專利名稱：分析方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分析核酸序列的方法，例如檢測(cè)某一特定序列在樣品中的存在，或測(cè)定某一特定核酸的精確序列，以及在這些方法中所用到的試劑盒和試劑。
目前有許多方法用于核酸分析。分析方法可以是那些檢測(cè)某一特定核酸序列在可能含有該序列的樣品中的存在或含量的方法。其他方法闡明核酸結(jié)構(gòu)以確定其核苷酸序列，用作信息資料或診斷目的。
人們通常利用擴(kuò)增反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)或輔助這種分析，特別是特定核酸序列的含量極微的情況下。利用例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的擴(kuò)增反應(yīng)來(lái)檢測(cè)靶核酸序列是人們所熟悉的。擴(kuò)增反應(yīng)混合物中包含一個(gè)或幾個(gè)對(duì)于特定序列特異的引物。在樣品管中，這些引物將和樣品管中單鏈形式存在的特異靶序列相雜交。如果靶序列存在，引物將與之結(jié)合，在某種溫度條件下混合物中存在的聚合酶會(huì)使引物延伸形成完全互補(bǔ)的一條鏈。這條鏈進(jìn)一步作為模板，在下一輪變性、引物退火和延伸的循環(huán)中進(jìn)行擴(kuò)增。
擴(kuò)增產(chǎn)物可以在電泳膠上檢測(cè)?，F(xiàn)在，經(jīng)常使用熒光標(biāo)記法檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物，和/或監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過(guò)程。這些分析方法包括TAQMANTM分析法，以及WO 99/28500、WO 99/28501、WO 99/42611和WO99/66071中描述并要求保護(hù)的分析方法。WO 98/04738中還描述了利用標(biāo)記的核糖-寡核苷酸探針的分析方法。但是探針的標(biāo)記是一個(gè)耗費(fèi)較多的復(fù)雜的過(guò)程。
核酸測(cè)序的方法也是人們所熟悉的。傳統(tǒng)的方法是凝膠法。最近的方法使用Pyrosequencing AB的Pyrosequencer設(shè)備進(jìn)行，其依賴于在單鏈核酸模板形成一條互補(bǔ)鏈的過(guò)程中，當(dāng)摻入正確的核苷酸時(shí)產(chǎn)生一個(gè)可見(jiàn)信號(hào)。WO 99/46409中還介紹了利用焦磷酸水解反應(yīng)鑒定核酸樣品中特定堿基一致性的其他方法。
申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)未標(biāo)記的RNA探針能夠提供一種監(jiān)測(cè)或檢測(cè)這樣的事件的有利方法。
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)或分析樣品中核酸序列的方法，所述方法包括使所述序列和RNA探針在一定條件下相接觸，使探針能夠和序列相結(jié)合。在一定條件下核酸/探針復(fù)合物中的與核酸結(jié)合的RNA探針?biāo)猱a(chǎn)生單磷酸腺苷(AMP)。檢測(cè)產(chǎn)生的AMP，并將產(chǎn)生AMP的情況和樣品中核酸序列的存在或特征相關(guān)聯(lián)。
在雙鏈狀態(tài)下，RNA探針可以為多種酶所水解。這些酶包括通常用于PCR反應(yīng)的聚合酶，如Taq聚合酶。RNA探針也可以為RNAse酶所水解，RNAse僅能水解雙鏈形式，如RNA/DNA雙鏈體。這種雙鏈體可以在例如PCR反應(yīng)的擴(kuò)增反應(yīng)中形成，但擴(kuò)增反應(yīng)并不是必需的。
本發(fā)明方法中RNA的水解產(chǎn)生單磷酸腺苷(AMP)。在酶的作用下，AMP可以直接磷酸化生成三磷酸腺苷(ATP)，也可以先磷酸化生成二磷酸腺苷，再進(jìn)一步生成ATP。
使用生物發(fā)光系統(tǒng)，可以容易地檢測(cè)ATP。生物發(fā)光系統(tǒng)的一個(gè)特別的實(shí)例是熒光素酶/熒光素檢測(cè)系統(tǒng)。例如，WO 96/02665中描述了這種檢測(cè)系統(tǒng)的應(yīng)用。
生物發(fā)光系統(tǒng)(例如熒光素酶/熒光素系統(tǒng))不能和通常加入PCR反應(yīng)體系中的、聚合酶活性所必需的脫氧ATP(dATP)發(fā)生反應(yīng)。因此，它們能夠區(qū)分RNA探針?biāo)猱a(chǎn)生的ATP和需要加入反應(yīng)混合物中、用于其他目的的dATP。
