專利名稱：Bacillus gibsonii (DSM 14391)的新型堿性蛋白酶以及包含該新型堿性蛋白酶的洗滌 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及Bacillus gibsonii(DSM 14391)的新的枯草直菌素型堿性蛋白酶及其充分相關(guān)的蛋白和衍生物。本發(fā)明還涉及含有此枯草芽孢桿菌的新的枯草桿菌素型堿性蛋白酶、充分相關(guān)的蛋白及其衍生物的洗滌產(chǎn)品和清潔產(chǎn)品，相應(yīng)的洗滌和清潔方法以及其在洗滌和清潔產(chǎn)品中的用途，以及可能的其他技術(shù)用途。
枯草桿菌素(subtilisin)型蛋白酶(Subtilase，枯草桿菌肽酶，EC3.4.21.62)，特別是枯草桿菌素由于催化活性的氨基酸被劃歸為絲氨酸蛋白酶。其是由微生物，特別是芽孢桿菌種天然產(chǎn)生和分泌的。它們起著非特異內(nèi)肽酶的作用，也就是說它可水解任何位于肽或蛋白質(zhì)內(nèi)部的酰胺鍵。其最適pH大多處于明顯的堿性范圍。有關(guān)該家族的綜述例如可見R.Bott和C.Betzel主編，New York，1996年出版的“Subtilisinenzymes”第75-95頁中由R.Siezen撰寫的文章“Subtilases枯草桿菌素樣-蛋白酶(Subtilisin-like Proteases)”?？莶輻U菌素適合于多種可能的技術(shù)應(yīng)用，如用作化妝品的組分，特別是用作洗滌劑或清洗劑的活性成分。
酶是洗滌和清潔產(chǎn)品中已確立的活性成分。在這方面，蛋白酶分解待清潔材料，諸如織物或硬表面上的類蛋白質(zhì)(proteinaceous)污漬。在有利情形下，在酶和相關(guān)產(chǎn)品的其他成分之間存在協(xié)同效應(yīng)。這例如描述在US6008178中。由于它們有利的酶特性，諸如穩(wěn)定性或最適合pH，枯草蛋白素在洗滌和清潔產(chǎn)品蛋白酶中脫穎而出。最重要的枯草蛋白素及其技術(shù)開發(fā)方面的最重要對(duì)策如下所述。
洗滌產(chǎn)品蛋白酶的開發(fā)是基于優(yōu)選由微生物產(chǎn)生的天然酶。它們被本身已知的誘變方法，例如點(diǎn)突變、缺失、插入或與其他蛋白或蛋白部分融合，或者通過其他修飾方法而得以優(yōu)化用于洗滌和清潔產(chǎn)品。
因此，例如，根據(jù)申請(qǐng)WO93/07276，蛋白酶164-A1得自芽孢桿菌種164-A1，并由Chemgen Corp.，Gaithersburg，MD，USA和VistaChemical Company，Austin，TX，USA提供，適用于洗滌和清潔產(chǎn)品中。其他例子為來自芽孢桿菌種PD138的堿性蛋白酶，Novozymes的NCIMB 40338(WO93/18140)，Kao Corp.，Tokyo，Japan的來自芽孢桿菌種ferm.BP-3376的蛋白酶K-16(US5344770)，以及根據(jù)WO96/25489(Procter & Gamble，Cincinnati，OH，USA)，來自嗜冷生物體大比目魚黃桿菌(Flavobacterium balustinum)的蛋白酶。其他微生物源、適用于洗滌和清潔產(chǎn)品的蛋白酶從下列專利文獻(xiàn)中也是已知的例如來自假單胞菌(Pseudomonas)(WO00/05352)，來自綠僵菌(Metarrhizium)(EP601005)，來自親堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)DMS 6845或DSM 5466(DE4411223)和其他多種微生物(WO95/07350，EP1029920，EP578712，WO01/00764，US6197740，WO01/16285)。
枯草桿菌素BPN’分別來自解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，已公開在下列文獻(xiàn)中Vasantha等(1984)，J.Bacteriol.，第159卷，第811-819頁和J.A.Wells等(1983)，Nucleic Acids Research，第11卷，第7911-7925頁?？莶輻U菌素BPN’用作枯草桿菌素的對(duì)照酶，尤其有關(guān)位置的編號(hào)。申請(qǐng)CA2049097公開了這種分子的多種變體，尤其是有關(guān)它們?cè)谙礈旌颓鍧嵁a(chǎn)品中的穩(wěn)定性。變體在該酶的環(huán)區(qū)中通過點(diǎn)突變而獲得，并且同時(shí)以水解速率增加的方式與底物結(jié)合降低，例如示出在專利申請(qǐng)WO95/07991和WO95/30010中。含有這種BPN’變體的洗滌產(chǎn)品例如公開在專利申請(qǐng)WO95/29979中。
蛋白酶枯草桿菌素Carlsberg由E.L.Smith等人(1968)在J.Biol.Chem.，第243卷，第2184-2191頁和由Jacobs等人(1985)在Nucl.AcidsRes.，第13卷，第8913-8926頁的出版物中進(jìn)行了介紹。其天然來自于地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，并分別可從GenencorInternational Inc.，Rochester，New York，USA以商品名Maxatase以及從丹麥Novozymes A/S公司，Bagsvaerd以商品名Alcalase購(gòu)得。通過點(diǎn)突變所獲得的變體在提高水解速率的同時(shí)對(duì)底物的結(jié)合減少，公開在例如申請(qǐng)WO96/28566A2中。在這些變體分子的環(huán)區(qū)中進(jìn)行了一個(gè)或多個(gè)的替換。
蛋白酶PB92天然產(chǎn)自于親堿細(xì)菌芽孢桿菌新種92和以商品名Maxacal從荷蘭的Gist-Brocades公司，Delft獲得。其原始序列已在專利申請(qǐng)EP283075A2中述及。已通過點(diǎn)突變獲得并適用于洗滌劑和清洗劑中的所述酶的變體，例如，在申請(qǐng)WO94/02618和EP328229中公開。
枯草桿菌蛋白酶147和309被Novozymes公司分別以商品名Esperase以及Savinase銷售。其來源于芽孢桿菌菌株，在申請(qǐng)GB1243784中作了公開。例如在申請(qǐng)WO94/02618(參見上文)，WO89/06279，WO95/30011和WO99/27082中公開了通過點(diǎn)突變開發(fā)的該酶的變體在洗滌產(chǎn)品和清洗產(chǎn)品中使用的情況。申請(qǐng)WO89/06279旨在獲取更高的氧化穩(wěn)定性，增加的水解速率以及改善的洗滌性能。該申請(qǐng)揭示了在特點(diǎn)位置上的取代改變了枯草桿菌素147或309分子的物理或化學(xué)特性。申請(qǐng)WO95/30011介紹了在分子環(huán)區(qū)中具有點(diǎn)突變的枯草桿菌素309的變體，并因此展示對(duì)底物的吸附減少，同時(shí)水解速率增加。申請(qǐng)WO99/27082通過例子方式開發(fā)了枯草桿菌素309的變體，其洗滌性能通過插入至少一個(gè)氨基酸擴(kuò)大活性環(huán)而得以增強(qiáng)。
遲緩芽孢桿菌(B.lentus)的堿性蛋白酶為得自于芽孢桿菌種(Bacillus species)的高堿性蛋白酶。野生型酶衍生自親堿性芽孢桿菌菌株，其自身顯示對(duì)氧化具有相對(duì)高的穩(wěn)定性和去污劑的作用。根據(jù)申請(qǐng)WO91/02792(EP493398和US5352604)，該菌株的保藏號(hào)為DSM 5483。根據(jù)同樣申請(qǐng)，該酶可在地衣芽孢桿菌宿主中異源表達(dá)。其三維結(jié)構(gòu)描述在下列文獻(xiàn)中Goddette等(1992)，J.Mol.Biol.，第228卷，第580-595頁“遲緩芽孢桿菌堿性蛋白酶枯草桿菌素BL的1.4分辨率的晶體結(jié)構(gòu)(The crystal structure of the Bacillus lentusalkaline protease，Subtilisin BL，at 1.4  resolution)”。該酶的變體可通過點(diǎn)突變獲得，并適用于洗滌和清潔產(chǎn)品中，公開在WO92/21760(US5340735，US5500364和US5985639)和WO95/23221(US5691295，US5801039和5855625)。WO95/23221中的對(duì)策，即精心改變靠近底物結(jié)合口袋處的電荷條件，解釋在US6197589中。該蛋白酶的其他變體描述在尚未公布的申請(qǐng)DE10121463和DE10153792中。
枯草桿菌素DY最初描述在Nedkov等1985，Biol.Chem Hoppe-Seyler，第366卷，第421-430頁。根據(jù)申請(qǐng)WO96/28557，例如，其可通過在活性環(huán)中的特異性點(diǎn)突變而得以優(yōu)化，產(chǎn)生具有吸附減少而水解速率增加的變體，用于洗滌劑和清洗劑中。
酶thermitase確定為subtilase，不再確定為枯草桿菌素(參照，R.Siezen，第75-95頁，“枯草桿菌素酶(Subtilisin enzymes)”，由R.Bott和C.Betzel公開，New York，1996)，并且由普通高溫放線菌(Thermoactinomyces vulgaris)天然產(chǎn)生，最初由Meloun等(FEBS Lett.1983，第195-200頁)描述。例如，申請(qǐng)WO96/28558公開了由環(huán)區(qū)中的替換產(chǎn)生具有吸附減少和水解速率增加的變體。然而，thermitase為一種分子，其序列整體上相當(dāng)大地偏離了其他枯草桿菌素的那些分子。
蛋白酶K也是一種例如與遲緩芽孢桿菌(B.lentus)堿性蛋白酶具有相對(duì)低的同源性的subtilase。蛋白酶K最初來自微生物林伯氏白色念球菌(Tritirachium album Limber)并且已在下列文獻(xiàn)中加以描述K.-D.Jany和B.Mayer 1985，Biol.Chem.Hoppe-Seyler，第366卷，第485-492頁。申請(qǐng)WO96/28556公開了多種蛋白酶K的變體，這些變體通過點(diǎn)突變獲得并具有對(duì)底物的吸附降低和水解速率的增加。
最后，WO88/07581公開了非常相似的蛋白酶TW3和TW7，尤其是用于洗滌和清潔產(chǎn)品中。
例如，申請(qǐng)EP199404，EP251446，WO91/06637和WO95/10591描述了其他蛋白酶，這些蛋白酶適合于技術(shù)用途，尤其用于洗滌劑和清洗劑。申請(qǐng)EP199404的蛋白酶為多種不同的BPN’變體，基于專利EP130756。EP251446公開了許多BPN’變體，這些變體通過替換單個(gè)氨基酸獲得。申請(qǐng)WO91/06637的蛋白酶的特征為BPN’在位置123和/或位置274的點(diǎn)突變。WO95/10591揭示了主要為遲緩芽孢桿菌蛋白酶的變體，這些變體在位置76發(fā)生突變，并且在其他位置也有突變。
其他已知的蛋白酶例如為可獲自Novozymes公司的商品名為Durazym，Relase，Everlase，Nafizym，Natalase和Kannase，Genencor公司的商品名為Purafect，Purafect OxP和Properase，印度AdvancedBiochemicals Ltd.公司，Thane的商品名為Protosol和中國(guó)Wuxi SnyderBiopruducts Ltd.的商品名為Wuxi的蛋白酶。
一個(gè)改善枯草桿菌素洗滌功效的對(duì)策為在已知分子中隨機(jī)或特異性用其他氨基酸替換單個(gè)氨基酸以及測(cè)試所獲得變體對(duì)洗滌功效的作用。該對(duì)策的獲取來自上述各個(gè)申請(qǐng)，例如EP130756中所示的一些其他進(jìn)展。酶的變應(yīng)原性(allergenicity)例如根據(jù)WO99/49056，WO99/49057和WO01/07575，采用某些氨基酸替換或缺失而得以提高。
為改善枯草桿菌素的洗滌功效，許多申請(qǐng)運(yùn)用了將其它氨基酸插入在活性環(huán)中的對(duì)策，例如除已述的申請(qǐng)WO99/27082外，還有以下述公布號(hào)WO00/37599，WO00/37621至WO00/37627和WO00/71683至WO00/71691所公開的申請(qǐng)。因此，所述對(duì)策在原理上應(yīng)該適用于所有枯草桿菌素，這些枯草桿菌素隸屬于亞組I-S1(真正枯草桿菌素)或I-S2(高堿性枯草桿菌素)。
另一提高性能的對(duì)策為修飾分子的表面電荷和/或等電點(diǎn)，由此改變它們與底物的相互作用。例如在下列文獻(xiàn)中公開了這種變化US5665587和申請(qǐng)EP405901，EP945502A1，WO91/00334和WO91/00345。WO92/11348公開了在分子電荷中減少pH依賴性變化的點(diǎn)突變。從該原理中，申請(qǐng)WO00/24924衍生出一種識(shí)別變體的方法，這些變體推測(cè)適用于洗滌和清潔產(chǎn)品中；所有在此公開的變體具有至少一個(gè)在位置103的替換，優(yōu)選多個(gè)含有與本申請(qǐng)無關(guān)的替換的變體。根據(jù)WO96/34935，為了提高洗滌和清潔產(chǎn)品的性能，也可能增加分子的疏水性，而這會(huì)影響酶的穩(wěn)定性。
申請(qǐng)WO99/20727公開了如通過申請(qǐng)WO00/24924的方法所得到的枯草桿菌素變體它們?nèi)堪辽僖粋€(gè)在位置103的取代，以及多個(gè)其他可能的替換。申請(qǐng)WO99/20723和WO99/20726公開了相同的用于洗滌和清潔產(chǎn)品的突變體，這些突變體另含有淀粉酶或漂白劑。
調(diào)節(jié)蛋白酶效率的另一方法是形成融合蛋白。因此，例如，申請(qǐng)WO98/13483和WO00/01831公開了包括蛋白酶和抑制劑，諸如鏈霉菌枯草桿菌素抑制劑的融合蛋白。例如，根據(jù)WO97/28243或WO99/57250，另一可能的方法是結(jié)合到來自纖維素酶的纖維素結(jié)合區(qū)(CBD)中，從而增加活性酶在底物的直接鄰近處中的濃度。根據(jù)WO99/48918，變應(yīng)原性或免疫原性通過結(jié)合肽接頭及其上的聚合物而得以減少。
例如，在WO99/20769中，揭示了由于隨機(jī)產(chǎn)生的氨基酸替換和隨后的選擇，變體的性能改善。例如在申請(qǐng)WO97/09446中，揭示了基于噬菌體展示體系的隨機(jī)方法，用于開發(fā)蛋白酶在洗滌和清潔產(chǎn)品中的應(yīng)用。
現(xiàn)代的酶發(fā)展方向是將已知蛋白的相互有關(guān)的元件通過統(tǒng)計(jì)方法結(jié)合成到新酶中，使其具有乞今未達(dá)到的性能。這樣的方法也概括地稱為指導(dǎo)演化法，并包括例如下述的方法StEP-法(Zhao等人(1998)，Nat.Biotechnol.，第16卷，第258-261頁)，隨機(jī)引發(fā)重組法(Shao等人(1998)，Nucleic Acids Res.，第26卷，第681-683頁)，DNA-改組(shuffling)法(Stemmer，W.P.C.(1994)，Nature，第370卷，第389-391頁)或回歸序列重組法(RSR；WO98/27230，WO97/20078，WO95/22625)或RACHITT(Coco，W.M.等人(2001)，Nat.Biotechnol.，第19卷，第354-359頁)。這些方法的綜述提供在下列在先文章中“GerichteteEvolution und Biokatalyse”，Powell等(2001)，Angew.Chem.，第113卷，第4068-4080頁。
另一特別的補(bǔ)充對(duì)策為提高所涉及蛋白酶的穩(wěn)定性和由此增加其作用效能。例如在US5230891中敘述了通過與聚合物結(jié)合提高了蛋白酶在化妝品中的穩(wěn)定性；所述穩(wěn)定性伴隨著皮膚相容性的增強(qiáng)。尤其對(duì)洗滌劑和清洗劑而言，與其不同，常用的穩(wěn)定法是借助于點(diǎn)突變。因此按照US6087315和US6110884，采用其他氨基酸殘基替換特定的酪氨酸殘基可使蛋白酶穩(wěn)定。WO89/09819和WO89/09830描述了通過氨基酸替換獲得的相對(duì)熱穩(wěn)定的BPN’變體。其他通過點(diǎn)突變來提高穩(wěn)定性的可能的例子為-根據(jù)WO92/19729，和分別根據(jù)EP583339和US5858757，以及根據(jù)EP516200，以脯氨酸替換特定的氨基酸殘基；-按照EP525610，EP995801和US5453372向分子表面引入更高極性或較多電荷的基團(tuán)；-增強(qiáng)金屬離子的結(jié)合，特別是通過突變鈣結(jié)合位點(diǎn)，例如按照申請(qǐng)WO88/08028和WO88/08033的教導(dǎo)；-通過修飾或突變阻斷自消化，例如根據(jù)WO98/20116或US5543302；-組合如在申請(qǐng)EP398539A1中公開的多個(gè)穩(wěn)定對(duì)策；-根據(jù)US5340735，US5500364，US5985639和US6136553，與穩(wěn)定性相關(guān)的位置可通過分析三維結(jié)構(gòu)而找到。
為了增加洗滌或清潔性能，例如文獻(xiàn)EP755999和WO98/30669公開了蛋白酶可與α-淀粉酶和其他洗滌產(chǎn)品用酶一起使用。例如，EP791046公開了與脂肪酶組合的可能性。例如，申請(qǐng)WO95/10592揭示了先前在WO95/10591中描述的用于洗滌產(chǎn)品中的變體也適用于漂白劑。例如，US6121226公開了同時(shí)把蛋白酶和去污劑用于洗滌產(chǎn)品中。
