專利名稱：牙鲆淋巴囊腫病毒中和單克隆抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體應(yīng)用技術(shù)的改進(jìn)，具體講是一種牙鲆淋巴囊腫病毒中和單克隆抗體及其制備方法。該中和單克隆抗體是由雜交瘤細(xì)胞分泌的牙鲆(Paralichthys olivaceus)淋巴囊腫病毒(Lymphocystis virus)中和單克隆抗體，其屬于免疫學(xué)和病毒學(xué)交叉技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在危害魚類生存生長的生物因素中，病毒是危害最大、也是最難防范的病原。由于病毒是一類寄生于宿主細(xì)胞內(nèi)的非細(xì)胞型超微微生物群體，所以至今也未研究出既能殺傷病毒又不損傷宿主細(xì)胞的有效藥物。另外，由于病毒的隱性感染和魚類特殊的水生環(huán)境，使病毒的感染難以覺察，常常一旦發(fā)現(xiàn)癥狀，即到了無法挽救的地步。牙鲆淋巴囊腫病是我國首次大規(guī)模爆發(fā)的海水魚類病毒病。患病魚的表皮、鰭和尾部等處出現(xiàn)許多囊腫。20世紀(jì)90年代以來，這種疾病的發(fā)生頻率逐漸增加，每年養(yǎng)殖魚類都會(huì)因此病大量死亡，造成的直接和間接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)百億元之巨。具有中和活性的單克隆抗體對病毒病的針對性治療具有潛在的實(shí)用價(jià)值。中和單克隆抗體所針對的抗原表位可以誘導(dǎo)保護(hù)性作用，該抗原表位合成肽疫苗可以有效地預(yù)防病毒感染。這在畜禽類動(dòng)物中，已有先例，如商品化治療雞傳染性法氏囊病毒的藥物“滅囊靈”，即是由中和單克隆抗體制成。從牙鲆淋巴囊腫病毒的單克隆抗體庫中篩選出該病毒的中和單克隆抗體，對研制淋巴囊腫病毒疫苗，進(jìn)而預(yù)防及治療該病毒病有著極為重要理論和現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是填補(bǔ)有關(guān)魚類淋巴囊腫病毒中和單克隆抗體研究的空白，提供一種由兩株雜交瘤細(xì)胞分別分泌的牙鲆淋巴囊腫病毒中和單克隆抗體。從而達(dá)到預(yù)防和控制牙鲆淋巴囊腫病毒病的目的。
本發(fā)明的任務(wù)是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，研制了一種由兩株雜交瘤細(xì)胞分別分泌的淋巴囊腫病毒的中和單克隆抗體，所述的分泌淋巴囊腫病毒中和單克隆抗體的該兩雜交瘤培養(yǎng)細(xì)胞的名稱分別為小鼠雜交瘤細(xì)胞株LCDV-E1和小鼠雜交瘤細(xì)胞株LCDV-E2，該兩雜交瘤細(xì)胞的保藏號(hào)分別為CCTCC-C200419和CCTCC-C200420，其保藏日期2004年12月14日；其分泌的特異性淋巴囊腫病毒中和單克隆抗體(簡稱中和單抗A和中和單抗B)具有與淋巴囊腫病毒上的粘附蛋白結(jié)合，從而封閉該粘附蛋白，阻斷該病毒的粘附蛋白與該病毒敏感細(xì)胞——牙鲆鰓細(xì)胞的細(xì)胞膜上的該病毒受體結(jié)合，阻止該病毒入侵細(xì)胞的功能；在倒置顯微鏡下觀察，生長狀態(tài)良好的該雜交瘤細(xì)胞分裂旺盛、外觀飽滿、渾圓、折光性強(qiáng)、細(xì)胞大小均一、貼壁良好；該雜交瘤細(xì)胞有無限分裂增生能力；長勢良好的該雜交瘤細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)2-3天，其培養(yǎng)基由桃紅色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，該培養(yǎng)基中含有該雜交瘤細(xì)胞分泌的大量的淋巴囊腫病毒中和單克隆抗體；在細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)中，該中和單抗A和中和單抗B中和效果明顯，具有保護(hù)牙鲆鰓細(xì)胞不受淋巴囊腫病毒侵染的特性。