生物發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)比熒光系統(tǒng)更為靈敏。因此，在分析方法中使用RNA水解探針加速了樣品中核酸水平上相互作用的檢測(cè)，從而提供了更好的分析方法。
在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)靶核酸在樣品中的存在或含量的方法，所述方法包括將樣品中的核酸變性，將變性的核酸和對(duì)于靶核酸中至少一段序列有特異性的RNA水解探針相接觸，使探針和靶核酸形成雙鏈體；加入一種能水解雙鏈形式(如RNA/DNA雙鏈體)RNA的酶，和將產(chǎn)生的單磷酸腺苷轉(zhuǎn)變?yōu)槿姿嵯佘账璧囊环N或幾種酶或試劑；向樣品中加入和ATP發(fā)生反應(yīng)的生物發(fā)光劑，檢測(cè)由生物發(fā)光劑產(chǎn)生的信號(hào)，并將之和靶核酸序列的存在或含量相關(guān)聯(lián)。
該方法經(jīng)常在擴(kuò)增反應(yīng)的意義上進(jìn)行。因此，在另一特別實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)樣品中靶核酸存在或含量的方法，所述方法包括進(jìn)行例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的擴(kuò)增反應(yīng)，該反應(yīng)在以下試劑存在的條件下進(jìn)行(a)一種對(duì)所述靶核酸的至少一部分有特異性的RNA探針；(b)水解雙鏈形式(如RNA/DNA雙鏈體)RNA的酶；(c)將產(chǎn)生的單磷酸腺苷轉(zhuǎn)變?yōu)槿姿嵯佘账璧囊环N或幾種酶或試劑；向樣品中加入和ATP發(fā)生反應(yīng)的生物發(fā)光劑，檢測(cè)由生物發(fā)光劑產(chǎn)生的信號(hào)，并將之和靶核酸序列的存在或含量相關(guān)聯(lián)。
水解雙鏈形式(上述(b))RNA的酶可以是用于擴(kuò)增反應(yīng)的聚合酶?？捎糜诒景l(fā)明的適當(dāng)DNA聚合酶的實(shí)例是例如水生棲熱菌(Thermus aquaticus)聚合酶(Taq)、嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)聚合酶(Tth)、棲熱菌NH聚合酶(TspNH)、Thermus brockianus聚合酶(Tbr)(都可以從例如英國(guó)Farnborough的GeneSys有限公司獲得)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)聚合酶(Pfu)(可以從Stratagene獲得)、9°N7 exo-DNA聚合酶和Thermococcus Litoralis DNA聚合酶(可以從新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室獲得，商品名VENTTMDNA聚合酶)的耐熱聚合酶。然而，如果不能足夠快地水解RNA(比如采用快速PCR時(shí))，可能還需要加入一種適當(dāng)?shù)腞NAse，特別是DNA依賴性的RNAse，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
將產(chǎn)生的單磷酸腺苷轉(zhuǎn)變?yōu)槿姿嵯佘账璧囊环N或幾種酶(上述(c))可以例如選自磷酸烯醇式丙酮酸合酶，該酶在磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸(也是加入反應(yīng)混合物的試劑)存在的情況下直接由AMP生成ATP。或者，聯(lián)合使用核苷三磷酸腺苷酸激酶(nucleosidetriphosphate-adenylate kinase)和NTP生成二磷酸腺苷(ADP)，加入例如腺苷激酶即可以將ADP轉(zhuǎn)化為ATP。
另外，適當(dāng)?shù)拿高€包括例如Eisaki等，Biochim.et Biophys Acta1431(1999)363-373]中描述的丙酮酸磷酸二激酶。
和ATP發(fā)生反應(yīng)的、特別合適的生物發(fā)光劑包括熒光素、熒光素酶以及(如果需要的話)鎂離子源，例如醋酸鎂。在存在ATP的情況下，這些試劑產(chǎn)生一個(gè)光信號(hào)，該信號(hào)可通過(guò)例如常規(guī)的光度計(jì)容易地監(jiān)測(cè)。
