專(zhuān)利名稱：酶電極及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶電極及其制造方法；具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及一種利用酶反應(yīng)對(duì)溶液中的一種特定化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行電化學(xué)測(cè)量的酶電極以及一種利用該酶電極的生物傳感器。
背景技術(shù)：
一種使用酶反應(yīng)和電化學(xué)反應(yīng)相結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于測(cè)量包含在來(lái)自生物體等的樣品中的各種成分。例如，在下面的情況中，生物傳感器已經(jīng)是很常用的了利用酶的催化作用，將溶液中的一種化學(xué)物質(zhì)定量轉(zhuǎn)化為酶反應(yīng)的產(chǎn)物和過(guò)氧化氫，然后通過(guò)一個(gè)氧化還原反應(yīng)檢測(cè)產(chǎn)生的過(guò)氧化氫。例如，在一個(gè)葡萄糖生物傳感器中，葡萄糖被葡萄糖氧化酶(GOX)氧化生成葡糖酸內(nèi)酯和過(guò)氧化氫。因?yàn)橛纱水a(chǎn)生的過(guò)氧化氫的量與葡萄糖的水平成正比，因此通過(guò)測(cè)量生成的過(guò)氧化氫的量可以對(duì)樣品中的葡萄糖水平進(jìn)行定量。一般來(lái)說(shuō)，酶的催化作用提供的反應(yīng)產(chǎn)物的量與底物濃度成正比，但是要保持這樣的比例關(guān)系對(duì)底物的濃度有限制。因此，為了測(cè)定上限以上的高濃度的底物，生物傳感器具有滲透限制功能以減少能夠到達(dá)酶的底物的量。例如，在用于生物傳感器的酶電極中的固定化酶層上覆蓋一個(gè)滲透限制層，這樣的方法已被常規(guī)使用。
為了解決常規(guī)技術(shù)中存在的上面提到的問(wèn)題，我們成功地開(kāi)發(fā)了一種優(yōu)良的滲透限制層，其中使用了一種薄膜，其主要成分包括一種含氟的聚合物，在其結(jié)構(gòu)中有一個(gè)其中含有至少一個(gè)氟亞烷基嵌段的側(cè)基被結(jié)合到一種未氟化的基于乙烯基的聚合物上，而不是結(jié)合到由具有高氟含量的聚合物組成的薄膜如Teflon上，我們已將其申請(qǐng)了專(zhuān)利(日本公開(kāi)專(zhuān)利申請(qǐng)No.2000-81409)。在日本公開(kāi)專(zhuān)利申請(qǐng)No.2000-81409中公開(kāi)的酶電極具有一個(gè)以包含這種特殊結(jié)構(gòu)的聚合物作為主要成分的薄膜所構(gòu)成的滲透限制層，從而使其可以在廣泛的應(yīng)用條件下進(jìn)行測(cè)量，并且表現(xiàn)出良好的耐久性，可以長(zhǎng)期使用。
具有滲透限制層的生物傳感器的另一個(gè)例子是美國(guó)專(zhuān)利5696314所公開(kāi)的酶電極，它在固定化酶層上具有一個(gè)含有Teflon微粒等的多孔的滲透限制層。在圖5所示的酶電極中，在底物30上是一個(gè)由鉑等制成的電極31，在其上是一個(gè)固定化酶層32。然后，在固定化酶層32上，通過(guò)一個(gè)附著層33而形成了一個(gè)聚合物層34，其中含有與包含在固定化酶層32中同樣的酶。另外，在聚合物層34之上是一個(gè)滲透限制層35、一個(gè)附著層38和一個(gè)保護(hù)層37。滲透限制層35是一個(gè)多孔的薄膜，其由基本成分例如聚合物微粒、金屬微粒和聚合物粘合物所組成。其中公開(kāi)的一個(gè)實(shí)施例中使用了Teflon(聚四氟乙烯)作為聚合物微粒和聚合物粘合物的原料。滲透限制層35通過(guò)絲網(wǎng)印刷法形成。具體而言，Teflon粘合物首先被溶解在一種含氟的溶劑中，然后將該溶液與鋁和Teflon微粒的混合物捏和(輥軋)而制成墨水。然后將制得的墨水絲網(wǎng)印刷(模板印刷)到聚合物層34上形成滲透限制層35。
然而，使用Teflon制成的這種滲透限制層缺乏足夠的撓性，因此當(dāng)相鄰的層膨脹時(shí)，它不能完全根據(jù)膨脹而變形。因此，在使用酶電極時(shí)一個(gè)需要解決的問(wèn)題是滲透限制層傾向于從臨近的層如固定化酶層上分離。一旦發(fā)生分離，在酶電極中的滲透限制層和一個(gè)諸如固定化酶層的層表面之間將產(chǎn)生一定的縫隙，這在隨后會(huì)產(chǎn)生問(wèn)題，縫隙使精確的測(cè)量難以進(jìn)行，或者需要較長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)除去吸入縫隙中的液體，從而導(dǎo)致再次測(cè)量時(shí)的調(diào)試時(shí)間延長(zhǎng)。
當(dāng)使用如上述專(zhuān)利公報(bào)中描述的Teflon粘合物這樣的高氟含量的聚合物粘合物時(shí)，它在溶劑中的溶解度不夠，從而不能制備含有受控粘度的溶液。因此，不能通過(guò)例如旋涂那樣的方法制成涂層，也因此難以制備厚度較薄的滲透限制層。此外，使用由高氟含量的聚合物組成的薄膜制成的滲透限制層為了表現(xiàn)出可控的滲透性，必會(huì)是一個(gè)多孔的薄膜，因此它的厚度需要保持稍厚一些。上述的專(zhuān)利公報(bào)中描述了滲透限制層35在優(yōu)選情況下厚度為10到40μm。如上所述，這造成了一個(gè)問(wèn)題，滲透限制層的厚度必須被制厚，而這造成了較低的響應(yīng)速度，以及花較長(zhǎng)的時(shí)間在測(cè)量后除去吸入滲透限制層的液體。
此外，如上所述，由高氟含量的聚合物如Teflon組成的薄膜缺乏撓性，使得滲透限制層由于與其相鄰的層的膨脹而傾向于破裂。從這一方面說(shuō)，它留下了改進(jìn)的空間。特別是在滲透限制層與能夠很容易地膨脹的固定化酶層相鄰放置的情況下，這個(gè)問(wèn)題可能相當(dāng)嚴(yán)重。
在上述專(zhuān)利公報(bào)中描述的酶電極中使用的這種由高氟含量的聚合物薄膜形成的滲透限制層可能無(wú)法表現(xiàn)出足夠的強(qiáng)度，以及與相鄰的層如固定化酶層的附著性。此外，由高氟含量的聚合物薄膜形成的滲透限制層缺乏撓性，因此當(dāng)相鄰的層膨脹時(shí)，它不能完全根據(jù)膨脹而變形。結(jié)果，在使用酶電極時(shí)會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題，滲透限制層傾向于從臨近的層如固定化酶層上分離。一旦發(fā)生分離，在酶電極中的滲透限制層和一個(gè)層諸如固定化酶層的層表面之間將產(chǎn)生一定的縫隙，這在隨后會(huì)產(chǎn)生問(wèn)題，即縫隙(1)使精確的測(cè)量難以進(jìn)行，或者(2)可能需要較長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)除去吸入酶電極中的液體，從而導(dǎo)致再次測(cè)量時(shí)的調(diào)試時(shí)間延長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
我們對(duì)大規(guī)模生產(chǎn)具有日本公開(kāi)專(zhuān)利申請(qǐng)No.2000-81409中所公開(kāi)的結(jié)構(gòu)的酶電極進(jìn)行了深入的研究，最終發(fā)現(xiàn)在0.01到1μm的范圍內(nèi)選擇滲透限制層的厚度能夠提高滲透限制層與下層(例如固定化酶層)的附著性，諸如此的方法可用于以較高的產(chǎn)率生產(chǎn)符合所需性能要求的酶電極。因?yàn)榫哂腥毡竟_(kāi)專(zhuān)利申請(qǐng)No.2000-81409中所公開(kāi)的結(jié)構(gòu)的酶電極含有前述的滲透限制層，它使用了主要成分為具有特殊結(jié)構(gòu)的含氟聚合物的薄膜，因此它與下層所顯現(xiàn)的附著性大大高于由具有高氟含量聚合物如Teflon的薄膜組成的滲透限制層，在后者中Teflon微粒等被混合在一起。但是，利用一種能夠同時(shí)在一種基材上大批量地生產(chǎn)酶電極的方法，在將此法用于晶片上大量生產(chǎn)多種酶電極的方法中，在滲透限制層及其下層(例如固定化酶層)之間需要更強(qiáng)的附著性。在對(duì)一個(gè)在其表面含有固定化酶層和滲透限制層的多層薄膜的晶片進(jìn)行加工時(shí)，例如從其上形成了多層薄膜的晶片上切下單個(gè)芯片以及將芯片分別固定在一處或另一處時(shí)，該多層薄膜會(huì)受到巨大的機(jī)械負(fù)載。因此，薄膜期望具有一種附著性良好的分層結(jié)構(gòu)，通過(guò)該結(jié)構(gòu)使它能夠經(jīng)受負(fù)載和足夠的變形。
根據(jù)日本公開(kāi)專(zhuān)利申請(qǐng)No.2000-81409所描述的生產(chǎn)方法，制造出的酶電極在長(zhǎng)期使用中表現(xiàn)出優(yōu)異的測(cè)量穩(wěn)定性和良好的重現(xiàn)性，只要這種酶電極是在單個(gè)芯片加工的規(guī)模上生產(chǎn)的。但是，在單一基材上同時(shí)生產(chǎn)大量的酶電極的方法，即所謂的晶片方法中，與使用各個(gè)芯片生產(chǎn)酶電極的方法相比，酶電極的性能波動(dòng)趨于增加。在所謂的晶片方法中，為了以較高的產(chǎn)率大量生產(chǎn)具有所需性能的酶電極，根據(jù)除了組成層的薄膜材料以外的其它因素研究滲透限制層可能是重要的。
為了解決上述的在大規(guī)模生產(chǎn)中的一些問(wèn)題，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種酶電極，它可以在廣泛的應(yīng)用條件下使用，在長(zhǎng)期使用中表現(xiàn)出良好的耐久性，并具有較高的生產(chǎn)率。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種酶電極，由于其結(jié)構(gòu)，即使使用大規(guī)模生產(chǎn)方法(晶片方法)，也可以始終如一地獲得所需的性能。
我們已經(jīng)深入地研究了一種酶電極結(jié)構(gòu)，其更適合于在晶片方法中以高產(chǎn)率大量生產(chǎn)酶電極，同時(shí)還保留了由于使用了日本公開(kāi)專(zhuān)利申請(qǐng)No.2000-81409所公開(kāi)的薄膜而使?jié)B透限制層獲得良好的性質(zhì)，這種薄膜含有的主要成分是含氟的聚合物，在其結(jié)構(gòu)中有一個(gè)其中含有至少一個(gè)氟亞烷基嵌段的側(cè)基被結(jié)合到一種未氟化的基于乙烯基的聚合物上，同時(shí)我們也研究了生產(chǎn)這種酶電極的方法。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在固定化酶層上形成由含有以具有特殊結(jié)構(gòu)的聚合物為主要成分的前述薄膜所構(gòu)成的滲透限制層時(shí)，通過(guò)選擇下述的電極結(jié)構(gòu)可以解決上面的問(wèn)題，從而完成了本發(fā)明。
根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種酶電極，其電極結(jié)構(gòu)中位于固定化酶層和滲透限制層之間是一個(gè)附著層，其中含有含硅烷的化合物。因此，根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，酶電極包括在絕緣基材上形成的電極部分、在電極部分上形成的固定化酶層、在固定化酶層上方形成的含有含硅烷化合物的附著層、以及在附著層上形成的滲透限制層，所述滲透限制層含有一種含氟的聚合物，在其結(jié)構(gòu)中有一個(gè)其中含有至少一個(gè)氟亞烷基嵌段的側(cè)基被結(jié)合到一種未氟化的基于乙烯基的聚合物上。本發(fā)明的第一個(gè)方面還提供了一種使用根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面的酶電極的生物傳感器。換句話說(shuō)，根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面的生物傳感器含有一個(gè)具有上述定義的結(jié)構(gòu)的酶電極。
根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面的酶電極包含了覆蓋在固定化酶層上的含有含硅烷化合物的附著層，以及與附著層的上表面接觸而形成的滲透限制層，滲透限制層由含有含氟聚合物的薄膜構(gòu)成，在所述聚合物的結(jié)構(gòu)中有一個(gè)其中含有至少一個(gè)氟亞烷基嵌段的側(cè)基被結(jié)合到一種未氟化的基于乙烯基的聚合物上。將由特殊結(jié)構(gòu)的含氟聚合物構(gòu)成的薄膜與附著層結(jié)合使用，可以極大地改善滲透限制層與其下層(例如固定化酶層)之間的附著性，產(chǎn)生具有良好的生產(chǎn)穩(wěn)定性的高性能酶電極。當(dāng)用于形成滲透限制層的含氟聚合物是前面提到的具有特殊結(jié)構(gòu)的含氟聚合物時(shí)，從附著層獲得的對(duì)附著性的改善尤其顯著。盡管對(duì)于通過(guò)含有所述含硅烷化合物的附著層對(duì)附著性改善的原因或機(jī)制尚未清楚地了解，但可以假設(shè)在固定化酶層上形成附著層可能引起了對(duì)其下層的表面的修飾，從而改善了用于形成滲透限制層的具有特殊結(jié)構(gòu)的含氟聚合物中的潤(rùn)濕性。例如，當(dāng)附著層由硅烷偶合劑制成時(shí)，硅烷偶合劑覆蓋了下層的表面，導(dǎo)致了較低的表面張力，增加了表面的親水性，這被認(rèn)為能改善具有特殊結(jié)構(gòu)的含氟聚合物中的潤(rùn)濕性。
使用附著層帶來(lái)的附著性改善效應(yīng)是由這種組成滲透限制層的具有特殊結(jié)構(gòu)的聚合物材料和形成附著層的含硅烷化合物的協(xié)同效應(yīng)而產(chǎn)生的。因此，當(dāng)使用在主要骨架中含有大量氟原子的聚合物如Teflon來(lái)作為組成滲透限制層的聚合物材料時(shí)，就不能完全達(dá)到由于使用該附著層而帶來(lái)的這種附著性改善效果。
在本發(fā)明的第一個(gè)方面中，提供了下述的方法來(lái)生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面的酶電極。具體來(lái)說(shuō)，生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面的酶電極的方法包括下面的步驟在一個(gè)絕緣基材的主表面形成一個(gè)電極膜，然后使電極膜成型形成電極的多個(gè)部分；將含酶的液體加到絕緣基材的主表面上，然后將絕緣基材干燥以在其上形成一個(gè)固定化酶層；在絕緣基材的主表面上形成一個(gè)含有含硅烷化合物的附著層；將含有含氟聚合物的液體加到絕緣基材的主表面上，在所述聚合物結(jié)構(gòu)中有一個(gè)其中含有至少一個(gè)氟亞烷基嵌段的側(cè)基被結(jié)合到一種未氟化的基于乙烯基的聚合物上，然后將絕緣基材干燥以形成滲透限制層；以及將絕緣基材切成小塊以產(chǎn)生多個(gè)酶電極。
根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面的酶電極的生產(chǎn)方法僅僅是一種在單個(gè)基材上生產(chǎn)多個(gè)酶電極的方法。按慣例，在用于生產(chǎn)酶電極的方法中，滲透限制層等是在預(yù)先已經(jīng)被切成單一芯片的基材上形成的。參考

圖19和20可以解釋這種常規(guī)的方法。首先，電極的多個(gè)部分在基材上形成，然后將基材切成芯片(圖19a)。例如，在旋轉(zhuǎn)器表面上使用一個(gè)雙面膠帶(圖19b)，將帶有形成的電極部分的基材芯片放置在一個(gè)撓性基座上，該基座通過(guò)雙面膠帶與旋轉(zhuǎn)器粘附在一起(圖19c)。將配制好的溶液滴加在電極部分上(圖20d)，然后以給定的速度旋轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)器(圖20e)。得到的酶電極儲(chǔ)存在40℃的含氮?dú)獾牡獨(dú)庀渲?圖20f)。在這種生產(chǎn)方法中，每個(gè)芯片都使用了形成這樣一種作為滲透限制層的層的步驟，因此對(duì)推進(jìn)大量生產(chǎn)計(jì)劃所要求的生產(chǎn)效率的提高有所限制。與此相反，本發(fā)明的第一個(gè)方面使用的方法包括下面的步驟在一個(gè)基材上形成多個(gè)酶電極，然后將基材切成酶電極芯片，并且使用具有滲透限制層的酶電極結(jié)構(gòu)作為一種手段以確保使用該生產(chǎn)方法制造的酶電極具有良好的生產(chǎn)穩(wěn)定性，在這種滲透限制層中含有具有特殊結(jié)構(gòu)的含氟聚合物。這種具有特殊結(jié)構(gòu)的含氟聚合物非常適用于下層，可以制備成溶液或具有相對(duì)較低的粘度的分散體。利用這種性質(zhì)，例如可以在基材的整個(gè)表面上通過(guò)具有更高重現(xiàn)性的旋涂方法來(lái)生成一個(gè)均一的層，從而可以在基材上適當(dāng)?shù)厣啥鄠€(gè)酶電極。
在這種根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面生產(chǎn)酶電極的方法中，如果以下述方式實(shí)施方法，即在形成固定化酶層步驟之后，進(jìn)行將含有含硅烷化合物的液體加到絕緣基材的主表面上，然后將絕緣基材干燥以形成附著層的步驟，接著再進(jìn)行將含氟聚合物加到覆蓋著絕緣基材主表面的附著層的上表面上以及將絕緣基材干燥以形成滲透限制層的步驟，那么滲透限制層和下面的附著層之間的附著性會(huì)得到更好的改善，從而產(chǎn)生良好的生產(chǎn)穩(wěn)定性。如上所述，這種良好的附著性是由組成滲透限制層的具有特殊結(jié)構(gòu)的含氟聚合物材料和含有含硅烷化合物的附著層的協(xié)同效應(yīng)而產(chǎn)生的。
在常規(guī)的生產(chǎn)方法中，在切割基材以提供多個(gè)酶電極的步驟或通過(guò)結(jié)合到酶電極上形成相互連接的步驟中，其中負(fù)載的機(jī)械應(yīng)力有時(shí)可以使?jié)B透限制層和下層之間分離，或者可能導(dǎo)致這些層的損壞。在上面提到的根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面的酶電極的生產(chǎn)方法中，當(dāng)在形成滲透限制層步驟之前方法中包含了使用含硅烷化合物形成附著層的步驟時(shí)，在生產(chǎn)過(guò)程中可以有效地防止這樣的分離或損壞的發(fā)生。