例如，申請(qǐng)WO97/07770公開了一些已確定用于洗滌產(chǎn)品中的蛋白酶也適用于化妝品目的。例如在申請(qǐng)EP380362A1中描述了蛋白酶其他可能的技術(shù)應(yīng)用。這涉及有機(jī)化學(xué)合成，并且根據(jù)該申請(qǐng)，據(jù)說適用于此的枯草桿菌素是那些通過點(diǎn)突變而穩(wěn)定的枯草桿菌素。
在此以示例方式提出的各種技術(shù)領(lǐng)域要求具有不同特性的蛋白酶，所述特性例如涉及反應(yīng)條件，穩(wěn)定性或底物特異性。相反，蛋白酶技術(shù)應(yīng)用的可能性例如在洗滌或清潔產(chǎn)品配方的情形下，依賴于其他因素，諸如酶對(duì)溫度的穩(wěn)定性，對(duì)氧化劑的穩(wěn)定性，通過表面活性劑的變性，折疊作用或者與其他成分所需的協(xié)同效應(yīng)。
因此，對(duì)蛋白酶繼續(xù)存在大量需求，所述蛋白酶技術(shù)上可用，并且由于其眾多的應(yīng)用領(lǐng)域，在整體上覆蓋大范圍的特性，包括性能上非常細(xì)小的差別。
這種需求的基礎(chǔ)通過新型蛋白酶而擴(kuò)大，而新型蛋白酶反過來又能夠進(jìn)一步開發(fā)靶向具體的應(yīng)用領(lǐng)域。
因此，本發(fā)明目的是基于發(fā)現(xiàn)另一尚未知曉的蛋白酶。預(yù)計(jì)野生型酶優(yōu)選的特征在于，當(dāng)用于合適的產(chǎn)品中時(shí)，它至少接近于已確定用于此目的的酶。在這方面，尤其感興趣的是有助于洗滌或清潔產(chǎn)品性能的提高。
另一次要目的是提供編碼此種蛋白酶的核酸，并且提供載體，宿主細(xì)胞以及可用來獲得此種蛋白酶的制備方法。其進(jìn)一步的目的是提供相應(yīng)的產(chǎn)品，尤其是洗滌和清潔產(chǎn)品，相應(yīng)的洗滌和清潔方法，還有相應(yīng)的此種蛋白酶的可能用途。最后，旨在限定所發(fā)現(xiàn)的蛋白酶的可能的技術(shù)應(yīng)用。
目的的實(shí)現(xiàn)來自枯草桿菌素型堿性蛋白酶，其氨基酸序列與SEQID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性。
在各種情況下，那些與來自Bacillus gibsonii(DSM 14391)的新型堿性蛋白酶的同一性程度提高的酶優(yōu)選性增加。
因此，在本發(fā)明各種內(nèi)在的方面，其他目的或次要目的的實(shí)現(xiàn)包括核酸，所述核酸的序列與SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或編碼本發(fā)明蛋白酶的核苷酸序列具有足夠的相似性，并且包括合適的載體，細(xì)胞或宿主細(xì)胞以及制備方法。本發(fā)明還提供相應(yīng)的產(chǎn)品，尤其是洗滌和清潔產(chǎn)品，相應(yīng)的洗滌和清潔產(chǎn)品，以及相應(yīng)的此種蛋白酶的可能的應(yīng)用。最后，限定了所發(fā)現(xiàn)的蛋白酶的可能的技術(shù)用途。
根據(jù)本申請(qǐng)，蛋白表示由天然氨基酸組成的聚合物，基本上為線性結(jié)構(gòu)，并且通常采用三維結(jié)構(gòu)發(fā)揮其功能。本申請(qǐng)是指19種生成蛋白的天然L-氨基酸，國(guó)際上以1-字和3-字代碼表示。任意這些名稱和數(shù)字的組合表示特定蛋白在各自位置所攜帶的氨基酸殘基。相同的命名建立在點(diǎn)突變上。除非另有所述，所示的位置是指相關(guān)蛋白的各種成熟形式，即無信號(hào)肽(參見下文)。
根據(jù)本申請(qǐng)，酶是指一種蛋白質(zhì)，它起著某種生化功能。蛋白酶或者具有蛋白酶解功能的酶例如，通常理解為那些水解蛋白質(zhì)的酰胺鍵(特別是那些位于蛋白質(zhì)內(nèi)部的鍵)的蛋白酶或酶，因此它們也被叫做內(nèi)肽酶?？莶輻U菌素蛋白酶就是這樣的內(nèi)肽酶，其由革蘭氏陽性菌天然形成并且一般是分泌型的，或者是由其例如通過分子生物方法從后者衍生的，并且經(jīng)部分區(qū)域例如形成結(jié)構(gòu)的或者攜帶官能團(tuán)的區(qū)域與天然枯草桿菌素蛋白酶成為同系物。它們被指定為subtilase。例如描述在R.Siezen的文章“Subtilases枯草桿菌素樣-蛋白酶”，《枯草桿菌素酶》(“Subtilisin enzymes”)第75至95頁，由R.Bott和C.Betzel編輯，New York，1996。
很多蛋白質(zhì)，作為所謂的蛋白前體(Praproteine)，與一個(gè)信號(hào)肽一起形成。在這種情況下，信號(hào)肽表示這種蛋白的N-末端，其功能通常是保證形成的蛋白質(zhì)從生產(chǎn)細(xì)胞釋放到胞質(zhì)或者周圍的介質(zhì)中，和/或保證其正確的折疊。然后信號(hào)肽在自然狀態(tài)下被一種信號(hào)肽酶從原始蛋白上切下來，從而使蛋白在初始沒有N末端氨基酸的情況下具有其真正的催化活性。
由于它們的酶活性，成熟的肽即合成后經(jīng)處理的酶比起蛋白前體來說在技術(shù)應(yīng)用上更受青睞。
前體蛋白(Pro-Proteine)就是沒有活性的蛋白前體。其具有信號(hào)序列的前體(Vorlaufer)被稱作前體蛋白的前體(Pra-Pro-Proteine)。
根據(jù)本申請(qǐng)，核酸是那些天然由核苷酸組成并被稱作信息載體的分子，其用于編碼蛋白質(zhì)或酶中的線性氨基酸序列。它們可能是單鏈的，也可能是互補(bǔ)于此單鏈的單鏈，或者是雙鏈。對(duì)于分子生物學(xué)工作而言，作為天然永久的信息載體，這些核酸DNA更適用于分子生物學(xué)工程。相比之下，為了在自然環(huán)境中例如在正在表達(dá)的細(xì)胞中實(shí)施本發(fā)明，形成RNA，從而對(duì)于本發(fā)明有很重要作用的RNA分子亦代表本發(fā)明的實(shí)施方案。反過來，例如通過反轉(zhuǎn)錄，(c)DNA分子可從中得以衍生。
根據(jù)本申請(qǐng)，對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)的核酸信息單元被稱作基因。在DNA中，所有三種可能的讀碼框中的兩條互補(bǔ)鏈的序列都必須考慮到。此外，需要注意的是，不同的密碼三聯(lián)體可編碼同一種氨基酸，因此，某種特定氨基酸序列可以從許多不同的并且也許僅有非常低同一性的核苷酸序列(遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性)得到。除此以外，不同的生物在應(yīng)用密碼子上也存在差異。由于這些原因，不管是氨基酸序列還是核苷酸序列都必須列入保護(hù)范圍，并且公開的核苷酸序列在每種情況下應(yīng)只被看作編碼某氨基酸序列的舉例。
在目前常用方法的幫助下，如化學(xué)合成或者聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，結(jié)合分子生物學(xué)和/或蛋白質(zhì)化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法，專業(yè)技術(shù)人員已經(jīng)能夠根據(jù)已知DNA和/或氨基酸序列生產(chǎn)完整的基因。這種方法是已知的，例如公開在“生化百科全書(Lexikon der Biochemie)”，Spektrum Akademischer Verlag，Berlin，1999，第1卷，第267-271頁和第2卷，第227-229頁上。具體而言，如果采用保藏在菌種保藏機(jī)構(gòu)的菌株，這也是可能的。例如，利用基于已知序列合成的PCR引物或通過分離的mRNA分子，有可能進(jìn)行合成，克隆以及如果需要進(jìn)一步加工，例如從這些菌株中突變處理目的基因。
核苷酸序列的變化，諸如那些通過本身已知的分子生物學(xué)方法得到的變化被稱為突變。根據(jù)變化的類型，已知突變分為例如缺失突變、插入突變、替代突變，或者不同的基因或基因的不同部分被相互融合在一起(“改組”)的突變；這些就是基因突變。與此相關(guān)的生物就稱為突變體。從這些突變核酸中得到的蛋白被稱為變體。例如，缺失突變、插入突變、替代突變或者融合導(dǎo)致了基因的缺失突變、插入突變、替代突變或融合，以及在蛋白質(zhì)水平上，導(dǎo)致對(duì)應(yīng)的缺失變體、插入變體或者替代變體或者融合蛋白。
根據(jù)本申請(qǐng)，載體被認(rèn)為是由核酸組成的元件，這些元件包括一個(gè)目的基因作為特征核酸區(qū)。它們能夠在物種或細(xì)胞系中經(jīng)若干代或細(xì)胞分裂作為穩(wěn)定的遺傳元件建立所述基因，所述遺傳元件能夠獨(dú)立于基因組的其他部分復(fù)制。載體是特殊的質(zhì)粒，即環(huán)形的遺傳元件，尤其是它們被用于細(xì)菌的時(shí)候。在基因工程中，用于儲(chǔ)存進(jìn)而進(jìn)行基因操作的載體(即所謂的克隆載體)與在宿主細(xì)胞中生成目的基因即促進(jìn)特定蛋白表達(dá)的載體是有區(qū)別的。這些載體都被認(rèn)為是表達(dá)載體。
包括所述載體的細(xì)菌細(xì)胞和真核生物細(xì)胞不管其差異，都統(tǒng)稱為細(xì)胞。含有載體，特別是表達(dá)載體并因此可被誘導(dǎo)表達(dá)轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞稱為宿主細(xì)胞，因?yàn)樗鼈儍?nèi)含相關(guān)的基因體系。
同源化是一種核酸或氨基酸序列與已知基因或蛋白的比較。例如，通過比對(duì)進(jìn)行。同源性的度量為同一性的百分比，如通過下列文獻(xiàn)中所示方法可加以確定D.J.Lipman和W.R.Pearson，Science227(1985)，第1435-1441頁。該信息在各種情況下可指完整蛋白或待指定的區(qū)域。比同源性概念更寬的是相似性，也包括保守變異，即具有相似化學(xué)活性的氨基酸，因?yàn)榭紤]到它們?cè)诘鞍變?nèi)通常具有相似的化學(xué)活性。對(duì)核酸而言，僅僅知道同一性的百分比。
通過同源化，從氨基酸或核苷酸序列中有可能推測(cè)出單個(gè)序列區(qū)域的功能，以及所涉及的完整酶的活性。不同蛋白之間的同源區(qū)域具有可比較的功能，這些功能在一級(jí)氨基酸序列中可被識(shí)別為同一性或保守替換。它們包括單個(gè)氨基酸，稱作盒的非常小的區(qū)域，其在氨基酸一級(jí)序列中的長(zhǎng)度有數(shù)個(gè)氨基酸，一直至長(zhǎng)的區(qū)域。因此，同源區(qū)的功能理解上也包括由完整蛋白所實(shí)施功能的非常小的部分功能，例如單個(gè)氫鍵的形成或底物的絡(luò)合或者過渡絡(luò)合物。不參與真正酶法反應(yīng)的蛋白的其他區(qū)域可對(duì)它們進(jìn)行定性或定量修飾。例如，這涉及酶的穩(wěn)定性，活性，反應(yīng)條件或底物特異性。
因此，術(shù)語蛋白水解酶或蛋白酶表示除催化活性部位的少量氨基酸殘基的功能外的所有功能，這些功能是通過其余蛋白質(zhì)全部或其一部分或大部分對(duì)真正的催化活性區(qū)域的影響而產(chǎn)生的。根據(jù)本發(fā)明，這些修飾的功能或部分活性，只要它們有助于蛋白酶解反應(yīng)，單獨(dú)也被認(rèn)為是蛋白酶解活性。輔助功能或者部分活性包括，例如底物的結(jié)合、中間產(chǎn)物或者終產(chǎn)物的結(jié)合、激活或抑制或介導(dǎo)對(duì)水解活性的控制效果。另一種可能的例子是形成遠(yuǎn)離活性中心的結(jié)構(gòu)單元。對(duì)于本發(fā)明的水解蛋白質(zhì)來說，第二個(gè)前提條件正是通過真正的活性殘基本身的化學(xué)行為或者附加地通過修飾部分的作用獲得肽鍵的水解。此外同樣可以通過例如本發(fā)明蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)部分定性或定量地修飾其它蛋白酶的活性。其它因素的影響也被認(rèn)為是蛋白酶解活性。活性蛋白酶同樣也是那些其活性在給定的時(shí)間例如通過抑制劑而封閉的酶。它們主要適于進(jìn)行相應(yīng)的蛋白酶解反應(yīng)是至關(guān)重要的。
片段是指那些比天然蛋白質(zhì)或那些對(duì)應(yīng)于完全翻譯的基因更短并且例如也可通過合成得到的任何蛋白或者肽。由于它們的氨基酸序列，它們可涉及相應(yīng)的完整蛋白。例如它們可以具有相同的結(jié)構(gòu)，或可發(fā)揮蛋白水解活性或者部分活性。片段及初始蛋白的缺失變體基本上是一樣的。然而，片段是相對(duì)較小的，缺失變體只是缺失小區(qū)域因此僅缺乏個(gè)別的部分功能。
根據(jù)本申請(qǐng)，嵌合或者雜交蛋白是由那些來自相同或不同生物的不同多肽鏈天然產(chǎn)生的元件組成的蛋白。這個(gè)過程也就是改組或融合突變。融合的目的是例如，在融合部分本發(fā)明的蛋白的幫助下生成或者修飾某種酶的功能。
通過插入突變得到的蛋白被稱為是變體，這種變體能夠通過本身已知的方法把核酸片段或蛋白片段插入到起始序列中而得到。因?yàn)樗鼈兊脑硐嗤?，?yīng)將它們規(guī)類為嵌合蛋白中。在這些嵌合蛋白中，區(qū)別僅在于蛋白的不變部分與整個(gè)蛋白的大小比例不同。在插入突變蛋白中，外源蛋白的比例低于嵌合蛋白。
倒置突變，即部分序列的倒置，被看作一種缺失和插入的特殊形式。同樣適用于分子不同部分的重組，這與原始的氨基酸序列相異。這也可以被看作是一種缺失變體，作為原始蛋白的插入變體或者改組變體。
根據(jù)本申請(qǐng)，衍生物是指其純的氨基酸鏈已經(jīng)化學(xué)修飾的蛋白。這種衍生化作用可通過宿主生物以生物方法結(jié)合蛋白合成進(jìn)行。分子生物學(xué)的方法可以用于此目的，例如與確保相關(guān)修飾的基因共轉(zhuǎn)化。然而，這些衍生物也可以化學(xué)方法來實(shí)施，例如將氨基酸的側(cè)鏈化學(xué)轉(zhuǎn)化或者通過共價(jià)結(jié)合將另一個(gè)化合物結(jié)合到蛋白上。該化合物可以是如通過雙官能化合物與本發(fā)明所述的蛋白結(jié)合的其他蛋白。當(dāng)結(jié)合的底物是抑制劑時(shí)，這種修飾例如可以影響底物的特異性或者與該底物的結(jié)合強(qiáng)度，或者導(dǎo)致酶活性的暫時(shí)性凍結(jié)。例如這對(duì)于儲(chǔ)存的時(shí)間也是有用的。衍生化作用也被認(rèn)為對(duì)大分子支持物的共價(jià)結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明，所有的酶、蛋白、片段、融合蛋白及衍生物被集體的冠以上位概念蛋白，除非它們需要清晰的指稱。
酶的性能在各種情形下被認(rèn)為是在所屬技術(shù)領(lǐng)域里的功效，優(yōu)選在相應(yīng)定向的產(chǎn)品的范圍。所述性能是基于實(shí)際的酶解活性，但是也依賴于其他與這個(gè)過程相關(guān)的因素。這些因素包括例如穩(wěn)定性、底物結(jié)合、與攜底物的物質(zhì)相互作用或與其他成分相互作用，尤其是協(xié)同作用。
根據(jù)本申請(qǐng)，洗滌劑的洗滌或清潔性能是指所涉及的產(chǎn)品對(duì)含污物品例如織物或者具有硬表面的物體所發(fā)揮的效果。評(píng)價(jià)這些產(chǎn)品中的單個(gè)組分例如單個(gè)酶對(duì)完整的洗滌或清潔產(chǎn)品的洗滌或清潔性能的作用。畢竟由一種酶的酶解性能不可能輕易地推斷出所述酶對(duì)產(chǎn)品的洗滌功效的作用。在除去污物時(shí)，在這里發(fā)揮作用的其它因素例如有穩(wěn)定性、底物結(jié)合、待洗滌物與所述洗滌或清潔產(chǎn)品中的其它成分的結(jié)合和相互作用，尤其是協(xié)同效應(yīng)在除去污漬時(shí)也起重要作用。
本發(fā)明的基礎(chǔ)是天然生成的枯草桿菌素型堿性蛋白酶，如從實(shí)施例中確認(rèn)的，可獲自菌株Bacillus gibsonii(DSM 14391)的培養(yǎng)上清液。
依據(jù)1997年4月28日鑒定的布達(dá)佩斯條約對(duì)微生物保藏機(jī)構(gòu)的國(guó)際認(rèn)可，該菌株于2001年3月1日保藏在德意志微生物保藏中心(theDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH)(DSMZ)Mascheroder Weg 1b，38124 Brunswick(http://www.dsmz，de)。其名稱為ID 01-192，保藏號(hào)為DSM 14391。有關(guān)該生物材料特征的標(biāo)準(zhǔn)信息，如2001年4月19日DSMZ對(duì)保藏菌株所確定的，編輯在表1(實(shí)施例1)中。
本專利申請(qǐng)遵循的對(duì)策是在天然產(chǎn)地發(fā)現(xiàn)一種產(chǎn)蛋白酶的微生物，以及由此發(fā)現(xiàn)最大可能地滿足所述的要求的一種天然產(chǎn)生的酶。
可發(fā)現(xiàn)這樣一種酶，如本申請(qǐng)的實(shí)施例中所述，其以堿性蛋白酶的形式存在，來自Bacillus gibsonii(DSM 14391)。
正如所確立的，超出了由德意志微生物保藏中心(DSMZ)所進(jìn)行的生化鑒定，并且顯示在實(shí)施例1的表1中，該菌株分泌蛋白水解活性。根據(jù)本申請(qǐng)的示例性實(shí)施方案，這一直加以研究，并可進(jìn)行如下描述根據(jù)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，其為26kD的蛋白，等電聚焦確定等電點(diǎn)為11。對(duì)底物AAPF的比活性為21U/mg。在50℃確定時(shí)，其最適pH為11。