在產(chǎn)生信號(hào)的過(guò)程中，這些試劑再次產(chǎn)生AMP分子，這些AMP在存在酶或試劑(c)的情況下會(huì)重新生成ATP。因此信號(hào)以指數(shù)方式累積，可以方便、快速地得以檢測(cè)。Sakakibara等，AnalyticalBiochemistry，268，94-101(1999)描述了這種系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例。在以前可能需要進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的情況中，信號(hào)的這種指數(shù)增長(zhǎng)意味著可以直接進(jìn)行檢測(cè)。
在整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)的過(guò)程中存在或加入生物發(fā)光劑比較合適，這樣可以監(jiān)測(cè)反應(yīng)的全過(guò)程。一般來(lái)說(shuō)，試劑(例如熒光素酶)的熱穩(wěn)定性不足以使試劑在整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中存在。因此，在每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)加入試劑比較合適。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的算法等，可利用這樣的信息對(duì)樣品中靶核酸序列進(jìn)行定量。
擴(kuò)增反應(yīng)可以按照常規(guī)的方法進(jìn)行，例如使反應(yīng)混合物進(jìn)行變性、退火和延伸的溫度循環(huán)。
上述的反應(yīng)可以在各種常規(guī)的儀器上完成。其中包括例如瑞典Pyrosequencing AB的Pyrosequencer，該儀器帶有適當(dāng)?shù)男盘?hào)檢測(cè)裝置。或者，上述的反應(yīng)可利用例如EP-A-0810030中描述的、Perkin-Elmer公司提供的模塊加熱儀、例如Idaho技術(shù)公司的RapidCyclerTM、LightCyclerTM的快速熱空氣熱循環(huán)儀或例如WO98/24548中描述的其他型號(hào)的熱循環(huán)儀完成。


圖1用圖解說(shuō)明了該方法。在PCR反應(yīng)的初始階段，將含有或可能含有特定核酸序列的樣品加熱到一定的溫度，使其中的DNA變性形成單鏈的模板鏈(1)。一個(gè)常規(guī)的PCR引物(2)和模板鏈的一端相結(jié)合，而互補(bǔ)的RNA探針(3)在靶序列的其他位置上結(jié)合。在反應(yīng)的延伸階段，聚合酶起作用將引物(2)以箭頭方向延伸，形成全長(zhǎng)的互補(bǔ)鏈。在這一過(guò)程中，RNA探針(3)將被水解(如圖中虛線所示)從而釋放AMP，AMP在原位生成ATP。這種ATP以光信號(hào)被檢測(cè)。
本發(fā)明的方法還適用于測(cè)序和/或檢測(cè)DNA或RNA序列中的多態(tài)性或變異。
在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了一種確定核酸序列的方法，所述方法包括(i)一種RNA探針和所述核酸序列的已知區(qū)域結(jié)合，使所述探針末端的至少一個(gè)核苷酸達(dá)到該序列的未知或不確定區(qū)域；(ii)利用能夠水解雙鏈形式(如RNA/DNA雙鏈體)RNA的酶水解RNA探針；(iii)將產(chǎn)生的單磷酸腺苷轉(zhuǎn)變?yōu)槿姿嵯佘眨?iv)向樣品中加入和ATP發(fā)生反應(yīng)的生物發(fā)光劑；(v)檢測(cè)由所述生物發(fā)光劑產(chǎn)生的信號(hào)；和(vi)將信號(hào)和序列中某個(gè)區(qū)域的存在相關(guān)聯(lián)，所述區(qū)域與探針末端互補(bǔ)或存在其他情況。
在這樣的情況下，如果探針末端的一個(gè)或幾個(gè)核苷酸和未知或不確定序列精確地互補(bǔ)，探針將最有效地與序列相結(jié)合，而酶將在步驟(ii)中將結(jié)合的探針?biāo)行У亟?。結(jié)果產(chǎn)生AMP，AMP如上所述轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP，通過(guò)生物發(fā)光系統(tǒng)得以檢測(cè)。
但是，如果RNA探針末端的核苷酸不能和模板DNA正確匹配，在步驟(ii)中酶的作用則是很大程度上將完整的探針從模板處移開(kāi)。結(jié)果是不發(fā)生顯著的水解作用，反映為產(chǎn)生的生物發(fā)光信號(hào)不存在或大大減弱。