本發(fā)明的淋巴囊腫病毒中和單克隆抗體的制備方法，其制備技術(shù)路線是從以牙鲆淋巴囊腫病毒為抗原開始，采用免疫學(xué)方法建立抗淋巴囊腫病毒的單克隆抗體庫；選擇中和實(shí)驗(yàn)測定方法，從該單克隆抗體庫中檢測篩選出淋巴囊腫病毒的中和單抗A和中和單抗B。
所述的中和實(shí)驗(yàn)測定方法是對牙鲆淋巴囊腫病毒敏感的牙鲆鰓細(xì)胞系為材料的中和實(shí)驗(yàn)，采用稀釋病毒法，即首先，不同稀釋度的淋巴囊腫病毒分別與該病毒單抗庫中的單抗等體積孵育；其次再將病毒——抗體混合物接種于牙鲆鰓細(xì)胞，待已接種的牙鲆鰓細(xì)胞充分出現(xiàn)感染效應(yīng)，即參照對照培養(yǎng)的牙鲆鰓細(xì)胞在感染后的病變和死亡情況，依據(jù)單克隆抗體能否阻止細(xì)胞病變的發(fā)生，確定具有中和活性的單克隆抗體。
所述的中和實(shí)驗(yàn)測定方法的具體步驟是(1)細(xì)胞準(zhǔn)備將生長旺盛的牙鲆鰓細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔3～5×104個(gè)，15～25℃，2％CO2培養(yǎng)；(2)病毒準(zhǔn)備將病毒懸液用孔徑為0.45μm的濾膜過濾，MEM培養(yǎng)液2倍或10倍連續(xù)稀釋，設(shè)立七個(gè)連續(xù)梯度；(3)對照準(zhǔn)備設(shè)置3組對照病毒對照，單克隆抗體毒性對照；牙鲆鰓細(xì)胞空白對照；(4)病毒與抗體孵育將抗牙鲆淋巴囊腫病毒的單克隆抗體分別與不同梯度淋巴囊腫病毒液等體積混合，25～37℃孵育1h～2h；(5)接種在狀態(tài)良好的牙鲆鰓細(xì)胞上接種孵育完畢的病毒與單抗的混合液、每個(gè)病毒梯度接種8～10個(gè)孔，每孔接種量25～200μl，25～37℃吸附1h～2h，而后15～25℃，2％CO2培養(yǎng)；(6)結(jié)果判定判定的必要條件為病毒對照組出現(xiàn)由淋巴囊腫病毒引起的典型細(xì)胞病變現(xiàn)象即牙鲆鰓細(xì)胞聚縮、變圓，空泡化嚴(yán)重，細(xì)胞顆粒增多，后期病變細(xì)胞脫壁形成空斑，出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)，而單克隆抗體毒性對照組、牙鲆鰓細(xì)胞空白對照組細(xì)胞飽滿呈梭形，鋪滿培養(yǎng)孔底部，細(xì)胞間無空隙，細(xì)胞狀態(tài)良好；依據(jù)單克隆抗體能否阻止細(xì)胞病變的發(fā)生從抗牙鲆淋巴囊腫病毒單抗庫中篩選出中和單克隆抗體A和中和單克隆抗體B。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明利用對牙鲆淋巴囊腫病毒敏感的牙鲆鰓細(xì)胞系為材料的中和實(shí)驗(yàn)證明單克隆抗體對病毒感染具有明顯的中和作用。細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)是免疫學(xué)和病毒學(xué)中常用的一種抗原抗體反應(yīng)實(shí)驗(yàn)方法，其用以測定抗體中和病毒感染性的生物學(xué)效應(yīng)。細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)具有高度的敏感性和免疫特異性，且結(jié)果穩(wěn)定一致，不存在個(gè)體差異問題，是一種非?？