根據(jù)本發(fā)明，Bacillus gibsonii(DSM 14391)的新型堿性蛋白酶的核苷酸序列以SEQ ID NO.1示于本申請(qǐng)的序列表中。其包含1152bp。從其衍生的氨基酸序列示于SEQ ID NO.2中。其包含383個(gè)氨基酸，后面為終止密碼子。前114個(gè)氨基酸極可能不存在于成熟蛋白中，因此，成熟蛋白的長(zhǎng)度預(yù)計(jì)為269個(gè)氨基酸。
如實(shí)施例2中所述，將這些序列與已知蛋白酶序列比較，這些已知序列一般來自可達(dá)的數(shù)據(jù)庫(kù)Swiss-Prot(Geneva Bioinformatics(GeneBio)S.A.，Geneva，Switzerland；http://www.genebio.com/sprot.html)和GenBank(National Center for Biotechnology Information NCBI，National Institutes of Health，Bethesda，MD，USA)。
通過該途徑，在DNA水平上，下列3種基因被鑒定成最相似的完整基因(1)來自芽孢桿菌Ya-B(ID ELYA_BACSP)的堿性彈性酶具有66％的同一性，(2)來自仙臺(tái)芽孢桿菌(Bacillus Sendai)(ID Q45522)的仙臺(tái)枯草桿菌素具有65％的同一性，以及(3)來自親堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)(ID ELYA_BACAO)的枯草桿菌素P92具有62％的同一性，在氨基酸水平，那些鑒定成最相似的完整前體蛋白的前體為(1)來自芽孢桿菌Ya-B(ID ELYA_BACSP)的堿性彈性酶與來自親堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)(ID ELYA_BACAO)的枯草桿菌素P92相等，具有66％的同一性，(2)來自仙臺(tái)芽孢桿菌(BacillusSendai)(ID Q45522)的仙臺(tái)枯草桿菌素具有64％的同一性，以及(3)來自芽孢桿菌種(ID Q45523)的枯草桿菌素AprQ具有50％的同一性。
在氨基酸水平，那些被鑒定成最相似的成熟蛋白為(1)兩種枯草桿菌素，即來自親堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)(ID ELYA_BACAO)的枯草桿菌素P92和來自遲緩芽孢桿菌(ID SUBS_BACLE)的枯草桿菌素309(Savinase)具有78％的同一性，(2)兩種枯草桿菌素，即來自遲緩芽孢桿菌(B.lentus)DSM 5483(ID SUBB_BACLE)的堿性蛋白酶和來自仙臺(tái)芽孢桿菌(Bacillus sendai)(ID Q45522)的仙臺(tái)枯草桿菌素具有77％的同一性，以及(3)來自芽孢桿菌Ya-B(ID ELYA_BACSP)的堿性彈性酶具有76％的同一性。
其他相似的酶列在實(shí)施例2中的表2中，并且在

圖1中對(duì)成熟蛋白的氨基酸序列與本發(fā)明來自Bacillus gibsonii(DSM 14391)的堿性蛋白酶進(jìn)行比對(duì)。
在鑒定的一致性以及與其他所示枯草桿菌素的關(guān)系基礎(chǔ)上，這種堿性蛋白酶被認(rèn)為是枯草桿菌素。
因此，本發(fā)明的一個(gè)主題為每一種枯草桿菌素型堿性蛋白酶，其氨基酸序列與SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列具有至少70％的同一性。
其中，愈加優(yōu)選的是那些酶的氨基酸序列與SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列分別具有至少72％，74％，76％，78％，80％，82％，84％，85％，86％，88％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％和100％的同一性。
這是因?yàn)椋梢灶A(yù)計(jì)其特性與B.gibsonii(DSM 14391)的堿性蛋白酶具有增加的相似性。
如上所述，在比較N-端序列的基礎(chǔ)上，第1-114位氨基酸假設(shè)為前導(dǎo)肽，并且成熟蛋白設(shè)想從SEQ ID NO.2的115位延伸到384位。
因此，位置384被一個(gè)終止密碼子占據(jù)，由此實(shí)際上不對(duì)應(yīng)氨基酸。然而，由于有關(guān)編碼區(qū)終點(diǎn)的信息可被視為氨基酸序列的重要組分，因此，根據(jù)本發(fā)明，該位置包括在對(duì)應(yīng)于成熟蛋白的區(qū)域中。
因此，在這方面，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案為每一種枯草桿菌素型堿性蛋白酶，其氨基酸序列在115位至384位與SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性。
其中，愈加優(yōu)選的是那些酶的氨基酸序列在115位到384位與SEQID NO.2所示的氨基酸序列分別具有至少82％，84％，86％，88％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％和100％的同一性。
例如，通過N-端測(cè)序由Bacillus gibsonii(DSM 14391)體內(nèi)釋放的酶解蛋白，如果出現(xiàn)切割位點(diǎn)不位于SEQ ID NO.2的114位和115位氨基酸之間，則在此情形下，這些敘述涉及實(shí)際的成熟蛋白。
在這方面，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案為每一種枯草桿菌素型堿性蛋白酶，其衍生自一種核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少70％的同一性，尤其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO.2中所示位置115到位置384的部分區(qū)域上。
其中，愈加優(yōu)選的是那些酶衍生的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中所示核苷酸序列分別具有至少72％，74％，76％，78％，80％，82％，84％，85％，86％，88％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％和100％的同一性，尤其是在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO.2中所示位置115到位置384的部分區(qū)域上。
這是因?yàn)椋梢灶A(yù)計(jì)，這些核酸編碼蛋白，其特性逐漸相似于那些來自B.gibsonii(DSM 14391)的堿性蛋白酶，尤其是成熟蛋白。如果出現(xiàn)蛋白的切割位點(diǎn)位于上述位置以外的其他地方，在這種情形下亦是如此，至于下列所有實(shí)施方案，這些敘述涉及實(shí)際的成熟蛋白也是真實(shí)的。
在這方面，本發(fā)明的最優(yōu)選的實(shí)施方案為每一種枯草桿菌素型堿性蛋白酶，其氨基酸序列整體上與SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列是相同的，優(yōu)選在其115位到384位相同，和/或其氨基酸序列整體上與從SEQ ID NO.1所示核苷酸序列中衍生的氨基酸序列是相同的，優(yōu)選在位置343到位置1152相同。
這是因?yàn)?，這樣一種序列構(gòu)成了本申請(qǐng)可提供的新發(fā)現(xiàn)的Bacillusgibsonii(DSM 14391)的堿性蛋白酶。
這種蛋白酶在現(xiàn)有技術(shù)中是尚未知曉的。如實(shí)施例中所述，其可進(jìn)行分離，制備和使用。同樣如實(shí)施例中所記載的，它另外的特征為在適當(dāng)產(chǎn)品的應(yīng)用中，接近或者在某些情況下甚至超過為此目的建立的酶的性能。
作為微生物天然產(chǎn)生的酶，其可用作出發(fā)點(diǎn)，以開發(fā)工業(yè)用蛋白酶，所述蛋白酶可具體用于洗滌產(chǎn)品中，目的是通過本身已知的突變方法，例如點(diǎn)突變，片段化，缺失，插入或與其他蛋白或蛋白部分融合，或者通過其他修飾方法來優(yōu)化目的用途。這種優(yōu)化作用可例如適用于溫度效應(yīng)，pH變化，氧還條件和/或其他與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域相關(guān)的影響因素。迫切需要的例子是如下改進(jìn)對(duì)氧化的抗性，對(duì)變性劑或蛋白酶降解的穩(wěn)定性，對(duì)高溫，酸性或強(qiáng)堿性條件的穩(wěn)定性，對(duì)鈣離子或其他輔助因子的靈敏度的變化，以及免疫原性或變應(yīng)原作用的減少。
為此目的，例如應(yīng)用WO00/36069的教導(dǎo)，通過靶向的點(diǎn)突變，可改變參與催化或底物結(jié)合的表面電荷或環(huán)。后者公開在例如WO95/30011，WO99/27082，WO00/37599，WO00/37621至WO00/37627和WO00/71683至WO00/71691中。例如應(yīng)用申請(qǐng)WO92/21760和WO95/23221的教導(dǎo)，可以進(jìn)行尤其是通過基因工程方法導(dǎo)入的其他修飾。為此的出發(fā)點(diǎn)是本申請(qǐng)中圖1所示的比對(duì)。這使得目的位置成為可能，這些位置描述在所述申請(qǐng)中，因?yàn)锽acillusgibsonii(DSM 14391)的蛋白酶推導(dǎo)自已知酶，并且通過本身已知的方法適當(dāng)加以改變。
突變方法是基于SEQ ID NO.1中所示的相關(guān)核苷酸序列，或者與其足夠相似的核苷酸序列，并且在下文描述成本發(fā)明的單獨(dú)主題。適當(dāng)?shù)姆肿由飳W(xué)方法描述在現(xiàn)有技術(shù)中，例如Fritsch，Sambrook和Maniatis“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”，Cold Spring Harbour LaboratoryPress，New York，1989。
本發(fā)明的其他實(shí)施方案為通過片段化或缺失突變而衍生自上述本發(fā)明枯草桿菌型堿性蛋白酶的所有蛋白或片段，并具有愈加優(yōu)選的至少20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，220，240，260，280，300，320，340，343和360個(gè)氨基酸，它們已經(jīng)連接在初始分子中，并位于出發(fā)氨基酸序列的開始，內(nèi)部或結(jié)束處。
圖1的比對(duì)揭示出，位置167到位置184的區(qū)域(根據(jù)比對(duì)的編號(hào))構(gòu)成18個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的片段，所述片段與最相似的酶相同。因而，通過片段化或缺失突變而衍生的本發(fā)明的蛋白或片段具有相對(duì)大的區(qū)域，所述區(qū)域與已知蛋白酶是不相同的。
這些蛋白或片段優(yōu)選對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO.2的氨基酸112到氨基酸381的區(qū)域，也就是成熟蛋白。
在各種情形下，有愈加優(yōu)選的通過片段化或缺失突變而衍生的蛋白或片段，這些蛋白或片段與SEQ ID NO.2所示的同源序列分別具有至少82％，84％，86％，88％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％和100％的同一性。
本發(fā)明的片段表示所有小于同源蛋白的蛋白或肽，所述同源蛋白對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2，但在適當(dāng)?shù)牟糠中蛄猩吓c它們相一致。這些片段例如可以是單一結(jié)構(gòu)域或區(qū)段，所述區(qū)段與結(jié)構(gòu)域不相一致。這樣的區(qū)段可以以較低成本生產(chǎn)，不再具有某些出發(fā)分子可能的不利特性，諸如可能的活性降低調(diào)節(jié)機(jī)制，或展示更有利的活性分布圖。這樣的蛋白片段也可以以非生物合成的方式但例如通過化學(xué)方法生產(chǎn)。例如當(dāng)合成后需要進(jìn)行化學(xué)修飾時(shí)，化學(xué)合成是有利的。
通過缺失突變獲得的蛋白也被指定為片段，因?yàn)樗鼈冊(cè)谠砩鲜穷愃频?。缺失突變特別值得用來缺失抑制區(qū)域。缺失的結(jié)果既可與專一化相關(guān)，也可與延伸蛋白應(yīng)用的范圍相關(guān)。
通過消除N-端氨基酸從前提蛋白獲得的蛋白以及信號(hào)肽也可被視為天然形成的片段或缺失突變的蛋白。這樣一種切割機(jī)制可用來例如借助于被信號(hào)肽酶所識(shí)別的特定序列區(qū)域的幫助，在重組蛋白中規(guī)定特異的切割位點(diǎn)。因此，有可能在體外進(jìn)行本發(fā)明蛋白的激活和/或鈍化。
本發(fā)明的其他實(shí)施方案是所有通過插入突變，通過替換突變和/或通過與至少一種其他蛋白或蛋白片段融合而衍生自上述本發(fā)明枯草桿菌素型堿性蛋白酶的蛋白。
本發(fā)明的嵌合蛋白在最大意義上展示蛋白水解活性。這可通過衍生自本發(fā)明蛋白的分子部分實(shí)施或修飾。因此，嵌合蛋白也可位于上述區(qū)域之外的整個(gè)長(zhǎng)度上。借助于本發(fā)明的蛋白上融合的部分，這樣的融合點(diǎn)例如導(dǎo)入或修飾特定功能或部分功能。就此而論，對(duì)于本發(fā)明的目的而言，它是非實(shí)質(zhì)的，不管這樣的嵌合蛋白是否由單個(gè)多肽鏈或多個(gè)亞基組成。為了實(shí)施上述的替代法，例如，在翻譯后或僅在純化步驟之后通過特異蛋白酶解切割，有可能將單個(gè)嵌合多肽鏈降解成多個(gè)亞基。
因此，例如，基于WO99/57254，通過肽接頭或直接作為與其他蛋白的結(jié)合區(qū)，例如纖維素結(jié)合區(qū)的融合蛋白，有可能提供本發(fā)明的蛋白或其部分，從而使得底物的水解更有效。這樣的結(jié)合區(qū)也可源自蛋白酶，例如為了增強(qiáng)本發(fā)明的蛋白與蛋白酶底物的結(jié)合。這提高了蛋白酶的局部濃度，在個(gè)別應(yīng)用中可能是有利的，例如在原料的處理中。對(duì)于本發(fā)明的蛋白同樣有可能加以連接到例如淀粉酶或纖維素酶，以執(zhí)行雙重功能。
通過插入突變獲得的本發(fā)明的蛋白由于在原理上是相似的，因此被指定為本發(fā)明的嵌合蛋白。這些嵌合蛋白也包括替換變體，也就是說其中分子的單個(gè)區(qū)域已被其他蛋白的元件所替換的那些變體。
正如在雜交體形成的情況下，插入和替換突變的點(diǎn)是將本發(fā)明蛋白的單獨(dú)特性，功能或部分功能與其他蛋白相結(jié)合。這也包括例如通過改組或重組不同蛋白酶的部分序列而獲得的變體。以此方式有可能獲得以前未曾描述的蛋白。這種技術(shù)允許從顯著的活性調(diào)制到很精細(xì)的活性調(diào)制的作用。
這種突變優(yōu)選通過隨機(jī)方法進(jìn)行，以指定到定向演化的領(lǐng)域，例如，通過StEP方法(Zhao等(1998)，Nat.Biotechnol.，第16卷，第258-261頁)，隨機(jī)引發(fā)重組(Shao等(1998)，Nucleic Acids Res.，第26卷，第681-683頁)，DNA改組(Stemmer，W.P.C.(1994)，Nature，第370卷，第389-391頁)或回歸序列重組(RSR；WO98/27230，WO97/20078，WO95/22625)或RACHITT法(Coco，W.M.等(2001)，Nat.Biotechnol.，第19卷，第354-359頁)。在突變和表達(dá)之后，將這些類型的方法便利地與選擇方法或篩選方法結(jié)合，以鑒定具有所需特性的變體。由于這些技術(shù)應(yīng)用在DNA水平上，在各種情形下有關(guān)的新生成的基因提供生物技術(shù)生產(chǎn)的出發(fā)點(diǎn)。
倒置突變，即部分序列倒置，可被視作缺失和插入的特殊形式。這種類型的變體同樣可以靶向或隨機(jī)的方式生產(chǎn)。
優(yōu)選迄今提到的所有蛋白，蛋白片段或融合蛋白，其特征在于，它們本身能夠水解蛋白。
這樣的實(shí)體根據(jù)IUBMB官方1992年酶命名法被分類為3.4(肽酶)。其中，優(yōu)選內(nèi)肽酶，尤其是組3.4.21絲氨酸蛋白酶，3.4.22半胱氨酸蛋白酶，3.4.23天冬氨酸蛋白酶和3.4.24金屬蛋白酶的內(nèi)肽酶。其中，絲氨酸蛋白酶(3.4.21)是尤其優(yōu)選的，并且其中又優(yōu)選subtilase，而其中最優(yōu)選枯草桿菌素(參照“Subtilases枯草桿菌素-樣蛋白酶”，R.Siezen，第75-95頁，“枯草桿菌素酶(Subtilisin enzymes)”，R.Bott和C.Betzel編，New York，1996)。其中，依次優(yōu)選組IS-2枯草桿菌素，其為高堿性枯草桿菌素。
就此而論，活性分子優(yōu)選失活分子，這是因?yàn)?，水解的進(jìn)行例如在下述的應(yīng)用領(lǐng)域中是尤其重要的。
上述片段在最廣意義上也具有酶解活性，例如，為了絡(luò)合底物，或?yàn)榱诵纬蓪?duì)水解所必需的結(jié)構(gòu)元件。當(dāng)它們自身可用于水解另一蛋白而無需其他蛋白酶組分存在的時(shí)候，它們是優(yōu)選的。這涉及可通過蛋白酶本身進(jìn)行的活性，同時(shí)可能必須存在的緩沖液物質(zhì)，輔助因子等保留未受此影響。