可以利用末端區(qū)域含有不同核苷酸的探針進(jìn)行多次這種反應(yīng)。比如，如果發(fā)現(xiàn)序列中這一位置上的核苷酸是未知的，可制備末端含有不同核苷酸C、G、U或A的四種探針。按照本發(fā)明中的方法，利用這些探針?lè)謩e進(jìn)行反應(yīng)，從產(chǎn)生信號(hào)的水平可以容易地得知這一位置上究竟是哪種核苷酸。只有末端包含互補(bǔ)核苷酸的探針?biāo)l(fā)生的反應(yīng)才能產(chǎn)生好的信號(hào)。
如果需要的話，探針末端可以包含多于一個(gè)的未知核苷酸，例如至多三個(gè)核苷酸。這樣的情況下，可使用在這些位置上具有所有可能的序列組合的探針。預(yù)期末端具有精確互補(bǔ)序列的探針將被有效地水解。
所用的末端可以是探針的3′或5′末端，依賴于已知序列和未知或不確定序列的性質(zhì)。選擇步驟(ii)中使用的酶時(shí)也應(yīng)考慮這一點(diǎn)。當(dāng)末端是3′末端、步驟(ii)中使用的酶具有3′-5′水解活性時(shí)，緊密結(jié)合的RNA探針?biāo)庑Ч?和3′-5′水解相比)，而3′-5′水解活性是具有較好“校正”功能的酶通常所具有的活性。
當(dāng)進(jìn)行許多反應(yīng)時(shí)，這些反應(yīng)在以陣列排列的單獨(dú)反應(yīng)管、孔或器皿中同時(shí)進(jìn)行是合適的。這些管、孔或器皿可以一起進(jìn)行循環(huán)，利用一個(gè)適當(dāng)位置上的光度計(jì)監(jiān)測(cè)各管產(chǎn)生的信號(hào)。
或者，探針可以固定在一種載體(例如“測(cè)驗(yàn)片(dipstick)”)上用于診斷性檢驗(yàn)。比如，按照如下所述檢測(cè)特定受試序列中的多態(tài)性或等位變異。
用于該方法的酶和試劑與上述檢測(cè)核酸樣品的存在或含量的方法中所用的酶和試劑相似。反應(yīng)也可在上述的儀器中進(jìn)行。
反應(yīng)可以和例如PCR的擴(kuò)增反應(yīng)聯(lián)用。例如，反應(yīng)可以在PCR反應(yīng)后進(jìn)行。在PCR反應(yīng)中至少某些階段可以實(shí)現(xiàn)步驟(ii)中的水解。但是，一般來(lái)說(shuō)，由于被檢測(cè)的AMP的“再循環(huán)”使系統(tǒng)自身能夠提供好的擴(kuò)增信號(hào)，擴(kuò)增反應(yīng)并不是必需的。
在至少一部分起始序列是已知的情況下(例如通用引物序列)，這種方法可用于測(cè)序。沿著序列重復(fù)進(jìn)行分析，就可以測(cè)定整個(gè)序列。在例如已知序列含有多個(gè)保守區(qū)域的情況下(例如在核糖分型(Ribotyping)中出現(xiàn)的)，有可能利用RNA寡核苷酸文庫(kù)作為探針，進(jìn)行平行反應(yīng)來(lái)測(cè)定序列。這些區(qū)域可各自作為已知序列來(lái)定位RNA探針。
本發(fā)明中的方法還可用于進(jìn)行反方向測(cè)序確認(rèn)。這可能是由于保守區(qū)域的存在，這種確認(rèn)可利用反應(yīng)陣列平行進(jìn)行。
或者，本發(fā)明的方法可用于檢測(cè)多態(tài)性或等位變異，用于診斷。這種情況下，大部分序列是已知的，只有多態(tài)性或變異位點(diǎn)處一個(gè)或幾個(gè)核苷酸不確定。這種情況下，RNA探針至少有一個(gè)末端區(qū)域的核苷酸和序列中的多態(tài)性或變異相對(duì)應(yīng)，這樣有效的水解或不水解將指示確切的序列是否和探針序列互補(bǔ)。
如上所述，這些反應(yīng)可以在反應(yīng)管、孔或器皿中進(jìn)行。而且，當(dāng)進(jìn)行多個(gè)反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)以陣列方式進(jìn)行更為方便。
進(jìn)一步來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供了用于上述方法的試劑盒。這種試劑盒包括對(duì)靶序列有特異性的至少一種RNA探針，和可選的將AMP轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP的裝置(means)。對(duì)于檢測(cè)多態(tài)性的方法來(lái)說(shuō)，試劑盒包括至多四種相似的RNA探針，四種探針的差別僅在于3′末端的核苷酸不同。
試劑盒再包含一種或幾種用于該方法的試劑是合適的。具體地說(shuō)，試劑盒可含有例如熒光素酶和/或熒光素的生物發(fā)光劑。試劑盒中其他特定的可選組分還包括用于特定擴(kuò)增反應(yīng)的引物。另外，試劑盒可包括上述的水解RNA的DNA聚合酶或RNAse。