煽俊⒖芍貜?fù)性好的實(shí)驗(yàn)方法。本發(fā)明獲得的具有中和活性的淋巴囊腫病毒單抗A、單抗B，可進(jìn)一步應(yīng)用到淋巴囊腫病毒病的深入研究中，為鑒定淋巴囊腫病毒的保護(hù)性抗原，區(qū)分不同地域、不同宿主的淋巴囊腫病毒，對淋巴囊腫病毒特異性抗原決定簇變異的分析，制備抗獨(dú)特型抗體、利用中和抗體抗原表位合成肽進(jìn)行診斷研究，以及疫苗有效成分的研究、提取純化等提供了最有效的工具，同時(shí)，對淋巴囊腫病毒基因工程疫苗、合成肽疫苗、亞單位疫苗的研制、病毒診斷試劑生產(chǎn)等奠定了理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。


本發(fā)明的實(shí)施例通過

如下圖1為本發(fā)明的工藝流程方框圖；圖2為放大4倍倒置顯微鏡下觀察的牙鲆鰓細(xì)胞的活細(xì)胞形態(tài)；圖3為接種病毒后出現(xiàn)細(xì)胞病變的牙鲆鰓細(xì)胞形態(tài)；圖4為接種病毒與單抗混合液，未出現(xiàn)細(xì)胞病變的牙鲆鰓細(xì)胞形態(tài)。
本發(fā)明的具體實(shí)施例不僅局限本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明研制的一種由兩株雜交瘤細(xì)胞分別分泌的淋巴囊腫病毒的中和單克隆抗體。所述的分泌淋巴囊腫病毒中和單克隆抗體的該兩雜交瘤培養(yǎng)細(xì)胞的名稱分別為小鼠雜交瘤細(xì)胞株LCDV-E1和小鼠雜交瘤細(xì)胞株LCDV-E2，該兩雜交瘤細(xì)胞的保藏號(hào)分別為CCTCC-C200419和CCTCC-C200420，其保藏日期2004年12月14日；其分泌的特異性淋巴囊腫病毒中和單克隆抗體(簡稱中和單抗A和中和單抗B)具有與淋巴囊腫病毒上的粘附蛋白結(jié)合，從而封閉該粘附蛋白，阻斷該病毒的粘附蛋白與該病毒敏感細(xì)胞——牙鲆鰓細(xì)胞的細(xì)胞膜上的該病毒受體結(jié)合，阻止該病毒入侵細(xì)胞的功能；在倒置顯微鏡下觀察，生長狀態(tài)良好的該雜交瘤細(xì)胞分裂旺盛、外觀飽滿、渾圓、折光性強(qiáng)、細(xì)胞大小均一、貼壁良好；該雜交瘤細(xì)胞有無限分裂增生能力；長勢良好的該雜交瘤細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)2-3天，其培養(yǎng)基由桃紅色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，該培養(yǎng)基中含有該雜交瘤細(xì)胞分泌的大量的淋巴囊腫病毒中和單克隆抗體；在中和實(shí)驗(yàn)中，該中和單抗A和中和單抗B中和效果明顯，具有保護(hù)牙鲆鰓細(xì)胞不受淋巴囊腫病毒侵染的特性。
本發(fā)明的淋巴囊腫病毒中和單克隆抗體的制備方法，如本發(fā)明的圖1所示的技術(shù)路線是從以牙鲆淋巴囊腫病毒為抗原開始，采用免疫學(xué)方法建立抗淋巴囊腫病毒的單克隆抗體庫；選擇中和實(shí)驗(yàn)測定方法，從該單克隆抗體庫中檢測篩選出淋巴囊腫病毒的中和單抗A和中和單抗B。
具體實(shí)施例方式