根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了一種酶電極，其結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)滲透限制層，該滲透限制層是在位于酶電極最上方的表面上的固定化酶層上形成的，其中滲透限制層的表面使用了具有上述特殊結(jié)構(gòu)的含氟聚合物，在其上形成許多溝槽，或者表面也可以具有不規(guī)則的形狀以便在一個(gè)給定的范圍內(nèi)將表面的粗糙度調(diào)整到平均的薄膜厚度。具體來(lái)說(shuō)，根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面的酶電極含有在絕緣基材上形成電極部分，在電極部分上形成固定化酶層，在固定化酶層上形成滲透限制層，并置于最上方的表面；其中滲透限制層由一層薄膜組成，其主要含有含氟聚合物，在主要含有含氟聚合物的滲透限制層的表面上內(nèi)置許多溝槽。此外，根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面的酶電極含有在絕緣基材上形成電極部分，在電極部分上形成固定化酶層，在固定化酶層上形成滲透限制層，并置于最上方的表面；其中滲透限制層由一層薄膜組成，其主要含有含氟聚合物；滲透限制層的平均厚度在0.01到1μm的范圍內(nèi)選擇；以及由主要含有含氟聚合物的薄膜組成的滲透限制層的表面具有不規(guī)則的形狀，其表面的粗糙度在該滲透限制層的平均厚度的≥0.0001倍到≤1倍之間的范圍內(nèi)。
在根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面的酶電極中，位于最上方表面的滲透限制層也由一個(gè)主要含有具有上述特殊結(jié)構(gòu)的含氟聚合物的層所構(gòu)成。因此，根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面的酶電極，其特征在于為滿足需要而特別定義的滲透限制層的表面形狀。按照慣例，用于酶電極的滲透限制層在構(gòu)成滲透限制層的材料及其厚度設(shè)計(jì)方面在技術(shù)上已經(jīng)基本上被研究過(guò)了，目的在于通過(guò)選擇材料和設(shè)計(jì)厚度以改善滲透控制能力。另一方面，在本發(fā)明的第二個(gè)方面中，位于最上方表面的滲透限制層的表面形狀被選擇成一種新設(shè)計(jì)的形狀，以便改善長(zhǎng)期測(cè)量的穩(wěn)定性、酶電極的測(cè)量精確性以及酶電極的產(chǎn)率。
如在后面的實(shí)施例中具體說(shuō)明的那樣，根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面的酶電極使用了一個(gè)含有滲透限制層的結(jié)構(gòu)，這個(gè)層在其表面上具有內(nèi)置許多溝槽的形狀或者不規(guī)則的形狀，同時(shí)表面的粗糙度受到控制以改善長(zhǎng)期穩(wěn)定性、酶電極的測(cè)量精確性以及酶電極的產(chǎn)率。盡管獲得這樣的改善的機(jī)制尚未被清楚地了解，但可以假設(shè)使用這種滲透限制層的表面構(gòu)型可以在一定程度上防止污染物附著在酶電極表面，附著在這些酶電極的表面上的污染物可以通過(guò)測(cè)量后清洗很容易地除去，此外，其中內(nèi)置的給定的表面構(gòu)型可以改善滲透限制層的強(qiáng)度，所有這些都對(duì)滲透限制層的性能改善有所貢獻(xiàn)。
通過(guò)在表面塑造溝槽或?qū)⒈砻娲植诙瓤刂圃陬A(yù)定范圍內(nèi)來(lái)改善性能的程度，相當(dāng)多地依賴于一些因素，諸如組成滲透限制層的材料及其厚度。在根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面的酶電極中，當(dāng)滲透限制層由主要含有上述的具有特殊結(jié)構(gòu)的含氟聚合物的層組成，并且它的厚度選定在上面定義的范圍之內(nèi)時(shí)，對(duì)滲透限制層的性能改善程度是明顯的。
在本發(fā)明的第二個(gè)方面中，可以使用下面的生產(chǎn)方法步驟在晶片表面形成含有固定化酶層和滲透限制層的多層薄膜；然后在最上面的滲透限制層形成薄膜之后，將晶片切成芯片，產(chǎn)生的酶電極可用于在位于酶電極最上方表面的滲透限制層的表面中塑造溝槽，或?qū)B透限制層的表面粗糙度調(diào)整到預(yù)定范圍內(nèi)。除了選用這種方法之外，將方法設(shè)計(jì)成下面的方式也是有益的使用旋涂作為滲透限制層的薄膜形成方法，實(shí)施將含有具特殊結(jié)構(gòu)的含氟聚合物的液體加到晶片上然后將其干燥形成滲透限制層的步驟，此外旋涂的條件被設(shè)置在可適用的條件內(nèi)。
因此，在本發(fā)明的第二個(gè)方面中，提供了下述的生產(chǎn)方法作為一種生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面的上述酶電極的新方法。具體來(lái)說(shuō)，根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面的酶電極的生產(chǎn)方法含有
在絕緣基材的主表面上形成電極膜，然后使電極膜成型以形成多個(gè)電極部分；將含酶的液體加到絕緣基材的主表面上，然后將絕緣基材干燥以形成固定化酶層；通過(guò)旋涂將含有含氟聚合物、其結(jié)構(gòu)中有一個(gè)含有至少一個(gè)氟亞烷基嵌段的側(cè)基被結(jié)合到一種未氟化的基于乙烯基的聚合物上的液體加到絕緣基材的主表面上，然后將絕緣基材干燥以形成滲透限制層；以及將絕緣基材切成小塊以產(chǎn)生多個(gè)酶電極。
在根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面的酶電極的生產(chǎn)方法中，當(dāng)通過(guò)旋涂施加含有具特殊結(jié)構(gòu)的含氟聚合物的液體、然后干燥以形成滲透限制層時(shí)，可以形成始終一致的滲透限制層，其中在形成的滲透限制層的表面上可以內(nèi)置大量溝槽，或者滲透限制層可以具有適當(dāng)?shù)谋砻娲植诙取?br> 此外，在根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面的酶電極的生產(chǎn)方法中，可以使用下述這樣的方法組成在形成固定化酶層步驟之后，進(jìn)行將含有含硅烷化合物的液體加到主表面上然后將絕緣基材干燥以形成附著層的步驟；然后，通過(guò)旋涂將含有具特殊結(jié)構(gòu)的含有所述含氟聚合物的液體加到附著層的上表面上，然后將絕緣基材干燥以形成該滲透限制層。在此情況下，硅烷偶合劑優(yōu)選用作形成附著層的所述含硅烷化合物。將含有具特殊結(jié)構(gòu)的含氟聚合物的滲透限制層和含有含硅烷化合物的附著層相結(jié)合，可以極大地改善滲透限制層和它下層(例如固定化酶層)之間的附著性，產(chǎn)生具有優(yōu)良的生產(chǎn)穩(wěn)定性的高性能酶電極。
此外，在本發(fā)明的第二個(gè)方面中，其結(jié)構(gòu)中有一個(gè)含有至少一個(gè)氟亞烷基嵌段的側(cè)基被結(jié)合到一種未氟化的基于乙烯基的聚合物上的含氟聚合物可以是一個(gè)聚羧酸(A)的氟代醇酯，其中含有的聚羧酸(A)作為未氟化的基于乙烯基的聚合物。此外，它也可以是含有一種聚羧酸(A)的氟代醇酯和另一種聚羧酸(B)的烷基醇酯的混合物，在聚羧酸(A)的氟代醇酯中含有的聚羧酸(A)作為未氟化的基于乙烯基的聚合物。此外，它也可以是一個(gè)由主要含有氟代醇酯基團(tuán)和烷基醇酯基團(tuán)的聚羧酸酯構(gòu)成的含氟聚合物。在使用這樣的具有未氟化的基于乙烯基的聚合物的含氟聚合物作為其聚合物鏈的骨架時(shí)，當(dāng)使用旋涂方法時(shí)可以在其表面內(nèi)置大量溝槽，因此可以更均一地形成具有適當(dāng)?shù)谋砻娲植诙鹊臐B透限制層。
在根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面的酶電極的生產(chǎn)方法中，當(dāng)為了制備含有具上述特殊結(jié)構(gòu)的含氟聚合物的液體時(shí)，可以使用含有含氟化合物的溶劑作為溶劑。通過(guò)在旋涂步驟中使用含有含氟化合物的溶劑，可以更穩(wěn)定地形成在其表面上內(nèi)置大量溝槽或其表面具有適當(dāng)?shù)谋砻娲植诙鹊臐B透限制層。
根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面的酶電極的生產(chǎn)方法是一種在晶片級(jí)別上生產(chǎn)多個(gè)酶電極的方法。在現(xiàn)有技術(shù)中，當(dāng)生產(chǎn)酶電極時(shí)，使用在一個(gè)預(yù)先已被切成芯片的基材表面上形成滲透限制層等的方法。傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法使用了圖19和20所示的步驟，當(dāng)需要大規(guī)模生產(chǎn)計(jì)劃時(shí)對(duì)生產(chǎn)效率的改善有所限制。在另一方面，在本發(fā)明的第二個(gè)方面中，當(dāng)使用包含了在基材上形成多個(gè)酶電極然后將基材切成酶電極芯片的步驟的方法時(shí)，通過(guò)旋涂可以以良好的重現(xiàn)性在基材的整個(gè)表面上形成平均厚度一致的施加的薄膜，從而在基材上適當(dāng)?shù)匦纬啥鄠€(gè)酶電極。此外，通過(guò)使用包含了通過(guò)旋涂施加液體然后使其干燥形成薄膜的步驟的方法，可以在表面上內(nèi)置大量溝槽，因此可以以良好的產(chǎn)率在基材的整個(gè)表面上形成具有適當(dāng)粗糙度的滲透限制層。
附圖簡(jiǎn)述圖1是一個(gè)橫截面示意圖，圖示了根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的酶電極的結(jié)構(gòu)的例子。
圖2是一個(gè)橫截面示意圖，圖示了另一個(gè)根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的酶電極的結(jié)構(gòu)的例子。
圖3是一個(gè)視圖，圖解了根據(jù)本發(fā)明的酶電極的生產(chǎn)過(guò)程，并示意性表示為了在絕緣基材1上形成酶電極芯片而對(duì)眾多電極的排列方式。
圖4圖示了根據(jù)本發(fā)明的酶電極的排列方式的一個(gè)例子。
圖5是一個(gè)橫截面示意圖，示意性圖示了一個(gè)常規(guī)的酶電極構(gòu)型的例子。
圖6示意性圖示了含有本發(fā)明的酶電極的的生物傳感器的一個(gè)例子。
圖7是一個(gè)橫截面示意圖，示意性圖示了根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的酶電極的結(jié)構(gòu)的例子。
圖8是一個(gè)橫截面示意圖，示意性圖示了另一個(gè)根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的酶電極的結(jié)構(gòu)的例子。
圖9圖示了現(xiàn)有技術(shù)不具有實(shí)施例1中所述的附著層8的酶電極的長(zhǎng)期穩(wěn)定性評(píng)估，以隨時(shí)間變化的傳感器輸出來(lái)表示。
圖10圖示了根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面具有實(shí)施例1中所述的附著層8的酶電極的長(zhǎng)期穩(wěn)定性評(píng)估，以隨時(shí)間變化的傳感器輸出來(lái)表示。
圖11圖示了在根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面具有實(shí)施例2所述的附著層8的酶電極與現(xiàn)有技術(shù)中不具有實(shí)施例2所述的附著層8的酶電極之間的比較實(shí)驗(yàn)中，由于抗壞血酸作為干擾物質(zhì)引起的傳感器輸出變化的結(jié)果評(píng)估。
圖12顯示了在現(xiàn)有技術(shù)中不具有實(shí)施例4所述的附著層8的酶電極中傳感器輸出對(duì)葡萄糖濃度的作圖(校正曲線)；圖12(a)顯示了總共5個(gè)酶電極的單個(gè)校正曲線，以及圖12(b)是以傳感器輸出平均值及從上述5個(gè)酶電極的傳感器輸出計(jì)算出的標(biāo)準(zhǔn)偏差對(duì)葡萄糖濃度的作圖。
圖13顯示了根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面具有實(shí)施例4所述的附著層8的酶電極中傳感器輸出對(duì)葡萄糖濃度的作圖(校正曲線)；圖13(a)顯示了總共5個(gè)具有使用0.1％(v/v)γ-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液形成的附著層8的酶電極的單個(gè)校正曲線，以及圖13(b)是以傳感器輸出平均值及從上述5個(gè)酶電極的傳感器輸出計(jì)算出的標(biāo)準(zhǔn)偏差對(duì)葡萄糖濃度的作圖。
圖14顯示了根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面具有實(shí)施例4所述的附著層8的酶電極中傳感器輸出對(duì)葡萄糖濃度的作圖(校正曲線)；圖14(a)顯示了總共5個(gè)具有使用0.05％(v/v)γ-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液形成的附著層8的酶電極的單個(gè)校正曲線，以及圖14(b)是以傳感器輸出平均值及從上述5個(gè)酶電極的傳感器輸出計(jì)算出的標(biāo)準(zhǔn)偏差對(duì)葡萄糖濃度的作圖。
圖15顯示了根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面具有實(shí)施例4所述的附著層8的酶電極中傳感器輸出對(duì)葡萄糖濃度的作圖(校正曲線)；圖15(a)顯示了總共5個(gè)具有使用0.2％(v/v)γ-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液形成的附著層8的酶電極的單個(gè)校正曲線，以及圖15(b)是以傳感器輸出平均值及從上述5個(gè)酶電極的傳感器輸出計(jì)算出的標(biāo)準(zhǔn)偏差對(duì)葡萄糖濃度的作圖。
圖16顯示了根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面具有實(shí)施例5所述的附著層8的7種類(lèi)型的酶電極的圖，在每一種酶電極中附著層8的形成使用了幾種不同的硅烷偶合劑之一，用組成為純水及最終濃度為5％的乙醇的混合溶劑配制成濃度為0.1％(v/v)，以對(duì)每種類(lèi)型總共5個(gè)單獨(dú)酶電極的傳感器輸出計(jì)算出的傳感器輸出平均值對(duì)葡萄糖濃度作圖，酶電極分別使用下述的偶合劑進(jìn)行制備s1(a)γ-氨基丙基三乙氧基硅烷；s2(b)γ-氨基丙基三甲氧基硅烷；s3(c)N-苯基-γ-氨基丙基三甲氧基硅烷；s4(d)γ-氯丙基三甲氧基硅烷；s5(e)γ-巰基丙基三甲氧基硅烷；s6(f)3-異氰酸根合丙基三乙氧基硅烷；和s7(g)3-丙烯氧基丙基三甲氧基硅烷。
圖17顯示了根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面具有實(shí)施例6所述的附著層8的4種類(lèi)型酶電極的圖，在每一種酶電極中附著層8的形成使用了γ-氨基丙基三乙氧基硅烷，用組成為純水及最終濃度為5％的不同有機(jī)溶劑的混合溶劑配制成濃度為0.1％(v/v)，以對(duì)每種類(lèi)型5個(gè)單獨(dú)酶電極的傳感器輸出計(jì)算出的傳感器輸出平均值對(duì)葡萄糖濃度作圖，酶電極分別使用下述溶劑進(jìn)行制備Et純水與乙醇的混合溶劑；Mt純水與甲醇的混合溶劑；EA純水與乙酸乙酯的混合溶劑；以及W純水。
圖18顯示了根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的4種酶電極的圖，在每一種酶電極中使用薄膜形成溶液中的不同濃度的1H，1H-全氟代辛基聚甲基丙烯酸酯來(lái)形成實(shí)施例8中所述的滲透限制層，其中以對(duì)每種類(lèi)型5個(gè)單獨(dú)酶電極的傳感器輸出計(jì)算出的傳感器輸出平均值對(duì)葡萄糖濃度作圖。
圖19顯示了根據(jù)酶電極生產(chǎn)方法的步驟，其中對(duì)于每個(gè)從晶片上切下的芯片使用旋涂方法進(jìn)行組成酶電極的涂層的形成步驟；圖19(a)顯示了將從晶片上切下的芯片固定在一個(gè)撓性基座上的步驟；圖19(b)顯示了使用雙面膠帶將該撓性基座固定在用于旋涂的旋轉(zhuǎn)器上的步驟；圖19(c)顯示了通過(guò)該雙面膠帶將該撓性基座固定在旋轉(zhuǎn)器上的步驟。
圖20顯示了根據(jù)酶電極生產(chǎn)方法的步驟，其中對(duì)于每個(gè)從晶片上切下的芯片使用旋涂方法進(jìn)行組成酶電極的涂層的形成步驟；圖20(d)顯示了將涂層溶液滴加在固定于旋轉(zhuǎn)器的撓性基座上的芯片上的步驟；圖20(e)顯示了通過(guò)旋轉(zhuǎn)器的轉(zhuǎn)動(dòng)使用滴加在芯片上的涂層溶液液滴形成旋轉(zhuǎn)涂層膜的步驟；以及圖20(f)顯示了在旋涂后將該施加的膜干燥以形成不同類(lèi)型涂層的步驟。
圖21顯示了根據(jù)實(shí)施例10中描述的本發(fā)明第二個(gè)方面的第一個(gè)酶電極中傳感器輸出對(duì)葡萄糖濃度的作圖(校正曲線)；具體來(lái)說(shuō)是總共4個(gè)酶電極的單個(gè)校正曲線。
圖22顯示了根據(jù)實(shí)施例10中描述的現(xiàn)有技術(shù)的第二個(gè)酶電極中傳感器輸出對(duì)葡萄糖濃度的作圖(校正曲線)；具體來(lái)說(shuō)是總共4個(gè)酶電極的單個(gè)校正曲線。
圖23是實(shí)施例9中描述的酶電極樣品1中滲透限制層6的表面三維AFM圖象的打印圖，根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，滲透限制層6通過(guò)旋涂形成，并放置在最上方的表面。