分子不同部分對(duì)蛋白水解的相互影響天然在缺失突變體中存在比在片段中多，尤其是出現(xiàn)在融合蛋白中，更特別是那些由相關(guān)蛋白改組而衍生的蛋白。其中這導(dǎo)致維持，修飾，說明或第一達(dá)到最廣意義上的酶解功能，缺失變體和融合蛋白是本發(fā)明的蛋白。其中在這方面，本發(fā)明優(yōu)選的代表是那些本身能夠水解蛋白底物而無需存在其他蛋白酶組分的蛋白。
優(yōu)選的實(shí)施方案由迄今所述的所有蛋白，蛋白片段或融合蛋白表示，其特征在于，它們另被衍生化。
衍生物表示那些通過其他修飾而衍生自上述蛋白的蛋白。這樣的修飾可影響例如穩(wěn)定性，底物特異性，或?qū)Φ孜锏慕Y(jié)合強(qiáng)度或者酶活性。它們也可用于減少蛋白的變應(yīng)原性和/或免疫原性，從而增加例如其與皮膚的相容性。
這些衍生化作用可例如通過生物學(xué)方法發(fā)生，例如通過生成的宿主生物體與蛋白生物合成相聯(lián)系。諸如脂或寡糖的低分子量化合物的偶聯(lián)應(yīng)該在此連接中受到特別強(qiáng)調(diào)。
然而，衍生化作用也可通過化學(xué)方法，例如通過化學(xué)轉(zhuǎn)化側(cè)鏈或通過把另一個(gè)例如大分子化合物共價(jià)結(jié)合到蛋白上而進(jìn)行?；瘜W(xué)修飾描述在例如申請(qǐng)DE4013142中。酶中的胺與羧基偶聯(lián)改變等電點(diǎn)，例如公開在WO95/26398中。例如，可例如通過雙官能團(tuán)化學(xué)化合物，將諸如蛋白質(zhì)的大分子與本發(fā)明蛋白連接起來。因此，例如，有可能通過應(yīng)用WO99/57154至WO99/57159，WO00/18865和WO00/57155的教導(dǎo)，通過含有特異結(jié)合區(qū)的接頭來提供本發(fā)明的蛋白。這樣的衍生物特別適用于洗滌或清潔產(chǎn)品中。也可能以類似于WO00/01831的方式將蛋白酶抑制劑與本發(fā)明的蛋白通過接頭，尤其是氨基酸接頭連接起來。與其他諸如聚乙二醇的大分子化合物的偶聯(lián)改善了該分子的其他有關(guān)特性，諸如穩(wěn)定性或與皮膚的相容性。這樣一種修飾例如描述在美國(guó)專利5230891中，將蛋白酶用于化妝品中。
本發(fā)明蛋白的衍生物也以最廣意義表示這些酶的制備物。取決于分離，加工或制備方法，蛋白可以與多種不同的其他物質(zhì)相結(jié)合，例如與來自產(chǎn)蛋白酶的微生物的培養(yǎng)物中的物質(zhì)相結(jié)合。蛋白也可與其他某些物質(zhì)已經(jīng)故意混合，例如以增加其儲(chǔ)存穩(wěn)定性。因此，本發(fā)明也涉及本發(fā)明蛋白的所有制備物。這也獨(dú)立于此酶活性是否真正展示在特定的制備物中。這是因?yàn)?，?duì)其來說，期望的是在儲(chǔ)存過程中僅具有一點(diǎn)點(diǎn)活性或沒有活性，而在使用時(shí)展示其酶解功能。例如通過適當(dāng)?shù)南喟槲镔|(zhì)，這可得以控制。蛋白酶與其抑制劑的共同制備物在現(xiàn)有技術(shù)(WO00/01826)中尤其是已知的。
優(yōu)選的實(shí)施方案由迄今所述的所有蛋白，蛋白片段或融合蛋白表示，其特征在于它們另被穩(wěn)定化。
這增加了它們?cè)趦?chǔ)存過程和/或使用過程中的穩(wěn)定性，例如在洗滌處理中，以便使它們的活性能更持久，并因此活性得以增強(qiáng)。本發(fā)明蛋白酶的穩(wěn)定性可通過例如偶聯(lián)到聚合物上而得以提高。這種方法描述在例如US5230891中。用前，它需要在適當(dāng)?shù)脑噭┲校ㄟ^化學(xué)偶聯(lián)步驟，將蛋白連接到這些聚合物上。
優(yōu)選通過點(diǎn)突變分子本身而獲得的可能的穩(wěn)定化作用，因?yàn)樗鼈冊(cè)讷@得蛋白后不需要任何其他的操作步驟。一些適用于此的點(diǎn)突變是本身已知的現(xiàn)有技術(shù)。因此，按照US6087315和US6110884，采用其他氨基酸殘基替換特定的酪氨酸殘基可使蛋白酶穩(wěn)定。
其他可能性例如為-按照EP583339用脯氨酸替換特定的氨基酸殘基；-按照EP995801向分子表面引入更高極性的或帶更多電荷的基團(tuán)；-改變金屬離子的結(jié)合，特別是鈣結(jié)合位點(diǎn)，例如按照申請(qǐng)WO88/08028和WO88/08033的教導(dǎo)。
根據(jù)上述第一個(gè)文獻(xiàn)，參與鈣結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基不得不被帶有負(fù)電荷的氨基酸所替換；根據(jù)申請(qǐng)WO88/08033的教導(dǎo)，點(diǎn)突變將不得不同時(shí)通過鈣結(jié)合導(dǎo)入兩個(gè)殘基精氨酸/甘氨酸的序列中的至少一個(gè)殘基中；-根據(jù)US5453372，蛋白可受到表面上特定突變的保護(hù)，以防止諸如表面活性劑的變性劑的作用。
其他可比較的可能性描述在US5340735，US5500364，US5985639和US6136553中。
另一針對(duì)高溫和表面活性劑作用的穩(wěn)定化作用的可能性將是應(yīng)用WO92/21760以及尚未公布的申請(qǐng)DE10121463和DE10153792的教導(dǎo)，對(duì)那些蛋白酶通過交換位于N端附近的氨基酸而得以穩(wěn)定化，使得通過非共價(jià)相互作用與剩余分子接觸，從而有助于維持球形結(jié)構(gòu)。
優(yōu)選的實(shí)施方案是那些其中分子以多種途徑被穩(wěn)定化的蛋白酶。這是因?yàn)?，例如，根?jù)WO89/09819，采用多個(gè)穩(wěn)定突變，可認(rèn)為有額外的作用。
優(yōu)選的實(shí)施方案由迄今所述的所有蛋白，蛋白片段或融合蛋白或衍生物表示，其特征在于它們與上述本發(fā)明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或其衍生物之一共同具有至少一種的抗原決定簇。
這是因?yàn)?，蛋白的二?jí)結(jié)構(gòu)元件及其三維折疊對(duì)酶活性至關(guān)重要。因此，在它們一級(jí)結(jié)構(gòu)中彼此有明顯區(qū)別的結(jié)構(gòu)域可形成在空間上基本一致的結(jié)構(gòu)，從而使得相同的酶行為成為可能。這種在二級(jí)結(jié)構(gòu)中的共同特征通過抗血清或純的抗體或單克隆抗體，通常被識(shí)別為符合抗原決定簇。彼此相似的蛋白或衍生物因此通過免疫化學(xué)交叉反應(yīng)可被檢測(cè)和指定。為此，從它們?cè)谝患?jí)結(jié)構(gòu)中的同源性水平不可能，但從它們的免疫化學(xué)關(guān)系則可能被指定到上述定義的本發(fā)明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或其衍生物，也尤其包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
優(yōu)選的實(shí)施方案由迄今所述的所有蛋白，蛋白片段或融合蛋白或衍生物表示，其特征在于它們可獲自天然來源，尤其是來自微生物。
這些微生物可以例如是單細(xì)胞真菌或細(xì)菌。這是因?yàn)樗鼈兺ǔ１榷嗉?xì)胞生物或來自多細(xì)胞生物的細(xì)胞培養(yǎng)物更容易分離和操作；盡管后者對(duì)特定實(shí)施方案而言可代表值得做的選擇，并且因此原則上不排除在本發(fā)明的主題之外。
雖然天然存在的生產(chǎn)菌能制備本發(fā)明的酶，但是酶在初始建立的條件下僅有小部分可被表達(dá)和/或釋放到周圍介質(zhì)中。但是，這不排除在通過實(shí)驗(yàn)確立的合適環(huán)境條件或其他因素影響下，對(duì)它們進(jìn)行刺激從而經(jīng)濟(jì)上值得生產(chǎn)本發(fā)明蛋白的可能性。這樣一種調(diào)節(jié)機(jī)制可有意用于生物技術(shù)生產(chǎn)中。如果后者也是不可能的，則它們?nèi)钥捎糜诜蛛x相關(guān)基因。
其中，那些來自革蘭氏陽性細(xì)菌的酶是尤其優(yōu)選的。
這是因?yàn)樗鼈儧]有外膜，因此將分泌的蛋白直接釋放到周圍介質(zhì)中。
那些來自芽孢桿菌屬的革蘭氏陽性細(xì)菌的酶是尤其優(yōu)選的。
芽孢桿菌蛋白酶從一開始就具有對(duì)各種可能的技術(shù)用途的有利特性。這些特性包括對(duì)高溫，氧化劑或變性劑的一定穩(wěn)定性。此外，利用微生物蛋白酶，對(duì)其生物技術(shù)生產(chǎn)例如所涉及的構(gòu)建合適的克隆載體，選擇宿主細(xì)胞和生長(zhǎng)條件或者諸如變應(yīng)原性的風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估，已經(jīng)獲得最多經(jīng)驗(yàn)。芽孢桿菌還被確立成生產(chǎn)生物體，其在工業(yè)處理中具有特別高的生產(chǎn)效率。對(duì)這些蛋白酶的制備和應(yīng)用所獲得的知識(shí)量的好處還在于促進(jìn)開發(fā)這些酶，例如涉及它們與諸如洗滌或清潔產(chǎn)品成分中的其他化學(xué)化合物的相容性。
在那些來自芽孢桿菌種的酶中，又優(yōu)選那些來自Bacillus gibsonii的酶，尤其是來自Bacillus gibsonii(DSM 14391)的酶。
這是因?yàn)?，本發(fā)明酶的實(shí)施方案最初是從中獲得的。其相關(guān)序列示于序列表中，而其酶特性描述在實(shí)施例中。從該菌株或從相關(guān)菌株中具體通過應(yīng)用諸如PCR和/或本身已知的點(diǎn)突變的分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法可制備上述的變體。
本發(fā)明的其他目的實(shí)現(xiàn)，因而也是本發(fā)明的固有方面，由用于實(shí)施本發(fā)明的核酸所代表。
核酸是蛋白的幾乎所有分子生物學(xué)研究，開發(fā)及其生產(chǎn)的出發(fā)點(diǎn)，尤其包括基因測(cè)序和衍生相應(yīng)的氨基酸序列，以及任何一種蛋白的突變(參見上文)和表達(dá)。
用于開發(fā)具有特定性質(zhì)的蛋白的突變也稱作“蛋白質(zhì)工程”。將要優(yōu)化的特性的例子上文已經(jīng)提及。這樣一種突變可以靶向方式或通過隨機(jī)方法進(jìn)行，例如采用后續(xù)的針對(duì)克隆基因上的活性的識(shí)別和/或選擇方法(篩選和選擇)，例如通過與核酸探針雜交，或者針對(duì)基因產(chǎn)物蛋白，例如通過其活性。本發(fā)明蛋白酶的進(jìn)一步開發(fā)具體也可定位在下列出版物中所提出的理念上“Protein engineering”，P.N.Bryan(2000)，Biochim.Biophys.Acta.，第1543卷，第203-222頁。
因此，本發(fā)明的一個(gè)主題是每一種編碼枯草桿菌素型堿性蛋白酶的核酸，該堿性蛋白酶的核苷酸序列具有至少70％的同一性，尤其是在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO.2的氨基酸115到氨基酸384的部分區(qū)域上。
其中，愈加優(yōu)選的是那些酶的核苷酸序列與SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列分別具有至少72％，74％，76％，78％，80％，82％，84％，85％，86％，88％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％和100％的同一性，尤其是在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO.2的氨基酸115到氨基酸384的部分區(qū)域上。上述同一性相應(yīng)也適用于成熟蛋白的位置和終止密碼子。
這是因?yàn)?，可以預(yù)計(jì)這些核酸編碼蛋白，其特性與來自B.gibsonii(DSM 14391)的堿性蛋白酶愈加相似。
在這方面，本發(fā)明的其他代表是所有核酸，其編碼上述本發(fā)明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或其衍生物中的一種。
編碼上述優(yōu)選形式的核酸是相應(yīng)優(yōu)選的，通過突變獲得的核酸也是尤其優(yōu)選的。
具體而言，編碼蛋白片段的核酸專門包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。采用這種寡核苷酸，所有三種讀碼框，無論有義還是反義方向，都必須考慮到。這是因?yàn)?，尤其通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，它們可用作合成相關(guān)核酸的起始點(diǎn)，例如用作從天然生物體中擴(kuò)增相關(guān)基因的起始點(diǎn)。通過基于PCR的改組方法，它們也可用于生產(chǎn)嵌合體。其他改組方法，例如公開在申請(qǐng)WO00/09679中的重組連接反應(yīng)(RLR)也是基于寡核苷酸，所述寡核苷酸對(duì)應(yīng)于隨機(jī)或特異性選定的蛋白片段。反義寡核苷酸也可用于例如調(diào)節(jié)表達(dá)。
根據(jù)上文所述，在上述的本發(fā)明核酸中，下列核酸是愈加優(yōu)選的-那些特征在于它們獲自天然來源，尤其是獲自微生物的核酸；-其中，那些特征在于微生物是革蘭氏陽性細(xì)菌的核酸；
-其中，那些特征在于革蘭氏細(xì)菌是一種芽孢桿菌屬的核酸；以及-其中，那些特征在于芽孢桿菌種是Bacillus gibsonii，尤其是Bacillus gibsonii(DSM14391)的核酸。
包含上述定義的本發(fā)明的一種核酸區(qū)域的載體，尤其是包含一種編碼上文定義的本發(fā)明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物之一的核酸區(qū)域的載體，構(gòu)成本發(fā)明的固有方面。
為了操作與本發(fā)明相關(guān)的核酸，并且因此特別是為了制備該核酸用于生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白，將它們方便地連接到載體中。這些載體及其相關(guān)的操作方法詳細(xì)描述在現(xiàn)有技術(shù)中。載體可以大量和多種選擇從市場(chǎng)上獲得，既用于克隆也用于表達(dá)。這些載體包括例如，衍生自細(xì)菌質(zhì)粒的載體，衍生自噬菌體的載體，或衍生自病毒的載體，或主要是合成的載體。此外，根據(jù)載體能夠建立自身的細(xì)胞類型的性質(zhì)，它們可區(qū)分成例如革蘭氏陰性細(xì)菌載體，革蘭氏陽性細(xì)菌載體，酵母載體或高等真核生物載體。它們是例如合適的分子生物學(xué)和生化研究的出發(fā)點(diǎn)，也是有關(guān)基因表達(dá)或者相應(yīng)蛋白的出發(fā)點(diǎn)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體是克隆載體。
克隆載體除了儲(chǔ)存，生物學(xué)擴(kuò)增或選擇目的基因之外，還適用于其他分子生物學(xué)鑒定。同時(shí)，它們是要求保護(hù)的核酸的可轉(zhuǎn)運(yùn)和可儲(chǔ)存的形式，并且也是不與細(xì)胞連接的分子生物學(xué)技術(shù)的出發(fā)點(diǎn)，所述技術(shù)諸如PCR或體外突變方法。
優(yōu)選地，本發(fā)明的載體是表達(dá)載體。
這種表達(dá)載體是在生物生產(chǎn)體系中用于實(shí)施相應(yīng)核酸并由此生產(chǎn)相應(yīng)蛋白的基礎(chǔ)。本發(fā)明這種主題的優(yōu)選實(shí)施方案是攜帶對(duì)表達(dá)所必需的遺傳元件的表達(dá)載體，所述遺傳元件例如是最初位于所述基因上游的天然啟動(dòng)子或另一生物體的啟動(dòng)子。所述元件可以例如排列成“表達(dá)盒”的形式。或選的可能性是在各種情形下，由宿主細(xì)胞提供的一種或所有的調(diào)節(jié)元件。表達(dá)載體尤其優(yōu)選地適用于其他特性，例如對(duì)選擇表達(dá)系統(tǒng)，尤其是宿主細(xì)胞的最適拷貝數(shù)(參見下文)。
為了得到高表達(dá)率，對(duì)表達(dá)載體而言如果可能僅包含相關(guān)基因作為插入物以及沒有相對(duì)大的5’或3’非編碼區(qū)，這是特別有利的。當(dāng)用限制性酶隨機(jī)處理出發(fā)菌株的染色體DNA所獲得的片段在測(cè)序之后和整合到表達(dá)載體之前經(jīng)再次故意切割時(shí)，可獲得這種插入體。
表達(dá)載體的一個(gè)例子為pAWA22，其描述在本申請(qǐng)的圖2中，并且可如在實(shí)施例2中所公開的那樣加以使用。其他載體為專業(yè)技術(shù)人員從現(xiàn)有技術(shù)中可獲得，并且可大量從市場(chǎng)上獲得。
包含上述定義的本發(fā)明的一種核酸區(qū)域的細(xì)胞，尤其是一種優(yōu)選在上述本發(fā)明的載體之一上包含一種編碼上文定義的本發(fā)明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物之一的核酸區(qū)域的細(xì)胞，構(gòu)成本發(fā)明的固有方面。
