一種固載甲基轉(zhuǎn)移酶電極傳感器的制備及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及的是一種酶電極傳感器的制備方法及快速檢測應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種固載甲基轉(zhuǎn)移酶電極傳感器的制備方法，用于檢測藥品、生物樣品中的S-腺苷甲硫氨酸技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]酶電極分析方法是將酶蛋白分子采用傳統(tǒng)的吸附法、包埋法、共價鍵合法、交聯(lián)法作用固定化制成固定化酶膜，再與電化學(xué)基礎(chǔ)電極相結(jié)合，構(gòu)成酶電極生物傳感器用于特異底物分析的一項生物技術(shù)。由于酶的高度專一性，該方法具有專一性高、穩(wěn)定性好、檢測速度快、選擇性好、靈敏度高等特點。酶電極研宄起步于20世紀60年代，自2000年以來，生物傳感器技術(shù)在環(huán)境檢測、食品安全、軍事和醫(yī)學(xué)等方面的應(yīng)用日益廣泛，在申請?zhí)枮?01410210210.3的專利中公開了檢測對苯二酚和鄰苯二酚的共固定酶電極制備方法及應(yīng)用；在授權(quán)公告號為CN102435650 B的專利中公開了一種酶電極的制備及快速檢測植物油過氧化值的方法；在授權(quán)公告號為CN102495115 B的專利中公開了利用生物酶電極法檢測根系分泌物中蘋果酸的電化學(xué)方法。
[0003]細胞內(nèi)的甲基化反應(yīng)存在通用甲基供體一S-腺苷甲硫氨酸(S-AdenosyImeth1nine，AdoMet，SAM)，SAM含有活性甲基，細胞內(nèi)幾乎所有用于甲基化修飾的甲基都來自SAM甲硫高能鍵。由于甲基化反應(yīng)的廣泛性，可以說，SAM是細胞內(nèi)參加反應(yīng)的重要性僅次于ATP的一種輔酶，細胞內(nèi)SAM濃度的微小改變，便會對細胞的生長、分化和功能產(chǎn)生重大影響。SAM在細菌體內(nèi)主要是由SAM合成酶(MetK)通過甲硫氨酸(Met)和ATP來合成。當E.的SAM合成酶水平下降，造成細胞內(nèi)甲基供體SAM缺乏時，細胞就不會正常分裂。如果將來自T3噬菌體的AdoMet水解酶基因?qū)隕.菌體細胞，使胞內(nèi)SAM水平下降時，大腸埃希氏菌也形成了不分裂的長絲狀菌體。進一步研宄表明，絲狀菌體中，引發(fā)疋細胞分裂的Z環(huán)復(fù)合體裝配可以正常起始，但不會完成，而當亮氨酸調(diào)節(jié)的SAM合成酶水平恢復(fù)正常，細胞內(nèi)甲基供體SAM不再缺乏時，細胞分裂也隨即恢復(fù)正常。很明顯，細菌細胞的生長分裂與胞內(nèi)SAM濃度是密切相關(guān)的。
[0004]通用甲基供體SAM受甲基轉(zhuǎn)移酶催化去甲基后，生成的通用產(chǎn)物是S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosylhomocystein，SAH), SAH被發(fā)現(xiàn)對胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸的甲基化過程具有普遍的反饋抑制作用，是轉(zhuǎn)甲基化反應(yīng)的有效競爭性抑制劑。在哺乳動物細胞內(nèi)，SAH通過SAH水解酶(SAH hydrolase, SAHH)催化水解生成腺苷酸和高半胱氨酸(Parveen, N.;Cornell, K.A..Me thyIth1adenosine/S-adenosylhomocysteine nucleosidase, acritical enzyme for bacterial metabolism.Mol Microb1l, 20117,9(I):7_20，)，而在大多數(shù)病原微生物的細胞內(nèi)，SAH的代謝則采用完全不同的方式一一通過S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(S-adenosylhomocystein nucleosidase, SAHN)催化裂解生成腺嘌呤和S-核糖基高半胱氨酸，SRH進一步在S-核糖基高半胱氨酸酶(SRHH)的作用下生成高半胱氨酸和 4，5 二輕-2, 3-乙?；?4，5-dihydroxy-2, 3-pentaned1ne，DPD),高半胱氨酸最后通過幾種甲硫氨酸合成酶(MetH、MetE)重新生成SAM的前體一一甲硫氨酸，或者經(jīng)過多步酶催化生成半胱氨酸。