為了實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增所需的例如緩沖液、核苷酸、聚合酶等的其他試劑也可包括在試劑盒中。
因此，RNA水解探針提供了非常多樣化的手段以產(chǎn)生信號(hào)，所述信號(hào)指示非常特異的核酸序列在樣品中的存在。將這種探針和生物發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)聯(lián)用的分析方法的靈敏性高，可以迅速產(chǎn)生信號(hào)。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)或分析樣品中核酸序列的方法，所述方法包括將所述序列和RNA探針在一定條件下接觸，使探針和序列結(jié)合，使核酸/探針復(fù)合物中的與核酸結(jié)合的RNA探針在一定條件下水解產(chǎn)生單磷酸腺苷(AMP)，檢測(cè)產(chǎn)生的AMP，并將產(chǎn)生的AMP和樣品中核酸序列的存在或特征相關(guān)聯(lián)。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中產(chǎn)生的單磷酸腺苷(AMP)被轉(zhuǎn)變?yōu)槿姿嵯佘?ATP)，利用生物發(fā)光劑檢測(cè)ATP。
3.按照權(quán)利要求2的方法，其中AMP在酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP。
4.按照權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的方法，其中生物發(fā)光劑包括熒光素酶/熒光素檢測(cè)系統(tǒng)。
5.按照前面任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中RNA探針以雙鏈形式存在時(shí)，被用于PCR反應(yīng)中的聚合酶水解。
6.檢測(cè)靶核酸在樣品中存在或含量的方法，所述方法包括在以下試劑存在時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)(a)和所述靶核酸的至少一部分序列有特異性的RNA探針；(b)能夠水解雙鏈形式RNA的酶；(c)將產(chǎn)生的單磷酸腺苷轉(zhuǎn)變?yōu)槿姿嵯佘账璧囊环N或幾種酶和/或試劑；向樣品中加入和ATP發(fā)生反應(yīng)的生物發(fā)光劑，檢測(cè)由生物發(fā)光劑產(chǎn)生的信號(hào)，并將之和靶核酸序列的存在或含量相關(guān)聯(lián)。
7.按照權(quán)利要求6的方法，其中擴(kuò)增反應(yīng)是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。
8.按照權(quán)利要求7的方法，其中(b)中的酶是用于擴(kuò)增反應(yīng)的DNA聚合酶或RNAse。
9.按照權(quán)利要求6～8任何一項(xiàng)的方法，其中(c)包括磷酸烯醇式丙酮酸合酶、磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸。
10.按照權(quán)利要求6～8任何一項(xiàng)的方法，其中(c)包括核苷三磷酸腺苷酸激酶、5′-三磷酸核苷(NTP)和腺苷酸激酶的組合。
11.按照權(quán)利要求6～10任何一項(xiàng)的方法，其中生物發(fā)光劑包括熒光素和熒光素酶。
12.按照權(quán)利要求11的方法，其中生物發(fā)光劑還包括鎂離子源。
13.按照權(quán)利要求6～12任何一項(xiàng)的方法，其中在整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中都加有生物發(fā)光劑。
14.一種確定核酸序列的方法，所述方法包括(i)將RNA探針和所述序列的已知區(qū)域結(jié)合，使得所述探針末端的至少一個(gè)核苷酸達(dá)到該序列的未知或不確定區(qū)域；(ii)利用僅能夠水解雙鏈形式(如RNA/DNA雙鏈體)RNA的酶水解RNA探針；(iii)將產(chǎn)生的單磷酸腺苷轉(zhuǎn)變?yōu)槿姿嵯佘眨?iv)向樣品中加入和ATP發(fā)生反應(yīng)的生物發(fā)光劑；(v)檢測(cè)由所述生物發(fā)光劑產(chǎn)生的信號(hào)；和(vi)將信號(hào)和序列中某區(qū)域的存在相關(guān)聯(lián)，所述區(qū)域與探針末端互補(bǔ)或不互補(bǔ)。