這是因?yàn)椋@些細(xì)胞含有合成本發(fā)明蛋白的遺傳信息。它們使得例如相應(yīng)基因的擴(kuò)增，突變處理或轉(zhuǎn)錄和翻譯成為可能，并且最終也使得相關(guān)蛋白通過生物技術(shù)生產(chǎn)成為可能。這種遺傳信息可存在于染色體外，作為固有的遺傳元件，即存在于細(xì)菌中位于質(zhì)粒上，或者被整合到染色體中。挑選合適系統(tǒng)取決于目的，例如基因或者生物體的儲(chǔ)存方式和持續(xù)時(shí)間或者突變或選擇的方式。因此，突變和選擇方法例如基于噬菌體及其特異宿主細(xì)胞，被描述用于開發(fā)在現(xiàn)有技術(shù)(WO97/09446)中洗滌產(chǎn)品用酶。
優(yōu)選宿主細(xì)胞，其表達(dá)或可被誘導(dǎo)表達(dá)任何本發(fā)明上述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物，尤其是通過利用上述本發(fā)明的核酸區(qū)域，更特別是通過利用上述的表達(dá)載體。
制備所述蛋白的宿主細(xì)胞使得通過生物技術(shù)生產(chǎn)該蛋白成為可能。為此目的，它們必須方便地與上述的一種載體一起已經(jīng)接受了有關(guān)基因，并且能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，翻譯以及優(yōu)選的其他可能的修飾步驟。
蛋白表達(dá)的合適的宿主細(xì)胞原則上是所有生物體，即原核生物，真核生物或藍(lán)藻(Cyanophyta)。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是那些可容易進(jìn)行遺傳操作，例如有關(guān)的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及其穩(wěn)定建立以及表達(dá)調(diào)控的細(xì)胞，如單細(xì)胞的真菌或者細(xì)菌。此外，優(yōu)選的宿主細(xì)胞的特征在于良好的微生物和生物技術(shù)操作性。這例如涉及易培養(yǎng)性、高生長(zhǎng)率、對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的低需求、良好的生產(chǎn)率以及外源蛋白質(zhì)的分泌。尤其優(yōu)選針對(duì)表達(dá)的試驗(yàn)菌株。這些菌株可商購(gòu)，或一般從菌種保藏機(jī)構(gòu)獲得。通過這種方法，本發(fā)明的任何蛋白質(zhì)理論上可以從大量宿主生物中得到。必須通過試驗(yàn)，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，從可得到的不同系統(tǒng)的豐度中才能確定哪種表達(dá)系統(tǒng)對(duì)個(gè)別情況最適合。
宿主細(xì)胞本身是蛋白酶陰性的，因此不會(huì)降解產(chǎn)生的蛋白，這是尤其有利的。一種這樣的菌株枯草芽孢桿菌DB104用于實(shí)施例2中。
優(yōu)選的實(shí)施方案是那些宿主細(xì)胞，其活性由于存在適當(dāng)?shù)倪z傳元件可得以調(diào)控，例如，通過控制加入化學(xué)化合物，改變培養(yǎng)條件或以特定的細(xì)胞密度作為函數(shù)。這種可控表達(dá)使得非常經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)目的蛋白成為可能。方便的是，基因，表達(dá)載體和宿主細(xì)胞例如對(duì)表達(dá)所需的遺傳元件(核糖體結(jié)合位點(diǎn)，啟動(dòng)子，終止子)，或?qū)γ艽a子應(yīng)用彼此匹配。后者例如可被優(yōu)化，在基因中通過用特定宿主最常用的那些密碼子替換僅被有關(guān)宿主翻譯較差的那些密碼子，而在各種情形下意思相同。
其中優(yōu)選這些宿主細(xì)胞，其特征在于它們是細(xì)菌，尤其是那些將產(chǎn)生的蛋白分泌到周圍介質(zhì)中的細(xì)菌。
細(xì)菌本身的特征在于短的傳代時(shí)間，以及對(duì)培養(yǎng)條件的低的要求。這使得建立成本效應(yīng)的方法成為可能。此外，可獲得細(xì)菌發(fā)酵技術(shù)中的大量經(jīng)驗(yàn)。對(duì)于在個(gè)別情況下有待通過試驗(yàn)確定的多種理由而言，革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細(xì)菌可以適用于特定生產(chǎn)，所述理由諸如營(yíng)養(yǎng)源，產(chǎn)物形成速率，所需時(shí)間等。
諸如大腸桿菌(E.coli)的革蘭氏陰性細(xì)菌，例如分泌多種蛋白到胞質(zhì)空間中。對(duì)于特殊應(yīng)用這可能是有利的。相反，諸如芽孢桿菌的革蘭氏陽性細(xì)菌，例如立即將分泌的蛋白釋放到細(xì)胞周圍的營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)中，根據(jù)另一優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的表達(dá)蛋白可從中直接加以純化。
申請(qǐng)WO01/81597公開了一種方法，根據(jù)該方法，表達(dá)的蛋白也實(shí)現(xiàn)了通過革蘭氏陰性細(xì)菌的輸出。這種系統(tǒng)也適用于生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白。因此，優(yōu)選的宿主細(xì)胞是大腸桿菌(Escherichia coli)或克雷伯氏菌(Klebsiella)，尤其是菌株E.coli JM 109，E.coli DH 100B，E.coliDH 12S或植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)(參照物)。它們要求在本申請(qǐng)中所述的適當(dāng)?shù)奈⑸镄揎椇?或合適的載體，以便使得產(chǎn)生的蛋白能夠釋放。
細(xì)菌優(yōu)選作為宿主細(xì)胞的特征在于，它們?yōu)楦锾m氏陽性細(xì)菌，尤其是它們屬于芽孢桿菌屬，更特別屬于遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)，地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或親堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案利用B.gibsonii，尤其是B.gibsonii(DSM14391)自身，從而(同源性)表達(dá)本發(fā)明蛋白。然而，另一方面，優(yōu)選異源表達(dá)，為此優(yōu)選芽孢桿菌屬的細(xì)菌，因?yàn)閷?duì)生產(chǎn)而言，在革蘭氏陽性細(xì)菌中它們是被最充分鑒定的。在此具體包括的是地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)，解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)或其他芽孢桿菌種或親堿芽孢桿菌(B.alcalophilus)菌株。這是因?yàn)?，例如從申?qǐng)WO91/02792的教導(dǎo)中，可獲得涉及用這些菌種生產(chǎn)蛋白酶的相關(guān)經(jīng)驗(yàn)。該申請(qǐng)還公開了眾多可能的表達(dá)載體。這些相關(guān)菌種另具有相似的密碼子用法，并且它們自身能生產(chǎn)可比較的枯草桿菌素，從而蛋白合成系統(tǒng)被天然適當(dāng)?shù)囟ㄏ颉?br> 另一優(yōu)點(diǎn)是通過該方法可能獲得本發(fā)明蛋白與由宿主菌株內(nèi)源性產(chǎn)生的枯草桿菌素的混合物。這樣一種共表達(dá)同樣公開在申請(qǐng)WO91/02792中。如果這不需要，則天然存在于宿主細(xì)胞的蛋白酶基因?qū)⑿枰M(jìn)行永久性或短暫性失活(參見上文)。
進(jìn)一步優(yōu)選宿主細(xì)胞，其特征在于它們是真核細(xì)胞，尤其是那些翻譯后對(duì)產(chǎn)生的蛋白進(jìn)行修飾的真核細(xì)胞。
合適的真核生物的例子為真菌，如放線菌(Actinomyceten)或者酵母如糖酵母(Saccharomyces)或克魯伯氏酵母(Kluyveromyces)。嗜熱真菌表達(dá)系統(tǒng)在例如WO96/02653中提出。它們尤其適合于表達(dá)耐熱的變體。真核系統(tǒng)中進(jìn)行的修飾，尤其與蛋白合成相連的修飾，包括結(jié)合諸如膜錨分子(anchor)或寡糖的低分子化合物。這種寡糖修飾可以是期望的，例如，用于減少變應(yīng)原性。與由這樣的細(xì)胞天然產(chǎn)生的酶，如纖維素酶共表達(dá)可能也是有利的。
本發(fā)明蛋白的制備方法是本發(fā)明的單獨(dú)主題。
因此，利用上述本發(fā)明的核酸和/或利用上述本發(fā)明的載體和/或利用上述的本發(fā)明的一種細(xì)胞，每一種生產(chǎn)上述本發(fā)明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物的方法都被要求保護(hù)。
這些包括例如化學(xué)合成方法，這些方法尤其對(duì)較短片段在經(jīng)濟(jì)上是值得的。
然而，所有分子生物學(xué)，微生物學(xué)或生物技術(shù)學(xué)生產(chǎn)方法的各個(gè)方面在上文中已得以提及，并且在現(xiàn)有技術(shù)中被確立，其對(duì)后者是優(yōu)選的。因而，根據(jù)分子生物學(xué)本身已知的方法，例如基于上述的DNA和氨基酸序列，如所推導(dǎo)的，例如也來自序列表，優(yōu)選基于SEQ ID NO.1和2本身，可合成相應(yīng)的寡核苷酸和寡肽，直至完整的基因和蛋白。
從已知枯草桿菌素生產(chǎn)微生物出發(fā)，例如，遵循本申請(qǐng)中的實(shí)施例，可鑒定和分離其他天然的枯草桿菌素產(chǎn)生菌，根據(jù)本文所述的條件，來確定它們的枯草桿菌素基因和/或氨基酸序列，并且開發(fā)它們。這種細(xì)菌菌種利用適當(dāng)?shù)纳a(chǎn)方法也可進(jìn)行培養(yǎng)。類似地，新的表達(dá)載體根據(jù)在申請(qǐng)WO91/02792中所公開的載體模型，可進(jìn)行開發(fā)。其中在體外進(jìn)行蛋白生物合成的不含細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)基于相應(yīng)的核酸序列，也可能是本發(fā)明的實(shí)施方案。上文已經(jīng)闡明的任何元件也可被組合生成新的方法，用于制備本發(fā)明蛋白。就此而論，對(duì)每種本發(fā)明的蛋白而言，多種可能的方法步驟組合是可以想象的，從而最適方法針對(duì)各個(gè)特定的個(gè)案必須通過試驗(yàn)才能加以確定。
本發(fā)明的單獨(dú)主題包含產(chǎn)物，其特征在于它們包括上述本發(fā)明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物。
所有類型的產(chǎn)物，尤其是混合物，制劑，溶液等，它們的效用通過加入上述本發(fā)明的蛋白而得以改善，在此包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。取決于應(yīng)用領(lǐng)域，它們可以是例如固體混合物，例如含有凍干或膠囊化的蛋白的粉劑，或凝膠狀產(chǎn)品或液體產(chǎn)品。優(yōu)選的制劑包括例如緩沖物質(zhì)，穩(wěn)定劑，蛋白酶的反應(yīng)物和/或其他輔助因子和/或與蛋白酶有協(xié)同作用的其他成分。這些成分應(yīng)該理解包括在下文詳述的應(yīng)用領(lǐng)域的特定產(chǎn)品中。其他應(yīng)用領(lǐng)域從現(xiàn)有技術(shù)中也是一目了然的，并且描述在例如手冊(cè)“工業(yè)用酶及其應(yīng)用(Industrial enzymes and theirapplications)”，H.Uhlig，Wiley出版，New York，1998。
包括在本發(fā)明主題中的優(yōu)選實(shí)施方案是洗滌或清潔產(chǎn)品，其特征在于它們包括上述的本發(fā)明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物之一。
這是因?yàn)?，如在本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中所示，令人驚奇地已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，特別優(yōu)選的B.gibsonii(DSM 14391)的堿性蛋白酶，也就是說，甚至是野生型酶，其特征在于，在相應(yīng)的洗滌或清潔產(chǎn)品中使用時(shí)，在它們對(duì)洗滌或清潔性能的貢獻(xiàn)方面，其至少接近為此目的確定的酶，或者在某些情形下事實(shí)上超過它們。
所有可能類型的洗滌產(chǎn)品，既包括濃縮物也包括不用稀釋加以使用的產(chǎn)品均屬于本發(fā)明的主題；商業(yè)規(guī)模的使用，用于洗衣機(jī)或用于手洗或手工清潔。對(duì)此包括例如用于織物、地毯或天然纖維的洗滌產(chǎn)品，在本發(fā)明對(duì)此使用術(shù)語洗滌產(chǎn)品。它們也包括例如用于洗碗機(jī)的洗碗劑或用于硬表面，例如金屬、玻璃器皿、瓷器、陶器、瓦片、寶石、涂漆面、塑料、木制品或皮革的手工洗碗劑或清洗劑。對(duì)于這些來說，在本發(fā)明使用術(shù)語清潔產(chǎn)品。任何類型的洗滌或清潔產(chǎn)品都是本發(fā)明的實(shí)施方案，只要其中加入本發(fā)明的蛋白質(zhì)，蛋白片段，融合蛋白或衍生物。
本發(fā)明的實(shí)施方案包含任何按照現(xiàn)有技術(shù)中確定的和/或適當(dāng)?shù)谋景l(fā)明洗滌或清潔產(chǎn)品的提供形式。它們包括例如固體、粉末、液體、膠狀或膏狀劑，如果需要由若干相組成，擠壓式或非擠壓式；其他例子還包括包裝在大容器內(nèi)和小份中的壓出膠、顆粒、片劑及小袋。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的洗滌或清潔產(chǎn)品包括上述本發(fā)明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物，其用量每克產(chǎn)品為2μg至20mg，優(yōu)選5μg至17.5mg，更優(yōu)選20μg至15mg，尤其更優(yōu)選50μg至10mg。
這種產(chǎn)品中的蛋白酶活性可以按照在Tenside，第7卷(1970)，第125-132頁中描述的方法測(cè)定，并以蛋白酶單位(PE＝蛋白酶-單元)給出。
除了本發(fā)明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物之外，如果需要，本發(fā)明的洗滌或清潔產(chǎn)品還包含其他成分，例如酶穩(wěn)定劑，表面活性劑，如非離子、陰離子和/或兩性表面活性劑，和/或漂白劑，和/或助洗劑(builder)以及任選下文所列的其他常規(guī)成分。
優(yōu)選的非離子表面活性劑為烷氧基化的，有利的是乙氧基化的，特別優(yōu)選含有8-18個(gè)碳原子以及平均每mol醇1-12mol環(huán)氧乙烷(EO)的伯醇，其中醇?xì)埢梢允侵辨湹模騼?yōu)選在位置2上被甲基支化的，優(yōu)選以混合形式含有直鏈和甲基支鏈的殘基，所以其通常以羰基合成醇?xì)埢嬖?。然而，尤其?yōu)選的是包含具有12-18碳原子、天然來源的醇的直鏈殘基以及平均每mol醇2-8EO的脂肪醇乙氧基化物，例如椰子油醇、棕櫚油醇、牛油醇或油醇。優(yōu)選的乙氧基化醇包括，例如含有3或4EO的C12-14醇、含有7EO的C9-11醇、含有3EO、5EO、7EO或8EO的C13-15醇、含有3EO、5EO或7 EO的C12-18醇及其混合物，例如含有3EO的C12-14醇和含有5EO的C12-18醇的混合物。上述乙氧化的程度是統(tǒng)計(jì)平均值，對(duì)于特殊產(chǎn)品來說，這個(gè)平均值可能是整數(shù)或分?jǐn)?shù)。優(yōu)選的醇乙氧基化物具有窄的同系物分布(窄范圍乙氧基化物，NRE)。除了這些非離子表面活性劑之外，也可以使用高于12EO的脂肪醇。這類脂肪醇的例子是包含14EO、25EO、30EO或40EO的牛油醇。
另一類或作為非離子表面活性劑單用或與其他非離子表面活性劑合用的優(yōu)選非離子表面活性劑是烷氧基化的、優(yōu)選乙氧基化的、或乙氧基化和丙氧基化的優(yōu)選包含1-4個(gè)碳原子的烷基鏈的脂肪酸烷酯，特別是脂肪酸甲酯。
另一類優(yōu)選使用的非離子表面活性劑是烷基多葡糖苷(APG)。合適的烷基多葡糖苷對(duì)應(yīng)于通式RO(G)z，其中R是直鏈或支鏈的，特別是2-甲基支鏈的、飽和或不飽和的、含有8-22個(gè)以及優(yōu)選12-18個(gè)碳原子的脂族基，G是含有5或6個(gè)碳原子的糖單元，優(yōu)選是葡萄糖。糖苷化的程度z介于1.0-4.0之間，優(yōu)選在1.0-2.0之間，以及更優(yōu)選在1.1-1.4之間。優(yōu)選使用直鏈烷基多葡糖苷，即烷基多葡糖苷，其中多糖基部分是葡萄糖單元以及烷基部分是正-烷基基團(tuán)。
氧化胺類的非離子表面活性劑，例如N-椰油烷基-N，N-二甲胺氧化物以及N-牛油烷基-N，N-二羥乙胺氧化物，和脂肪酸鏈烷醇酰胺類也適用。這些非離子表面活性劑的所用量?jī)?yōu)選不多于乙氧基脂肪醇量，尤其不多于其量的一半。
其它合適的表面活性劑為多羥基脂肪酸酰胺，對(duì)應(yīng)于通式(II) 其中RCO是包含6-22個(gè)碳原子的脂族酰基，R1是氫、含有1-4個(gè)碳原子的烷基或羥烷基基團(tuán)，以及[Z]是直鏈或支鏈的、包含3-10個(gè)碳原子和3-10個(gè)羥基的多羥烷基。多羥基脂肪酸酰胺為已知物質(zhì)，其通?？赏ㄟ^將還原糖用氨、烷基胺或鏈烷醇胺加以還原性胺化，繼而用脂肪酸、脂肪酸烷酯或氯代脂肪酸加以酰化而獲得。