如下一)、研制抗牙鲆淋巴囊腫病毒的單克隆抗體1)病毒提純(1)取患病牙鲆，先用70％酒精棉球消毒患部，再用滅菌手術(shù)刀片切下囊腫，加入石英砂和TNE(50mM Tris，100mM NaCl，1mM EDTA，pH7.4)緩沖液，勻漿；(2)勻漿液離心4℃，500g，20min，取上清；(3)上清液離心4℃，1800g，，20min，取上清；(4)上清液和蔗糖配成30％(W/W)的蔗糖溶液，4℃，78500g離心120min，棄上清；(5)向沉淀中添加TNE至1ml，混勻，將其輕置于蔗糖梯度液(37％、40％、47％、52％、57％、62％)上方，4℃，78500g離心120min；(6)吸出蔗糖梯度中的病毒帶，調(diào)整蛋白含量為1mg/ml，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 2)免疫免疫共分4次進(jìn)行，每次的免疫劑量為0.1ml。
(1)基礎(chǔ)免疫，腹腔注射，提純的病毒與完全福氏佐劑等量(V/V)混勻作為抗原；(2)二兩周后，加強(qiáng)免疫，腹腔注射，提純的病毒與不完全福氏佐劑等量(V/V)混勻作為抗原；(3)三周后，二次加強(qiáng)免疫，尾靜脈注射，提純的病毒作為抗原；(4)融合前三天的擴(kuò)增免疫，尾靜脈注射，提純的病毒作為抗原。
3)細(xì)胞融合(1)脫頸椎處死免疫小鼠，抽血，4℃放置過夜，取血清；無菌取出脾臟和胸腺細(xì)胞后，分別過100目網(wǎng)篩，用RPMI-1640吹打形成單細(xì)胞懸液；(2)分別將脾細(xì)胞懸液和胸腺細(xì)胞懸液200g離心3min，棄去上清液，脾細(xì)胞沉淀用RPMI-1640重懸，胸腺細(xì)胞沉淀用含有1％HAT的選擇性細(xì)胞培養(yǎng)液重懸；(3)取3×107個(gè)處于對數(shù)生長期的P3-X63-Ag8U1骨髓瘤細(xì)胞，200g離心3min，去上清液后，用RPMI-1640重懸；(4)將脾細(xì)胞懸液與瘤細(xì)胞懸液混合均勻后，200g離心3min，吸去上清液，輕彈離心管底，使沉淀充分混勻。吸取預(yù)溫到37℃的PEG液1ml，滴加到離心管內(nèi)；(5)補(bǔ)加RPMI-1640液至40ml，經(jīng)200g離心5min，棄去上清液；(7)細(xì)胞沉淀輕懸于3ml細(xì)胞培養(yǎng)液中，凍存2ml；(8)剩下的細(xì)胞懸液中加入(2)制成的胸腺細(xì)胞懸液，混合均勻后滴加到96孔培養(yǎng)板中，37℃，4.5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，大約兩周后，取上清液檢測4)檢測(1)取新鮮囊腫，切成約3mm見方的小塊，生理鹽水清洗，吸干水分后，用冷凍包埋劑OCT包埋，-20℃放置30min，冰凍切片，切片厚度5μm。丙酮固定20min，室溫干燥，-20℃凍存?zhèn)溆茫?2)分別以免疫小鼠血清和雜交瘤上清為第一抗體，加在切片上；(3)37℃濕盒中孵育45min；(4)取出載玻片，用0.01M PBS洗三次，每次5min；(5)異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG第二抗體，加在切片上；(6)37℃濕盒中避光孵育45min；
(7)取出載玻片，用0.01M PBS洗三次，每次5min；(8)甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，拍照；5)克隆采用有限稀釋法對檢測出的陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆；(1)脫頸椎處死小鼠，無菌取出胸腺，在100目網(wǎng)篩上研磨，用RPMI-1640吹打形成單細(xì)胞懸液；(2)把胸腺細(xì)胞懸液200g離心3min，棄上清液，沉淀用10ml細(xì)胞完全培養(yǎng)液重懸；(3)血球記數(shù)板記數(shù)要克隆的陽性細(xì)胞，用培養(yǎng)液以10倍梯度稀釋，取出100個(gè)陽性雜交瘤細(xì)胞，放入重懸后的胸腺細(xì)胞懸液中；(4)細(xì)胞懸液吹打均勻，滴加到96孔培養(yǎng)板中，每孔100μl；(5)免疫熒光抗體法檢測單克隆細(xì)胞孔上清液，陽性孔細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)。