圖24是如實(shí)施例9中所述，在圖23所示的滲透限制層6表面的AFM圖象的基礎(chǔ)上所確定的表面粗糙度分布的條形圖。
圖25是在實(shí)施例9中描述的酶電極的滲透限制層6的表面上觀察到的兩維AFM圖象的打印圖，其中不規(guī)則性由漸變的級(jí)段指示，凹陷(溝槽)被顯示為白色，根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，滲透限制層6通過(guò)旋涂形成，并放置在最上方的表面。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明的第一個(gè)和第二個(gè)方面將參考針對(duì)每個(gè)方面的實(shí)施方案進(jìn)行更具體的解釋。
首先，第一到第四個(gè)實(shí)施方案將作為本發(fā)明第一個(gè)方面的優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行描述。
第一個(gè)實(shí)施方案根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的第一個(gè)實(shí)施方案將參考附圖進(jìn)行描述。圖1顯示了根據(jù)第一個(gè)實(shí)施方案的酶電極的構(gòu)型。如圖1所示，作為工作電極的電極2在絕緣基材1上形成，在電極的上表面上形成主要由尿素化合物構(gòu)成的電極保護(hù)層5。電極保護(hù)層5在電極2的部分上選擇性地形成。在這些層上形成一個(gè)結(jié)合層3，主要由γ-氨基丙基三乙氧基硅烷制成，然后在其上形成一個(gè)固定化酶層4，其中酶已經(jīng)固定在作為基質(zhì)的有機(jī)聚合物中。在這個(gè)層上形成一個(gè)由γ-氨基丙基三乙氧基硅烷制成的附著層8。然后在附著層8的上表面上形成一個(gè)滲透限制層6，其主要成分含有聚羧酸樹(shù)脂的氟代醇酯。
對(duì)于作為絕緣基材1的物質(zhì)而言，使用的物質(zhì)主要由高絕緣性的材料組成，例如陶瓷、玻璃、石英和塑料是適用的。用于絕緣基材1的材料優(yōu)先從具有優(yōu)異的防水性、抗熱性、抗化學(xué)性和與電極的附著性的材料中選擇。
例如，一種含有例如鉑的導(dǎo)電材料可以用做電極2的材料，金、銀和碳作為其中的主要成分；其中，鉑是特別優(yōu)選的材料，它在檢測(cè)過(guò)氧化氫時(shí)具有優(yōu)異的抗化學(xué)性和性能。在絕緣基材1上的電極2可以通過(guò)例如濺射、離子電鍍、真空沉積、化學(xué)蒸汽沉積和電解這樣的方法來(lái)形成，其中，優(yōu)選的是使用濺射方法。使用濺射方法，在形成的導(dǎo)電材料薄膜和絕緣基材1之間達(dá)到良好的附著性，一個(gè)鉑層可以容易地形成。此外，為了改善電極2與絕緣基材1之間的附著性，一個(gè)諸如鈦或鉻層這樣的層可以被插入在它們中間。
覆蓋在電極2上的電極保護(hù)層5限制了包含在被測(cè)量樣品中的污染物如尿素向電極內(nèi)的滲透。例如，電極保護(hù)層5可以由尿素化合物組成。尿素化合物的例子包括尿素、硫脲等，但不限于此，在這些化合物中優(yōu)選使用尿素，因?yàn)樗亩拘缘筒⑶伊畠r(jià)。本發(fā)明的酶電極的結(jié)構(gòu)中含有污染物如尿素化合物的電極保護(hù)層預(yù)先在電極表面生成，這可以防止由于污染物如尿素滲透進(jìn)電極的表面而引起出現(xiàn)靈敏度的波動(dòng)。因此，由于電極保護(hù)層的這種功能，顯然可用于電極保護(hù)層的尿素化合物不限于上面例舉的種類(lèi)。
電極保護(hù)層5可以通過(guò)例如浸泡、等離子聚合作用和電解等方法生成；在這些方法中，優(yōu)選的方法是電解，它可以通過(guò)使用廉價(jià)的裝置在較短的加工時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。具體來(lái)說(shuō)，優(yōu)選方法是將其上已經(jīng)形成了電極的絕緣基材浸泡在含有支持電解質(zhì)和尿素化合物的混合溶液中，然后施加電流在其上形成電極保護(hù)層。當(dāng)使用尿素作為尿素化合物時(shí)，混合溶液中的尿素的濃度優(yōu)選在0.1mM到6.7M的范圍內(nèi)，更優(yōu)選為1M到6.7M的范圍內(nèi)。當(dāng)使用氯化鈉作為支持電解質(zhì)時(shí)，混合溶液中的氯化鈉濃度優(yōu)選在0.1mM到2M的范圍內(nèi)，更優(yōu)選為1.5mM到150mM的范圍內(nèi)。選擇上述的薄膜形成條件可以使電極保護(hù)層具有高質(zhì)量，可以有效地抑制污染物的附著，并且可以防止干擾物質(zhì)滲透進(jìn)入電極2中與過(guò)氧化氫反應(yīng)，從而使電極2中與過(guò)氧化氫的反應(yīng)具有良好的選擇性。此外，裝備電極保護(hù)層5可以改善與在其上形成的結(jié)合層3之間的附著性。
在電極保護(hù)層5上生成的結(jié)合層3可以改善在其上形成的固定化酶層4與絕緣基材1和電極保護(hù)層5之間的附著性(結(jié)合強(qiáng)度)。結(jié)合層3也可以改善絕緣基材1表面的濕潤(rùn)性，并且當(dāng)在其上將酶固定化形成固定化酶層4時(shí)，可以有效地改善固定化酶層4的厚度均一性。此外，結(jié)合層3對(duì)可以干擾電極2中與過(guò)氧化氫反應(yīng)的抗壞血酸、尿酸和對(duì)乙酰氨基酚表現(xiàn)出選擇透性。例如，結(jié)合層3可以由硅烷偶合劑制成。可用于其中的硅烷偶合劑的例子包括乙烯基三氯硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷、β-(3，4-環(huán)氧環(huán)己基)乙基三甲氧基硅烷、γ-環(huán)氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷、γ-環(huán)氧丙氧基丙基甲基二乙氧基硅烷、γ-環(huán)氧丙氧基丙基三乙氧基硅烷、γ-甲基丙烯酰氧基丙基甲基二甲氧基硅烷、γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、γ-甲基丙烯酰氧基丙基甲基二乙氧基硅烷、γ-甲基丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷、N-(β-氨基乙基)-γ-氨基丙基甲基二甲氧基硅烷、N-(β-氨基乙基)-γ-氨基丙基三甲氧基硅烷、N-(β-氨基乙基)-γ-氨基丙基三乙氧基硅烷、γ-氨基丙基三甲氧基硅烷、γ-氨基丙基三乙氧基硅烷、N-苯基-γ-氨基丙基三甲氧基硅烷、γ-氯代丙基三甲氧基硅烷、γ-硫烷基丙基三甲氧基硅烷、3-異氰酸根合丙基三乙氧基硅烷、3-丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷以及3-三乙氧基硅烷基-N-(1，3-二甲基-亞丁基)丙基胺；在這些物質(zhì)中，優(yōu)選使用的是屬于氨基硅烷類(lèi)型的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷，因?yàn)樗哂袏A層結(jié)合力和選擇透性。例如，結(jié)合層3可以通過(guò)旋涂用一種硅烷偶合劑形成。當(dāng)使用硅烷偶合劑通過(guò)旋涂形成結(jié)合層3時(shí)，硅烷偶合劑的濃度優(yōu)選為大約1v/v％(體積比)，以便選擇這樣的條件可以極大地改善選擇透性。
固定化酶層4是一個(gè)使用有機(jī)聚合物作為基質(zhì)(粘合劑)將具有催化能力的酶固定在其上的層。固定化酶層4可以通過(guò)例如滴加然后旋涂含有某些種類(lèi)的酶、蛋白交聯(lián)劑如戊二醛和白蛋白的溶液在結(jié)合層3上形成。白蛋白在與交聯(lián)劑的反應(yīng)中可以保護(hù)多種酶，可以充當(dāng)酶蛋白的基座的角色。適合用于其中的酶包括那些能夠產(chǎn)生過(guò)氧化氫作為酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的酶，或者耗氧的酶，可以從氧化酶中選擇，例如乳酸氧化酶、葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、半乳糖氧化酶、乳糖氧化酶、蔗糖氧化酶、乙醇氧化酶、甲醇氧化酶、淀粉氧化酶、氨基酸氧化酶、一元胺氧化酶、膽固醇氧化酶、膽堿氧化酶和丙酮酸氧化酶。
在一個(gè)固定化酶層4中可以將兩種或多種酶結(jié)合使用以產(chǎn)生過(guò)氧化氫。適合于結(jié)合使用兩種或多種酶的一個(gè)例子是一組肌酸酐酶、肌酸酶和肌氨酸氧化酶，使用它們可以檢測(cè)肌酸酐。在固定化酶層4中，酶還可以與輔酶結(jié)合。適合于結(jié)合使用酶和輔酶的一個(gè)例子是3-羥基乳酸脫氫酶和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的對(duì)，使用該酶和輔酶可以檢測(cè)3-羥基乳酸。在固定化酶層4中，酶還可以與一個(gè)電子介質(zhì)結(jié)合使用，其中被酶還原的電子介質(zhì)在電極表面被氧化，由此產(chǎn)生的電流然后被電極2測(cè)量。例如，適合于結(jié)合使用酶和電子介質(zhì)的一個(gè)例子是葡萄糖氧化酶和鐵氰化鉀，在酶反應(yīng)系統(tǒng)中使用它們可以檢測(cè)葡萄糖。
如上所述，對(duì)固定化酶層4的結(jié)構(gòu)沒(méi)有限制，只要它包含至少一種酶，并且能夠作用于待檢測(cè)的靶物質(zhì)將它轉(zhuǎn)化為電極敏感的物質(zhì)例如過(guò)氧化氫。
對(duì)形成固定化酶層4的方法沒(méi)有限制，只要它是一種能夠形成均一的層的方法；例如旋涂、噴涂和浸泡都可以使用。在這些方法中，優(yōu)選使用的是旋涂，使用它可以始終一致地形成具有均一的質(zhì)量和厚度的固定化酶層。
在固定化酶層4上形成的附著層8可以改善固定化酶層4和其上形成的滲透限制層6之間的附著性。在傳統(tǒng)的酶電極中，在將基材切成小塊以提供多個(gè)酶電極或通過(guò)與酶電極結(jié)合而形成互相連接的步驟中，有可能在滲透限制層和下層之間產(chǎn)生分離，或在這些層之間發(fā)生損壞。相反，在根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的酶電極中，在形成滲透限制層之前使用含硅烷化合物形成附著層，以便這樣的分離可以被有效地防止。因此，使用一種所謂的晶片方法可以生產(chǎn)具有均一性質(zhì)的酶電極。此外，當(dāng)形成滲透限制層6時(shí)，它能有效地改善在其上形成的滲透限制層的厚度均一性或表面平整性。另外，與能夠干擾電極2中與過(guò)氧化氫反應(yīng)的干擾物質(zhì)例如抗壞血酸、尿酸和對(duì)乙酰氨基酚相比，滲透限制層對(duì)檢測(cè)的靶物質(zhì)的選擇透性可以被改善到極好的水平。
例如，附著層8可以由一種硅烷偶合劑制成。對(duì)附著層有用的硅烷偶合劑的范圍可以包括上面列出的可以用于結(jié)合層3的硅烷偶合劑的例子中的系列化合物。在附著層8中，氨基硅烷、特別是γ-氨基丙基三乙氧基硅烷也可以被優(yōu)選使用，這是因?yàn)樗鼈兊睦绺街赃@樣的性質(zhì)。使用3-異氰酸根合丙基三乙氧基硅烷或3-丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷也可能有效。
對(duì)于將偶合劑溶液等施加到附著層8或結(jié)合層3上的方法，可以使用例如旋涂、噴涂、浸泡和熱氣流這樣的方法。旋涂是指這樣一種方法，使用旋涂器來(lái)施加用于附著層或結(jié)合層的成分例如偶合劑的溶液或分散體。使用旋涂方法，可以形成厚度較薄的結(jié)合層或附著層，對(duì)厚度控制良好。噴涂是指通過(guò)噴灑將例如原子化的偶合劑溶液這樣的液體吹到基材表面上的方法，而浸泡是指將基材浸在例如偶合劑溶液這樣的液體中的方法。使用這些形成涂層膜的方法，不使用任何特別的裝置通過(guò)一個(gè)簡(jiǎn)單的步驟就可形成結(jié)合層或附著層。在另一方面，熱氣流是指將基材放置在熱環(huán)境下然后將偶合劑的蒸氣流過(guò)其上的方法。使用熱氣流方法，也可以形成厚度較薄的結(jié)合層或附著層，對(duì)厚度控制良好。
當(dāng)附著層8由偶合劑制成時(shí)，在所有方法中，優(yōu)選使用硅烷偶合劑溶液的旋涂。使用通過(guò)旋涂由硅烷偶合劑制成的附著層可以始終如一地獲得良好的附著性。在使用旋涂的方法中，溶液中硅烷偶合劑的濃度優(yōu)選在0.01到5％(v/v)的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在0.05到1％(v/v)的范圍內(nèi)。至于硅烷偶合劑溶液的溶劑，純水、醇類(lèi)如甲醇、乙醇和異丙醇、酯類(lèi)如乙酸乙酯可以單獨(dú)使用，也可以從中選擇兩種或多種組合使用。在這些溶劑中，優(yōu)選使用用純水稀釋的乙醇、甲醇或乙酸乙酯的混合物。在通過(guò)旋涂使用該溶劑的混合物由硅烷偶合劑制成的附著層中，附著性的改善特別顯著。此外，附著層8對(duì)于滲透限制層的選擇透性的顯著改善也有影響。
在施加了偶合劑溶液等后，將施加的含有溶劑的薄膜干燥。干燥的溫度一般在從室溫(25℃)到170℃的范圍內(nèi)，但不限于此。干燥的時(shí)間依賴于干燥溫度，但一般在0.5到24小時(shí)內(nèi)。干燥可以在空氣中也可以在惰性氣體如氮?dú)庵羞M(jìn)行。例如可以使用氮?dú)夤娘L(fēng)法，其中將氮?dú)獯翟诨纳线M(jìn)行干燥。
至于滲透限制層6的組成材料，使用一種聚合物，其中含有至少一個(gè)氟亞烷基嵌段的側(cè)基被結(jié)合到一種未氟化的基于乙烯基的聚合物上。通過(guò)使用這樣一種含有未氟化的基于乙烯基的聚合物作為聚合物骨架，其上結(jié)合了含有至少一個(gè)氟亞烷基嵌段的側(cè)基，它作為下層與附著層的附著性被極大地改善了。在此所用的“未氟化的基于乙烯基的聚合物”是一個(gè)部分，它在功能上參與了與另一種有機(jī)聚合物層例如固定化酶層的良好附著性。相反，當(dāng)使用在聚合物部分中包含了大量氟而不是側(cè)基的聚合物時(shí)，它與另一種有機(jī)聚合物層例如固定化酶層的附著性可能被降低，此外，制備含有該聚合物的溶液并用來(lái)形成滲透限制層作為一個(gè)薄膜可能比較困難。該未氟化的基于乙烯基的聚合物是一種主骨架由碳-碳鍵組成的聚合物；其優(yōu)選的例子包括選自未飽和的碳?xì)浠衔?、未飽和的羧酸和未飽和的醇中的一種或多種單體的同聚物或共聚物。在這些未氟化的基于乙烯基的聚合物中，特別優(yōu)選的是聚羧酸類(lèi)型的聚合物。當(dāng)選擇這種聚合物類(lèi)型時(shí)，它作為下層與附著層的附著性可以被更明顯地改善，因此可以提供具有良好耐久性的滲透限制層。此外，作為與基于乙烯基的聚合物結(jié)合的側(cè)基，優(yōu)選通過(guò)一個(gè)酯基結(jié)合氟亞烷基嵌段。酯基具有適當(dāng)?shù)臉O性，一個(gè)滲透限制層主要包含一種聚合物，其中至少一個(gè)氟亞烷基嵌段作為側(cè)基通過(guò)酯基結(jié)合到基于乙烯基的聚合物上，這樣的滲透限制層可以表現(xiàn)出與被附著層包被的下層的顯著的附著性。此外，含有氟亞烷基嵌段的側(cè)基是指含有氟亞烷基作為其成分單元的側(cè)基。在另一方面，氟亞烷基是指一個(gè)亞烷基基團(tuán)，其部分或所有的氫原子被氟原子取代。
如上所述，滲透限制層6的組成材料包含了其中含有至少一個(gè)氟亞烷基嵌段的側(cè)基結(jié)合到未氟化的基于乙烯基的聚合物上的聚合物，其中特別優(yōu)選的是聚羧酸的氟代醇酯。該聚羧酸的例子包括聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸和丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物。在此，聚羧酸的氟代醇酯是指其中聚羧酸中存在的多個(gè)羧基的部分或全部被氟醇所酯化。氟醇是指醇中的所有或至少一個(gè)氫原子被氟原子取代。聚羧酸中存在的所有羧基基團(tuán)可以被酯化，或它們中的部分可以被酯化。為了獲得均一的性質(zhì)，預(yù)期聚羧酸的存在的多個(gè)羧基的0.1％或以上將被酯化。包含在聚氟醇中的碳的數(shù)量?jī)?yōu)選在C5到C9的范圍內(nèi)，這是因?yàn)樵诒∧こ练e后的良好耐久性，更優(yōu)選C8，這是因?yàn)樵诒∧こ练e中的便利性。在另一方面，至于聚氟醇中羥基的位置，優(yōu)選的是伯醇類(lèi)型，使用它們?cè)谀途眯院突瘜W(xué)抗性方面可以提供最好的性能。在聚羧酸的氟代醇酯中，特別優(yōu)選的是1H，1H-全氟代辛基聚甲基丙烯酸和1H，1H，2H，2H-全氟代癸基聚丙烯酸。使用該聚羧酸的氟代醇酯可以獲得良好的滲透控制、促進(jìn)薄膜沉積并表現(xiàn)出對(duì)酸、堿和各種有機(jī)溶劑的高度抗性。
除了聚羧酸的氟代醇酯外，聚羧酸的烷基醇酯也可引入作為滲透限制層的材料組分。例如，滲透限制層可以由聚羧酸(A)的氟代醇酯和聚羧酸(B)的烷基醇酯的混合物制成，或者滲透限制層可以主要由其結(jié)構(gòu)中具有氟代醇酯和烷基醇酯基團(tuán)的聚羧酸的酯化合物制成。包含在上述混合物中的聚羧酸(A)和聚羧酸(B)可以是相同的或不同的。詞組“主要含有”是指上述的聚合物是構(gòu)成滲透限制層的主要成分；例如聚合物的含量占滲透限制層的50wt％或以上。當(dāng)形成的滲透限制層的成分主要含有上述的聚合物時(shí)，可以獲得具有良好的高溫穩(wěn)定性的酶電極。此外，組成滲透限制層的聚合物的分子量(平均分子量)優(yōu)選在1000到50000的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在3000到30000的范圍內(nèi)。過(guò)分高的分子量可能使制備含有該聚合物的溶液及形成較薄的滲透限制層變得困難。當(dāng)使用過(guò)低的分子量時(shí)，得到的滲透限制層有可能不能實(shí)現(xiàn)足夠的滲透控制。在此，分子量是指數(shù)均分子量，可以通過(guò)GPC(凝膠滲透層析)來(lái)測(cè)定。