這組多羥基脂肪酸酰胺還包括對(duì)應(yīng)于式(III)的化合物
其中R是含有7-12個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基或者鏈烯基，R1是含有2-8個(gè)碳原子的直鏈、支鏈或環(huán)化的烷基基團(tuán)或者芳香基團(tuán)，以及R2是含有1-8個(gè)碳原子的直鏈、支鏈或環(huán)化的烷基基團(tuán)或芳香基團(tuán)或者是烷氧基基團(tuán)，但優(yōu)選C1-4的烷基或者苯基基團(tuán)，以及[Z]是直鏈的多羥基烷基基團(tuán)，其烷基鏈至少被2個(gè)羥基取代，或者該基團(tuán)的烷氧基化，優(yōu)選乙氧基化或丙氧基化的衍生物。優(yōu)選由還原糖例如葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、甘露糖或木糖的還原性胺化而獲得。然后通過例如以醇鹽作為催化劑與脂肪酸甲酯反應(yīng)，可將N-烷氧基或N-芳氧基取代的化合物轉(zhuǎn)化成所需的多羥基脂肪酸酰胺。
合適的陰離子表面活性劑是例如那些磺酸酯和硫酸酯類。合適的磺酸酯類表面活性劑優(yōu)選是C9-13的烷基苯磺酸酯、烯烴磺酸酯，即烯烴和羥烷基磺酸酯的混合物，以及例如通過氣態(tài)三氧化硫的磺酸化接著堿化或酸化磺酸化產(chǎn)物而從帶有中間或末端雙鍵的C12-18單烯烴中獲得的二磺酸酯。其它合適的磺酸酯類表面活性劑是例如通過氯磺化作用或磺化氧化作用接著水解或中和而從C12-18烷烴中獲得的鏈烷磺酸酯。α-磺基脂肪酸的酯(磺酸酯)，例如氫化椰子油、棕櫚核油或牛油脂肪酸的α-磺酸化甲酯也適用。
其它合適的陰離子表面活性劑有硫酸化脂肪酸甘油酯。本發(fā)明上下文中的脂肪酸甘油酯指單酯、二酯和三酯及其混合物，其由單甘油與1-3mol的脂肪酸的酯化作用或者在甘油三酯和0.3-2mol的甘油發(fā)生酯交換反應(yīng)進(jìn)行生產(chǎn)而得來的。優(yōu)選的硫酸化脂肪酸甘油酯是含6-22個(gè)碳原子的飽和脂肪酸的硫酸化產(chǎn)物，例如己酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸或山萮酸。
優(yōu)選的烷(鏈烯)基硫酸鹽是堿金屬鹽，以及具體是C12-18的脂肪醇的硫酸半酯的鈉鹽，例如椰油脂肪醇、牛油脂肪醇、月桂醇、肉豆蔻醇、鯨蠟醇或硬脂醇或C10-20的羰基合成醇以及具有同樣鏈長(zhǎng)仲醇的對(duì)應(yīng)的半酯。其它優(yōu)選的烷(鏈烯)基硫酸鹽是那些具有上述鏈長(zhǎng)、含有基于石化產(chǎn)品的合成的、直鏈烷基鏈，并且它們的降解行為類似于基于油化品原料的對(duì)應(yīng)的化合物。C12-16烷基硫酸酯、C12-15烷基硫酸酯以及C14-15烷基硫酸酯從洗滌技術(shù)的觀點(diǎn)出發(fā)而優(yōu)選。其它合適的陰離子表面活性劑是2，3-烷基硫酸酯。
用1-6mol的環(huán)氧乙烷乙氧基化的直鏈或者支鏈C7-21醇例如含有平均3.5mol環(huán)氧乙烷(EO)的2-甲基支鏈的C9-11醇或者是含有1-4EO的C12-18脂肪醇的硫酸單酯也同樣適用。鑒于他們高的發(fā)泡能力，他們僅以相對(duì)小的量使用，例如按重量計(jì)在清洗劑中的量為1％-5％。
其它合適的陰離子表面活性劑是烷磺基琥珀酸的鹽，其也已知是磺基琥珀酸鹽或磺基琥珀酸酯，以及表示磺基琥珀酸與醇，優(yōu)選脂肪醇，以及特別是乙氧基化的脂肪醇而形成的單酯或/或二酯。優(yōu)選的磺基琥珀酸酯含有C8-18脂肪醇?xì)埢蚱浠旌衔?。特別優(yōu)選的磺基琥珀酸酯含有衍生自乙氧基化的脂肪醇的脂肪醇部分，其在分離中考慮時(shí)，代表非離子的表面活性劑(描述參見上文)。在這些磺基琥珀酸鹽中，那些衍生自窄范圍乙氧基化的脂肪醇的脂肪醇部分尤其優(yōu)選。在烷(鏈烯)基鏈中優(yōu)選含有8-18個(gè)碳原子的烷(鏈烯)基琥珀酸或其鹽也同樣適用。
其它合適的陰離子表面活性劑尤其是肥皂。合適的肥皂是飽和脂肪酸肥皂，如月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、氫化芥子酸和山萮酸的鹽，以及尤其衍生自天然脂肪酸如椰油、棕櫚核油或牛油脂肪酸的肥皂混合物。
陰離子表面活性劑包括肥皂可以鈉、鉀或銨鹽及作為有機(jī)堿如單-、二-或三乙醇胺的可溶性鹽的形式存在。陰離子表面活性劑優(yōu)選以鈉或鉀鹽的形式存在，更優(yōu)選的是鈉鹽形式。
表面活性劑在本發(fā)明的清潔或洗滌產(chǎn)品中存在的總量?jī)?yōu)選5-50重量％，特別是8-30重量％，以最終產(chǎn)品計(jì)。
本發(fā)明的洗滌或清潔產(chǎn)品可包含漂白劑。在那些能在水中產(chǎn)生H2O2而充當(dāng)漂白劑的化合物中，過碳酸鈉，過硼酸鈉鹽四水合物和過硼酸鈉一水合物是特別的重要。其它有用的漂白劑有例如過氧焦磷酸鹽、檸檬酸的過水合物和產(chǎn)生H2O2的過酸鹽或過酸，如過硫酸鹽或過硫酸。也可使用脲過氧水合物過尿素，其化學(xué)式為H2N-CO-NH2·H2O2。如果需要，產(chǎn)品中也可含有有機(jī)類的漂白劑，特別是用于清洗硬表面，例如在洗碗機(jī)中，雖然原則上有機(jī)漂白劑也可用于洗衣劑。典型的有機(jī)漂白劑是二?；^氧化物，例如二苯甲?；^氧化物。其它典型的有機(jī)漂白劑是過氧酸，其中烷基過氧酸和芳基過氧酸作為例子特別提及。優(yōu)選的代表是過氧苯甲酸及其環(huán)取代的衍生物，例如烷基過氧苯甲酸，還有過氧-α-萘甲酸和單過鄰苯二甲酸鎂鹽，脂族或取代的脂族過氧酸，例如過氧月桂酸、過氧硬脂酸、ε-苯二(甲)酰亞氨基過氧己酸(PAP)、o-羧基苯甲酰氨基過氧己酸、正壬烯氨基過酸性脂肪酸和正壬烯氨基過琥珀酸鹽，以及脂族和芳脂族的過氧二羧酸，例如1，12-二過氧羧酸、1，9-二過氧壬二酸、二過氧癸二酸、二過氧巴西基酸、二過氧苯二甲酸、2-癸基二過氧丁烷-1，4-二酸、N，N-對(duì)苯二甲酰-二(6-氨基過氧己酸)。
漂白劑在洗滌或清潔產(chǎn)品中的含量是1-40重量％，特別是10至20重量％，其中有利地使用過硼酸鹽一水合物或者過碳酸鹽如果洗滌溫度等于或者低于60℃，以及特別是對(duì)衣物進(jìn)行預(yù)處理，為了提高漂白效果，洗滌劑中可含有漂白活化劑。合適的漂白活化劑是形成脂族過氧羧酸的化合物，所述脂族過氧羧酸優(yōu)選含有1-10個(gè)碳原子，以及更優(yōu)選含有2-4個(gè)碳原子和/或在過水解條件下任選取代的過苯甲酸。攜帶具有上述碳原子數(shù)的O-和/或N-?；?或任選取代的苯甲?；奈镔|(zhì)是適用的。優(yōu)選的漂白活化劑是聚酰化的烷撐二胺，特別是四乙?；蚁┒?TAED)、?；娜貉苌铮貏e是1，5-二乙?；?2，4-二氧代六氫-1，3，5-三嗪(DADHT)、酰化的甘脲，特別是1，3，4，6-四乙酰基甘脲(TAGU)、N-酰基亞胺，特別是正壬?；牾啺?NOSI)、?；谋椒踊撬猁}，特別是正壬?；蛘呤钱惾甚；u苯磺酸鹽(正-或異-NOBS)、酰化羥羧酸，例如三乙基-O-乙酰基檸檬酸鹽(TEOC)、羧酸酐，特別是鄰苯二甲酸酐、靛紅酸酐和/或琥珀酸酐、羧酸酰胺，例如N-甲基二乙酰胺、乙交酯、?；嘣迹貏e是三醋精、乙二醇二乙酸酯、異丙烯基乙酸酯、2，5-雙乙酸基-2，5-二氫呋喃和烯醇酯，它們從德國(guó)專利申請(qǐng)DE196 16 693和DE196 16 767中得知，乙酰化的山梨醇和甘露醇及其混合物(SORMAN)，它們?cè)跉W洲專利申請(qǐng)EP0 525 239中描述，?；茄苌?，特別是五乙酰基葡萄糖(PAG)、五乙酰基果糖、四乙酰基木糖和八乙?；樘牵约耙阴；娜芜xN-烷基化葡糖胺和葡糖酸內(nèi)酯、三唑和三唑衍生物和/或粒狀的己內(nèi)酰胺和/或己內(nèi)酰胺衍生物，優(yōu)選的是N-乙?；瘍?nèi)酰胺，例如N-苯甲酰己內(nèi)酰胺和N-乙酰己內(nèi)酰胺，這些是從國(guó)際專利申請(qǐng)WO94/27970、WO94/28102、WO94/28103、WO95/00626、WO95/14759和WO95/17498中得來。從德國(guó)專利申請(qǐng)DE196 16 769中得知的取代的親水性?；铱s醛和在德國(guó)專利申請(qǐng)DE196 16 770以及國(guó)際專利申請(qǐng)WO95/14075中描述的酰基內(nèi)酰胺也優(yōu)選采用。與從德國(guó)專利申請(qǐng)DE44 43 177中得知的常規(guī)漂白活化劑組合也可采用。腈衍生物，例如氰基吡啶、四腈(Nitrilquats)，例如N-烷基銨乙腈，和/或氨腈衍生物也可使用。優(yōu)選的漂白活化劑為4-(辛酰氧基)-苯磺酸鈉、正壬?；虍惾甚Ｑ趸交撬狨?正或異-NOBS)、十一酰氧基苯磺酸酯(UDOBS)、十二酰氧基苯磺酸鈉(DOBS)、十一酰氧基苯甲酸(DOBA，OBC10)和/或十二酰氧基苯磺酸酯(OBS12)以及N-甲基嗎啉鎓乙腈(MMA)。這類漂白活化劑常用量占整個(gè)組成的0.01-20重量％，優(yōu)選0.1-15重量％，以及更優(yōu)選1-10重量％。
除了或代替上述的常規(guī)漂白活化劑，所謂的漂白催化劑也可摻入。漂白催化劑是促進(jìn)漂白的過渡金屬鹽或者是過渡金屬配合物如錳、鐵、鈷、釕或者鉬-Salen配合物或者羰基配合物。具有含氮的三角配體的錳、鐵、鈷、釕、鉬、鈦、釩和銅的配合物，以及鈷、鐵、銅、釕-氨合物的復(fù)合物體也可以用做漂白催化劑，優(yōu)選使用在DE19709284A1中描述的化合物。
本發(fā)明的洗滌或清潔產(chǎn)品通常含有一種或多種助洗劑(Builder)，特別是沸石、硅酸鹽、碳酸鹽、有機(jī)共助洗劑以及磷酸鹽，假使根據(jù)生態(tài)環(huán)境對(duì)使用這些磷酸鹽沒有反對(duì)意見的話。磷在洗碗機(jī)洗滌劑中是尤其優(yōu)選的主要材料。
可在此提及的化合物為晶體層狀硅酸鈉，對(duì)應(yīng)于通式NaMSixO2x+1·yH2O，其中M是鈉或者氫，x是1.6-4，優(yōu)選1.9至4.0之間的數(shù)，以及y是0-20之間的數(shù)，x值優(yōu)選為2、3或4。這樣的晶體層狀硅酸鹽記載在如歐洲專利申請(qǐng)EP164514中。對(duì)應(yīng)于上述通式的優(yōu)選的晶體層硅酸鹽是其中M為鈉、x為2或3的那些。β-和δ-二硅酸鈉Na2Si2O5·yH2O均特別優(yōu)選。這些化合物可從市場(chǎng)上購(gòu)得，如SKS(Clariant)。因此SKS-6主要是δ-二硅酸鈉，其化學(xué)式為Na2Si2O5·yH2O，而SKS-7主要是β-二硅酸鈉。通過與酸(例如檸檬酸或碳酸)反應(yīng)，δ-二硅酸鈉生成kanemite NaHSi2O5·H2O，其以SKS-9和SKS-10(Clariant)在市場(chǎng)上銷售。對(duì)這些層狀硅酸鹽進(jìn)行化學(xué)修飾也有優(yōu)勢(shì)。例如，層狀硅酸鹽的堿度可受到適度的影響。與δ-二硅酸鈉相比，摻雜磷酸或者碳酸的層狀硅酸鹽已經(jīng)修飾了晶體形態(tài)，他們?nèi)芙飧於绎@示出與δ-二硅酸鈉相關(guān)的鈣結(jié)合能力增加。層狀硅酸鹽具有一般的經(jīng)驗(yàn)式xNa2O·yH2O·zP2O5，其中x與y的比例對(duì)應(yīng)于0.35-0.6，x和z的比例對(duì)應(yīng)于1.75-1200，以及y和z的比例對(duì)應(yīng)于4-2,800，它們?cè)趯＠暾?qǐng)DE196 01 063中有記載。層狀硅酸鹽的溶解度還可通過利用特別精細(xì)顆粒的層狀硅酸鹽來提高。晶體層狀硅酸鹽和其他成分的化合物也可采用。尤其引人關(guān)注的是與纖維素衍生物組成的化合物，其在崩解效果上具有優(yōu)勢(shì)，并尤其用于洗滌劑片劑中，以及與聚羧酸如檸檬酸或聚合的聚羧酸組成的化合物，例如丙烯酸的共聚物。
其他有用的助洗劑是無定形硅酸鈉鹽，其模量(Na2O∶SiO2比率)為1∶2-1∶3.3，優(yōu)選為1∶2-1∶2.8，以及更優(yōu)選是1∶2-1∶2.6，其可以延遲崩解并表現(xiàn)多重洗滌循環(huán)特性。與常規(guī)的無定形硅酸鈉相關(guān)的溶解推遲可由多種方法獲得，例如表面處理、混合/壓實(shí)或通過過干燥法。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“無定形”同樣可理解為包括“X-射線無定形”。換一種說法，硅酸鹽并不產(chǎn)生任何強(qiáng)烈的X-射線反射，這在X-射線衍射實(shí)驗(yàn)中是晶體物質(zhì)的特征，但最多有一個(gè)或多個(gè)具有幾度衍射角寬的散射X-輻射的最大值。然而，在電子衍射實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)硅酸鹽粒子產(chǎn)生彎曲或者甚至尖銳的衍射最大值時(shí)，甚至可獲得特別好助洗劑特性。這個(gè)可解釋表示這些產(chǎn)品具有微晶區(qū)域，大小介于10至數(shù)百nm，優(yōu)選上限為50nm以及更優(yōu)選上限達(dá)20nm。尤其優(yōu)選壓實(shí)的無定型硅酸鹽、混合的無定型硅酸鹽以及干燥的X-射線-無定形硅酸鹽。
如果需要，本發(fā)明可使用的精細(xì)晶體、含有結(jié)合水的合成沸石優(yōu)選是沸石A和/或沸石P。沸石MAP(Crosfield公司的銷售產(chǎn)品)是尤其優(yōu)選的P-型沸石。然而，沸石X和A、X和/或P的混合物也可適用。依照本發(fā)明，優(yōu)選的是使用例如，商業(yè)上可得到的沸石X和沸石A的共晶體化物(約80重量％的沸石X)，其由CONDEA Augusta S.p.A.公司以VEGOBOND AX商品名銷售，并可由下式描述nNa2O·(1-n)K2O·Al2O3·(2-2.5)SiO2·(3.5-5.5)H2O。
適合的沸石的平均粒子尺寸小于10μm(體積分布，測(cè)量方法Coulter Counter)，并優(yōu)選含有18-22重量％，以及更優(yōu)選的20-22重量％的結(jié)合水。
眾所周知的磷酸鹽當(dāng)然也可用作助洗劑，倘若它們的應(yīng)用對(duì)處于生態(tài)環(huán)境的理由不應(yīng)避免。在大量市場(chǎng)上可得到的磷酸鹽中，堿金屬磷酸鹽在洗滌劑工業(yè)中最為重要，三磷酸五鈉和三磷酸五鉀(鈉和鉀的三磷酸鹽)尤其優(yōu)選。
“堿金屬磷酸鹽”是各種磷酸的堿金屬(特別是鈉和鉀)鹽的集合術(shù)語，包括偏磷酸(HPO3)n和正磷酸(H3PO4)以及更高分子量的代表。磷酸鹽兼有各種優(yōu)點(diǎn)他們充當(dāng)堿性載體，阻止石灰沉積在機(jī)器零件上以及在織物上石灰結(jié)殼，此外，有助于清潔效果。
磷酸二氫鈉(NaH2PO4)以二水化合物(密度1.91gcm-3，熔點(diǎn)60°)和一水化合物(密度2.04gcm-3)存在。這兩種鹽都是白色非常易溶于水的粉末，加熱后失去結(jié)晶水，并在200℃下轉(zhuǎn)化為弱酸性的二磷酸鹽(二磷酸氫二鈉，Na2H2P2O7)，以及在更高溫度時(shí)轉(zhuǎn)化為三偏磷酸鈉(Na3P3O9)和長(zhǎng)鏈高分子量偏磷酸鈉(Maddrell鹽)(參見下文)。NaH2PO4顯示酸性反應(yīng)。用氫氧化鈉調(diào)整磷酸到pH值4.5，然后噴霧干燥所得“漿”就可形成NaH2PO4。磷酸二氫鉀(原或者一元磷酸鉀、磷酸氫鉀、KDP)KH2PO4是白色鹽，其密度為2.33gcm-3，熔點(diǎn)253°(分解形成多磷酸鉀(KPO3)x)，并且易溶于水。
硫酸氫二鈉(次磷酸鈉)Na2HPO4是無色、易溶于水的晶體鹽。以無水、帶2mol水(密度2.066gcm-3，95℃時(shí)失水)、帶7mol水(密度1.68gcm-3，熔點(diǎn)48°時(shí)失去5水)以及12mol水(密度1.52gcm-3，熔點(diǎn)35°失去5水)的形式存在，在100°時(shí)變成無水，在急劇加熱下，就會(huì)轉(zhuǎn)變成二磷酸鹽Na4P2O7。以酚酞作指示劑，用蘇打水中和磷酸就能制備磷酸氫二鈉。磷酸氫二鉀(次級(jí)或者二元磷酸鉀)K2HPO4是無定型的白色鹽、易溶于水。
磷酸三鈉，叔磷酸鈉，Na3PO4，是無色晶體，作為十二水合物，其密度是1.62gcm-3，熔點(diǎn)是73-76℃(分解)，作為十水合物，其熔點(diǎn)為100℃(對(duì)應(yīng)于19-20％P2O5)，無水形式的密度為2.536gcm-3(對(duì)應(yīng)于39-40％P2O5)。通過堿性反應(yīng)磷酸三鈉易溶于水，其制備方法是通過蒸發(fā)濃縮恰好1mol磷酸二鈉和1mol氫氧化鈉的溶液。磷酸三鉀(三級(jí)或者三元磷酸鉀)K3PO4是白色易潮解的顆粒粉末，密度2.56gcm-3，熔點(diǎn)1340°，通過堿性反應(yīng)易溶于水。例如如果托馬斯(Thomas)礦渣與煤和硫酸鉀一起加熱，就形成磷酸三鉀。盡管價(jià)格更高，但由于它們更易溶，所以在洗滌劑工業(yè)中，高效磷酸鉀通常比相應(yīng)的鈉化合物更受歡迎。
二磷酸四鈉(焦磷酸鈉)Na4P2O7以無水形式(密度2.534gcm-3，熔點(diǎn)988℃，有時(shí)是880℃)和十水合物的形式存在(密度1.815-1.836gcm-3，熔點(diǎn)94℃時(shí)失水)。這兩個(gè)物質(zhì)都是無色晶體，通過堿性反應(yīng)溶于水中。當(dāng)磷酸氫二鈉加熱到200°以上，或通過磷酸與蘇打以化學(xué)計(jì)量比反應(yīng)并噴霧干燥該溶液就形成焦磷酸鈉。十水合物絡(luò)合重金屬鹽和硬鹽，由此減少了水的硬度。二磷酸鉀(焦磷酸鉀)K4P2O7以三水合物的形式存在，是一種無色吸濕性粉末，密度2.33gcm-3，溶于水，在25°時(shí)，1％溶液pH值為10.4。