6)凍存取生長旺盛，形態(tài)良好的待凍存細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，200g離心5min，去上清，加凍存液(含10％DMSO的細(xì)胞培養(yǎng)液)，使最終細(xì)胞密度為5×106個(gè)/ml，將1ml細(xì)胞懸液裝于2ml凍存管中，擰緊螺蓋，然后將凍存管裝入盛有棉花的小盒內(nèi)，放于-80℃超低溫冰箱內(nèi)過夜后，再浸入液氮內(nèi)長期保存。
7)結(jié)果本發(fā)明所得到的長勢良好的陽性雜交瘤細(xì)胞大小均一，渾圓，透亮，分裂旺盛，有無限分裂增生能力；大小均一，渾圓，透亮，分裂旺盛；間接免疫熒光法檢測結(jié)果顯示細(xì)胞質(zhì)邊緣出現(xiàn)散布的塊狀強(qiáng)陽性信號(hào)，陽性信號(hào)呈楔狀、塊狀，或數(shù)個(gè)成鏈圈狀排列，且大多集中在細(xì)胞的邊緣部分。而正常組織中沒有發(fā)現(xiàn)熒光。
二)、敏感細(xì)胞系-牙鲆鰓細(xì)胞系的培養(yǎng)1)液體配制制備細(xì)胞培養(yǎng)液MEM/EBSS一袋(9.5g)溶于1L滅菌三蒸水中，加入NaHCO32.2g，氨芐青霉素1×105IU，鏈霉素1×105μg，調(diào)整pH為7.0-7.4。通過0.22μm微孔濾膜濾菌，分裝，4℃保存。臨用前，加入10％小牛血清(V/V)。
制備細(xì)胞消化液0.25％胰蛋白酶(Trypsin 1∶250)液，無菌PBS(0.01M，pH7.4)緩沖液配制，通過0.22μm微孔濾膜濾菌，分裝，-20℃保存。
制備細(xì)胞清洗液在PBS(0.01M，pH7.4)緩沖液中加入0.02％EDTA，高壓滅菌，室溫保存。
2)牙鲆鰓細(xì)胞培養(yǎng)(1)復(fù)蘇從液氮中取出凍存管，立即投入40-42℃水中快速晃動(dòng)，直至凍存液完全溶解；200g離心5min，棄上清；向沉淀加入培養(yǎng)液1ml，輕輕吹吸均勻；將細(xì)胞懸液移入25cm2培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充培養(yǎng)液4ml，20℃培養(yǎng)。
(2)傳代細(xì)胞長滿底層后，倒掉舊培養(yǎng)液，加3ml細(xì)胞清洗液，除掉上層的死細(xì)胞，倒掉清洗液，然后加0.3ml細(xì)胞消化液，待細(xì)胞收縮變圓，用手輕輕震動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶底部脫落下來，加入新鮮培養(yǎng)液2ml，混勻后，分成兩瓶每瓶各補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)液4ml，20℃培養(yǎng)。
(3)鰓細(xì)胞的形態(tài)特征及生長規(guī)律鰓細(xì)胞為上皮樣細(xì)胞，貼壁分布。細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察呈梭形，形態(tài)飽滿，大小均勻，長軸為30-40μm。鰓細(xì)胞傳代后，前3天為快速增長期，細(xì)胞數(shù)量增加約一倍；細(xì)胞密度達(dá)7-8×105cells/ml后，細(xì)胞生長趨勢減慢，數(shù)量基本不增加。