滲透限制層6可以通過(guò)旋涂使用含有前述的含氟聚合物的溶液在位于其下的附著層8的上表面上形成。在已經(jīng)固定化了具有催化活性的酶的固定化酶層4上預(yù)先形成了附著層8后，可以通過(guò)滴加然后旋涂用全氟代碳溶劑如全氟代己烷稀釋的聚甲基丙烯酸的聚氟代醇酯的溶液來(lái)形成滲透限制層6。在使用旋涂時(shí)，溶液中的含氟聚合物的含量?jī)?yōu)選被調(diào)整到0.1-5wt％，更優(yōu)選為大約0.3wt％，這依賴于檢測(cè)的靶物質(zhì)。使用這樣濃度范圍的溶液通過(guò)旋涂來(lái)形成薄膜，可以在得到的滲透限制層6中獲得較好的滲透控制。此外，對(duì)于形成滲透限制層6的方法，任何方法、例如旋涂、噴涂和浸泡都可以不受限制地使用，只要它能夠提供均一的薄膜厚度。在這些方法中，優(yōu)選使用的是上述的旋涂。當(dāng)使用旋涂形成薄膜時(shí)，可以始終如一地獲得具有均一的質(zhì)量和厚度的滲透限制層。在另一方面，滲透限制層的合適的厚度優(yōu)選在0.01到3μm之內(nèi)，更優(yōu)選在0.01到1μm之內(nèi)。使用這種厚度的滲透限制層6，可以提高酶電極的反應(yīng)速度，并減少測(cè)量后用于清洗的時(shí)間。
通過(guò)形成一個(gè)以具有前述特殊結(jié)構(gòu)的含氟聚合物作為主要成分的滲透限制層6，可以防止污染物如蛋白和尿素化合物附著到酶電極上。因此，可以形成如圖1所示的電極保護(hù)層5，除了滲透限制層6的效應(yīng)之外其還能提供協(xié)同效應(yīng)以防止電極保護(hù)層5對(duì)污染物的附著效應(yīng)，在長(zhǎng)期使用過(guò)程中這些效應(yīng)也能穩(wěn)定輸出性質(zhì)的性能。將滲透限制層6與下面的附著層8結(jié)合起來(lái)可以產(chǎn)生良好的滲透控制，可以在非常寬的測(cè)量濃度范圍內(nèi)提供這樣的效應(yīng)。此外，當(dāng)滲透限制層6和附著層8之間的附著性增強(qiáng)時(shí)，分離可能發(fā)生得很少，這也使在長(zhǎng)期過(guò)程中穩(wěn)定地測(cè)量溶液中得靶物質(zhì)成為可能。此外，在使用晶片方法進(jìn)行大批量生產(chǎn)的步驟中，這種多層的結(jié)構(gòu)在形成多層膜之后的步驟中可以經(jīng)受較少的損壞，從而產(chǎn)生較高的產(chǎn)率。
在本發(fā)明的第一個(gè)方面中，當(dāng)將具有按照第一個(gè)實(shí)施方案的酶電極的傳感器用做葡萄糖傳感器時(shí)，最外層的滲透限制層6限制了葡萄糖的擴(kuò)散速度，在固定化酶層4中使用了葡萄糖氧化酶，擴(kuò)散進(jìn)來(lái)的葡萄糖通過(guò)與氧的催化反應(yīng)產(chǎn)生了過(guò)氧化氫和葡糖酸內(nèi)酯。在兩者中，產(chǎn)生的過(guò)氧化氫到達(dá)電極2時(shí)產(chǎn)生的氧化電流被測(cè)量，用來(lái)確定樣品中含有的葡萄糖的濃度。對(duì)于測(cè)量中的電極系統(tǒng)而言，在雙電極方法的情況下將使用一個(gè)常規(guī)的外部參比電極，而在三電極方法的情況下，將對(duì)電極和參比電極都同時(shí)浸泡在被測(cè)量的溶液中。
第二個(gè)實(shí)施方案在圖2中顯示了根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的第二個(gè)實(shí)施方案的酶電極的構(gòu)型。在圖2所示的酶電極中，在絕緣基材1上形成一個(gè)電極2作為工作電極，一個(gè)主要由尿素化合物構(gòu)成的電極保護(hù)層5覆蓋在它的上表面上。在它們外面形成一個(gè)主要由γ-氨基丙基三乙氧基硅烷構(gòu)成的結(jié)合層3，在其上依次形成一個(gè)由全氟代碳磺酸樹(shù)脂制成的離子交換樹(shù)脂層7、一個(gè)使用有機(jī)聚合物作為基質(zhì)將酶固定化的固定化酶層4、以及一個(gè)用γ-氨基丙基三乙氧基硅烷形成的附著層8，最后，在附著層8上，形成一個(gè)以聚羧酸樹(shù)脂的氟代醇酯作為主要成分的滲透限制層6。
在絕緣基材1上形成的電極2、電極保護(hù)層5、結(jié)合層3、固定化酶層4、附著層8和滲透限制層6可以以與第一個(gè)實(shí)施方案中描述的相同方式依序形成。
在第二個(gè)實(shí)施方案的酶電極中，全氟代碳磺酸樹(shù)脂如Nafion(商品名)可用于合成離子交換樹(shù)脂層7。Nafion是一種可購(gòu)買(mǎi)到的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，其結(jié)構(gòu)中具有一個(gè)磺酸末端基團(tuán)的全氟代聚亞烷基醚側(cè)鏈結(jié)合到一個(gè)全氟代亞甲基主鏈上。
通過(guò)在固定化酶層4下面安排離子交換樹(shù)脂層7，例如Nafion薄膜，干擾物質(zhì)對(duì)電極2的影響可以被消除。因此，它的效應(yīng)與結(jié)合層3、附著層8和電極保護(hù)層5限制干擾物質(zhì)向電極2滲透的效應(yīng)協(xié)同作用，可以極大地減少干擾物質(zhì)對(duì)第二個(gè)實(shí)施方案的酶電極的測(cè)量精確性的影響。
離子交換樹(shù)脂層7的形成是通過(guò)在由γ-氨基丙基三乙氧基硅烷層組成的結(jié)合層3上滴加和旋涂用50％乙醇的純水溶解Nafion制備的溶液。這種用于旋涂的Nafion溶液的溶劑的例子包括醇類(lèi)例如異丙醇和乙醇。在被滴加的溶液中的Nafion的濃度優(yōu)選為1-10w/v％，更優(yōu)選為5-7w/v％。通過(guò)使用在這個(gè)濃度范圍內(nèi)的溶液進(jìn)行旋涂來(lái)形成離子交換樹(shù)脂層7，得到的離子交換樹(shù)脂層7消除干擾物質(zhì)對(duì)電極2的影響的效應(yīng)可以是顯著的。
第三個(gè)實(shí)施方案現(xiàn)在將參考圖3和圖4來(lái)描述根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的酶電極的生產(chǎn)方法。在如第三個(gè)實(shí)施方案所解釋的生產(chǎn)方法中，在由絕緣基材制成的晶片12上首先形成一個(gè)電極薄膜，然后被加工定型分別形成多個(gè)工作電極9、對(duì)電極10和參比電極11。在圖3中顯示了在形成電極的步驟結(jié)束時(shí)的情況。然后，通過(guò)例如旋涂的方法在晶片12上施加一種含酶的溶液，然后將晶片12干燥以形成至少覆蓋了工作電極9的固定化酶層。
接著在完成了形成固定化酶層步驟的晶片12上施加一種含有上述的含硅烷化合物的溶液，然后將晶片12干燥以形成附著層。
然后在附著層的上表面上施加具有前述特殊結(jié)構(gòu)的含氟聚合物的溶液，并將晶片12干燥以形成滲透限制層。使用含氟聚合物例如聚羧酸的氟代醇酯作為組成滲透限制層的成分，可以始終如一地形成具有均一的質(zhì)量和厚度的薄的滲透限制層。此外，當(dāng)使用這樣的含氟聚合物材料時(shí)，含有含氟聚合物的溶液的粘度可以設(shè)置得較低，以便通過(guò)旋涂可以始終如一地形成薄的滲透限制層。
在此之后，將晶片12切成芯片以提供多個(gè)酶電極。在圖4中圖示了三電極方法的酶電極的構(gòu)型。三電極方法的酶電極的構(gòu)型中，工作電極9、對(duì)電極10和參比電極11位于一個(gè)單一芯片上。工作電極9和對(duì)電極10可以與第一個(gè)和第二個(gè)實(shí)施方案中描述的電極2相同。用于參比電極11的材料優(yōu)選為銀/氯化銀。
圖4顯示的工作電極、對(duì)電極和參比電極在單一的絕緣基材上形成的構(gòu)型，使在傳感器操作過(guò)程中更換溶液成為可能。也就是說(shuō)，只要傳感器的表面被例如一個(gè)電解質(zhì)所浸濕，工作電極、對(duì)電極和參比電極在電學(xué)上是彼此相連的，那么即使在更換溶液過(guò)程中傳感器暫時(shí)與空氣接觸，測(cè)量仍可以繼續(xù)而沒(méi)有任何問(wèn)題。此外，它使通過(guò)三電極方法進(jìn)行精確的電化學(xué)測(cè)量成為可能；特別是，可以實(shí)現(xiàn)使用酶電極檢測(cè)細(xì)微的電流。
第四個(gè)實(shí)施方案在圖6中顯示了使用根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的酶電極的生物傳感器的結(jié)構(gòu)。在如第四個(gè)實(shí)施方案所說(shuō)明的生物傳感器中，在絕緣基材1的上面安排了一個(gè)工作電極17、一個(gè)對(duì)電極18和一個(gè)參比電極19，此外還形成了一個(gè)溫度傳感器15。工作電極17、對(duì)電極18和參比電極19的表面分別被具有圖1所示的分層結(jié)構(gòu)的多層薄膜覆蓋。
在第四個(gè)實(shí)施方案中，在用于生物傳感器的酶電極中使用了一種類(lèi)型的工作電極，但是可以使用其結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)工作電極的傳感器，這些工作電極上形成了不同的固定化酶層。此外，除了溫度傳感器之外，放置了其它傳感器例如pH傳感器的構(gòu)型也可以接受。在另一方面，組成三電極方法的酶電極的工作電極17、對(duì)電極18和參比電極19可以被適當(dāng)?shù)匕才?。此外，在第四個(gè)實(shí)施方案中，已經(jīng)描述了由三個(gè)電極即工作電極、對(duì)電極和參比電極組成的生物傳感器，但是生物傳感器本身也可以有這樣的構(gòu)型，即在石英基材上可形成一個(gè)由鉑制成的工作電極和一個(gè)參比電極。
在第四個(gè)實(shí)施方案中，已經(jīng)圖示了一個(gè)測(cè)量電流類(lèi)型的傳感器，但是，根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的酶電極當(dāng)然也可以適用離子敏感的場(chǎng)效應(yīng)晶體管類(lèi)型的傳感器。
此外，第五到第七個(gè)實(shí)施方案將作為本發(fā)明第二個(gè)方面的優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行描述。
第五個(gè)實(shí)施方案根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的第五個(gè)實(shí)施方案將參考附圖進(jìn)行解釋。在圖7中顯示了第五個(gè)實(shí)施方案的酶電極的構(gòu)型。如圖7所示，在第五個(gè)實(shí)施方案的酶電極中，在絕緣基材1上形成了一個(gè)作為工作電極的電極2，在其上依次形成一個(gè)主要由γ-氨基丙基三乙氧基硅烷構(gòu)成的結(jié)合層3以及一個(gè)使用有機(jī)聚合物作為基質(zhì)將酶固定化的固定化酶層4，最后，在固定化酶層4上，形成一個(gè)以聚羧酸樹(shù)脂的氟代醇酯作為主要成分的滲透限制層6。在位于最外表面的滲透限制層的表面中有許多內(nèi)置溝槽。
在根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的酶電極中，所用的絕緣基材1和電極2可以與前述的組成根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的酶電極的絕緣基材和電極相同。此外，絕緣基材和電極的優(yōu)選實(shí)施方案與前述的根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的酶電極的優(yōu)選實(shí)施方案相同。
對(duì)在電極2上形成的結(jié)合層3的使用也與對(duì)根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的酶電極中在電極保護(hù)層上形成的結(jié)合層所述的相同。在這種情況下，第五個(gè)實(shí)施方案的酶電極中的結(jié)合層的優(yōu)選實(shí)施方案也與上述的根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的酶電極中的結(jié)合層的優(yōu)選實(shí)施方案相同。在該第五個(gè)實(shí)施方案的酶電極中，結(jié)合層3可以改善其上形成的固定化酶層4與絕緣基材1以及電極2之間的附著性(結(jié)合力)。結(jié)合層3可以改善絕緣基材1表面的濕潤(rùn)性，以便在形成其中固定了酶的固定化酶層4時(shí)，固定化酶層4的厚度均一性可以提高。此外，結(jié)合層3對(duì)能夠干擾電極2中過(guò)氧化氫反應(yīng)的抗壞血酸、尿酸或?qū)σ阴０被颖憩F(xiàn)出選擇透性。
在根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的酶電極中，所用的固定化酶層4可以與前述的用于根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的酶電極中的固定化酶層相同。在此，固定化酶層的優(yōu)選實(shí)施方案也與前述的根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的酶電極中的優(yōu)選實(shí)施方案相同。
在根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)實(shí)施方案的酶電極中，對(duì)于位于最外表面的滲透限制層6來(lái)說(shuō)，使用具有特殊的表面形式、在其表面上具有許多內(nèi)置溝槽的含有含氟聚合物的滲透限制層6，以便可以防止污染物例如蛋白和尿素化合物附著在酶電極上。因此，由于滲透限制層6防止污染物附著的效應(yīng)，使得即使在長(zhǎng)期使用中也可給出始終如一的輸出性質(zhì)這一效果可以達(dá)到。由于具有特殊表面構(gòu)型的滲透限制層6位于最外的表面，可以獲得良好的滲透控制，能極大地?cái)U(kuò)展可測(cè)量的濃度范圍。例如，在本發(fā)明的第二個(gè)方面中，當(dāng)使用一個(gè)含有第五個(gè)實(shí)施方案的酶電極的傳感器作為葡萄糖傳感器時(shí)，安排在最外表面的滲透限制層6限制了葡萄糖的擴(kuò)散速度，在固定化酶層4中使用了葡萄糖氧化酶，擴(kuò)散進(jìn)來(lái)的葡萄糖由于與氧的催化反應(yīng)產(chǎn)生了過(guò)氧化氫和葡萄酸內(nèi)酯。在兩者中，產(chǎn)生的過(guò)氧化氫到達(dá)電極2時(shí)產(chǎn)生的氧化電流被測(cè)量，用來(lái)確定樣品中含有的葡萄糖的濃度。對(duì)于測(cè)量中的電極系統(tǒng)而言，在雙電極方法的情況下使用一個(gè)常規(guī)的外部參比電極，而在三電極方法的情況下，將對(duì)電極和參比電極都同時(shí)浸泡在被測(cè)量的溶液中。
因此，在根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的酶電極中，在最外表面上形成的滲透限制層6的表面構(gòu)型滿足下面的(1)、(2)或同時(shí)滿足。
(1)在滲透限制層的表面上內(nèi)置許多溝槽。
(2)滲透限制層的平均厚度在0.01到1μm的范圍內(nèi)選擇，優(yōu)選在0.02到0.5μm范圍內(nèi)，滲透限制層的表面粗糙度在滲透限制層的平均厚度的≥0.0001倍到≤1倍之間，優(yōu)選在≥0.001倍到≤1倍之間。
因此，通過(guò)選擇這樣的一種放置在最外表面的滲透限制層6的結(jié)構(gòu)，其表面內(nèi)置許多溝槽或具有表現(xiàn)出表面粗糙度的不規(guī)則形狀，將根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的酶電極設(shè)計(jì)成這樣一種酶電極，它可以在廣泛的應(yīng)用條件下使用，在長(zhǎng)期使用中具有良好的耐久性，在較高生產(chǎn)率時(shí)表現(xiàn)優(yōu)異。此外，當(dāng)利用晶片生產(chǎn)方法進(jìn)行大批量生產(chǎn)時(shí)，產(chǎn)生的酶電極的結(jié)構(gòu)可以始終如一地保證所需的性能。盡管獲得的這些效應(yīng)的機(jī)制尚未清楚地了解，但選擇使用了具有上述的表面結(jié)構(gòu)的滲透限制層6的結(jié)構(gòu)，能夠在一定程度上防止污染物附著到酶電極的表面，并且通過(guò)形成特定的表面構(gòu)型，滲透限制層的強(qiáng)度增加了，這也被認(rèn)為對(duì)性能的改善有所貢獻(xiàn)。
對(duì)于在滲透限制層6表面內(nèi)置的多個(gè)溝槽的大小沒(méi)有特別的限制，但是它們優(yōu)選具有可以在電子顯微鏡、特別是一個(gè)具有極好的三維分析性能的原子力顯微鏡下觀察的小的尺寸。更具體來(lái)說(shuō)，溝槽的深度可以在0.1到100nm的范圍內(nèi)選擇，更優(yōu)選在0.5到30nm范圍內(nèi)。
為了在滲透限制層的表面內(nèi)置許多溝槽或?qū)B透限制層的表面粗糙度調(diào)整到給定的范圍內(nèi)，使用這樣一種生產(chǎn)方法是有效的在晶片表面上形成一個(gè)含有固定化酶層和滲透限制層的多層薄膜，在薄膜沉積后，將晶片切成芯片以產(chǎn)生酶電極；以及在對(duì)晶片進(jìn)行形成滲透限制層的步驟中使用旋涂作為滲透限制層的薄膜形成方法，并進(jìn)一步對(duì)旋涂的條件進(jìn)行足夠的調(diào)整。例如，對(duì)晶片實(shí)行形成多層薄膜的步驟至少包括下面的步驟在絕緣基材的主表面上形成電極薄膜，然后對(duì)電極薄膜進(jìn)行加工以形成多個(gè)電極2的部分；將含有酶的溶液加到絕緣基材的主表面上，然后將絕緣基材干燥以形成固定化酶層4；通過(guò)旋涂施加含有含氟聚合物的溶液，該含氟聚合物的結(jié)構(gòu)中含有至少一個(gè)氟亞烷基嵌段的側(cè)基被連接到一個(gè)未氟化的基于乙烯基的聚合物上，然后將絕緣基材干燥以形成滲透限制層6。接著，可以使用一種酶電極生產(chǎn)方法，其中在形成多層膜后完成將絕緣基材切成芯片以提供多個(gè)酶電極的步驟放在最后執(zhí)行，這使具有上述特定的表面結(jié)構(gòu)的滲透限制層的形成具有良好的生產(chǎn)穩(wěn)定性。
下面是形成滲透限制層6的步驟中在晶片表面上旋涂含有含氟聚合物溶液的優(yōu)選條件。優(yōu)選使用的旋轉(zhuǎn)器的旋轉(zhuǎn)速度是500rpm或以上，更優(yōu)選未2000rpm或以上。旋轉(zhuǎn)器的旋轉(zhuǎn)速度的上限是例如600rpm或以下，即使依賴于所施加的薄膜的厚度。在施加薄膜時(shí)的溫度優(yōu)選在0℃到40℃之間，例如可以在大約4℃時(shí)合適地進(jìn)行薄膜的施加。所用材料的選擇預(yù)計(jì)將對(duì)形成的滲透限制層的形狀，特別是厚度或表面形狀有重大影響，這將在后面詳細(xì)描述。