相對(duì)高分子量的磷酸鈉和磷酸鉀是通過濃縮NaH2PO4和KH2PO4形成的。它們可劃分成環(huán)型，即鈉和鉀的偏磷酸鹽，以及鏈型，即鈉和鉀的多磷酸鹽。特別是鏈型有很多不同的名稱熔合或煅燒的磷酸鹽、格雷姆鹽(Graham鹽)、四聚偏磷酸鉀(Kurrol鹽)以及Maddrell鹽。所有更高的鈉和鉀的磷酸鹽都統(tǒng)稱為濃縮的磷酸鹽。
在工業(yè)上有重要用途的三磷酸五鈉Na5P3O10(三聚磷酸鈉)是非吸濕性白色水溶性鹽，其不帶水或帶6個(gè)水分子結(jié)晶，具有通式NaO-[P(O)(ONa)-O]n-Na，其中n＝3。在室溫條件下，大約17克無結(jié)晶水的鹽溶于100克的水中，在60°時(shí)是約20克，而在100°時(shí)大約是32克。將這種溶液加熱2小時(shí)到100°，大約8％的正磷酸鹽和15％的二磷酸通過水解形成。在制備三磷酸五鈉時(shí)，將磷酸與蘇打水溶液或者氫氧化鈉以化學(xué)計(jì)量比反應(yīng)，并將溶液噴霧干燥。同格雷姆鹽和磷酸氫鈉相似，三磷酸五鈉溶解許多不溶性的金屬化合物(包括石灰肥皂等)。市場(chǎng)上的三磷酸五鈉K5P3O10例如按重量計(jì)都是50％溶液(＞23％P2O5，25％K2O)的形式。多磷酸鉀廣泛應(yīng)用于洗滌劑工業(yè)中。還存在三磷酸鉀鈉，根據(jù)本發(fā)明，也可使用。例如當(dāng)三偏磷酸鈉用氫氧化鉀水解時(shí)形成三磷酸鉀鈉(NaPO3)3+2KOHNa3K2P3O10+H2O根據(jù)本發(fā)明，它們可以完全相同的方式用作三聚磷酸鈉、三聚磷酸鉀或者它們的混合物。根據(jù)本發(fā)明，三聚磷酸鈉和三聚磷酸鈉鉀兩者的混合物或者三聚磷酸鉀和三聚磷酸鉀鈉兩者的混合物或者三聚磷酸鈉和三聚磷酸鉀和三聚磷酸鈉鉀三者的混合物也可使用。
本發(fā)明的洗滌和清潔產(chǎn)品中的有機(jī)共助洗劑尤其包括多羧酸鹽或多羧酸、聚體多羧酸鹽、多天冬氨酸、聚乙縮醛、任選氧化糊精、其他有機(jī)共助洗劑(參見下文)和膦酸酯。下面描述這些類物質(zhì)。
有用的有機(jī)助洗劑例如為以其鈉鹽形式使用的多羧酸，其中多羧酸應(yīng)理解為攜帶一個(gè)以上酸官能團(tuán)的羧酸。只要對(duì)生態(tài)是安全的，這些羧酸包括例如檸檬酸、己二酸、丁二酸、戊二酸、蘋果酸、酒石酸、馬來酸、反丁烯二酸、糖酸、氨基羧酸、次氮基三乙酸(NTA)及其混合物。優(yōu)選的鹽是多羧酸的鹽，如檸檬酸、己二酸、丁二酸、戊二酸、酒石酸、糖酸及其混合物。
這些酸本身就可使用。除了它們助洗效應(yīng)以外，這些酸也通常具有使成分酸化的性質(zhì)，因此在洗滌劑或清洗劑中用來建立相對(duì)較低和適中的pH值，除非pH值要求通過混合其他成分而得到。在這方面特別提及系統(tǒng)相容性和對(duì)環(huán)境安全的酸，如檸檬酸、乙酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙醇酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、葡萄酸以及它們的任意混合物。然而，無機(jī)酸尤其是硫酸，或堿尤其是銨或堿金屬的氫氧化物也可用作pH調(diào)節(jié)劑。這些調(diào)節(jié)劑存在于本發(fā)明的產(chǎn)品中，其量?jī)?yōu)選不高于20重量％，以及特別為1.2-17重量％。
其他合適的助洗劑有聚合的多羧酸鹽，例如是聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸的堿金屬鹽，例如那些相對(duì)分子量為500-700,000g/mol的。
本說明書中提及的聚合多羧酸鹽的分子量是各自酸形式的重均分子量Mw，其主要利用紫外檢測(cè)儀通過凝膠滲透色譜法(GPC)測(cè)定。測(cè)定根據(jù)聚丙烯酸的外標(biāo)進(jìn)行，所述外標(biāo)依靠其與所研究聚合物的結(jié)構(gòu)相似性而提供實(shí)際的分子量值。這些值完全不同于以聚苯乙烯磺酸為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定的分子量值。以聚苯乙烯磺酸為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定的分子量一般高于本說明書中給出的分子量。
尤其合適的聚合物是聚丙烯酸酯，其優(yōu)選具有2,000-20,000g/mol的分子量。由于具有優(yōu)良的溶解性，該組優(yōu)選的代表是短鏈聚丙烯酸酯，其分子量為2,000-10,000g/mol，以及特別為3,000-5,000g/mol。
此外，合適的還有共聚合的聚羧酸酯，特別是丙烯酸與甲基丙烯酸的那些共聚合的聚羧酸酯，以及丙烯酸或甲基丙稀酸與馬來酸的那些共聚合的聚羧酸酯。證明含有50-90重量％丙烯酸以及50-10重量％馬來酸的丙烯酸/馬來酸共聚物尤其合適。以游離酸計(jì)，它們的相對(duì)分子量一般為2,000 to 70,000g/mol，優(yōu)選在20,000-50,000g/mol，更優(yōu)選在30,000-40,000g/mol。(共)聚合的聚羧酸酯可以粉末形式或者水溶液的形式利用。(共)聚合的聚羧酸酯在清洗劑中所占的含量為0.5-20重量％，特別為1-10重量％。
為了改善水中的溶解度，這些聚合體也可包含烯丙基磺酸，如烯丙基羥苯磺酸以及甲代烯丙基磺酸作為單體。
特別優(yōu)選的聚合物是由2種以上不同單體單元構(gòu)成的可生物降解的聚合物，如那些含有丙烯酸和馬來酸以及乙烯醇或乙烯醇衍生物作為單體的，或者那些含有以丙烯酸和2-烷基烯丙基磺酸和糖衍生物作為單體的。
其他優(yōu)選的共聚物是那些優(yōu)選含有丙烯醛和丙烯酸/丙烯酸鹽或丙烯醛和乙烯基醋酸酯作為單體的共聚物。
其他優(yōu)選的助洗劑是聚合的氨基二元羧酸、其鹽或其前體。聚天冬氨酸或者鹽及其衍生物是特別優(yōu)選的。
其他合適的助洗劑是聚縮醛，它們可通過二醛與含有5-7個(gè)碳原子和至少3個(gè)羥基的多羥基羧酸反應(yīng)得到。優(yōu)選的聚縮醛可從二醛如乙二醛、戊二醛、對(duì)苯二醛及其混合物得到，以及從多羥基羧酸如葡糖酸和/或葡庚糖酸獲得。
其他合適的有機(jī)助洗劑是糊精，如碳水化合物的低聚物或聚合物，它們可由部分水解淀粉獲得。通過常規(guī)方法如酸或者酶催化的方法進(jìn)行水解反應(yīng)。水解產(chǎn)物優(yōu)選平均分子量為400-500,000g/mol。優(yōu)選具有右旋糖當(dāng)量(DE)0.5-40，特別為2-30的多糖，其中與DE為100的右旋糖比較，該DE是衡量多糖的還原效果的常用尺度。DE為3-20的麥芽糊精和DE為20-37的干葡萄糖糖漿以及具有相對(duì)高的分子量為2,000-30,000g/mol的所謂黃、白糊精都可采用。
這些糊精的氧化衍生物是它們與氧化劑的反應(yīng)產(chǎn)物，所述氧化劑能將糖環(huán)的至少一個(gè)醇官能團(tuán)氧化成羧酸官能團(tuán)。本發(fā)明產(chǎn)品中尤其優(yōu)選的有機(jī)助洗劑是根據(jù)EP472 042、WO97/25399和EP755944的氧化淀粉或其衍生物。
其他合適的共助洗劑是羥二琥珀酸鹽以及其他二琥珀酸的衍生物，優(yōu)選二琥珀酸化乙二胺。乙二胺-N，N’-二琥珀酸鹽(EDDS)優(yōu)選以鈉鹽或者鎂鹽形式使用。就此而論，丙三醇二琥珀酸酯和丙三醇三琥珀酸酯也是優(yōu)選對(duì)象。在含沸石、碳酸鹽和/或含硅酸鹽的產(chǎn)品中使用量為3-15重量％。
其它有用的有機(jī)助洗劑是例如乙?；牧u基羧酸及其鹽，其可任選以內(nèi)酯形式出現(xiàn)并含有至少4個(gè)碳原子、至少一個(gè)羥基和最多2個(gè)酸性基團(tuán)。
具有共助洗劑特性的另一類物質(zhì)是膦酸鹽。對(duì)此特別是羥基鏈烷和氨基鏈烷膦酸鹽。在羥基鏈烷膦酸鹽中，1-羥基乙烷-1，1-二膦酸鹽(HEDP)作為共助洗劑尤為重要。優(yōu)選使用鈉鹽，其中二鈉鹽顯示中性反應(yīng)，以及四鈉鹽顯示堿性反應(yīng)(pH9)。優(yōu)選的氨基鏈烷膦酸鹽有乙二胺四亞甲基膦酸鹽(EDTMP)、二乙基三胺五亞甲基膦酸鹽(DTPMP)及其更高的同系物。優(yōu)選使用中性反應(yīng)的鈉鹽形式，如EDTMP的六鈉鹽或者DTPMP的七-和十鈉鹽。在膦酸鹽中，HEDP優(yōu)選用作助洗劑。另外，氨基鏈烷膦酸鹽具有顯著的重金屬結(jié)合能力。因此，尤其如果洗滌劑里亦含有漂白劑，有益的是可利用氨基鏈烷膦酸鹽，特別為DTPMP，或者上述膦酸鹽的混合物。
另外，任何能與堿土金屬離子形成復(fù)合物的化合物都可用作共助洗劑。
本發(fā)明的洗滌或清潔產(chǎn)品中可任選包含其量高達(dá)90重量％的助洗劑。其含量?jī)?yōu)選高達(dá)75重量％。本發(fā)明洗滌劑中的助洗劑含量尤其為5-50重量％。在本發(fā)明的洗滌劑用于硬表面清潔，特別是用于餐具的機(jī)械洗滌時(shí)，助洗劑的含量尤其為5-88重量％，其中在這種洗滌劑中優(yōu)選不含水不溶性的助洗劑。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的特別用于洗碗機(jī)的洗滌劑包含20-40重量％的水溶性有機(jī)助洗劑，特別是堿金屬檸檬酸鹽，含有5-15重量％的堿金屬碳酸鹽以及20-40重量％的堿金屬二硅酸鹽。
在液體至凝膠形式的洗滌和清潔產(chǎn)品的組成中可用的溶劑來源于例如一元醇或者多元醇、烷醇胺或乙二醇醚的基團(tuán)，條件是在指定的濃度范圍內(nèi)它們能與水混合。這些溶劑優(yōu)選選自乙醇，正或異丙醇，丁醇，乙二醇甲醚，乙二醇乙醚，乙二醇丙醚，乙二醇一-正丁醚，二乙二醇甲醚，二乙二醇二乙醚，丙二醇甲基、乙基或丙基醚，二丙二醇單甲基或單乙基醚，二異丙二醇單甲基或單乙基醚，甲氧基、乙氧基或丁氧基三甘醇，1-丁氧基乙氧基-2-丙醇，3-甲基-3-甲氧基丁醇，丙二醇叔-丁醚以及這些溶劑的混合物。
在本發(fā)明的液體至凝膠形式的洗滌和清潔產(chǎn)品中，溶劑的含量為0.1-20重量％，優(yōu)選低于15重量％，以及特別低于10重量％。
為了調(diào)節(jié)粘度，可向本發(fā)明產(chǎn)品中加入一種或者多種增稠劑，例如增稠體系。這些高分子量物質(zhì)也稱為膨脹劑通常吸收大量液體并且在此過程中膨脹，以便最終變成粘滯的純?nèi)芤夯蚰z狀溶液。
合適的增稠劑是無機(jī)或者聚合的有機(jī)化合物。無機(jī)增稠劑包括例如聚硅酸、粘土礦物如蒙脫石、沸石、硅石和膨潤(rùn)土。有機(jī)增稠劑來源于天然聚合物、改性的天然聚合物和完全合成的聚合物。天然存在的聚合物的例子有瓊脂、角叉菜、黃蓍膠、阿拉伯膠、藻酸鹽、果膠、聚糖、瓜耳膠、刺槐豆膠、淀粉、糊精、明膠以及干酪素。可用作增稠劑的改性天然聚合體主要來源于改性淀粉和纖維素。這里例如是羧甲基纖維素及其他纖維素醚、羥基乙基和羥基丙基纖維素以及樹膠醚。完全合成的增稠劑包括聚合物，如聚丙烯和聚甲基丙烯化合物、乙烯基聚合物、聚羧酸、聚醚、聚亞胺、聚酰胺和聚氨基甲酸酯。
以最終的產(chǎn)品計(jì)，增稠劑的用量最高達(dá)5重量％，優(yōu)選0.05-2重量％，以及特別優(yōu)選為0.1-1.5重量％。
本發(fā)明的洗滌和清潔產(chǎn)品可任選含有螯合劑、電解液和其他助劑，如熒光增白劑、泛灰抑制劑、銀腐蝕抑制劑、染料轉(zhuǎn)移抑制劑、泡沫抑制劑、研磨劑、染料和/或香精，以及微生物活性成分和/或紫外吸收劑作為它的補(bǔ)充成分。
本發(fā)明的織物洗滌劑可包含二氨基1，2-二苯乙烯二磺酸的衍生物或其堿金屬鹽作為熒光增白劑。合適的熒光增白劑有例如4，4’-雙-(2-苯胺基-4-嗎啉基-1，3，5-三嗪基-6-氨基)-1，2-二苯乙烯-2，2’-二磺酸的鹽或者相似組成的化合物，所述化合物的嗎啉基可被二乙醇氨基、甲氨基、苯胺基或者2-甲氧基乙氨基替代。也可使用取代的二苯基苯乙烯基型的增白劑，如4，4’-雙-(2-磺苯乙烯基)-二苯基、4，4’-雙-(4-氯-3-磺苯乙烯基)-二苯基或者4-(4-氯苯乙烯基)-4’-(2-磺苯乙烯基)-二苯基的堿金屬鹽。上述熒光增白劑的混合物也可以使用。
泛灰抑制劑的作用是使從織物纖維上溶解出的污物保持懸浮于洗滌液中。合適的泛灰抑制劑是大多數(shù)的天然有機(jī)物的水溶性膠體，如淀粉、動(dòng)物膠、明膠、淀粉或纖維素的羧酸乙醚或者磺酸乙醚的鹽，也可以是纖維素或淀粉的酸性硫酸酯的鹽。包含酸性基團(tuán)的水溶性聚酰胺也適用此目的。淀粉衍生物除了上面提及的以外，例如還有乙醛淀粉等也都可使用。纖維素乙醚如羧甲基纖維素(鈉鹽)、甲基纖維素、羥烷基纖維素以及混合醚，如甲基羥乙基纖維素、甲基羥丙基纖維素、甲基羧甲基纖維素及其混合物優(yōu)選使用，例如以該洗滌劑計(jì)，其用量為0.1-5重量％。
為了保護(hù)銀器免遭腐蝕，可以在本發(fā)明的洗碗洗滌劑中使用銀腐蝕抑制劑?，F(xiàn)有技術(shù)中，銀腐蝕抑制劑是已知的，并包括例如，苯并三唑、氯化鐵(III)以及硫酸鈷。例如，從歐洲專利EP0 736 084B1已知，特別適合與酶一起使用的銀腐蝕抑制劑有錳、鈦、鋯、鉿、釩、鈷或鈰鹽和/或絡(luò)合物，在這些絡(luò)合物中上述金屬元素以氧化數(shù)II、II、IV、V或VI的一種形式存在。這些化合物的例子有MnSO4、V2O5、V2O4、VO2、TiOSO4、K2TiF6、K2ZrF6、Co(NO3)2、Co(NO3)3及其混合物。
污漬釋放劑或污漬驅(qū)除劑通常是聚合物，當(dāng)這些聚合物用于洗滌劑中時(shí)，它們就給洗滌的纖維提供污漬排斥特性和/或支持洗滌劑的其他成分懸浮污漬的能力。在這些聚合物用于硬表面的清洗劑中時(shí)，也能觀測(cè)到可比的效果。
特別有效并且長(zhǎng)期以來已知的污漬釋放活性劑是具有二羧酸、烷撐二醇以及聚亞烷基二醇單元的共聚酯。例子為聚對(duì)苯二甲酸乙二酯和聚乙二醇的共聚物或混合聚合物(DT16 17 141或DT22 00 911)。DE22 53 063中提到酸性組合物，其中含有由二堿性羧酸和亞烷基或環(huán)亞烷基聚乙二醇組成的共聚物。在DE28 57 292、DE33 24 258以及EP0253 567中描述了對(duì)苯二甲酸亞乙酯和聚環(huán)氧乙烷-對(duì)苯二甲酸酯的共聚物和它們?cè)谙礈靹┲械膽?yīng)用。歐洲專利EP066 944涉及一種組合物，其含有由乙二醇、聚乙二醇、芳族二羧酸與磺化芳族二羧酸以一定摩爾比構(gòu)成的共聚酯。歐洲專利EP0 185 427描述了甲基-或乙基-末端的聚酯，其含有對(duì)苯二甲酸亞乙酯和/或亞丙酯單元和聚環(huán)氧乙烷-對(duì)苯二甲酸酯單元，以及描述了含有此種污漬釋放聚合物的洗滌劑。歐洲專利EP0 241 984涉及聚酯，這種聚酯除了含有氧乙烯基團(tuán)和對(duì)苯二甲酸單元以外，還包含取代的亞乙基單元和甘油單元。歐洲專利EP0241 985公開了一種聚酯，其除了含有氧乙烯基團(tuán)和對(duì)苯二甲酸以外，還含有1，2-亞丙基、1，2-亞丁基和/或3-甲氧基-1，2-亞丙基和甘油單元，并且其以C1-4烷基為末端。歐洲專利申請(qǐng)EP0 272 033描述了包含聚對(duì)苯二甲酸亞丙酯和聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯單元的至少部分以C1-4烷基或酰基為末端的聚酯。歐洲專利EP0 274 907描述了包含以磺乙基為末端的對(duì)苯二甲酸酯的污漬釋放聚酯。根據(jù)歐洲專利申請(qǐng)EP0357280，包含對(duì)苯二甲酸、亞烷基二醇和聚-C2-4-乙二醇單元的污漬釋放聚酯可通過不飽和端基的磺化來制備。國(guó)際專利申請(qǐng)WO95/32232涉及酸性芳族污漬釋放聚酯。國(guó)際專利申請(qǐng)WO97/31085描述用于棉織物的未聚合的污漬驅(qū)除劑，其含有若干官能團(tuán)單元第一單元例如可能是陽離子的，能通過靜電相互作用吸附到棉表面，以及第二單元是疏水的，負(fù)責(zé)遺留在水/棉界面上的活性物質(zhì)。
適用于本發(fā)明的洗衣店用洗滌劑中的染料轉(zhuǎn)移抑制劑尤其包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯咪唑、聚合的N-氧化物，如聚-(乙烯基吡啶-N-氧化物)和乙烯基吡咯烷酮與乙烯基咪唑的共聚物。
在機(jī)器清洗過程中使用時(shí)，將泡沫抑制劑加入到洗滌劑中會(huì)大有好處。合適的泡沫抑制劑例如是具有較高含量的C18-24脂肪酸的天然或合成來源的皂類。合適的非表面活性劑類的泡沫抑制劑是例如有機(jī)聚硅氧烷及其與微細(xì)的任選硅烷化的硅酸以及石臘、臘、微晶臘的混合物，以及它們與硅烷化的硅酸或者二-硬脂酰亞乙基二酰胺的混合物。不同泡沫抑制劑的混合物，如硅酮、石蠟和蠟的混合物也可以被有效的利用。泡沫抑制劑，特別是含硅氧烷-和/或含石蠟-的泡沫抑制劑優(yōu)選固定到粒狀水溶性的或水分散的支持物上。尤其優(yōu)選石蠟和雙-硬脂酰亞乙基二酰胺的混合物。
另外，本發(fā)明的硬表面清洗劑可含有研磨劑組分，特別是選自石英粉、鋸末、塑料粉、白堊和玻璃微珠以及它們的混合物。存在于本發(fā)明清洗劑中的研磨劑，其量?jī)?yōu)選不超過20重量％，特別為5-15重量％。
將染料和香精加入到本發(fā)明的洗滌劑/清洗劑中以改善產(chǎn)品的美學(xué)吸引力，并給消費(fèi)者不僅提供所需要的洗滌和清潔功效而且還提供了視覺和感官上“特別和不易錯(cuò)認(rèn)”的產(chǎn)品。合適的芳香油或香料包括個(gè)別的芳香化合物，如酯、醚、醛、酮、醇和烴類的合成產(chǎn)品。酯類的芳香化合物例如是乙酸芐酯、異丁酸苯氧基乙基酯、乙酸p-叔丁基環(huán)己酯、乙酸芳樟酯、乙酸二甲基芐基原酯、乙酸苯基乙酯、苯甲酸芳樟酯、甲酸芐基酯、氨基乙酸乙基甲基苯酯、丙酸烯丙基環(huán)己酯、丙酸甲基苯基原酯和水楊酸芐酯。醚包括例如芐基乙基醚；醛包括例如含有8-18個(gè)碳原子的直鏈鏈烷醛(Alkanale)、檸檬醛、香茅醛、香茅基含氧乙醛、仙客來醛、羥基香茅醛、鈴蘭醛和Bourgeonal；酮包括例如紫羅酮、α-異甲基紫羅酮以及甲基柏木酮；醇包括茴香腦、香茅醇、丁子香酚、香葉醇、沉香醇、苯乙基醇和松油醇；以及烴最主要包括萜烯，如苧烯和蒎烯。然而，優(yōu)選使用各種香精的混合物一起產(chǎn)生誘人的香味。象這樣的芳香油也可包含天然香精混合物，這些混合物可得自植物源如松樹、柑橘屬植物、茉莉、綠葉刺蕊草、玫瑰或衣蘭衣蘭油。還可適用的有鼠尾草油、春黃菊油、丁香油、蜜蜂花油、薄荷油、肉桂葉油、酸橙花油、杜松子油、巖蘭油、乳香油、楓子香油和巖薔薇油，以及橙花油、苦橙油、桔皮油和檀香油。洗滌劑/清洗劑的染料含量通常低于0.01重量％，而香料卻可占到整個(gè)組合物的2重量％。