三)、細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)1)病毒提純(1)取患病牙鲆，先用70％酒精棉球消毒患部，再用滅菌手術(shù)刀片切下囊腫，加入石英砂和TNE(50mM Tris，100mM NaCl，1mM EDTA，pH7.4)緩沖液，勻漿；(2)勻漿液離心4℃，500g，30min，取上清；(3)上清液離心4℃，1800g，，30min，取上清，-80℃保存?zhèn)溆茫?)病毒感染牙鲆鰓細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(1)將生長旺盛的牙鲆鰓細(xì)胞接種到96孔板中，每孔100μl(3-5×105cells/ml)，20℃，2％CO2培養(yǎng)；(2)待細(xì)胞長成單層，用PBS緩沖液清洗1-2遍，每孔加入0.45μm的濾膜過濾的病毒懸液40μl，20℃吸附1h(間或輕輕震蕩)，加維持液(Eagle MEM，2％小牛血清)100μl，20℃，2％CO2培養(yǎng)，每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變情況，拍照。對照組細(xì)胞加入無菌PBS緩沖液40μ；(3)結(jié)果參見圖2——圖4所示；接種病毒后1-2天，單層鰓細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變。病變細(xì)胞聚縮、聚堆、脫壁，隨著病變程度加深，細(xì)胞空泡化并逐漸崩解，形成明顯的空斑；3)細(xì)胞中和試驗(yàn)采用稀釋病毒法；(1)細(xì)胞準(zhǔn)備將生長旺盛的牙鲆鰓細(xì)胞接種到96孔板中，每孔3-5×104cells，20℃，2％CO2培養(yǎng)；(2)病毒準(zhǔn)備將粗提病毒用0.45μm的濾膜過濾，MEM培養(yǎng)液稀釋，設(shè)立七個(gè)連續(xù)梯度，2-1、2-22-3、2-4、2-5、2-6、2-7；(3)對照準(zhǔn)備設(shè)置3組對照病毒對照，每個(gè)濃度病毒液均設(shè)對照；單克隆抗體毒性對照；牙鲆鰓細(xì)胞空白對照；(4)病毒與抗體孵育將抗牙鲆淋巴囊腫病毒的單克隆抗體分別與不同梯度淋巴囊腫病毒液等體積混合，25℃孵育1h(間或輕輕震蕩)；(5)接種當(dāng)96孔細(xì)胞長成單層時(shí)，用PBS緩沖液清洗1～2遍，分別接種已孵育好的病毒與單抗的混合液以及對照組的病毒液、單抗、MEM，每種每個(gè)梯度接種8個(gè)孔，每孔40μl。20℃吸附1h(間或輕輕震蕩)，加維持液(Eagle MEM，2％小牛血清)100μl，20℃，2％CO2培養(yǎng)。
(6)觀察每天在倒置顯微鏡下觀察并記錄接種24h，48h，72h，96h，120h后的細(xì)胞變化，拍照。
(7)結(jié)果連續(xù)觀察5天，接種病毒液的病毒感染陽性對照孔，在48h后出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變效應(yīng)，病變細(xì)胞聚縮、變圓，空泡化嚴(yán)重，細(xì)胞顆粒增多，最后細(xì)胞脫壁形成空斑，出現(xiàn)淋巴囊腫病毒引起的典型細(xì)胞病變效應(yīng)。單克隆抗體毒性對照孔和未接種病毒的鰓細(xì)胞對照孔，細(xì)胞飽滿呈梭形，鋪滿培養(yǎng)孔，細(xì)胞間無空隙。接種單克隆抗體A或單克隆抗體B與病毒混合液孔中的細(xì)胞狀態(tài)良好，根據(jù)Reed——Muench方法計(jì)算半數(shù)感染量分別為病毒感染陽性對照為2-2.9，即該病毒7.5倍稀釋液40μl等于1個(gè)TCID50，單抗A中和后病毒的半數(shù)感染量為2-2，即該病毒4倍稀釋液40μl等于1個(gè)TCID50。單抗B中和后病毒的半數(shù)感染量為2-2.5。即該病毒5.7倍稀釋液40μl等于1個(gè)TCID50。多次中和實(shí)驗(yàn)均測定此2株單克隆抗體具有較好中和活性，能夠抑制接種病毒后細(xì)胞CPE的出現(xiàn)。根據(jù)以上結(jié)果可知，單抗A和單抗B均為具有中和活性的單抗。