在根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的酶電極中使用的滲透限制層6由含氟聚合物制成。象本發(fā)明第一個(gè)方面一樣，對(duì)于優(yōu)選的主要構(gòu)成滲透限制層6的聚合物材料來(lái)說(shuō)，舉例的是其中含有至少一個(gè)氟亞烷基嵌段的側(cè)基結(jié)合到一個(gè)未氟化的基于乙烯基的聚合物上的聚合物。通過(guò)使用這種具有特殊結(jié)構(gòu)的含氟聚合物作為主要成分，形成的滲透限制層的表面可以被可靠地控制在適當(dāng)?shù)男螤?，因此可以獲得所需的溝槽或不規(guī)則形狀。結(jié)果，它可以改善根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的酶電極中的測(cè)量穩(wěn)定性，從而增加其在生產(chǎn)過(guò)程中的產(chǎn)率。
此外，在本發(fā)明的第二個(gè)方面的酶電極中，使用這樣一種聚合物作為構(gòu)成滲透限制層6的成分，其未氟化的基于乙烯基的聚合物骨架結(jié)合到至少一個(gè)具有氟亞烷基嵌段的側(cè)基上，可以顯著地改善它與下層的附著性。出于這樣的目的，在根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的酶電極中，所用的組成滲透限制層6的成分可以與前述的組成根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的酶電極的滲透限制層的材料相同。此外，對(duì)于滲透限制層6的組成成分，優(yōu)選實(shí)施方案可以與前述的用于本發(fā)明第一個(gè)方面的酶電極的優(yōu)選實(shí)施方案相同。
在圖7顯示的根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的第五個(gè)實(shí)施方案的酶電極中，滲透限制層6可以通過(guò)在下面的固定化酶層4的上表面上用含有前述的含氟聚合物的溶液進(jìn)行旋涂而形成。滲透限制層6可以通過(guò)在已經(jīng)固定了具有催化活性的酶的固定化酶層4上滴加用全氟代碳溶劑如全氟代己烷稀釋的聚甲基丙烯酸的聚氟代醇酯溶液，然后將施加的溶液進(jìn)行旋涂而形成。在使用旋涂的方法時(shí)，溶液中該含氟聚合物的含量?jī)?yōu)選被調(diào)整到0.1-5wt％，更優(yōu)選為大約0.3wt％，這依賴于測(cè)量的靶物質(zhì)。通過(guò)使用在這個(gè)濃度范圍內(nèi)的溶液旋涂來(lái)形成薄膜，在得到的滲透限制層6中可以獲得較好的滲透控制。此外，對(duì)于形成滲透限制層6的技術(shù)而言，任何方法只要它可以提供均一的薄膜厚度都可以不受限制地使用，例如旋涂、噴涂和浸泡。在這些方法中，當(dāng)使用晶片方法時(shí)，正如前面解釋的，優(yōu)選使用旋涂方法。當(dāng)通過(guò)旋涂形成薄膜時(shí)，可以始終如一地獲得具有均一的質(zhì)量和厚度的滲透限制層。在另一方面，當(dāng)使用構(gòu)型(1)，其中在滲透限制層的表面上內(nèi)置許多溝槽時(shí)，滲透限制層6的厚度優(yōu)選為0.01到1μm，更優(yōu)選為0.02到0.5μm，更優(yōu)選為0.04到0.25μm。通過(guò)使用具有這樣厚度的滲透限制層6，可以獲得改善的酶電極反應(yīng)速度，并減少在測(cè)量后清洗所需的時(shí)間。
第六個(gè)實(shí)施方案在圖8中顯示了根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的第六個(gè)實(shí)施方案的酶電極的構(gòu)型。在圖8所示的酶電極中，在絕緣基材1上形成了一個(gè)作為工作電極的電極2，在其上相繼形成一個(gè)主要由γ-氨基丙基三乙氧基硅烷制成的結(jié)合層3、一個(gè)以有機(jī)聚合物作為基質(zhì)固定了酶的固定化酶層4以及一個(gè)主要由γ-氨基丙基三乙氧基硅烷制成的附著層8，最后在附著層8上形成一個(gè)包含聚羧酸樹(shù)脂的氟代醇酯作為主要成分的滲透限制層6。
在絕緣基材1上形成的電極2、結(jié)合層3、固定化酶層4和滲透限制層6是以根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的第五個(gè)實(shí)施方案中所述的相同的方式按序形成的。
與在前述的根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的酶電極中的附著層一樣，在固定化酶層4上形成的附著層8在改善第六個(gè)實(shí)施方案的酶電極中的固定化酶層4和其上形成的滲透限制層6之間的附著性方面發(fā)揮作用。因此，優(yōu)選用于第六個(gè)實(shí)施方案的酶電極中的附著層8與前述的用于根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的酶電極的附著層相同。
因此，在第六個(gè)實(shí)施方案的酶電極中，附著層8可以由例如一種硅烷偶合劑如γ-氨基丙基三乙氧基硅烷制成，如同前面在結(jié)合層3中描述的那樣。此外，對(duì)于第六個(gè)實(shí)施方案的酶電極中的附著層而言，其優(yōu)選實(shí)施方案可以與前述的根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的酶電極中的附著層的優(yōu)選實(shí)施方案相同。
此外，在本發(fā)明的第二個(gè)方面中，為附著層8和結(jié)合層3施加這種偶合劑溶液的方法可以是用于在本發(fā)明的第一個(gè)方面中形成附著層和結(jié)合層的方法。在這些方法中，當(dāng)用本發(fā)明第二個(gè)方面的偶合劑制作附著層8時(shí)，與在本發(fā)明的第一個(gè)方面中一樣，優(yōu)選使用硅烷偶合劑溶液進(jìn)行旋涂。此外，對(duì)于第六個(gè)實(shí)施方案的酶電極中形成附著層的步驟及其條件而言，其優(yōu)選實(shí)施方案也與前述的用于根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的酶電極的附著層的優(yōu)選實(shí)施方案相同。
第七個(gè)實(shí)施方案在圖6中圖示了使用根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的酶電極的生物傳感器的結(jié)構(gòu)。在如第七個(gè)實(shí)施方案所示的生物傳感器中，在絕緣基材1上也排列了一個(gè)工作電極17、一個(gè)對(duì)電極18和一個(gè)參比電極19，此外還形成了一個(gè)溫度傳感器15。工作電極17、對(duì)電極18和參比電極19的表面分別被具有分層結(jié)構(gòu)的多層薄膜所覆蓋，如圖7中所示。
在第七個(gè)實(shí)施方案中，在用于生物傳感器的酶電極中使用了一種類(lèi)型的工作電極，但是可以使用其結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)工作電極的傳感器，這些工作電極上形成了不同的固定化酶層。此外，除了溫度傳感器之外，放置了其它傳感器例如pH傳感器的構(gòu)型也可以接受。在另一方面，組成三電極方法的酶電極的工作電極17、對(duì)電極18和參比電極19可以被適當(dāng)?shù)匕才?。此外，在第七個(gè)實(shí)施方案中，已經(jīng)描述了含有三個(gè)電極即工作電極、對(duì)電極和參比電極的生物傳感器，但是生物傳感器本身也可以有這樣的構(gòu)型，其中在石英基材上可形成一個(gè)由鉑制成的工作電極和一個(gè)參比電極。
在第七個(gè)實(shí)施方案中，已經(jīng)圖示了一個(gè)測(cè)量電流類(lèi)型的傳感器，但是，根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的酶電極當(dāng)然也可以適用于離子敏感的場(chǎng)效應(yīng)晶體管類(lèi)型的傳感器。
實(shí)施例本發(fā)明將參考實(shí)施例進(jìn)行更具體的描述。在這些實(shí)施例中使用的1H，1H-全氟代辛基聚甲基丙烯酸是從Sumitomo-3M獲得的Florard FC-722，平均分子量Mn為大約6000到8000(GPC測(cè)量值)。
下面陳述的實(shí)施例1到8代表了根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的最優(yōu)選實(shí)施方案，但是本發(fā)明的第一個(gè)方面不限于這些特定的實(shí)施例。
實(shí)施例1如圖3所示，在一個(gè)4英寸的石英晶片12(厚度0.515mm，NipponElectric Glass Co.，Ltd.)上形成了82組電極芯片，每一組具有圖4顯示的構(gòu)型，并含有一個(gè)工作電極9(面積5mm2)、一個(gè)由鉑制成的對(duì)電極10(面積5mm2)和一個(gè)由銀/氯化銀制成的參比電極11(面積1mm2)。在切成單獨(dú)的組時(shí)，每個(gè)電極芯片的大小是10mm×6mm。然后將芯片浸泡在含有150mM氯化鈉的6M尿素溶液中，相對(duì)于參比電極11在工作電極9上施加0.7V電壓10分鐘。實(shí)際上，如圖3所示，所有的工作電極9都是彼此相連的并連接到周邊。因此，周邊和參比電極11被連接到一個(gè)電化學(xué)測(cè)量裝置上，并施加上述的電壓。因此，通過(guò)電解在工作電極9上形成了一個(gè)尿素層作為電極保護(hù)層2。
然后，將1v/v％的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(此后當(dāng)需要時(shí)稱為“APTES”)水溶液進(jìn)行旋涂形成結(jié)合層3。接著，將含有葡萄糖氧化酶和1v/v％戊二醛的22.5w/v％白蛋白溶液進(jìn)行旋涂以形成固定化酶層4。然后，將0.1v/v％的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液進(jìn)行旋涂形成附著層8。隨后，將用全氟代己烷為溶劑配制的0.3wt％的1H，1H-全氟代辛基聚甲基丙烯酸溶液進(jìn)行旋涂以形成由1H，1H-全氟代辛基聚甲基丙烯酸制成的滲透限制層6。這樣就制成了酶電極晶片。
最后，用劃玻璃的裝置將晶片切成芯片以提供酶電極。適當(dāng)選擇三個(gè)制備的酶電極芯片。每個(gè)芯片通過(guò)一根連接電線與一個(gè)撓性基材相連，然后對(duì)連接部分進(jìn)行防水處理。
作為對(duì)照，如上所述制備酶電極晶片，只是在固定化酶層4和滲透限制層6之間不形成附著層8。再次合適地選擇三個(gè)制備的酶電極芯片，每個(gè)芯片通過(guò)一根連接電線與一個(gè)撓性基材相連，然后對(duì)連接部分進(jìn)行防水處理。
將這樣制備的酶電極浸泡在含有150mM氯化鈉的pH7的TES(N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸)緩沖液中進(jìn)行儲(chǔ)存。對(duì)于含有TES緩沖液的200mg/dl的葡萄糖溶液，在第0、1、3、9、27天測(cè)量作為傳感器輸出的電流，并對(duì)測(cè)量的傳感器輸出的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估。儲(chǔ)存溫度為24℃，在儲(chǔ)存過(guò)程中不施加電壓。
作為評(píng)估的結(jié)果，圖9顯示了在固定化酶層4和滲透限制層6之間沒(méi)有附著層8的酶電極的傳感器輸出隨時(shí)間的變化，而圖10顯示了在固定化酶層4和滲透限制層6之間具有附著層8的酶電極的傳感器輸出隨時(shí)間的變化。對(duì)這些結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果表明在固定化酶層4和滲透限制層6之間形成的附著層8可以在一段較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)提供穩(wěn)定的傳感器輸出，傳感器輸出的變化可以被最小化。
實(shí)施例2如圖3所示，在一個(gè)4英寸的石英晶片12(厚度0.515mm，NipponElectric Glass Co.，Ltd.)上形成了82組電極芯片，每一組具有圖4顯示的構(gòu)型，并含有一個(gè)工作電極9(面積5mm2)、一個(gè)由鉑制成的對(duì)電極10(面積5mm2)和一個(gè)由銀/氯化銀制成的參比電極11(面積1mm2)。在切成單獨(dú)的組時(shí)，每個(gè)電極芯片的大小是10mm×6mm。然后將芯片浸泡在含有150mM氯化鈉的6M尿素溶液中，相對(duì)于參比電極11在工作電極9上施加0.7V電壓10分鐘。實(shí)際上，如圖3所示，所有的工作電極9都是彼此相連的并連接到周邊。因此，周邊和參比電極11被連接到一個(gè)電化學(xué)測(cè)量裝置上，并施加上述的電壓。因此，通過(guò)電解在工作電極9上形成了一個(gè)尿素層作為電極保護(hù)層2。
然后，將1v/v％的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液進(jìn)行旋涂形成結(jié)合層3。然后，將5w/v％的全氟代碳磺酸溶液進(jìn)行旋涂以在結(jié)合層3上形成主要由全氟代碳磺酸樹(shù)脂(Nafion)制成的離子交換樹(shù)脂層7。然后，將含有葡萄糖氧化酶和1v/v％戊二醛的22.5w/v％白蛋白溶液進(jìn)行旋涂以形成固定化酶層4。接著，將0.1v/v％的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液進(jìn)行旋涂形成附著層8。隨后，將用全氟代己烷為溶劑配制的0.3wt％的1H，1H-全氟代辛基聚甲基丙烯酸溶液進(jìn)行旋涂以形成由1H，1H-全氟代辛基聚甲基丙烯酸制成的滲透限制層6。這樣就制成了酶電極晶片。
最后，用劃玻璃的裝置將晶片切成芯片以提供酶電極。適當(dāng)選擇20個(gè)制備的酶電極芯片。每個(gè)芯片通過(guò)一根連接電線與一個(gè)撓性基材相連，然后對(duì)連接部分進(jìn)行防水處理。
作為對(duì)照，如上所述制備酶電極晶片，只是在固定化酶層4和滲透限制層6之間不形成附著層8。再次，適當(dāng)選擇20個(gè)制備的酶電極芯片，并把每個(gè)芯片通過(guò)一根連接電線與一個(gè)撓性基材相連，然后對(duì)連接部分進(jìn)行防水處理。
將這樣制備的酶電極浸泡在含有150mM氯化鈉的pH7的TES(N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸)緩沖液中進(jìn)行儲(chǔ)存。對(duì)于含有TES緩沖液的200mg/dl的抗壞血酸溶液，測(cè)量作為傳感器輸出的電流，并對(duì)抗壞血酸影響測(cè)量的傳感器輸出進(jìn)行評(píng)估。儲(chǔ)存溫度為24℃，在儲(chǔ)存過(guò)程中不施加電壓。
作為評(píng)估的結(jié)果，將20個(gè)酶電極的傳感器輸出進(jìn)行平均，圖11顯示了在固定化酶層4和滲透限制層6之間具有附著層8的酶電極的傳感器輸出的相對(duì)值，以在固定化酶層4和滲透限制層6之間沒(méi)有附著層8的酶電極的傳感器輸出為100％。對(duì)這些結(jié)果進(jìn)行比較，表明在固定化酶層4和滲透限制層6之間形成的附著層8可以將作為干擾物質(zhì)的抗壞血酸的影響減少到十分之一。
實(shí)施例3如圖3所示，在一個(gè)4英寸的石英晶片12(厚度0.515mm，NipponElectric Glass Co.，Ltd.)上形成了82組電極芯片，每一組具有圖4顯示的構(gòu)型，并含有一個(gè)工作電極9(面積5mm2)、一個(gè)由鉑制成的對(duì)電極10(面積5mm2)和一個(gè)由銀/氯化銀制成的參比電極11(面積1mm2)。在切成單獨(dú)的組時(shí)，每個(gè)電極芯片的大小是10mm×6mm。然后將芯片浸泡在含有150mM氯化鈉的6M尿素溶液中，相對(duì)于參比電極11在工作電極9上施加0.7V電壓10分鐘。實(shí)際上，如圖3所示，所有的工作電極9都是彼此相連的并連接到周邊。因此，周邊和參比電極11被連接到一個(gè)電化學(xué)測(cè)量裝置上，并施加上述的電壓。由此，通過(guò)電解在工作電極9上形成了一個(gè)尿素層作為電極保護(hù)層2。
然后，將1v/v％的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液進(jìn)行旋涂形成結(jié)合層3。接著，將5w/v％的全氟代碳磺酸溶液進(jìn)行旋涂以在結(jié)合層3上形成主要由全氟代碳磺酸樹(shù)脂(Nafion)制成的離子交換樹(shù)脂層7。然后，將含有葡萄糖氧化酶和1v/v％戊二醛的22.5w/v％白蛋白溶液進(jìn)行旋涂以形成固定化酶層4。然后，將0.1v/v％的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液進(jìn)行旋涂形成附著層8。隨后，將用全氟代己烷為溶劑配制的0.3wt％的1H，1H-全氟代辛基聚甲基丙烯酸溶液進(jìn)行旋涂以形成由1H，1H-全氟代辛基聚甲基丙烯酸制成的滲透限制層6。這樣就制成了酶電極晶片。
最后，用劃玻璃的裝置將晶片切成芯片以提供酶電極。隨機(jī)選擇一個(gè)酶電極芯片，并將它通過(guò)一根連接電線與一個(gè)撓性基材相連，然后對(duì)連接部分進(jìn)行防水處理。
作為對(duì)照，如上所述制備酶電極晶片，只是在固定化酶層4和滲透限制層6之間不形成附著層8。再次隨機(jī)選擇一個(gè)酶電極芯片，并將它通過(guò)一根連接電線與一個(gè)撓性基材相連，然后對(duì)連接部分進(jìn)行防水處理。
將這樣制備的酶電極浸泡在含有150mM氯化鈉的pH7的TES(N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸)緩沖液中進(jìn)行儲(chǔ)存。對(duì)于一個(gè)含有大約10mg/dl葡萄糖的來(lái)自BioRad Inc.(Lifocheck)的正常的尿?qū)φ諛悠愤M(jìn)行10次重復(fù)的連續(xù)的測(cè)量。根據(jù)上述兩個(gè)酶電極的測(cè)量值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)偏差以評(píng)估重復(fù)再現(xiàn)性。作為評(píng)估結(jié)果，表1顯示了以平均測(cè)量值為對(duì)照的重復(fù)再現(xiàn)性的相對(duì)值。
