專利名稱：一種生產(chǎn)高密度硅酸鹽細菌菌劑的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地講，涉及一種微生物肥料(生物鉀肥)菌劑及其生產(chǎn)方法，該種微生物為膠質(zhì)芽孢桿菌(Bacillusmucilaginosus)。通過本發(fā)明所采用的固體發(fā)酵方法生產(chǎn)出高密度的膠質(zhì)芽孢桿菌菌劑。(生物鉀肥)做為生物肥料用于促進各種農(nóng)作物及樹木，草坪的生長。
背景技術(shù)：
膠質(zhì)芽孢桿菌菌劑(生物鉀肥)在我國是生產(chǎn)時間最長，生產(chǎn)企業(yè)最多，應(yīng)用面積最大的微生物肥料產(chǎn)品。目前國內(nèi)約有300家以上的企業(yè)生產(chǎn)硅酸鹽細菌菌劑，有的專業(yè)生產(chǎn)廠家已達到年產(chǎn)10000噸以上的規(guī)模。但由于一直采用傳統(tǒng)工藝，產(chǎn)品質(zhì)量存在嚴重問題，成為限制企業(yè)發(fā)展的極大障礙。產(chǎn)品質(zhì)量的核心問題是二個，一是有效菌數(shù)太少，農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY227-94規(guī)定固體膠質(zhì)芽孢桿菌菌劑含2億活菌/克。但目前大多數(shù)企業(yè)生產(chǎn)的膠質(zhì)芽孢桿菌細菌菌劑達不到這一標(biāo)準(zhǔn)；二是雜菌嚴重超標(biāo)。其主要原因是生產(chǎn)過程還沒有解決有效控制雜菌污染的辦法。由于產(chǎn)品質(zhì)量低劣，嚴重影響田間的使用效果和產(chǎn)品的信譽，制約了產(chǎn)品的推廣應(yīng)用。
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一種提高有效活菌數(shù)、控制雜菌污染生產(chǎn)高密度微生物菌劑的方法。該方法適用于一般的好氧微生物菌劑的制備。尤其適用于膠質(zhì)芽孢桿菌作為菌種的生物鉀肥的生產(chǎn)。該工藝的具體措施包括采用膠質(zhì)芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus K401)作為菌劑的生產(chǎn)菌種(或購自中國科學(xué)院微生物研究所的膠質(zhì)芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus)CGMCC，1.153 1.231 1.232和1.910等菌株)；將傳統(tǒng)的大罐液體發(fā)酵生產(chǎn)工藝改為草炭分袋滅菌(采用60Co輻射滅菌，輻射劑量40-60KGY或121℃高壓蒸汽滅菌60-120分鐘的分袋滅菌方法)、分袋固體發(fā)酵的工藝；提高發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源、氮源的濃度以滿足菌體快速生長的需要，添加(NH4)2SO4大大地降低了發(fā)酵液的黏度利于菌體的生長。以上具體措施，有效地避免了傳統(tǒng)工藝中發(fā)酵液吸附、混合及稱重、分裝等過程造成的二次污染。極大地降低了產(chǎn)品的雜菌率，而且避免了混合過程中草炭粉對環(huán)境的污染，改善了工人的工作環(huán)境。本發(fā)明中提供的生產(chǎn)工藝有效地解決了目前生產(chǎn)中存在的關(guān)鍵問題，使產(chǎn)品中活菌數(shù)比傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品提高了1000倍以上(2000-3500億活菌/克)。因此，可以通過對2000-3500億活菌/克進行稀釋，大規(guī)模地生產(chǎn)直接提供可以使用的產(chǎn)品。本發(fā)明提供的生產(chǎn)工藝至今未見有報道，適于在生物菌劑的工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用。
具體實施例方式
通過以下實施對本發(fā)明予以進一步地說明，但并非對本發(fā)明技術(shù)的限定。