[0005]目前，已報道的測定SAM的方法有高效液相色譜法(HPLC)，該方法存在色譜柱容易污染，分析價格昂貴的缺陷，分光光度法，谷勁松等研宄S-腺苷甲硫氨酸依賴的甲級轉(zhuǎn)移酶活性的檢測方法(谷勁松等，一種S-腺苷甲硫氨酸依賴的甲級轉(zhuǎn)移酶活性的檢測方法，高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，2012，33(3):521~525)，該方法是依賴甲基轉(zhuǎn)移酶、S-腺苷高半胱氨酸核苷酶和S-核糖基高半胱氨酸酶的催化作用將SAM分解為高半胱氨酸，再對高半胱氨酸顯色反應(yīng)，操作比較繁瑣，準確度也不理想。由于樣品的基質(zhì)比較復(fù)雜，給檢測帶來了困難。因此，建立一種靈敏、快速、簡便、特異性高、重復(fù)性好經(jīng)濟使用的檢測方法，對研宄人員、生產(chǎn)企業(yè)、質(zhì)控人員、進出口商檢、政府管理部門等的迫切需要的，對食品、藥品、環(huán)境安全、生物樣品中的SAM含量準確定量測定十分必要，對于SAM生產(chǎn)和藥理研宄也具有十分重要的意義。
[0006]生物酶電極傳感器是當前開發(fā)具有專一性、穩(wěn)定性、檢測速度快、選擇性好、靈敏度高等特點，廣泛用于醫(yī)藥臨床、食品、環(huán)境及生物樣品檢測領(lǐng)域，而將甲基轉(zhuǎn)移酶固載在電極上用于SAM的檢測未見報道。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是將甲基轉(zhuǎn)移酶固載鉑電極上與電化學(xué)相結(jié)合，提供了一種固載甲基轉(zhuǎn)移酶傳感器的制備方法，并應(yīng)用檢測SAM中，采用電聚合法在鉑電極表面電聚合聚(3-噻吩乙酸)制備聚(3-噻吩乙酸)電極，然后將聚3-噻吩乙酸電極氨基化，再將甲基轉(zhuǎn)移酶固載在氨基化的電極上，制備得甲基轉(zhuǎn)移酶電極傳感器。
[0009]儀器與試劑
CHI660B電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)，電聚合體系:工作電極是直徑為3 mm的鉑盤電極，對電極、參比電極均使用直徑為0.5 mm的Pt絲；實驗采用三電極體系:鉑絲電極為輔助電極，Ag/AgCl為參比電極(SCE)，酶電極(GCE)為工作電極；KQ_250E型超聲波清洗器(坤峰超聲儀器有限公司)。
[0010]3-噻吩乙酸，三氟化硼乙醚(BFEE)，N-甲基吡咯烷酮，氯化亞砜，N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)，乙二胺，甲醇，戊二醛，甲基轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.1.1.3)，DNA, SAM ;硫酸，磷酸鹽緩沖溶液，所用試劑均為分析純，水為高純水。
[0011]本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)。
[0012]一種固載甲基轉(zhuǎn)移酶電極傳感器的制備方法，特征在于該方法具有以下工藝步驟:
(1)鉑電極預(yù)處理:將直徑為3mm的鉑盤電極，對電極、參比電極均使用直徑為0.5 mm的Pt絲依次用1.0 Mm、0.3 Mm、0.05 Mm的Al2O3泥漿拋光打磨成鏡面，并在超聲清洗儀中先后用乙醇、水超聲清洗5 min，以清洗后的鉑盤電極做為工作電極，于1.0 mol L—1的硫酸溶液中以0.1 V s—1的速度從-0.2到+1.5 V電位范圍內(nèi)進行循環(huán)伏安掃描至穩(wěn)定，得到預(yù)處理鉑電極；
(2)聚3-噻吩乙酸膜電極制備:將含有3-噻吩乙酸的質(zhì)量百分濃度為35~45%的N-甲基吡咯烷酮溶液通入氮氣除氧15~20min除氧后，加入0.5-1.0 mL三氟化硼乙醚作為電解質(zhì)，將預(yù)處理電極放入，采用計時電流法在電壓為1.4 V，時間為70-90 s的條件下合成3-噻吩乙酸膜電極，將合成的聚合膜在80 °C的真空干燥箱中干燥12小時以除去電極上的溶劑，得到聚3-噻吩乙酸膜電極；