表1

對(duì)這些結(jié)果進(jìn)行比較，在固定化酶層4和滲透限制層6之間具有附著層8的酶電極的重復(fù)再現(xiàn)性為2.5％，而在固定化酶層4和滲透限制層6之間沒(méi)有附著層8的酶電極的重復(fù)再現(xiàn)性為3.1％，表明在固定化酶層4和滲透限制層6之間具有附著層8的酶電極較好。
實(shí)施例4如圖3所示，在一個(gè)4英寸的石英晶片12(厚度0.515mm，NipponElectric Glass Co.，Ltd.)上形成了82組電極芯片，每一組具有圖4顯示的構(gòu)型，并含有一個(gè)工作電極9(面積5mm2)、一個(gè)由鉑制成的對(duì)電極10(面積5mm2)和一個(gè)由銀/氯化銀制成的參比電極11(面積1mm2)。在切成單獨(dú)的組時(shí)，每個(gè)電極芯片的大小是10mm×6mm。然后將芯片浸泡在含有150mM氯化鈉的6M尿素溶液中，相對(duì)于參比電極11在工作電極9上施加0.7V電壓10分鐘。實(shí)際上，如圖3所示，所有的工作電極9都是彼此相連的并連接到周邊。因此，將周邊和參比電極11連接到一個(gè)電化學(xué)測(cè)量裝置上，并施加上述的電壓。由此，通過(guò)電解在工作電極9上形成了一個(gè)尿素層作為電極保護(hù)層2。
然后，將1v/v％的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液進(jìn)行旋涂然后在40℃于氮?dú)鈿夥障赂稍?小時(shí)以形成結(jié)合層3。接著，將5w/v％的Nafion溶液進(jìn)行旋涂，并在40℃于氮?dú)鈿夥罩懈稍?小時(shí)以在結(jié)合層3上形成主要由Nafion制成的離子交換樹(shù)脂層7。然后，將含有葡萄糖氧化酶和1v/v％戊二醛的22.5w/v％白蛋白溶液進(jìn)行旋涂以形成固定化酶層4。
然后，將三個(gè)以純水為溶劑的0.05v/v％、0.1v/v％和0.2v/v％的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液進(jìn)行旋涂，并在40℃于氮?dú)鈿夥罩懈稍?小時(shí)以形成三個(gè)具有不同平均薄膜厚度的附著層8。此外，制備沒(méi)有附著層8的晶片作為對(duì)照。
隨后，在上述4個(gè)晶片上將用全氟代己烷為溶劑配制的0.3wt％的1H，1H-全氟代辛基聚甲基丙烯酸溶液進(jìn)行旋涂以形成由1H，1H-全氟代辛基聚甲基丙烯酸制成的滲透限制層6，這樣就制成了酶電極晶片。
最后，用劃玻璃的裝置將晶片切成芯片以提供酶電極。適當(dāng)選擇5個(gè)酶電極芯片。每個(gè)芯片通過(guò)一根連接電線與一個(gè)撓性基材相連，然后對(duì)連接部分進(jìn)行防水處理。
將這樣制備的4種類(lèi)型的酶電極浸泡在含有150mM氯化鈉的pH7的TES(N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸)緩沖液中進(jìn)行儲(chǔ)存。對(duì)于含有TES緩沖液的0到2000mg/dl的葡萄糖溶液，測(cè)量作為傳感器輸出的電流，并對(duì)5個(gè)酶電極中的每個(gè)進(jìn)行校正曲線作圖。此外，對(duì)于4種類(lèi)型的酶電極中的每個(gè)來(lái)說(shuō)，計(jì)算5個(gè)酶電極在校正曲線中的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖12顯示了在固定化酶層4和滲透限制層6之間沒(méi)有附著層8的酶電極(作為對(duì)照)的測(cè)量結(jié)果，而圖13到15顯示了在固定化酶層4和滲透限制層6之間具有附著層8的酶電極的測(cè)量結(jié)果。圖13、14和15分別顯示了從其中使用濃度為0.05v/v％、0.1v/v％和0.2v/v％的3種γ-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液形成附著層8的酶電極中所獲得的結(jié)果。在這些圖中，(a)顯示了每種類(lèi)型的5個(gè)酶電極的校正曲線，以及(b)是一個(gè)平均值的條形圖，其中誤差棒是標(biāo)準(zhǔn)偏差。對(duì)這些結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在固定化酶層4和滲透限制層6之間形成的附著層8使得可以制備具有較小偏差的酶電極，即表現(xiàn)出均一的性質(zhì)并給出高度線性的校正曲線的酶電極。特別是發(fā)現(xiàn)了在酶電極中當(dāng)附著層8是使用0.1v/v％的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液形成時(shí)可以獲得最佳的性質(zhì)，如圖13所示，這是根據(jù)每個(gè)酶電極的測(cè)量靈敏度、測(cè)量值的偏差和線性程度而確定的。
實(shí)施例5如圖3所示，在一個(gè)4英寸的石英晶片12(厚度0.515mm，NipponElectric Glass Co.，Ltd.)上形成了82組電極芯片，每一組具有圖4顯示的構(gòu)型，并含有一個(gè)工作電極9(面積5mm2)、一個(gè)由鉑制成的對(duì)電極10(面積5mm2)和一個(gè)由銀/氯化銀制成的參比電極11(面積1mm2)。在切成單獨(dú)的組時(shí)，每個(gè)電極芯片的大小是10mm×6mm。然后將芯片浸泡在含有150mM氯化鈉的6M尿素溶液中，相對(duì)于參比電極11在工作電極9上施加0.7V電壓10分鐘。實(shí)際上，如圖3所示，所有的工作電極9都是彼此相連的并連接到周邊。因此，周邊和參比電極11被連接到一個(gè)電化學(xué)測(cè)量裝置上，并施加上述的電壓。由此，通過(guò)電解在工作電極9上形成了一個(gè)尿素層作為電極保護(hù)層2。
然后，將1v/v％的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液進(jìn)行旋涂并在40℃于氮?dú)鈿夥罩懈稍?小時(shí)以形成結(jié)合層3。接著，將5w/v％的Nafion溶液進(jìn)行旋涂，并在40℃于氮?dú)鈿夥罩懈稍?小時(shí)以在結(jié)合層3上形成主要由Nafion制成的離子交換樹(shù)脂層7。然后，將含有葡萄糖氧化酶和1v/v％戊二醛的22.5w/v％白蛋白溶液進(jìn)行旋涂以形成固定化酶層4。
然后，作為用于通過(guò)旋涂形成附著層8的硅烷偶合劑溶液，將0.1v/v％的下列偶合劑(a)到(g)之一溶解于終濃度為5v/v％的乙醇的純水的混合溶劑中，配制7種溶液(a)γ-氨基丙基三乙氧基硅烷；(b)γ-氨基丙基三甲氧基硅烷；(c)N-苯基-γ-氨基丙基三乙氧基硅烷；(d)γ-氯丙基三甲氧基硅烷；(e)γ-巰基丙基三甲氧基硅烷；(f)3-異氰酸根合丙基三乙氧基硅烷；和(g)3-丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷。
在每個(gè)晶片上旋涂7種溶液之一，然后在40℃于氮?dú)鈿夥罩懈稍?小時(shí)以形成由不同硅烷偶合劑制成的附著層8。
然后，在7個(gè)晶片中的每個(gè)上將用全氟代己烷為溶劑配制的0.3wt％的1H，1H-全氟代辛基聚甲基丙烯酸溶液進(jìn)行旋涂以形成由1H，1H-全氟代辛基聚甲基丙烯酸制成的滲透限制層6，這樣就制成了酶電極晶片。
最后，用劃玻璃的裝置將晶片切成芯片以提供酶電極。適當(dāng)選擇5個(gè)酶電極芯片。每個(gè)芯片通過(guò)一根連接電線與一個(gè)撓性基材相連，然后對(duì)連接部分進(jìn)行防水處理。
將這樣制備的7種類(lèi)型的酶電極浸泡在含有150mM氯化鈉的pH7的TES(N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸)緩沖液中進(jìn)行儲(chǔ)存。對(duì)于含有TES緩沖液的0到2000mg/dl的葡萄糖溶液，測(cè)量作為傳感器輸出的電流，并對(duì)5個(gè)酶電極中的每個(gè)進(jìn)行校正曲線作圖。此外，對(duì)于7種類(lèi)型的酶電極中的每個(gè)來(lái)說(shuō)，計(jì)算5個(gè)酶電極在校正曲線中的平均值。圖16顯示了通過(guò)將平均值對(duì)葡萄糖濃度作圖獲得的結(jié)果作為平均值校正曲線。在圖16中，s1到s7代表具有從下列偶合劑制成的附著層8的酶電極s1(a)γ-氨基丙基三乙氧基硅烷；s2(b)γ-氨基丙基三甲氧基硅烷；s3(c)N-苯基-γ-氨基丙基三甲氧基硅烷；s4(d)γ-氯丙基三甲氧基硅烷；s5(e)γ-巰基丙基三甲氧基硅烷；s6(f)3-異氰酸根合丙基三乙氧基硅烷；和s7(g)3-丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷。
盡管電流值和校正曲線的線性在一定程度上隨著用于制備附著層8的偶合劑的類(lèi)型而變化，但是偶合劑(a)到(g)中任何一個(gè)都可以用于在制備的酶電極中對(duì)于低水平的葡萄糖獲得足夠的電流值。也就是說(shuō)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以制備能夠精確地測(cè)量低水平的葡萄糖的酶電極。
實(shí)施例6如圖3所示，在一個(gè)4英寸的石英晶片12(厚度0.515mm，NipponElectric Glass Co.，Ltd.)上形成了82組電極芯片，每一組具有圖4顯示的構(gòu)型，并含有一個(gè)工作電極9(面積5mm2)、一個(gè)由鉑制成的對(duì)電極10(面積5mm2)和一個(gè)由銀/氯化銀制成的參比電極11(面積1mm2)。在切成單獨(dú)的組時(shí)，每個(gè)電極芯片的大小是10mm×6mm。然后將芯片浸泡在含有150mM氯化鈉的6M尿素溶液中，相對(duì)于參比電極11在工作電極9上施加0.7V電壓10分鐘。實(shí)際上，如圖3所示，所有的工作電極9都是彼此相連的并連接到周邊。因此，周邊和參比電極11被連接到一個(gè)電化學(xué)測(cè)量裝置上，并施加上述的電壓。由此，通過(guò)電解在工作電極9上形成了一個(gè)尿素層作為電極保護(hù)層2。
然后，將1v/v％的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液進(jìn)行旋涂并在40℃于氮?dú)鈿夥罩懈稍?小時(shí)以形成結(jié)合層3。接著，將5w/v％的Nafion溶液進(jìn)行旋涂，并在40℃于氮?dú)鈿夥罩懈稍?小時(shí)以在結(jié)合層3上形成主要由Nafion制成的離子交換樹(shù)脂層7。然后，將含有葡萄糖氧化酶和1v/v％戊二醛的22.5w/v％白蛋白溶液進(jìn)行旋涂以形成固定化酶層4。
然后，作為用于通過(guò)旋涂形成附著層8的硅烷偶合劑溶液，將0.1v/v％的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷溶解在三種不同的混合溶劑中形成三種溶液，這三種不同的混合溶劑為終濃度5v/v％的乙醇、甲醇和乙酸乙酯的純水。此外，0.1v/v％的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷的純水溶液作為對(duì)照。4種溶液之一被旋涂在各個(gè)晶片上，并在40℃于氮?dú)鈿夥罩懈稍?小時(shí)以形成附著層8。
隨后，在上述4個(gè)晶片中的每一個(gè)上將用全氟代己烷為溶劑配制的0.3wt％的1H，1H-全氟代辛基聚甲基丙烯酸溶液進(jìn)行旋涂以形成由1H，1H-全氟代辛基聚甲基丙烯酸制成的滲透限制層6，這樣就制成了酶電極晶片。
最后，用劃玻璃的裝置將晶片切成芯片以提供酶電極。適當(dāng)選擇5個(gè)酶電極芯片。每個(gè)芯片通過(guò)一根連接電線與一個(gè)撓性基材相連，然后對(duì)連接部分進(jìn)行防水處理。
將這樣制備的4種類(lèi)型的酶電極浸泡在含有150mM氯化鈉的pH7的TES(N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸)緩沖液中進(jìn)行儲(chǔ)存。對(duì)于含有TES緩沖液的0到2000mg/dl的葡萄糖溶液，測(cè)量作為傳感器輸出的電流，并對(duì)5個(gè)酶電極中的每個(gè)進(jìn)行校正曲線作圖。此外，對(duì)于4種類(lèi)型的酶電極中的每個(gè)來(lái)說(shuō)，計(jì)算5個(gè)酶電極在校正曲線中的平均值。圖17顯示了通過(guò)將平均值對(duì)葡萄糖濃度作圖獲得的結(jié)果作為平均值校正曲線。在圖17中，4個(gè)符號(hào)Et、Mt、EA和W代表了具有不同附著層8的酶電極，它們分別由含有Et乙醇的純水、Mt甲醇的純水、EA乙酸乙酯的純水和W純水作為溶劑的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液制備而成。電流值和校正曲線的線性依賴于混合溶劑的類(lèi)型的差異很小，與使用純水作為溶劑的電極相比，任何通過(guò)在純水中加入少量的有機(jī)溶劑之一制備的混合溶劑即使在葡萄糖濃度低時(shí)也能給出明顯較高的電流值。也就是說(shuō)，可以使用有機(jī)溶劑加到純水中得到的混合溶劑來(lái)進(jìn)行形成由硅烷偶合劑制成的附著層8的步驟，并且其效果與實(shí)施例5中所述的使用在純水中加入少量乙醇得到的混合試劑所獲得的相同。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用在純水中含有任何有機(jī)溶劑的溶劑，其含量在與實(shí)施例6所述的終濃度為5v/v％相當(dāng)?shù)臐舛确秶鷥?nèi)，例如終濃度為7v/v％或以下，就可以制成能夠精確測(cè)量低水平葡萄糖的酶電極。
實(shí)施例7如圖3所示，在一個(gè)4英寸的石英晶片12(厚度0.515mm，NipponElectric Glass Co.，Ltd.)上形成了82組電極芯片，每一組具有圖4顯示的構(gòu)型，并含有一個(gè)工作電極9(面積5mm2)、一個(gè)由鉑制成的對(duì)電極10(面積5mm2)和一個(gè)由銀/氯化銀制成的參比電極11(面積1mm2)。在切成單獨(dú)的組時(shí)，每個(gè)電極芯片的大小是10mm×6mm。然后將芯片浸泡在含有150mM氯化鈉的6M尿素溶液中，相對(duì)于參比電極11在工作電極9上施加0.7V電壓10分鐘。實(shí)際上，如圖3所示，所有的工作電極9都是彼此相連的并連接到周邊。因此，周邊和參比電極11被連接到一個(gè)電化學(xué)測(cè)量裝置上，并施加上述的電壓。由此，通過(guò)電解在工作電極9上形成了一個(gè)尿素層作為電極保護(hù)層2。
然后，將1v/v％的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液進(jìn)行旋涂并在40℃于氮?dú)鈿夥罩懈稍?小時(shí)以形成結(jié)合層3。接著，將5w/v％的Nafion溶液進(jìn)行旋涂，并在40℃于氮?dú)鈿夥罩懈稍?小時(shí)以在結(jié)合層3上形成主要由Nafion制成的離子交換樹(shù)脂層7。然后，將含有葡萄糖氧化酶和1v/v％戊二醛的22.5w/v％白蛋白溶液進(jìn)行旋涂以形成固定化酶層4。
然后，在晶片上將在乙醇加到純水中終濃度為5v/v％的混合溶劑中制得的0.1v/v％的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液進(jìn)行旋涂。然后將晶片在40℃于氮?dú)鈿夥罩懈稍?小時(shí)以形成附著層8。
隨后，將用全氟代己烷為溶劑配制的0.3wt％的1H，1H-全氟代辛基聚甲基丙烯酸溶液進(jìn)行旋涂以形成由1H，1H-全氟代辛基聚甲基丙烯酸制成的滲透限制層6，這樣就制成了酶電極晶片。
最后，用劃玻璃的裝置將晶片切成芯片以提供酶電極。每個(gè)制備的酶電極芯片通過(guò)一根連接電線與一個(gè)撓性基材相連，然后對(duì)連接部分進(jìn)行防水處理。
將這樣制備的酶電極浸泡在含有150mM氯化鈉的pH7的TES(N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸)緩沖液中進(jìn)行儲(chǔ)存。對(duì)于含有TES緩沖液的0到2000mg/dl的葡萄糖溶液，測(cè)量作為傳感器輸出的電流，并對(duì)每個(gè)從在作為基質(zhì)的晶片上制備的芯片制成的酶電極進(jìn)行校正曲線作圖。
此外，作為對(duì)照制備不含附著層8的酶電極晶片，方法同上，只是將形成附著層8的步驟取消，從而獲得不含附著層8的酶電極。對(duì)于這些電極，對(duì)每個(gè)從在作為基質(zhì)的晶片上制備的芯片制成的酶電極進(jìn)行校正曲線作圖。
對(duì)于單個(gè)酶電極而言，可接受的酶電極是在校正曲線的基礎(chǔ)上根據(jù)下列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行選擇的。一個(gè)可接受的酶電極滿足兩個(gè)下列標(biāo)準(zhǔn)在靈敏度方面對(duì)于濃度為2000mg/dl的葡萄糖的輸出值為30nA到150nA之間；在校正曲線的線性方面，對(duì)于濃度為500mg/dl的葡萄糖的輸出值為濃度為2000mg/dl的葡萄糖的輸出值的1/4±30％。從每個(gè)晶片上的每個(gè)芯片形成的82個(gè)酶電極中，選出可接受的酶電極，根據(jù)下面的計(jì)算公式計(jì)算出產(chǎn)率計(jì)算公式產(chǎn)率(％)＝可接受的產(chǎn)品/全部產(chǎn)品×100針對(duì)葡萄糖濃度為2000mg/dl的輸出得到測(cè)量結(jié)果，為了將此用作選擇標(biāo)準(zhǔn)，表2顯示了不具有附著層的酶電極的傳感器輸出值，而表3顯示了具有附著層的酶電極的傳感器輸出值。在這些表中，每個(gè)形成的芯片作為基質(zhì)在晶片上的面內(nèi)位置用一個(gè)字母和一個(gè)數(shù)字結(jié)合起來(lái)表示。例如，從在表2中用“A”和“3”結(jié)合起來(lái)表示的位置上的芯片中形成的酶電極的傳感器輸出值為“43.6”。從評(píng)估結(jié)果看出，對(duì)于不含和含有附著層的酶電極，產(chǎn)率分別為32％(26/82)和85％(70/82)。上述的比較結(jié)果表明在使用晶片方法的大規(guī)模生產(chǎn)過(guò)程中，使用含有附著層的酶電極結(jié)構(gòu)可以有效地提高每個(gè)晶片產(chǎn)生的可接受的產(chǎn)品的產(chǎn)率。
表2葡萄糖濃度為2000mg/dl的輸出值在晶片上的面內(nèi)分布(nA)

