分鐘，獲LCDV011126病毒粗提液。將制備好的LCDV011126病毒粗提液經(jīng)過(guò)濾后，分別接種到已長(zhǎng)成單層的草魚腎CO011126細(xì)胞和CIK011126細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)有相應(yīng)的正常細(xì)胞對(duì)照，并置溫度為20℃的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。利用光學(xué)顯微鏡，定時(shí)觀察已接種了LCDV011126的細(xì)胞，并與相應(yīng)的正常細(xì)胞作比較。
C、對(duì)接種細(xì)胞活體或染色后，進(jìn)行顯微觀察，證實(shí)LCDV011126在2-3天內(nèi)可引起CO011126病變(圖1)和CIK011126細(xì)胞病變(圖2)。
D、將接種病毒后24小時(shí)收集的細(xì)胞樣品，經(jīng)固定、超薄切片和染色后進(jìn)行超微觀察，明確病毒引起感染細(xì)胞的體積明顯膨大，超過(guò)未感染細(xì)胞的5倍-15倍(圖3)。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果魚細(xì)胞培養(yǎng)可模擬魚體生長(zhǎng)條件，簡(jiǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境。在魚的細(xì)胞中增殖和測(cè)定病毒，與通過(guò)魚體回接感染實(shí)驗(yàn)相比，不僅快速、易于控制實(shí)驗(yàn)條件、且可獲得直接觀測(cè)結(jié)果，并能明顯的降低了檢測(cè)成本。此外，通過(guò)這一途經(jīng)，可大量擴(kuò)增淋巴囊腫病毒，提供均一、充足的病毒材料。


圖1、(A)正常的CO011126細(xì)胞；(B)接種了LCDV011126，并已出現(xiàn)病變的CO011126細(xì)胞，示細(xì)胞“補(bǔ)疤樣”病變。x20圖2、(A)正常的CIK011126細(xì)胞；(B)接種了LCDV011126的CIK011126細(xì)胞，示細(xì)胞“補(bǔ)疤樣”病變。x20圖3、接種了LCDV011126細(xì)胞的電鏡照片，示細(xì)胞的超微病變(如細(xì)胞內(nèi)空泡)和在細(xì)胞內(nèi)增殖的病毒粒子。x20000具體實(shí)施方式
所有用于細(xì)胞培養(yǎng)和病毒擴(kuò)增的器皿器材、培養(yǎng)基、試劑均要求事先經(jīng)高壓滅菌或過(guò)濾除菌等處理，保持無(wú)菌。部分常用試劑的配制方法如下磷酸鹽緩沖液(PBS，無(wú)Ca++、Mg++)NaCl 8.00gKCl0.20gNa2HPO42.31gKH2PO40.31g溶于500ml雙蒸水中，加入5ml 0.4％酚紅液，攪拌均勻后加雙蒸水至1000ml。10磅15分鐘滅菌備用。
雙抗(青霉素、鏈霉素)溶液將106單位青霉素G和106μg鏈霉素溶解于100ml滅菌的三蒸水中，使每ml青霉素104單位，鏈霉素104μg。
TC119培養(yǎng)基將購(gòu)置來(lái)的TC199培養(yǎng)基粉劑，按說(shuō)明書要求的量，加入用新鮮的三蒸水稀釋，充分溶解后加入血清、雙抗，并加入碳酸輕鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.2-7.4，再用三蒸水定容后，經(jīng)濾器過(guò)濾，分裝。
病毒接種和擴(kuò)增的操作步驟將病魚組織(如皮膚表面的腫瘤)取出后，剪碎、加入1-2倍體積的PBS進(jìn)行勻漿，再加入雙抗，置冰箱-20℃冰凍過(guò)夜，次日取出待其融化后，以1000-2000轉(zhuǎn)/分的速度離心10分鐘，獲LCDV011126病毒粗提液。將制備好的LCDV011126病毒粗提液經(jīng)過(guò)濾后，分別接種到已長(zhǎng)成單層的草魚腎CO011126細(xì)胞和CIK011126細(xì)胞中。同時(shí)設(shè)有相應(yīng)的正常細(xì)胞對(duì)照，并置溫度為20℃的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。利用光學(xué)顯微鏡，對(duì)接種了病毒的活體細(xì)胞定時(shí)觀察，并與相應(yīng)的正常細(xì)胞作比較。
顯微鏡下可見到在上皮樣細(xì)胞CO011126或成纖維樣細(xì)胞CIK011126單層的表面，局部出現(xiàn)大小不一、形狀不規(guī)則、細(xì)胞堆積并類似補(bǔ)疤樣的病變斑。這種病變斑是LCDV011126在CO011126細(xì)胞和CIK011126細(xì)胞中所引起的特征性病變(圖1和圖2)，不同于其它水生動(dòng)物病毒株在這兩種細(xì)胞中引起的壞死或空斑病變。
將接種病毒后24小時(shí)收集的細(xì)胞樣品，經(jīng)固定、超薄切片和染色后進(jìn)行超微觀察，明確病毒引起感染細(xì)胞的體積明顯膨大，超過(guò)未感染細(xì)胞的5倍-15倍(圖3)。
權(quán)利要求
1.一種牙鲆淋巴囊腫病毒毒株，其特征在于牙鲆淋巴囊腫病毒毒株P(guān)aralichthysolivaceus lymphocysitis disease virus，LCDV011126，CCTCC NOV202007。
2.一種實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1所述的一種牙鲆淋巴囊腫病毒毒株的制備方法，包括下列步驟A、以患有淋巴囊腫病的牙鲆腫瘤組織作為材料；B、將病魚組織取出后，剪碎、加入1-2倍體積的PBS進(jìn)行勻漿，加入雙抗后，置冰箱-20℃冰凍，融化后，以1000-2000轉(zhuǎn)/分的速度離心10分鐘，獲LCDV011126病毒粗提液，將LCDV011126病毒粗提液經(jīng)過(guò)濾后，分別接種到已長(zhǎng)成單層的草魚腎CO011126細(xì)胞和CIK011126細(xì)胞中，并置溫度為20℃的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；C、對(duì)接種細(xì)胞活體或染色后，觀察，證實(shí)LCDV011126在2-3天內(nèi)可引起CO011126病變和CIK011126細(xì)胞病變；D、將接種病毒后24小時(shí)收集的細(xì)胞樣品，經(jīng)固定、超薄切片和染色后進(jìn)行超微觀察，病毒引起感染細(xì)胞的體積膨大，超過(guò)未感染細(xì)胞的5-15倍。
3.權(quán)利要求1所述的牙鲆淋巴囊腫病毒毒株在魚類淋巴囊腫病毒檢測(cè)和診斷中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的牙鲆淋巴囊腫病毒毒株在細(xì)胞工程疫苗制備中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種牙鲆淋巴囊腫病毒毒株及其制備方法和應(yīng)用，牙鲆淋巴囊腫病毒毒株LCDV
文檔編號(hào)C12N7/01GK1410534SQ0213928
公開日2003年4月16日 申請(qǐng)日期2002年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月14日
發(fā)明者張奇亞, 李正秋, 袁秀平, 桂建芳 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所