1.菌種膠質(zhì)芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus)K401 CGMCC 1.1531.231 1.232 1.910購自中國科學(xué)院微生物研究所2.草炭載體的準(zhǔn)備和滅菌將草炭粉與3-10％CaCO3混合后，分裝于塑料袋中，每袋100-1000克左右?？筛鶕?jù)條件選以下一種滅菌工藝進行滅菌。
1)60Co輻射滅菌，輻射劑量40-60KGY。
2)121℃高壓蒸汽滅菌60-120分鐘。
如采用蒸汽滅菌工藝應(yīng)先將固體發(fā)酵液預(yù)先與草炭粉拌勻。
3.液體發(fā)酵1)搖瓶和鈄面培養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)基 (g/L)蔗糖或葡萄糖10-20K2HPO40.2-0.5MgSO40.2
NaCl 0.2CaCO35.0酵母粉 0.2-2.0H2O 1L瓊脂粉 15(斜面培養(yǎng)基)將平皿劃線分離純化的菌種，接種于三角瓶培養(yǎng)基中，在搖床上以150-200轉(zhuǎn)/分，28-37℃培養(yǎng)20-24小時，即得到搖瓶種子。
2)種子罐培養(yǎng)種子罐培養(yǎng)基(g/L)蔗糖或葡萄糖 10-20K2HPO40.2-0.5MgSO40.2NaCl 0.2(NH4)2SO41.0-3.0CaCO35.0酵母粉 0.5-2.0H2O 1LPH 7.0-8.0將搖瓶種子以5-10％比例接入種子罐(無菌操作)轉(zhuǎn)速200 300轉(zhuǎn)/分，溫度28-37℃，通氣量1∶0.3-0.5，培養(yǎng)20-24小時。
3)固體發(fā)酵固體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)蔗糖或葡萄糖 1.0-5.0淀粉或玉米粉 10-25(NH4)2SO42.0-5.0K2HPO42.0-5.0FeCl310mg-20mg酵母粉 1.0-3.0
MgSO40.5-1.0H2O 1LPH 7.0-8.0固體基質(zhì)草炭粉，碳酸鈣固體發(fā)酵工藝將培養(yǎng)20-24小時的種子以5-10％的接種量接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，混合均勻后再以30-40％比例與塑料袋內(nèi)的草炭混合均勻。
將菌劑置于28-37℃培養(yǎng)。一般3-7天即可完成固體發(fā)酵得到高密度膠質(zhì)芽孢桿菌菌劑。
實例1步驟一載體的制備及滅菌。將草炭粉曬干，加3-10％CaCO3混勻后分裝于塑料袋中，然后用40-60KGY60Co輻射滅菌。
步驟二接種。將培養(yǎng)20-24小時的種子以5-10％比例加入無固體基質(zhì)的發(fā)酵培養(yǎng)基于發(fā)酵罐中，充分混勻后，以30％-40％比例與塑料袋內(nèi)已滅菌的草炭粉混勻。
步驟三培養(yǎng)。將接種后的草炭粉放置于28-37℃培養(yǎng)室培養(yǎng)，5-7天即可得到每克含2000-3500億活菌的高密度膠質(zhì)芽孢桿菌菌劑。
實例2步驟一載體滅菌。按實例1將3-10％CaCO3與草炭粉混勻后分裝于塑料袋中，將固體發(fā)酵培養(yǎng)基(液體)與草炭粉以3∶7的比例混合，121℃滅菌60-120分鐘。
步驟二接種。以5-10％的比例將培養(yǎng)了20-24小時的種子與塑料袋內(nèi)已滅菌的草炭粉混勻。
步驟三培養(yǎng)。將接種后的草炭放置于28-37℃培養(yǎng)，5-7天即得到每克含2000-3500億/克的高密度膠質(zhì)芽孢桿菌細菌菌劑成品。
實例3通過稀釋的方法大規(guī)模制備固體菌劑步驟一種子的稀釋。用每克含2000億-3500億活菌數(shù)的固體發(fā)酵草炭菌劑作為種子，以1∶100-300的比例用0.02-0.1molL-1磷酸緩沖液洗脫，然后再與等體積的固體發(fā)酵培養(yǎng)液混合。
步驟二吸附及混合。將步驟一制備的稀釋液以30-40％比例吸附到60Co滅菌的草炭中?；靹蚝蠹纯傻玫交罹鷶?shù)10億/克左右的固體菌劑?？芍苯庸┙o客戶使用。
實例4按本發(fā)明制備的膠質(zhì)芽孢桿菌菌劑進行田間接種試驗。結(jié)果表明，在山東沂水縣對蘿卜增產(chǎn)幅度為19.7％-24.6％，在安丘縣的花生增產(chǎn)幅度為8.5％-24.6％。