表3葡萄糖濃度為2000mg/dl的輸出值在晶片上的面內(nèi)分布(nA)

實(shí)施例8如圖3所示，在一個(gè)4英寸的石英晶片12(厚度0.515mm，NipponElectric Glass Co.，Ltd.)上形成了82組電極芯片，每一組具有圖4顯示的構(gòu)型，并含有一個(gè)工作電極9(面積5mm2)、一個(gè)由鉑制成的對(duì)電極10(面積5mm2)和一個(gè)由銀/氯化銀制成的參比電極11(面積1mm2)。在切成單獨(dú)的組時(shí)，每個(gè)電極芯片的大小是10mm×6mm。然后將芯片浸泡在含有150mM氯化鈉的6M尿素溶液中，相對(duì)于參比電極11在工作電極9上施加0.7V電壓10分鐘。實(shí)際上，如圖3所示，所有的工作電極9都是彼此相連的并連接到周邊。因此，周邊和參比電極11被連接到一個(gè)電化學(xué)測(cè)量裝置上，并施加上述的電壓。由此，通過(guò)電解在工作電極9上形成了一個(gè)尿素層作為電極保護(hù)層2。
然后，將1v/v％的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液進(jìn)行旋涂以形成結(jié)合層3。接著，將5w/v％的Nafion溶液進(jìn)行旋涂以在結(jié)合層3上形成主要由全氟代碳磺酸樹(shù)脂(Nafion)制成的離子交換樹(shù)脂層7。然后，將含有葡萄糖氧化酶和1v/v％戊二醛的22.5w/v％白蛋白溶液進(jìn)行旋涂以形成固定化酶層4。然后，將0.1v/v％的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液進(jìn)行旋涂以形成附著層8。隨后，將用全氟代己烷為溶劑配制的0.1、0.3、1.0或10wt％的1H，1H-全氟代辛基聚甲基丙烯酸溶液分別進(jìn)行旋涂以形成由1H，1H-全氟代辛基聚甲基丙烯酸制成的具有相應(yīng)厚度的滲透限制層6。這樣就制成了4種類(lèi)型酶電極晶片。
旋涂條件如下旋轉(zhuǎn)速度3000rpm，旋轉(zhuǎn)時(shí)間30秒，在4℃大氣中進(jìn)行。
最后，用劃玻璃的裝置將晶片切成芯片以提供酶電極，然后從中適當(dāng)選出每種類(lèi)型各5個(gè)芯片。每個(gè)制備的酶電極芯片通過(guò)一根連接電線與一個(gè)撓性基材相連，然后對(duì)連接部分進(jìn)行防水處理。
將這樣制備的酶電極浸泡在含有150mM氯化鈉的pH7的TES(N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸)緩沖液中進(jìn)行儲(chǔ)存，測(cè)量0到2000mg/dl葡萄糖溶液的電流值，圖18顯示了5個(gè)電極的測(cè)量值的平均值。
如上所述，在具有同樣尺寸的石英晶片表面上以上述4種濃度將1H，1H-全氟代辛基聚甲基丙烯酸溶液進(jìn)行旋涂，以形成用于評(píng)估滲透限制層薄膜厚度的樣品。然后，用劃玻璃的裝置象把晶片切為酶電極芯片那樣把晶片切成同樣大小的小塊。然后使用超聲切割器將評(píng)估樣品上的滲透限制層的一部分剝?nèi)ケ砻嬉员┞冻鍪⒉ＡП砻?。然后，使用原子力顯微鏡(SPI 3000，來(lái)自Seiko Insrument)，測(cè)量(在n＝5)石英玻璃表面和滲透限制層表面之間的臺(tái)階以確定滲透限制層的厚度。表4顯示了測(cè)量到的滲透限制層的厚度。
表4滲透限制層的厚度

從圖18顯示的結(jié)果和表4概括的薄膜厚度的測(cè)量結(jié)果的比較中，可以推斷使用1wt％或以上的1H，1H-全氟代辛基聚甲基丙烯酸溶液，形成的滲透限制層的厚度在250nm或以上，從而滲透限制效應(yīng)急劇增加，引起傳感器的輸出為極其低的電流。但是，由于輸出的線性仍然被保持了，滲透限制層的形成似乎是均一的。
因此，根據(jù)輸出的線性，這表明顯示出合適的滲透控制的滲透限制層的厚度為70nm。
下面陳述的實(shí)施例9到12代表了在本發(fā)明第二個(gè)方面中的最優(yōu)選實(shí)施方案，但是本發(fā)明的第二個(gè)方面不限于這些特定的實(shí)施例。
實(shí)施例9準(zhǔn)備兩張厚度為0.515mm的4英寸晶片(Nippon Electric Glass Co.，Ltd.)，用于下面的步驟。
如圖3所示，在石英晶片12上形成了87組電極芯片，每一組具有圖4顯示的構(gòu)型，并含有一個(gè)工作電極9(面積5mm2)、一個(gè)由鉑制成的對(duì)電極10(面積5mm2)和一個(gè)由銀/氯化銀制成的參比電極11(面積1mm2)。在切成單獨(dú)的組時(shí)，每個(gè)電極芯片的大小是10mm×6mm。如圖3所示，所有的工作電極9都是彼此相連的并連接到周邊。
然后，將1v/v％的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(此后當(dāng)需要時(shí)稱為“APTES”)水溶液進(jìn)行旋涂以形成結(jié)合層3。然后，將含有葡萄糖氧化酶和1v/v％戊二醛的22.5w/v％白蛋白溶液進(jìn)行旋涂以形成固定化酶層4。
然后，將用全氟代己烷為溶劑配制的0.3wt％的1H，1H-全氟代辛基聚甲基丙烯酸溶液加到固定化酶層4上，并將施加的薄膜干燥以形成由1H，1H-全氟代辛基聚甲基丙烯酸制成的滲透限制層6。
對(duì)于一個(gè)晶片，通過(guò)在下述條件下進(jìn)行旋涂來(lái)形成施加的薄膜。通過(guò)旋涂方法制備的樣品稱為“樣品1”。
旋涂旋轉(zhuǎn)速度3000rpm，旋轉(zhuǎn)時(shí)間30秒；施加的溶液體積0.3μl/mm2；沉積溫度(溶液溫度)4℃。
對(duì)于另一個(gè)晶片，施加的薄膜通過(guò)浸涂形成。通過(guò)這種浸涂制備的樣品稱為“樣品2”。
最后，用劃玻璃的裝置將晶片切成芯片以提供酶電極。對(duì)于這兩種通過(guò)不同的方法用組成滲透限制層6的聚合物材料制備的酶電極芯片，測(cè)定滲透限制層6的薄膜厚度和表面粗糙度，并通過(guò)原子力顯微鏡觀察涂有滲透限制層6的電極表面以確定它的表面粗糙度。結(jié)果如下樣品1(旋涂)平均薄膜厚度D0.3μm；表面粗糙度R0.6nm；R/D＝0.002。
樣品2(浸涂)平均薄膜厚度D1.4μm；表面粗糙度R1.3nm；R/D＝0.0009。
表面粗糙度是一個(gè)中值(R50)。
對(duì)于通過(guò)旋涂形成的樣品1，滲透限制層6的整個(gè)表面具有細(xì)小的溝槽。圖23是在滲透限制層6的表面形成的溝槽的表面AFM(AFM原子力顯微術(shù))圖象的打印圖。圖24顯示了一個(gè)相應(yīng)的滲透限制層的表面粗糙度，它是基于圖23顯示的表面AFM圖象來(lái)確定的。溝槽的深度表現(xiàn)出一種向粗糙度集中的分布方式，它們都在0.1到100nm的范圍內(nèi)。
圖25顯示了通過(guò)AFM觀察到的滲透限制層6的圖象的打印圖。在這張圖中，白色的部分指示在滲透限制層上形成的溝槽。已經(jīng)觀察到通過(guò)上述的生產(chǎn)方法形成的滲透限制層6的表面隨機(jī)地具有大量的溝槽。
實(shí)施例10準(zhǔn)備兩張厚度為0.515mm的4英寸晶片(Nippon Electric Glass Co.，Ltd.)，用于下面的步驟。
如圖3所示，在石英晶片12上形成了87組電極芯片，每一組具有圖4顯示的構(gòu)型，并含有一個(gè)工作電極9(面積5mm2)、一個(gè)由鉑制成的對(duì)電極10(面積5mm2)和一個(gè)由銀/氯化銀制成的參比電極11(面積1mm2)。在切成單獨(dú)的組時(shí)，每個(gè)電極芯片的大小是10mm×6mm。如圖3所示，所有的工作電極9都是彼此相連的并連接到周邊。
然后，將1v/v％的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液進(jìn)行旋涂以形成結(jié)合層3。接著，將含有葡萄糖氧化酶和1v/v％戊二醛的22.5w/v％白蛋白溶液進(jìn)行旋涂以形成固定化酶層4。
然后，對(duì)于一個(gè)晶片，在固定化酶層4上通過(guò)旋涂施加用二甲苯六氟化物作為溶劑配制的0.3wt％的丙烯酸樹(shù)脂的氟代醇酯溶液，然后將施加的薄膜干燥以形成由丙烯酸樹(shù)脂的氟代醇酯制成的滲透限制層6。旋涂條件為旋轉(zhuǎn)速度3000rpm，時(shí)間30秒。施加的溶液的制備方法是在1H，1H，2H，2H-全氟代癸基聚丙烯酸的二甲苯六氟化物溶液(丙烯酸樹(shù)脂17％，二甲苯六氟化物83％，粘度在25℃時(shí)為20cps)中加入二甲苯六氟化物溶劑以得到稀釋的溶液，其中樹(shù)脂含量為0.3wt％。最后，用劃玻璃的裝置將晶片切成芯片以制備第一種酶電極。
對(duì)于作為對(duì)照的另一種晶片，在固定化酶層4上通過(guò)浸涂施加丙烯酸樹(shù)脂的氟代醇酯溶液，然后將施加的薄膜干燥以形成由丙烯酸樹(shù)脂的氟代醇酯制成的滲透限制層6。如上所述，用劃玻璃的裝置將晶片切成芯片以制備第二種酶電極。
對(duì)于第一和第二種酶電極中的每一種，從晶片上隨機(jī)取出4個(gè)芯片用于下面的評(píng)估。第一種酶電極的滲透限制層的平均厚度為0.08μm，而第二種酶電極的為1.6μm。對(duì)于第一種酶電極，基于表面AFM圖象所確定的滲透限制層6的圖形，如下平均薄膜厚度D0.08μm；表面粗糙度R0.6nm；R/D＝0.0075。
每個(gè)酶電極芯片通過(guò)連接電線與一個(gè)電化學(xué)測(cè)量裝置相連，然后于24℃浸泡在用含有150mM氯化鈉的pH7的TES(N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸)緩沖液調(diào)整了pH的溶液中。然后，測(cè)量當(dāng)對(duì)不含靶物質(zhì)的溶液施加電壓時(shí)的基本電流和不含靶物質(zhì)的溶液的輸出電流之間的區(qū)別作為傳感器輸出。相對(duì)于參比電極在工作電極上施加700mV的電壓。不僅在測(cè)量過(guò)程中而且在儲(chǔ)存過(guò)程中，每個(gè)酶電極都浸泡在含有150mM氯化鈉的pH7的TES緩沖液中。測(cè)量含有0到2000mg/dl葡萄糖的TES緩沖液溶液的傳感器輸出值，并對(duì)每種類(lèi)型的4個(gè)酶電極進(jìn)行校正曲線作圖。
圖21顯示了在第一種酶電極(旋涂)中針對(duì)葡萄糖的傳感器輸出(校正曲線)。圖22顯示了在第二種酶電極(浸涂)中針對(duì)葡萄糖的傳感器輸出(校正曲線)。對(duì)于通過(guò)旋涂形成滲透限制層6的第一種酶電極，獲得了高度線性的傳感器輸出，觀察到的傳感器之間的輸出差別很小。通過(guò)旋涂在表面制造溝槽而形成的滲透限制層6可以獲得改善的選擇透性，允許葡萄糖順暢地滲透到固定化酶層4。與此相反，當(dāng)滲透限制層通過(guò)浸涂形成時(shí)，傳感器輸出(校正曲線)的線性減少，傳感器之間的輸出差別增加。這可能是因?yàn)槭褂媒吭跐B透限制層6的表面沒(méi)有形成溝槽，從而使葡萄糖的滲透不是很便利，滲透性的差別可能增加，以及在晶片板上形成的每個(gè)酶電極芯片中的性能差別可能增加。
從上面的比較中，當(dāng)通過(guò)旋涂形成滲透限制層6時(shí)產(chǎn)生的酶電極含有在其表面具有溝槽的滲透限制層6，已經(jīng)證實(shí)這樣形成的酶電極表現(xiàn)出優(yōu)異的性質(zhì)，例如高度線性的校正曲線和傳感器之間較小的差別。
實(shí)施例11準(zhǔn)備兩張厚度為0.515mm的4英寸晶片(Nippon Electric Glass Co.，Ltd.)，用于下面的步驟。
如圖3所示，在石英晶片12上形成了87組電極芯片，每一組具有圖4顯示的構(gòu)型，并含有一個(gè)工作電極9(面積5mm2)、一個(gè)由鉑制成的對(duì)電極10(面積5mm2)和一個(gè)由銀/氯化銀制成的參比電極11(面積1mm2)。在切成單獨(dú)的組時(shí)，每個(gè)電極芯片的大小是10mm×6mm。如圖3所示，所有的工作電極9都是彼此相連的并連接到周邊。
然后，將1v/v％的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液進(jìn)行旋涂以形成結(jié)合層3。接著，將含有葡萄糖氧化酶和1v/v％戊二醛的22.5w/v％白蛋白溶液進(jìn)行旋涂以形成固定化酶層4。在固定化酶層4上旋涂1v/v％的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液以形成附著層8。
然后，對(duì)于一個(gè)晶片，在其上形成了附著層8的固定化酶層4上通過(guò)旋涂施加用二甲苯六氟化物作為溶劑配制的0.3wt％的丙烯酸樹(shù)脂的氟代醇酯溶液，然后將施加的薄膜干燥以形成由丙烯酸樹(shù)脂的氟代醇酯制成的滲透限制層6。旋涂條件為旋轉(zhuǎn)速度3000rpm，時(shí)間30秒。施加的溶液的制備方法是在1H，1H，2H，2H-全氟代癸基聚丙烯酸的二甲苯六氟化物的溶液(丙烯酸樹(shù)脂17％，二甲苯六氟化物83％，粘度在25℃時(shí)為20cps)中加入二甲苯六氟化物溶劑以得到稀釋的溶液，其中樹(shù)脂含量為0.3wt％。最后，用劃玻璃的裝置將晶片切成芯片以制備第一種酶電極。
對(duì)于作為對(duì)照的另一種晶片，在固定化酶層4上通過(guò)浸涂施加丙烯酸樹(shù)脂的氟代醇酯溶液，然后將施加的薄膜干燥以形成由丙烯酸樹(shù)脂的氟代醇酯制成的滲透限制層6。如上所述，用劃玻璃的裝置將晶片切成芯片以制備第二種酶電極。
對(duì)于第一和第二種酶電極中的每一種，從晶片上隨機(jī)取出3個(gè)芯片用于下面的評(píng)估。第一種酶電極的滲透限制層的平均厚度為0.2μm，而第二種酶電極的為1.4μm。對(duì)于第一種酶電極，基于表面AFM圖象所確定的滲透限制層6的圖形如下平均薄膜厚度D0.2μm；表面粗糙度R0.5nm；R/D＝0.0025。
每個(gè)酶電極芯片通過(guò)連接電線與一個(gè)電化學(xué)測(cè)量裝置相連，然后于24℃浸泡在用含有150mM氯化鈉的pH7的TES(N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸)緩沖液調(diào)整了pH的溶液中。然后，測(cè)量當(dāng)對(duì)不含靶物質(zhì)的溶液施加電壓時(shí)的基本電流和不含靶物質(zhì)的溶液的輸出電流之間的區(qū)別作為傳感器輸出。相對(duì)于參比電極在工作電極上施加700mV的電壓。不僅在測(cè)量過(guò)程中而且在儲(chǔ)存過(guò)程中，每個(gè)酶電極都浸泡在含有150mM氯化鈉的pH7的TES緩沖液中。例如，測(cè)量含有0到2000mg/dl葡萄糖的TES緩沖液的溶液的傳感器輸出值，并對(duì)每種類(lèi)型的4個(gè)酶電極將校正曲線對(duì)葡萄糖作圖。
對(duì)于第一種酶電極(旋涂)，使用了校正曲線已經(jīng)作圖的三個(gè)傳感器，測(cè)量了糖尿病人真實(shí)尿液中的成分(22個(gè)樣品)。分別地使用一種現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)裝置(商品名Hitachi Automatic Measurement Apparatus7050(日立自動(dòng)測(cè)量裝置7050))在同樣條件下測(cè)量了糖尿病人真實(shí)尿液中的成分(22個(gè)樣品)。將從第一種酶電極測(cè)量到的值針對(duì)用現(xiàn)有裝置測(cè)量所確定的真實(shí)尿液(22個(gè)樣品)中的每種成分的含量進(jìn)行回歸分析，并計(jì)算出對(duì)現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)裝置測(cè)量值的相關(guān)系數(shù)以用于評(píng)估。同樣地，第二種酶電極(浸涂)被用來(lái)確定糖尿病人的真實(shí)尿液中的成分，在回歸分析后，計(jì)算出對(duì)現(xiàn)有裝置測(cè)量值的相關(guān)系數(shù)以用于評(píng)估。表5顯示了從每種酶電極的評(píng)估結(jié)果計(jì)算出的相關(guān)系數(shù)。
對(duì)于通過(guò)旋涂形成滲透限制層6的第一種酶電極，每個(gè)電極給出了較高的相關(guān)性，R為0.99或以上。另一方面，對(duì)于通過(guò)浸涂形成滲透限制層6的第二種酶電極來(lái)說(shuō)，觀察到了電極間相關(guān)系數(shù)中的差別，在任何情況下相關(guān)系數(shù)R為≤0.89。
當(dāng)通過(guò)旋涂形成滲透限制層6產(chǎn)生的酶電極在滲透限制層6的表面具有大量溝槽時(shí)，酶電極具有均一的溝槽，葡萄糖可以順暢地透過(guò)。此外，酶電極被賦予了適當(dāng)?shù)谋砻娲植诙?，以便污染物的附著可以被最小化，因此在晶片板上制備的每個(gè)酶電極的性能可以是一致的。
從上面的比較中，當(dāng)通過(guò)旋涂形成滲透限制層6以產(chǎn)生含有滲透限制層6的酶電極時(shí)，已經(jīng)證實(shí)這樣的酶電極提高了測(cè)量的精確性，等同于利用現(xiàn)有大裝置用于實(shí)驗(yàn)室測(cè)試所測(cè)量的精確性。
表5

實(shí)施例12準(zhǔn)備兩張厚度為0.515mm的4英寸晶片(Nippon Electric Glass Co.，Ltd.)，用于下面的步驟。
如圖3所示，在石英晶片12上形成了87組電極芯片，每一組具有圖4顯示的構(gòu)型，并含有一個(gè)工作電極9(面積5mm2)、一個(gè)由鉑制成的對(duì)電極10(面積5mm2)和一個(gè)由銀/氯化銀制成的參比電極11(面積1mm2)。在切成單獨(dú)的組時(shí)，每個(gè)電極芯片的大小是10mm×6mm。如圖3所示，所有的工作電極9都是彼此相連的并連接到周邊。
然后，將1v/v％的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液進(jìn)行旋涂以形成結(jié)合層3。接著，將含有葡萄糖氧化酶和1v/v％戊二醛的22.5w/v％白蛋白溶液進(jìn)行旋涂以形成固定化酶層4。在固定化酶層4上旋涂1v/v％的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷水溶液以形成附著層8。