(3)氨基化聚3-噻吩乙酸膜電極制備:在反應(yīng)器中，按如下組成的質(zhì)量百分濃度加入，氯化亞砜:60~75%，N, N- 二甲基甲酰胺:5~12%，混合均勾，將聚3-噻吩乙酸膜電極放入，室溫反應(yīng)24~30h，溫度升到55~60°C恒溫反應(yīng)4~5 h，滴加乙二胺:18~30%，再于55~60°C恒溫反應(yīng)2~3 h，取出電極，用N，N- 二甲基甲酰胺洗滌，于60°C干燥，放入質(zhì)量百分濃度為12%的戊二醛溶液中，超聲50~60min，取出干燥，得到氨基化聚3-噻吩乙酸膜電極；
(4)甲基轉(zhuǎn)移酶固定液的制備:在反應(yīng)器中，按甲基轉(zhuǎn)移酶與DNA質(zhì)量比為1:1加入，甲基轉(zhuǎn)移酶與DNA溶解在pH值為7.2的磷酸鹽緩沖溶液中，溶液中含甲基轉(zhuǎn)移酶與DNA的濃度都在12~15mg/mL范圍內(nèi)，該溶液為甲基轉(zhuǎn)移酶固定液；
(5)固載甲基轉(zhuǎn)移酶電極傳感器的制備方法:取步驟(4)制備的甲基轉(zhuǎn)移酶固定液滴涂到步驟(3)制備的氨基化聚3-噻吩乙酸膜電極上，滴涂的量為22~30 yL，在5~8°C干燥，即得固載甲基轉(zhuǎn)移酶電極傳感器。
[0013]固載甲基轉(zhuǎn)移酶電極傳感器的使用方法:
(1)標準溶液配制:配制一組包括空白標樣在內(nèi)的不同濃度的SAM標準溶液，底液為PH7.2的磷酸鹽緩沖溶液；
(2)將Ag/AgCl為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，本發(fā)明制備的固載甲基轉(zhuǎn)移酶電極為工作電極組成三電極系統(tǒng)，連接CHI660B電化學(xué)工作站，采用計時電流法掃描該溶液，工作電壓為-1.1V，取不同濃度下SAM的峰電流值與SAM濃度做工作曲線；
(3)SAM的檢測:用待測樣品代替步驟(I)中的SAM標準溶液，按照步驟(2)的方法進行檢測，根據(jù)響應(yīng)電流降低的差值Ζ Τ?Ρ工作曲線，得到待測樣品中SAM的含量。
[0014]本發(fā)明的優(yōu)點及效果是:
本發(fā)明采用電化學(xué)聚合制備含有豐富羧基的聚3-噻吩乙酸膜電極，然后在氨基化，再將甲基轉(zhuǎn)移酶固載上，制得固載甲基轉(zhuǎn)移酶電極傳感器。該固載甲基轉(zhuǎn)移酶電極傳感器對SAM表現(xiàn)出很高選擇性和靈敏性，響應(yīng)電流與SAM的濃度在2~25 ymol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R=0.9990，檢測限為4.32X10_6mol/L，將本發(fā)明制備的固載甲基轉(zhuǎn)移酶電極傳感器成功用于藥品、食品中SAM的檢測中，回收率在95.15-105.2%之間，因此本發(fā)明制備的固載甲基轉(zhuǎn)移酶電極傳感器可廣泛應(yīng)用于化工、生物醫(yī)藥、食品、環(huán)保檢測等相關(guān)領(lǐng)域。
【具體實施方式】
[0015]實施例1
(I)鉑電極預(yù)處理:將直徑為3 mm的鉑盤電極，對電極、參比電極均使用直徑為0.5 mm的Pt絲依次用1.0 Mm、0.3 Mm、0.05 Mm的Al2O3泥漿拋光打磨成鏡面，并在超聲清洗儀中先后用乙醇、水超聲清洗5 min，以清洗后的鉑盤電極做為工作電極，于1.0 mol L—1的硫酸溶液中以0.1 V s—1的速度從-0.2到+1.5 V電位范圍內(nèi)進行循環(huán)伏安掃描至穩(wěn)定，得到預(yù)處理鉑電極； (2)聚3-噻吩乙酸膜電極制備:在反應(yīng)器中分別加入1g的3-噻吩乙酸18mL的N-甲基吡咯烷酮溶解后，通入ISmin氮氣除氧，除氧后，加入0.8 mL三氟化硼乙醚作為電解質(zhì)，將預(yù)處理電極放入，采用計時電流法在電壓為1.4 V，時間為80 s的條件下合成3-噻吩乙酸膜電極，將合成的聚合膜在80 °C的真空干燥箱中干燥12小時以除去電極上的溶劑，得到聚3-噻吩乙酸膜電極；
(3)氨基化聚3-噻吩乙酸膜電極制備:在反應(yīng)器中，分別加入，氯化亞砜:5mL，N，N-二甲基甲酰胺:1.0mL，混合均勻，將聚3-噻吩乙酸膜電極放入，室溫反應(yīng)28h，溫度升到58°C恒溫反應(yīng)4.5 h，滴加乙二胺:2.0mL，再于60°C恒溫反應(yīng)2.5 h，取出電極，用N，N-二甲基甲酰胺洗滌，于60°C干燥，放入質(zhì)量百分濃度為12%的戊二醛溶液中，超聲55min，取出干燥，得到氨基化聚3-噻吩乙酸膜電極；
(4)甲基轉(zhuǎn)移酶固定液的制備:準確稱取650mg甲基轉(zhuǎn)移酶和650mgDNA于小燒杯中，加入20 mL左右pH值為7.2的磷酸鹽緩沖溶液使其溶解，定量轉(zhuǎn)移到50.0 mL的容