本發(fā)明所用儀器及試劑培養(yǎng)基MEM/EBSS(購自Hyclone公司)；小牛血清(購自Hyclone公司)；胰蛋白酶Trypsin 1∶250(購自Amersco公司)；二甲亞砜(DMSO)(購自Sigma公司)；冰凍切片機(jī)(購自Leica公司)；熒光顯微鏡(購自O(shè)lympus公司)；倒置相差顯微鏡(購自O(shè)lympus公司)；1640(購自Gibco公司)；胎牛血清(購自Hyclone公司)；HAT(購自Gibco公司)；異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗小鼠抗體(購自Sigma公司)。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會(huì)理解，在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，對于上述實(shí)施例進(jìn)行修改，添加和替換都是可能的，其都沒有超出本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種由兩株雜交瘤細(xì)胞分別分泌的淋巴囊腫病毒的中和單克隆抗體，其特征在于分泌淋巴囊腫病毒中和單克隆抗體的該兩雜交瘤培養(yǎng)細(xì)胞的名稱分別為小鼠雜交瘤細(xì)胞株LCDV-E1和小鼠雜交瘤細(xì)胞株LCDV-E2，該兩雜交瘤細(xì)胞的保藏號(hào)分別為CCTCC-C200419和CCTCC-C200420，其保藏日期2004年12月14日；其分泌的特異性淋巴囊腫病毒中和單克隆抗體(簡稱中和單抗A和中和單抗B)具有與淋巴囊腫病毒上的粘附蛋白結(jié)合，從而封閉該粘附蛋白，阻斷該病毒的粘附蛋白與該病毒敏感細(xì)胞——牙鲆鰓細(xì)胞的細(xì)胞膜上的該病毒受體結(jié)合，阻止該病毒入侵細(xì)胞的功能；在倒置顯微鏡下觀察，生長狀態(tài)良好的該雜交瘤細(xì)胞分裂旺盛、外觀飽滿、渾圓、折光性強(qiáng)、細(xì)胞大小均一、貼壁良好；該雜交瘤細(xì)胞有無限分裂增生能力；長勢良好的該雜交瘤細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)2-3天，其培養(yǎng)基由桃紅色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，該培養(yǎng)基中含有該雜交瘤細(xì)胞分泌的大量的淋巴囊腫病毒中和單克隆抗體；在中和實(shí)驗(yàn)中，該中和單抗A和中和單抗B中和效果明顯，具有保護(hù)牙鲆鰓細(xì)胞不受淋巴囊腫病毒侵染特性。
2.一種由權(quán)利要求1所述淋巴囊腫病毒中和單克隆抗體的制備方法，其制備技術(shù)路線是從以牙鲆淋巴囊腫病毒為抗原開始，采用免疫學(xué)方法建立抗淋巴囊腫病毒的單克隆抗體庫；其特征在于選擇中和實(shí)驗(yàn)測定方法，從該單克隆抗體庫中檢測篩選出淋巴囊腫病毒的中和單抗A和中和單抗B。