權(quán)利要求
1.一種利用膠質(zhì)芽孢桿菌生產(chǎn)微生物菌劑的方法，該方法涉及膠質(zhì)芽孢桿菌是在含有草炭、CaCO3的高濃度碳源、氮源的固體培養(yǎng)基上進行分袋固體發(fā)酵培養(yǎng)；種子罐培養(yǎng)中添加(NH4)2SO4；固體發(fā)酵培養(yǎng)基分袋后采用60Co輻射或高壓蒸汽滅菌、以及分袋接種的固體發(fā)酵的工藝。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的種子罐培養(yǎng)中添加(NH4)2SO4的量為1.0-3.0g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的含有草炭、CaCO3的高濃度碳源、氮源固體發(fā)酵培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的組成如下(g/L)蔗糖或葡萄糖1.0-5.0、淀粉或玉米粉10-25、(NH4)2SO42.0-5.0、K2HPO42.0-5.0、FeCl310mg-20mg、酵母粉1.0-3.0、MgSO40.5-1.0、H2O1L、PH7.0-8.0，固體基質(zhì)為草炭粉，3-10％碳酸鈣。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)基分袋后通過60Co輻射或高壓蒸汽滅菌。當(dāng)采用60Co輻射滅菌時，輻射劑量40-60KGY，或采用121℃高壓蒸汽滅菌時間為60-120分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，分袋固體發(fā)酵的工藝是將草炭粉與3-10％CaCO3混合后，分裝于塑料袋，每袋固體基質(zhì)為100-1000克左右滅菌；培養(yǎng)20-24小時的種子以5-10％的接種量接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，混合均勻后再以30-40％比例與塑料袋內(nèi)的固體基質(zhì)混合均勻。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，分袋固體發(fā)酵的工藝是接種后放置在28-37℃培養(yǎng)室培養(yǎng)，5-7天即可得到每克含2000-3500億/克的高密度膠質(zhì)芽孢桿菌菌劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，得到每克含2000-3500億/克的高密度膠質(zhì)芽孢桿菌菌劑，通過稀釋的方法大規(guī)模生產(chǎn)直接提供使用的產(chǎn)品。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或/和2或/和3或/和4或/和5所述的方法，在生物菌劑的工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，利用膠質(zhì)芽孢桿菌在生產(chǎn)生物鉀肥中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種高密度硅酸鹽細菌菌劑及其生產(chǎn)方法，該種微生物為膠質(zhì)芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus)。通過固體發(fā)酵方法生產(chǎn)出高密度的膠質(zhì)芽孢桿菌菌劑。使產(chǎn)品中活菌數(shù)比傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品提高了1000倍以上(2000－3500億活菌/克)。生物鉀肥做為生物肥料用于促進各種農(nóng)作物及樹木，草坪的生長。
文檔編號C12M1/12GK1504563SQ0215296
公開日2004年6月16日 申請日期2002年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月29日
發(fā)明者李永興, 李久蒂 申請人:中國科學(xué)院植物研究所