本發(fā)明涉及了一種快速檢測(cè)黃曲霉毒素B1的方法及試劑盒，屬于酶聯(lián)免疫分析領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

黃曲霉毒素（Aflatoxins）是黃曲霉和寄生曲霉等產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似的次生代謝產(chǎn)物，是一組以二吠喃香豆素為基本結(jié)構(gòu)的化合物。廣泛存在于各種糧食谷物和飼料及其加工品中，對(duì)人類和動(dòng)物表現(xiàn)出很強(qiáng)的毒性。黃曲霉毒素1993年被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為Ⅰ類致癌物。其中黃曲霉毒素B1（AFB1）的致癌性、致突變性、致畸性均居首位。

現(xiàn)有技術(shù)中常用的黃曲霉毒素檢測(cè)技術(shù)主要有薄層層析法（TLC)、高效液相色譜法（HPLC)、免疫學(xué)分析法。前兩者具有樣品前處理步驟繁瑣，耗時(shí)費(fèi)力，儀器價(jià)格昂貴，需要專業(yè)人員操作等的缺點(diǎn)，而免疫學(xué)分析法具有特異性強(qiáng)、樣品前處理簡(jiǎn)單、成本低、對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和環(huán)境的污染危害小等優(yōu)點(diǎn)。免疫學(xué)分析法特別是酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)具有快速、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，適合高通量樣品篩選，因此對(duì)于快速檢測(cè)黃曲霉毒素的殘留，ELISA方法更具優(yōu)勢(shì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測(cè)黃曲霉毒素B1的方法及試劑盒，以便快速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)黃曲霉毒素B1。

本發(fā)明所述的檢測(cè)黃曲霉毒素B1試劑盒包括：黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液，黃曲霉毒素B1包被反應(yīng)板，酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原稀釋緩沖液，底物液，顯色液，終止液，樣品稀釋液，濃縮洗滌液，濃縮PBS溶液。

基于上述，所述黃曲霉毒素B1試劑盒的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為：0 ng/ml，0.1 ng/ml，0.25 ng/ml，0.5 ng/ml，1 ng/ml，2 ng/ml。

基于上述，所述黃曲霉毒素B1試劑盒的黃曲霉毒素B1包被反應(yīng)板，包被液是黃曲霉毒素B1抗體，濃度為2~6 ug/ml，每孔包被90~160 ul的包被液。

本發(fā)明所述的快速檢測(cè)黃曲霉毒素B1試劑盒的方法，包括以下步驟：

1) 取上述所述包被反應(yīng)板，洗滌0~1次，甩干，拍干；

2) 分別在包被反應(yīng)板各孔加入50 μL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液、50 μL待測(cè)樣液；

3) 每孔均加入50 μL酶標(biāo)抗原工作溶液；

4) 放入37 ℃培養(yǎng)箱，孵育8 min～15 min；

5) 取出反應(yīng)板，洗滌4~5次，甩干、拍干后，每孔分別加入50 μL的底物液和50 μL的顯色液；

6) 放入37 ℃培養(yǎng)箱，孵育8 min～15 min；

7) 每孔分別加入50 μL的終止液，用450 nm酶標(biāo)儀讀取各孔的吸光度。

本發(fā)明提供了一種快速檢測(cè)黃曲霉毒素B1的方法及試劑盒，反應(yīng)時(shí)間縮短到25~35分鐘，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，同時(shí)簡(jiǎn)化了洗滌過程，加快了實(shí)驗(yàn)反應(yīng)進(jìn)程，可有效提高批量檢測(cè)速度。能快速、簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)黃曲霉毒素B1。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

實(shí)施例1

一種快速檢測(cè)黃曲霉毒素B1的方法及試劑盒

一、包被反應(yīng)板的制備

1、將黃曲霉毒素B1抗體加入反應(yīng)板中，抗體包被液濃度為2 ug/ml，每孔包被150 ul，保鮮膜密封后4 ℃冰箱過夜后，洗滌1次，拍干。

2、每孔加入250 ul封閉液后，包被反應(yīng)板密封后，37 ℃孵育2小時(shí)。

3、取出包被反應(yīng)板，甩干，拍干，37 ℃烘干1.5小時(shí)。

二、黃曲霉毒素B1的超級(jí)快試劑盒

1、取相應(yīng)的包被反應(yīng)板放在框架上，對(duì)反應(yīng)孔進(jìn)行編號(hào)，設(shè)定1~6號(hào)孔為AFB1標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照孔，其余孔為樣品孔。

2、洗滌：每孔加入250 μL（約5滴）洗滌液，放置1 min。甩干，在吸水紙上拍干。

3、實(shí)驗(yàn)加樣：1~6號(hào)孔分別加入50 μL的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液（0，0.1，0.25，0.5，1，2 ppb），其余孔加入相應(yīng)的待測(cè)樣液。