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述淋巴囊腫病毒中和單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的中和實(shí)驗(yàn)測定方法是對牙鲆淋巴囊腫病毒敏感的牙鲆鰓細(xì)胞系為材料的中和實(shí)驗(yàn)，采用稀釋病毒法，即首先，不同稀釋度的淋巴囊腫病毒分別與該病毒單抗庫中的單抗等體積孵育；其次再將病毒——抗體混合物接種于牙鲆鰓細(xì)胞，待已接種的牙鲆鰓細(xì)胞充分出現(xiàn)感染效應(yīng)，即參照對照培養(yǎng)的牙鲆鰓細(xì)胞在感染后的病變和死亡情況，依據(jù)單克隆抗體能否阻止細(xì)胞病變的發(fā)生，確定具有中和活性的單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述淋巴囊腫病毒中和單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的中和實(shí)驗(yàn)測定方法的具體步驟是(1)細(xì)胞準(zhǔn)備將生長旺盛的牙鲆鰓細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔3～5×104個(gè)，15～25℃，2％CO2培養(yǎng)；(2)病毒準(zhǔn)備將病毒懸液用孔徑為0.45μm的濾膜過濾，MEM培養(yǎng)液2倍或10倍連續(xù)稀釋，設(shè)立七個(gè)連續(xù)梯度；(3)對照準(zhǔn)備設(shè)置3組對照病毒對照，單克隆抗體毒性對照；牙鲆鰓細(xì)胞空白對照；(4)病毒與抗體孵育將抗牙鲆淋巴囊腫病毒的單克隆抗體分別與不同梯度淋巴囊腫病毒液等體積混合，25～37℃孵育1h～2h；(5)接種在狀態(tài)良好的牙鲆鰓細(xì)胞上接種孵育完畢的病毒與單抗的混合液、每個(gè)病毒梯度接種8～10個(gè)孔，每孔接種量25～200μl，25～37℃吸附1h～2h，而后15～25℃，2％CO2培養(yǎng)；(6)結(jié)果判定判定的必要條件為病毒對照組出現(xiàn)由淋巴囊腫病毒引起的典型細(xì)胞病變現(xiàn)象即牙鲆鰓細(xì)胞聚縮、變圓，空泡化嚴(yán)重，細(xì)胞顆粒增多，后期病變細(xì)胞脫壁形成空斑，出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)，而單克隆抗體毒性對照組、牙鲆鰓細(xì)胞空白對照組細(xì)胞飽滿呈梭形，鋪滿培養(yǎng)孔底部，細(xì)胞間無空隙，細(xì)胞狀態(tài)良好；依據(jù)單克隆抗體能否阻止細(xì)胞病變的發(fā)生從抗牙鲆淋巴囊腫病毒單抗庫中篩選出中和單克隆抗體A和中和單克隆抗體B。
全文摘要
本發(fā)明是由兩株雜交瘤細(xì)胞分別分泌的淋巴囊腫病毒的中和單克隆抗體A和B，該兩株雜交瘤培養(yǎng)細(xì)胞的名稱分別為小鼠雜交瘤細(xì)胞株LCDV－E1和小鼠雜交瘤細(xì)胞株LCDV－E2，該兩雜交瘤細(xì)胞的保藏號(hào)分別為CCTCC－C200419和CCTCC－C200420，該中和單抗A和B具有與淋巴囊腫病毒上的粘附蛋白結(jié)合，從而封閉該粘附蛋白，阻斷該病毒的粘附蛋白與該病毒敏感細(xì)胞——牙鲆鰓細(xì)胞的細(xì)胞膜上的該病毒受體結(jié)合，阻止該病毒入侵細(xì)胞的功能；該單抗制備是以提純淋巴囊腫病毒為抗原，經(jīng)免疫學(xué)方法，建立抗淋巴囊腫病毒的單克隆抗體庫，再應(yīng)用中和實(shí)驗(yàn)測定方法篩選出中和單抗A和B。該兩中和單抗對淋巴囊腫病毒病的診斷與治療具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)G01N33/569GK1683411SQ200510042128
公開日2005年10月19日 申請日期2005年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月7日
發(fā)明者戰(zhàn)文斌, 刁菁, 程順峰 申請人:中國海洋大學(xué)