15.按照權(quán)利要求14的方法，可以利用末端有不同核苷酸的RNA水解探針進(jìn)行多次反應(yīng)。
16.按照權(quán)利要求15的方法，其中利用末端有不同的C、G、U和A之一的相似RNA水解探針進(jìn)行四次反應(yīng)。
17.按照權(quán)利要求15或權(quán)利要求16的方法，其中反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行。
18.按照權(quán)利要求17的方法，其中反應(yīng)在以陣列方式排列的單獨(dú)反應(yīng)管、孔或器皿中進(jìn)行。
19.按照權(quán)利要求14～18任何一項(xiàng)的方法，其中步驟(iii)中的轉(zhuǎn)變通過(guò)加入磷酸烯醇式丙酮酸合酶、磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸進(jìn)行。
20.按照權(quán)利要求14～18任何一項(xiàng)的方法，其中步驟(iii)中的轉(zhuǎn)變通過(guò)加入核苷三磷酸腺苷酸激酶、5′-三磷酸核苷(NTP)和腺苷酸激酶的組合來(lái)進(jìn)行。
21.按照權(quán)利要求14～20任何一項(xiàng)的方法，其中步驟(iv)中使用的生物發(fā)光劑包括熒光素和熒光素酶。
22.按照權(quán)利要求21的方法，其中生物發(fā)光劑還包括鎂離子源。
23.按照權(quán)利要求14～22任何一項(xiàng)的方法，用于檢測(cè)多態(tài)性或等位變異。
24.按照權(quán)利要求23的方法，其中RNA探針固定在例如測(cè)驗(yàn)片的載體上。
25.按照權(quán)利要求14～22任何一項(xiàng)中的方法，用于核酸測(cè)序。
26.一種用于分析的試劑盒，包括對(duì)靶序列有特異性的至少一種RNA探針，以及能水解雙鏈形式RNA的酶。
27.按照權(quán)利要求26的試劑盒，還包括將AMP轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP的裝置。
28.按照權(quán)利要求27的試劑盒，其中所述裝置包括磷酸烯醇式丙酮酸合酶、磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸的組合；或者核苷三磷酸腺苷酸激酶、5′-三磷酸核苷(NTP)和腺苷酸激酶的組合。
29.按照權(quán)利要求27～28任何一項(xiàng)的試劑盒，包括至多四種相似的RNA探針，其差別僅在于末端核苷酸的不同。
30.按照權(quán)利要求27～29任何一項(xiàng)的試劑盒，還包括生物發(fā)光劑。
31.按照權(quán)利要求30的試劑盒，包括熒光素酶和/或熒光素。
32.按照權(quán)利要求27～31任何一項(xiàng)的試劑盒，還包括擴(kuò)增引物。
33.按照權(quán)利要求27～32任何一項(xiàng)的試劑盒，還包括水解RNA的DNA聚合酶或RNAse。
34.一種檢測(cè)樣品中靶核酸存在或含量的方法，所述方法包括使樣品中的核酸變性，將變性的樣品與對(duì)所述靶核酸的至少一部分序列有特異性的RNA水解探針相接觸，使探針和靶核酸形成雙鏈體；加入能夠水解雙鏈形式(如RNA/DNA雙鏈體)RNA的酶和將產(chǎn)生的單磷酸腺苷轉(zhuǎn)變?yōu)槿姿嵯佘账璧囊环N或幾種酶或試劑；向樣品中加入和ATP發(fā)生反應(yīng)的生物發(fā)光劑，檢測(cè)由所述生物發(fā)光劑產(chǎn)生的信號(hào)，并將之和靶核酸序列的存在或含量相關(guān)聯(lián)。
35.RNA探針在按照權(quán)利要求1～26或34任何一項(xiàng)的方法中的用途。
全文摘要
本發(fā)明描述了利用RNA探針檢測(cè)或分析核酸序列的分析方法。這些探針和可能含有某核酸序列的樣品相接觸，如果它們能夠形成雙鏈體，則它們將被水解。這可以在例如擴(kuò)增反應(yīng)的過(guò)程中完成。水解產(chǎn)生的AMP被轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP。利用生物發(fā)光劑可檢測(cè)ATP。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1526026SQ02813859
公開(kāi)日2004年9月1日 申請(qǐng)日期2002年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月9日
發(fā)明者D·J·斯奎雷爾, M·A·李, D J 斯奎雷爾, 李 申請(qǐng)人:英國(guó)國(guó)防部