4、加酶標(biāo)抗原：各反應(yīng)孔均加入50 μL的酶標(biāo)抗原工作溶液。輕輕振搖包被反應(yīng)板框架，使試劑充分混勻。蓋上蓋子，放入37 ℃培養(yǎng)箱，孵育8 min。

5、洗滌：取出反應(yīng)板，甩干，拍干。每孔加入250 μL（約5滴）的洗滌液，放置1 min。甩干并拍干。按上述操作再重復(fù)洗滌4次。

6、顯色：反應(yīng)板拍干后，每孔分別加入50 μL的底物液和50 μL的顯色液。輕輕振搖包被反應(yīng)板框架，使試劑充分混勻。蓋上蓋子，放入37 ℃培養(yǎng)箱，孵育8 min。

7、讀取數(shù)值：取出反應(yīng)板，每孔加入50 μL的終止液。輕輕振搖包被反應(yīng)板框架，使反應(yīng)板中的試劑充分混勻。放入450 nm酶標(biāo)儀中讀取各孔的吸光度（OD值）數(shù)值。用數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行處理得出濃度值。

實(shí)施例2

一、包被反應(yīng)板的制備

1、將黃曲霉毒素B1抗體加入反應(yīng)板中，抗體包被液濃度為6 ug/ml，每孔包被90 ul，保鮮膜密封后4 ℃冰箱過夜后，洗滌1次，拍干。

2、每孔加入250 ul封閉液后，包被反應(yīng)板密封后，37 ℃孵育2小時(shí)。

3、取出包被反應(yīng)板，甩干，拍干，37 ℃烘干1.5小時(shí)。

二、黃曲霉毒素B1的超級(jí)快試劑盒

1、取相應(yīng)的包被反應(yīng)板放在框架上，對(duì)反應(yīng)孔進(jìn)行編號(hào)，設(shè)定1~6號(hào)孔為AFB1標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照孔，其余孔為樣品孔。

2、洗滌：每孔加入250 μL（約5滴）洗滌液，放置1 min。甩干，在吸水紙上拍干。

3、實(shí)驗(yàn)加樣：1~6號(hào)孔分別加入50 μL的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液（0，0.1，0.25，0.5，1，2 ppb），其余孔加入相應(yīng)的待測(cè)樣液。

4、加酶標(biāo)抗原：各反應(yīng)孔均加入50 μL的酶標(biāo)抗原工作溶液。輕輕振搖包被反應(yīng)板框架，使試劑充分混勻。蓋上蓋子，放入37 ℃培養(yǎng)箱，孵育15 min。

5、洗滌：取出反應(yīng)板，甩干，拍干。每孔加入250 μL（約5滴）的洗滌液，放置1 min。甩干并拍干。按上述操作再重復(fù)洗滌4次。

6、顯色：反應(yīng)板拍干后，每孔分別加入50 μL的底物液和50 μL的顯色液。輕輕振搖包被反應(yīng)板框架，使試劑充分混勻。蓋上蓋子，放入37 ℃培養(yǎng)箱，孵育15 min。

7、讀取數(shù)值：同實(shí)施例1。

實(shí)施例3

一、包被反應(yīng)板的制備

1、將黃曲霉毒素B1抗體加入反應(yīng)板中，抗體包被液濃度為4 ug/ml，每孔包被100 ul，保鮮膜密封后4 ℃冰箱過夜后，洗滌1次，拍干。

2、每孔加入250 ul封閉液后，包被反應(yīng)板密封后，37 ℃孵育2小時(shí)。

3、取出包被反應(yīng)板，甩干，拍干，37 ℃烘干1.5小時(shí)。

二、黃曲霉毒素B1的超級(jí)快試劑盒

1、取相應(yīng)的包被反應(yīng)板放在框架上，對(duì)反應(yīng)孔進(jìn)行編號(hào)，設(shè)定1~6號(hào)孔為AFB1標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照孔，其余孔為樣品孔。

2、洗滌：每孔加入250 μL（約5滴）洗滌液，放置1 min。甩干，在吸水紙上拍干。

3、實(shí)驗(yàn)加樣：1~6號(hào)孔分別加入50 μL的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液（0，0.1，0.25，0.5，1，2 ppb），其余孔加入相應(yīng)的待測(cè)樣液。

4、加酶標(biāo)抗原：各反應(yīng)孔均加入50 μL的酶標(biāo)抗原工作溶液。輕輕振搖包被反應(yīng)板框架，使試劑充分混勻。蓋上蓋子，放入37 ℃培養(yǎng)箱，孵育11 min。

5、洗滌：取出反應(yīng)板，甩干，拍干。每孔加入250 μL（約5滴）的洗滌液，放置1 min。甩干并拍干。按上述操作再重復(fù)洗滌4次。

6、顯色：反應(yīng)板拍干后，每孔分別加入50 μL的底物液和50 μL的顯色液。輕輕振搖包被反應(yīng)板框架，使試劑充分混勻。蓋上蓋子，放入37 ℃培養(yǎng)箱，孵育10 min。

7、讀取數(shù)值：同實(shí)施例1。