然后，對(duì)于一個(gè)晶片，在其上形成了附著層8的固定化酶層4上通過(guò)旋涂施加用二甲苯六氟化物作為溶劑配制的0.3wt％的丙烯酸樹(shù)脂的氟代醇酯溶液，然后將施加的薄膜干燥以形成由丙烯酸樹(shù)脂的氟代醇酯制成的滲透限制層6。旋涂條件為旋轉(zhuǎn)速度3000rpm，時(shí)間30秒。施加的溶液的制備方法是在1H，1H，2H，2H-全氟代癸基聚丙烯酸的二甲苯六氟化物溶液(丙烯酸樹(shù)脂17％，二甲苯六氟化物83％，粘度在25℃時(shí)為20cps)中加入二甲苯六氟化物溶劑以得到稀釋的溶液，其中樹(shù)脂含量為0.3wt％。最后，用劃玻璃的裝置將晶片切成芯片以制備第一種酶電極。
對(duì)于作為對(duì)照的另一種晶片，在固定化酶層4上通過(guò)浸涂施加丙烯酸樹(shù)脂的氟代醇酯溶液，然后將施加的薄膜干燥以形成由丙烯酸樹(shù)脂的氟代醇酯制成的滲透限制層6。如上所述，用劃玻璃的裝置將晶片切成芯片以制備第二種酶電極。
對(duì)于第一和第二種酶電極中的每一種，從晶片上隨機(jī)取出3個(gè)芯片用于下面的評(píng)估。第一種酶電極的滲透限制層的平均厚度為0.2μm，而第二種酶電極的為1.4μm。對(duì)于第一種酶電極，基于表面AFM圖象所確定的滲透限制層6的圖形如下
平均薄膜厚度D0.2μm；表面粗糙度R0.5nm；R/D＝0.0025。
每個(gè)酶電極芯片通過(guò)連接電線與一個(gè)電化學(xué)測(cè)量裝置相連，然后于24℃浸泡在用含有150mM氯化鈉的pH7的TES(N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸)緩沖液調(diào)整了pH的溶液中。然后，測(cè)量當(dāng)對(duì)不含靶物質(zhì)的溶液施加電壓時(shí)的基本電流和不含靶物質(zhì)的溶液的輸出電流之間的區(qū)別作為傳感器輸出。相對(duì)于參比電極在工作電極上施加700mV的電壓。不僅在測(cè)量過(guò)程中而且在儲(chǔ)存過(guò)程中，每個(gè)酶電極都浸泡在含有150mM氯化鈉的pH7的TES緩沖液中。例如，測(cè)量含有0到2000mg/dl葡萄糖的TES緩沖液的溶液的傳感器輸出值，對(duì)每種類(lèi)型的4個(gè)酶電極將校正曲線對(duì)葡萄糖作圖。
對(duì)于第一種酶電極(旋涂)，使用了校正曲線已經(jīng)作圖的三個(gè)傳感器，測(cè)量了糖尿病人血漿中的成分(31個(gè)樣品)。分別地，使用一種現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)裝置(商品名日立自動(dòng)測(cè)量裝置7050)在同樣條件下測(cè)量了糖尿病人血漿中的成分(31個(gè)樣品)。將從第一種酶電極測(cè)量到的值針對(duì)利用現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)裝置測(cè)量確定的血漿(31個(gè)樣品)中的每種成分的含量進(jìn)行回歸分析，并計(jì)算出對(duì)現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)裝置測(cè)量值的相關(guān)系數(shù)以用于評(píng)估。同樣，第二種酶電極(浸涂)被用來(lái)確定糖尿病人的真實(shí)尿液中的成分，在回歸分析后，計(jì)算出對(duì)現(xiàn)有裝置測(cè)量值的相關(guān)系數(shù)以用于評(píng)估。表6顯示了從每種酶電極的評(píng)估結(jié)果計(jì)算出的相關(guān)系數(shù)。
第一種酶電極(旋涂)被用于分析糖尿病人的血漿(31個(gè)樣品)，同時(shí)使用實(shí)驗(yàn)室測(cè)試裝置(商品名日立自動(dòng)測(cè)量裝置7050)作為現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)裝置在相同條件下分析這些樣品。對(duì)獲得的每種成分的值進(jìn)行回歸分析并計(jì)算出相關(guān)系數(shù)以進(jìn)行評(píng)估。此外，使用第二種酶電極(浸涂)來(lái)分析糖尿病人的血漿。結(jié)果顯示在表6中。
對(duì)于通過(guò)旋涂形成滲透限制層6的第一種酶電極，每個(gè)電極給出了較高的相關(guān)性，R為0.99或以上。另一方面，對(duì)于通過(guò)浸涂形成滲透限制層6的第二種酶電極來(lái)說(shuō)，觀察到了電極間相關(guān)系數(shù)中的差別，在任何情況下相關(guān)系數(shù)R≤0.92。
當(dāng)通過(guò)旋涂形成滲透限制層6產(chǎn)生的酶電極含有在其表面具有大量溝槽的滲透限制層6時(shí)，酶電極具有均一的溝槽，葡萄糖可以順暢地透過(guò)。此外，酶電極被賦予了適當(dāng)?shù)谋砻娲植诙?，以便污染物的附著可以被最小化，因此在晶片板上制備的每個(gè)酶電極的性能可以是一致的。此外，盡管沒(méi)有數(shù)據(jù)顯示，完全地除去附著在電極表面特別是最外的表面的污染物，即滲透限制層在測(cè)量后的清洗過(guò)程中可能也對(duì)分析大量樣品時(shí)的測(cè)量精確性的提高有貢獻(xiàn)。
從上面的比較中，當(dāng)通過(guò)旋涂形成滲透限制層6以產(chǎn)生含有滲透限制層6的酶電極時(shí)，已經(jīng)證實(shí)這樣的酶電極提高了測(cè)量的精確性，等同于使用現(xiàn)有的大裝置用于實(shí)驗(yàn)室測(cè)試所測(cè)量的精確性。
表6

工業(yè)實(shí)用性正如上面解釋的，在本發(fā)明中，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的酶電極具有這樣的結(jié)構(gòu)，其中在固定化酶層4上覆蓋形成了含有含硅烷化合物的附著層8，與附著層8的上表面接觸形成了具有特殊結(jié)構(gòu)的含有含氟聚合物的滲透限制層6，因此含有含硅烷化合物的附著層8位于固定化酶層4和滲透限制層6之間，滲透限制層6和其下的層(例如固定化酶層4)之間的附著性可以被改善，并且由于固定化酶層4和滲透限制層6之間的分離而造成的性能的波動(dòng)可以被防止，從而提供具有良好生產(chǎn)穩(wěn)定性的高性能酶電極。此外，根據(jù)本發(fā)明的酶電極的生產(chǎn)方法可用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面的酶電極，以便即使在使用晶片方法時(shí)，也可以以比現(xiàn)有技術(shù)更高生產(chǎn)能力和產(chǎn)量的方式生產(chǎn)高質(zhì)量的酶電極。
此外，在本發(fā)明中，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的酶電極具有這樣的結(jié)構(gòu)，其中在固定化酶層4上在其最外的表面上放置了以含有含氟聚合物為主要成分的滲透限制層6，并且在其表面上形成了一種高度控制的形狀，所述形狀在其表面上具有大量的內(nèi)置溝槽或適當(dāng)?shù)谋砻娲植诙龋瑥亩贡砻嫘螤罡叨瓤刂频臐B透限制層6具有優(yōu)異的選擇透性，可以提供一種可在廣泛條件下使用、表現(xiàn)出良好的長(zhǎng)期使用耐久性和高生產(chǎn)率的酶電極。特別是對(duì)于形成其表面形狀被高度控制的滲透限制層6的步驟，采用了根據(jù)本發(fā)明使用晶片方法的酶電極生產(chǎn)方法，其中含有具有特殊結(jié)構(gòu)的含氟聚合物的溶液通過(guò)旋涂施加在晶片上，然后將施加的薄膜干燥以形成滲透限制層6，以便可以以較高的生產(chǎn)率和產(chǎn)率生產(chǎn)出具有根據(jù)本發(fā)明第二個(gè)方面的結(jié)構(gòu)，并始終如一地表現(xiàn)出所需的性能的酶電極。
權(quán)利要求
1.一種酶電極，其含有一個(gè)在絕緣基材上形成的電極部分；一個(gè)在電極部分上方形成的固定化酶層；一個(gè)在固定化酶層上方形成的含有含硅烷化合物的附著層；以及一個(gè)在附著層上形成的含有含氟聚合物的滲透限制層，在所述含氟聚合物的結(jié)構(gòu)中，一個(gè)含有至少一個(gè)氟亞烷基嵌段的側(cè)基被連接到一個(gè)未氟化的基于乙烯基的聚合物上。
2.權(quán)利要求1所述的酶電極，其中所述附著層是一個(gè)基本上由硅烷偶合劑組成的層。
3.權(quán)利要求1或2所述的酶電極，其中所述含氟聚合物是一種聚羧酸(A)的氟代醇酯，其中含有的聚羧酸(A)作為其未氟化的基于乙烯基的聚合物。
4.權(quán)利要求1或2所述的酶電極，其中所述含氟聚合物是一種含有聚羧酸(A)的氟代醇酯和另一種聚羧酸(B)的烷基醇酯的混合物，在聚羧酸(A)的氟代醇酯中含有的聚羧酸(A)作為未氟化的基于乙烯基的聚合物。
5.權(quán)利要求4所述的酶電極，其中所述含氟聚合物是由所述聚羧酸(A)的氟代醇酯和聚羧酸(B)的烷基醇酯組成的共聚物。
6.權(quán)利要求4或5所述的酶電極，其中所述聚羧酸(B)從聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸或丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物中選擇。
7.權(quán)利要求3到6中任一項(xiàng)所述的酶電極，其中所述聚羧酸(A)從聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸或丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物中選擇。
8.一種酶電極，其含有一個(gè)在絕緣基材上形成的電極部分；一個(gè)覆蓋在電極部分上的電極保護(hù)層；一個(gè)在電極保護(hù)層上形成的含有含硅烷化合物的結(jié)合層；一個(gè)在結(jié)合層上形成的離子交換樹(shù)脂薄膜層；一個(gè)在離子交換樹(shù)脂薄膜層上形成的固定化酶層；一個(gè)在固定化酶層上形成的含有含硅烷化合物的附著層；以及一個(gè)在附著層上形成的含有含氟聚合物的滲透限制層，在所述含氟聚合物的結(jié)構(gòu)中，一個(gè)含有至少一個(gè)氟亞烷基嵌段的側(cè)基被連接到一個(gè)未氟化的基于乙烯基的聚合物上。
9.權(quán)利要求8所述的酶電極，其中所述電極保護(hù)層主要由尿素化合物制成。
10.權(quán)利要求8所述的酶電極，其中所述結(jié)合層和所述附著層基本上由硅烷偶合劑組成。
11.權(quán)利要求8所述的酶電極，其中所述含氟聚合物是一種聚羧酸(A)的氟代醇酯，其中含有的聚羧酸(A)作為其未氟化的基于乙烯基的聚合物。
12.權(quán)利要求8所述的酶電極，其中所述含氟聚合物是含有一種聚羧酸(A)的氟代醇酯和另一種聚羧酸(B)的烷基醇酯的混合物，在聚羧酸(A)的氟代醇酯中含有的聚羧酸(A)作為未氟化的基于乙烯基的聚合物。
13.權(quán)利要求12所述的酶電極，其中所述含氟聚合物是由所述聚羧酸(A)的氟代醇酯和聚羧酸(B)的烷基醇酯組成的共聚物。
14.權(quán)利要求12或13所述的酶電極，其中所述聚羧酸(B)從聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸或丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物中選擇。
15.權(quán)利要求11到13中任一項(xiàng)所述的酶電極，其中所述聚羧酸(A)從聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸或丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物中選擇。
16.一種酶電極，其含有一個(gè)在絕緣基材上形成的電極部分；一個(gè)在電極部分上形成的固定化酶層；以及一個(gè)在固定化酶層上方形成的滲透限制層，其置于最外的表面；其中所述滲透限制層由基本上含有含氟聚合物的薄膜組成，以及在由基本上含有含氟聚合物的薄膜組成的所述滲透限制層的表面上內(nèi)置許多溝槽。
17.權(quán)利要求16所述的酶電極，其中所述滲透限制層的平均厚度在0.01到1μm的范圍內(nèi)選擇；以及滲透限制層的表面具有不規(guī)則的形狀，其具有的表面粗糙度在所述滲透限制層平均厚度的≥0.0001倍到≤1倍的范圍之內(nèi)。
18.權(quán)利要求16所述的酶電極，其中在所述含氟聚合物的結(jié)構(gòu)中，一個(gè)含有至少一個(gè)氟亞烷基嵌段的側(cè)基被連接到一個(gè)未氟化的基于乙烯基的聚合物上。
19.權(quán)利要求16或18所述的酶電極，其中所述含氟聚合物是一種聚羧酸(A)的氟代醇酯，其中含有的聚羧酸(A)作為其未氟化的基于乙烯基的聚合物。
20.權(quán)利要求16或18所述的酶電極，其中所述含氟聚合物是一種含有聚羧酸(A)的氟代醇酯和另一種聚羧酸(B)的烷基醇酯的混合物，在聚羧酸(A)的氟代醇酯中含有的聚羧酸(A)作為未氟化的基于乙烯基的聚合物。
21.權(quán)利要求20所述的酶電極，其中所述含氟聚合物是一種由聚羧酸(A)的氟代醇酯和聚羧酸(B)的烷基醇酯組成的共聚物。
22.權(quán)利要求20或21所述的酶電極，其中所述聚羧酸(B)從聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸或丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物中選擇。
23.權(quán)利要求19到21中任一項(xiàng)所述的酶電極，其中所述聚羧酸(A)從聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸或丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物中選擇。
24.一種生產(chǎn)酶電極的方法，其包含下列步驟在絕緣基材的主表面上形成一個(gè)電極薄膜，然后對(duì)電極薄膜進(jìn)行定型以形成多個(gè)電極部分；在電極表面上覆蓋一層電極保護(hù)層；在絕緣基材的主表面上形成一個(gè)含有含硅烷化合物的結(jié)合層；在絕緣基材的主表面上形成一個(gè)離子交換樹(shù)脂薄膜層；在絕緣基材的主表面上施加含有酶的液體，然后將絕緣基材干燥以形成一個(gè)固定化酶層；在絕緣基材的主表面上通過(guò)旋涂施加含有含氟聚合物的液體，然后將絕緣基材干燥以形成滲透限制層，在所述含氟聚合物的結(jié)構(gòu)中，一個(gè)含有至少一個(gè)氟亞烷基嵌段的側(cè)基被連接到一個(gè)未氟化的基于乙烯基的聚合物上；以及將絕緣基材切成芯片以產(chǎn)生多個(gè)酶電極。
25.權(quán)利要求24中所述的生產(chǎn)酶電極的方法，其中方法以下述方式進(jìn)行在形成固定化酶層所述步驟之后，進(jìn)一步實(shí)施施加含有含硅烷化合物的液體到絕緣基材的主表面然后將絕緣基材干燥以形成附著層的步驟，接著向覆蓋在絕緣基材主表面上的附著層的上表面施加含有一種含有含氟聚合物的液體，然后將絕緣基材干燥以形成滲透限制層的步驟。
26.權(quán)利要求24或25所述的生產(chǎn)酶電極的方法，其中所述滲透限制層是通過(guò)旋涂形成的層。
27.權(quán)利要求25所述的生產(chǎn)酶電極的方法，其中用于形成附著層的所述含硅烷化合物是一種硅烷偶合劑。
28.一種生物傳感器，其含有權(quán)利要求1到23中任一項(xiàng)所述的酶電極。
29.權(quán)利要求24或25所述的生產(chǎn)酶電極的方法，其中在所述含氟聚合物的結(jié)構(gòu)中，一個(gè)含有至少一個(gè)氟亞烷基嵌段的側(cè)基被連接到一個(gè)未氟化的基于乙烯基的聚合物上。
30.權(quán)利要求24、25和29中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)酶電極的方法，其中所述含氟聚合物是一種聚羧酸(A)的氟代醇酯，其中含有的聚羧酸(A)作為其未氟化的基于乙烯基的聚合物。
31.權(quán)利要求24、25、29和30中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)酶電極的方法，其中所述含氟聚合物是一種含有聚羧酸(A)的氟代醇酯和另一種聚羧酸(B)的烷基醇酯的混合物，在聚羧酸(A)的氟代醇酯中含有的聚羧酸(A)作為未氟化的基于乙烯基的聚合物。
32.權(quán)利要求32所述的生產(chǎn)酶電極的方法，其中所述含氟聚合物是由所述聚羧酸(A)的氟代醇酯和聚羧酸(B)的烷基醇酯組成的共聚物。
33.權(quán)利要求31或32所述的生產(chǎn)酶電極的方法，其中所述聚羧酸(B)從聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸或丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物中選擇。
34.權(quán)利要求30到32中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)酶電極的方法，其中所述聚羧酸(A)從聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸或丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物中選擇。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種能夠在廣泛的應(yīng)用條件下表現(xiàn)出良好的測(cè)量性能、在長(zhǎng)期使用中有優(yōu)異的耐久性、可以以較高產(chǎn)率再現(xiàn)的酶電極，以及一種使用特別適合于大規(guī)模生產(chǎn)的晶片方法生產(chǎn)酶電極的方法。根據(jù)本發(fā)明的酶電極含有在絕緣基材1上形成的電極2，在電極2上形成的固定化酶層4和位于最外表面和固定化酶層4上的滲透限制層6，其中在固定化酶層4上還任選形成一個(gè)含有含硅烷化合物的附著層8，在它的上表面形成滲透限制層6；或者滲透限制層6可以是一個(gè)主要含有含氟聚合物的薄膜，其中在其表面上內(nèi)置了許多溝槽，或者薄膜可以具有不規(guī)則的形狀，其平均厚度在0.01到1μm的范圍內(nèi)選擇，其表面的粗糙度為其平均厚度的≥0.0001倍到≤1倍之間。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK1518665SQ02812558
公開(kāi)日2004年8月4日 申請(qǐng)日期2002年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月24日
發(fā)明者松本達(dá) 申請(qǐng)人:日本電氣株式會(huì)社