香料可直接摻入到洗滌和清潔產(chǎn)品中，然而，有利地是將香味涂覆到載體上，所述載體能夠增強(qiáng)香氣在洗滌物上的附著力，并通過緩慢釋放香氣給處理過的織物特別提供持久的芳香。合適的載體物質(zhì)例如是環(huán)糊精，其中環(huán)糊精/香料復(fù)合物還可附加地用其它助劑涂覆。另一優(yōu)選的芳料載體是已描述過的沸石X，它也能夠代替表面活性劑或與表面活性劑混合吸收香氣。因此，含有所述沸石X的洗滌和清潔產(chǎn)品是優(yōu)選的，其中所述香料至少部分吸收在沸石上。
專業(yè)人員毫無困難地選擇的優(yōu)選的染料具有高的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，不受產(chǎn)品中的其他常規(guī)成分和受光的影響，并且對(duì)織物纖維不顯示顯著的直接染色性從而不給它們上色。
為了控制微生物，洗滌或清潔產(chǎn)品可以含有抗菌活性成分。依賴抗菌譜和作用機(jī)理，抗菌劑分為細(xì)菌抑制劑和殺菌劑、真菌抑制劑和殺真菌劑等。這些組的重要代表是例如苯扎氯胺、烷芳基磺酸鹽、鹵代苯酚和苯酚醋酸汞化物。在本發(fā)明教導(dǎo)的范圍中，術(shù)語“抗微生物活性”和“抗微生物活性物質(zhì)”具有本領(lǐng)域的常規(guī)意義，如K.H.Wallhuβer在“Praxis der Sterilisation，Desinfektion-KonservierungKeimidentifizierung-Betriebshygiene”(第5版，Stuttgart/New YorkThieme，1995)中所定義，其中所述的任何具有抗微生物活性的物質(zhì)均可使用。合適的抗微生物活性成分優(yōu)選選自醇、胺、醛、抗微生物的酸及其鹽、羧酸酯、酰胺、苯酚、苯酚衍生物、聯(lián)苯、聯(lián)苯基烷、尿素衍生物、氧和氮縮醛和縮甲醛、芐脒、異噻唑啉、鄰苯二甲酰亞胺衍生物、吡啶衍生物、抗微生物的表面活性化合物、胍、抗微生物的兩性化合物、喹啉、1，2-二溴代-2，4-二氰基丁烷、碘代-2-丙基丁基氨基甲酸酯、碘、碘遞體、過氧化合物、鹵化合物以及上述的任意混合物。
因此殺菌活性成分可選自乙醇、正丙醇、異丙醇、1，3-丁二醇、苯氧基乙醇、1，2-丙二醇、甘油、十一烯酸、苯甲酸、水楊酸、二氫乙酸(Dihydracetic acid)、鄰-苯基酚、N-甲基嗎啉乙腈(MMA)、2-芐基-4-氯酚、2，2’-亞甲基-雙-(6-溴代-4-氯酚)、4，4’-二氯-2’-羥基聯(lián)苯乙醚(Dichlosan)、2，4，4’-三氯-2’-羥基二苯基醚(Trichlosan)、Chlorohexidine、N-(4-氯苯基)-N-3，4-二氯苯基)-脲、N，N′-(1，10-癸烷二基二-1-嘧啶基-4-亞基)-雙-(1-辛胺)-二氫氯化物、N，N′-雙-(4-氯苯基)-3，12-二亞氨基-2，4，11，13-四氮雜四癸烷二亞氨基酰胺、葡糖魚精蛋白、抗微生物的表面活性季化合物、胍包括二胍和聚胍，如1，6-雙-(2-乙基己基二胍基己烷)-二氫氯化物、1，6-雙-(N1，N1′-苯基二胍基-N5，N5′)-己烷四氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-苯基-N1，N1-甲基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-鄰-氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-2，6-二氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、1，6-二-[N1N1′-β-(對(duì)-甲氧基苯基)-二胍基-N5，N5′]-己烷二氫氯化物、1，6-二-(N1N1′-α-甲基-β-苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-對(duì)-硝基苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、ω:ω-二-(N1，N1′-苯基二胍基-N5，N5′)-二-正丙基醚二氫氯化物、ω:ω′-二-(N1，N1′-對(duì)-氯苯基二胍基-N5，N5′)-二-正丙基醚四氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-2，4-二氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷四氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-對(duì)-甲基苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-2，4，5-三氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷四氫氯化物、1，6-二-[N1，N1′-α-(對(duì)-氯苯基)-乙基二胍基-N5，N5′]-己烷二氫氯化物、ω:ω-二-(N1，N1′-對(duì)-氯苯基二胍基-N5，N5′)-間-二甲苯二氫氯化物、1，12-二-(N1，N1′-對(duì)-氯苯基二胍基-N5，N5′)-十二烷二氫氯化物、1，10-二-(N1，N1′-苯基二胍基-N5，N5′)-癸烷四氫氯化物、1，12-二-(N1，N1′-苯基二胍基-N5，N5′)-十二烷四氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-鄰-氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷二氫氯化物、1，6-二-(N1，N1′-鄰-氯苯基二胍基-N5，N5′)-己烷四氫氯化物、乙烯-雙-(1-甲苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(對(duì)-甲苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(3，5-二甲基苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(對(duì)-叔戊基苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(壬基苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(正丁基苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(2，5-二乙氧基苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(2，4-二甲基苯基雙縮胍)、乙烯-雙-(鄰-聯(lián)苯雙縮胍)、乙烯-雙-(混合-戊基萘基雙縮胍)、正丁基乙烯-雙-(苯基雙縮胍)、三亞甲基-雙-(鄰-甲苯基雙縮胍)、正丁基三亞甲基-雙-(苯基雙縮胍)以及相應(yīng)的鹽，如醋酸鹽、葡糖酸鹽、氫氯化物、氫溴化物、檸檬酸鹽、亞硫酸氫鹽、氟化物、聚馬來酸鹽、正椰油烷基肌氨酸鹽、亞磷酸鹽、次亞磷酸鹽、過氟辛酸鹽、硅酸鹽、山梨酸鹽、水楊酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、延胡索酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、亞氨基醋酸鹽、肉桂酸鹽、硫氰酸鹽、精氨酸鹽、苯四酸鹽、四羧基丁酸鹽、安息香酸鹽、戊二酸鹽、單氟磷酸鹽、過氟丙酸鹽和它們的混合物。鹵化二甲苯和甲酚衍生物，如對(duì)-氯-間-甲酚或?qū)?氯-間-二甲苯，并且植物起源的天然殺菌劑(如香料和香草)以及動(dòng)物和微生物起源的天然抗菌劑也是合適的。優(yōu)選的抗菌劑有抗菌性表面活性的四元化合物、植物起源和/或動(dòng)物起源的天然抗菌劑，以及最優(yōu)選的是至少一個(gè)植物起源的抗菌劑，其來自咖啡因、可可堿和茶堿以及香精油如丁子香酚、麝香草酚和香葉醇，和/或至少一個(gè)動(dòng)物起源的抗菌劑，其來自酶如牛奶蛋白、溶菌酶以及乳過氧化物酶和/或至少一個(gè)抗菌性表面活性的四元化合物，其包含銨、锍、鏻、碘鎓或砷鎓基、過氧化合物和氯化合物。微生物起源的物質(zhì)即所謂的“殺菌素”也可以使用。
適合用作抗微生物活性成分的季銨化合物(QAC)具有通式(R1)(R2)(R3)(R4)N+X-，其中R1-R4可以相同或不同，并代表C1-22烷基、C7-28芳烷基或雜環(huán)基，其中兩個(gè)或在芳香化合物如吡啶的情況下甚至是三個(gè)基團(tuán)與氮原子一起形成雜環(huán)基，如吡啶鎓或咪唑鎓化合物，以及X-代表鹵離子、硫酸根離子、氫氧根離子或類似的陰離子。為了達(dá)到最佳抗微生物活性，這些取代基中至少一個(gè)優(yōu)選具有8-18，更優(yōu)選12-16個(gè)碳原子的鏈長(zhǎng)。
QAC可以通過叔胺與烷基化試劑反應(yīng)得到，所述烷基化試劑如氯代甲烷、芐基氯、硫酸二甲酯、十二烷基溴，以及環(huán)氧乙烷。帶有一個(gè)長(zhǎng)烷基鏈和兩個(gè)甲基的叔胺的烷基化尤其簡(jiǎn)單，同樣在氯代甲烷的幫助下在溫和條件下可以進(jìn)行含兩個(gè)長(zhǎng)鏈基團(tuán)和一個(gè)甲基的叔胺的季銨化。含三個(gè)長(zhǎng)烷基或者羥基取代的烷基的胺缺乏活性，并優(yōu)選采用硫酸二甲酯來季銨化。
合適的QAC是例如芐烷銨氯化物(N-烷基-N，N-二甲基芐基氯化銨，CAS No.8001-54-5)、Benzalkon B(m，p-二氯芐基二甲基-C12-烷基氯化銨，CAS No.58390-78-6)、苯佐氯銨(芐基-十二基-雙-(2-羥乙基)-氯化銨)、十六烷三甲基溴化銨(N-十六烷基-N，N-三甲基溴化銨，CASNo.57-09-0)、苯索氯銨(N，N-二甲基-N-[2-[2-[對(duì)-(1，1，3，3-四甲基丁基)-苯氧基]-乙氧基]-乙基]-芐基氯化銨，CAS No.121-54-0)、二烷基二甲基氯化銨，如二-正癸基二甲基氯化銨(CAS No.7173-51-5-5)、二癸基二甲基溴化銨(CAS No.2390-68-3)、二辛基二甲基氯化銨、1-十六烷基氯化吡啶鎓(CAS No.123-03-5)和噻唑啉碘化物(CAS No.15764-48-1)以及它們的混合物。尤其優(yōu)選的QAC是含有C8-18烷基的芐烷氯化銨，特別是C12-14-烷基-芐基-二甲基-氯化銨。
苯扎鹵銨和/或取代的苯扎鹵銨是商業(yè)上可獲得的，如來自Lonza的Barquat、來自Mason的Marquat、來自Witco/Sherex的Variquat以及來自Lonza的Hyamine和來自Lonza的Bardac。其他商業(yè)上可獲得的抗微生物活性成分有N-(3-氯烯丙基)-hexaminium氯化物，如來自Dow的Dowicide和Dowicil，芐索氯銨，如來自Rohm & Haas的Hyamine1622，甲基苯索氯銨，如來自Rohm & Haas的Hyamine10X，十六烷基吡啶鎓氯化物，如來自Merrell Labs的氯化十六烷基吡啶。
該殺菌活性成分的用量在0.0001-1重量％的范圍內(nèi)，優(yōu)選在0.001-0.8重量％的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在0.005-0.3重量％的范圍內(nèi)，以及最優(yōu)選在0.01-0.2重量％的范圍內(nèi)。
另外，本發(fā)明的洗滌或清潔產(chǎn)品可任選含有紫外吸收劑，所述吸收劑可吸附到經(jīng)處理的織物上，并增強(qiáng)纖維和/或其他組成成分的光穩(wěn)定性。紫外吸收劑是有機(jī)物質(zhì)(濾光劑)，它們能吸收紫外線并以長(zhǎng)波輻射如熱的形式釋放吸收的能量。
具有這些所需特性的化合物是例如通過無輻射鈍化作用而具有所需特性的化合物以及具有位置2和/或位置4取代基的二苯甲酮的衍生物。此外其他合適的紫外吸收劑是取代的苯并三唑、3-苯基-取代的丙烯酸鹽(位置2上任選用氰基取代的肉桂酸衍生物)、水楊酸鹽、有機(jī)Ni復(fù)合物和天然物質(zhì)，如傘形酮和內(nèi)生的尿刊酸。聯(lián)苯基以及主要是1，2-二苯乙烯衍生物具有特別的意義，例如在EP0728749A中所述的商業(yè)上以TinosorbFD和TinosorbFR ex Ciba可得到的。合適的UV-B吸收劑包括3-苯亞甲基樟腦或3-苯亞甲基降樟腦和它的衍生物，如在EP0693471B1中所述的3-(4-甲基苯亞甲基)-樟腦；4-氨基苯甲酸衍生物，優(yōu)選4-(二甲基氨基)-苯甲酸-2-乙基己基酯、4-(二甲基氨基)-苯甲酸-2-辛基酯和4-(二甲基氨基)-苯甲酸戊基酯；肉桂酸的酯，優(yōu)選4-甲氧基肉桂酸-2-乙基己基酯、4-甲氧基肉桂酸丙基酯、4-甲氧基肉桂酸異戊基酯、2-氰基-3，3-苯基肉桂酸-2-乙基己基酯(氰雙苯丙烯酸辛酯)；水楊酸的酯，優(yōu)選水楊酸-2-乙基己基酯、水楊酸-4-異丙基芐基酯、水楊酸高薄荷基酯；二苯甲酮的衍生物，優(yōu)選2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮、2-羥基-4-甲氧基-4′-甲基二苯甲酮、2，2′-二羥基-4-甲氧基二苯甲酮；亞芐基丙二酸的酯，優(yōu)選4-甲氧基亞芐基丙二酸二-2-乙基己基酯；三嗪衍生物，如2，4，6-三苯胺-(對(duì)-羰基-2′-乙基-1′-己氧基)-1，3，5-三嗪和EP0818450A1中所述的辛基三嗪酮或者二辛基丁氨基三嗪酮(UvasorbHEB)；丙烷-1，3-二酮如1-(4-叔丁基苯基)-3-(4′-甲氧基苯基)-丙烷-1，3-二酮；如EP0694521B1中所述的酮三環(huán)(5.2.1.0)癸烷衍生物。其他合適的UV-B吸收劑有2-苯基苯并咪唑-5-磺酸和堿金屬、堿土金屬、銨、烷基銨、烷醇銨及其葡糖銨鹽；二苯甲酮的磺酸衍生物，優(yōu)選2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮-5-磺酸及其鹽；3-苯亞甲基樟腦的磺酸衍生物，如4-(2-氧代-3-亞龍腦基甲基)-苯磺酸和2-甲基-5-(2-氧代-3-亞龍腦基)-磺酸及其鹽。
典型的UV-A過濾劑具體有苯甲酰甲烷的衍生物，如1-(4′-叔丁基苯基)-3-(4′-甲氧基苯基)-丙烷-1，3-二酮、4-叔丁基-4′-甲氧基聯(lián)苯甲酰甲烷(Parsol 1789)、1-苯基-3-(4′-異丙基苯基)-丙烷-1，3-二酮和DE19712033A1(BASF)中所述的烯胺化合物。UV-A和UV-B過濾劑當(dāng)然可以混合物的形式利用。除了上面提到的可溶性物質(zhì)外，不溶的光封閉色素，也就是細(xì)分散的優(yōu)選“毫微化的”金屬氧化物或鹽也可以用于這種目的。適合的金屬氧化物的例子具體有氧化鋅、二氧化鈦以及鐵、鋯、硅、鎂、鋁和鈰的氧化物以及它們的混合物。硅酸鹽(滑石)、硫酸鋇和硬脂酸鋅也可作為鹽使用。氧化物和鹽以色素的形式應(yīng)用在護(hù)膚的乳劑和裝飾性化妝品上。顆粒直徑平均小于100nm，優(yōu)選在5-50nm之間，以及更優(yōu)選在15-30nm之間。它們一般為球形，盡管橢圓或其他非球形顆粒也能用。這些色素也可經(jīng)表面處理，也就是說親水性的或疏水性的。典型的例子是包覆的二氧化鈦，如Titandioxid T805(Degussa)和EusolexT2000(Merck)。合適的疏水型包覆材料首要是硅氧烷，以及其中尤其是三烷氧基辛硅烷或者二甲硅油。微粉化的氧化鋅優(yōu)選使用。其他合適的UV過濾劑可以在P.Finkel，SFW-Journal 122，第543頁(1996)的綜述中找到。
UV吸收劑的常用量在0.01-5重量％的范圍內(nèi)，以及優(yōu)選在0.03-1重量％的范圍內(nèi)。
通常用于洗滌產(chǎn)品和清潔產(chǎn)品中的成分還包括清潔劑和清洗活性的酶。
因此，以除上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)，蛋白片段，融合蛋白或衍生物之外的其它酶為特征的洗滌產(chǎn)品或清潔產(chǎn)品是本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案。這些酶尤其包括其它蛋白酶，淀粉酶，纖維素酶，半纖維素酶，諸如β-葡聚糖酶，氧還酶，諸如蟲漆酶，角質(zhì)酶和/或脂肪酶，還有酯酶，以及本應(yīng)用領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)中所述的其他所有酶。
數(shù)十年來，將酶例如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶或纖維素酶作為洗滌產(chǎn)品和清潔產(chǎn)品中的活性組分使用。它們各自對(duì)有關(guān)試劑的洗滌或清潔功效的作用是在蛋白酶的情況下降解含蛋白質(zhì)污物的能力，在淀粉酶的情況下降解含淀粉的污物，在脂肪酶的情況下裂解脂肪的活性。纖維素酶除其去污即基本洗滌和清潔功效外，特別由于其對(duì)洗滌劑的二次洗滌功效的作用和由于其對(duì)織物的纖維作用優(yōu)選在洗滌劑中使用。特定的水解產(chǎn)物被洗滌劑和清潔劑中的常規(guī)組分損壞、溶解、乳化或懸浮或者由于其高的溶解度被洗液沖洗出，因此獲得酶和其他組分之間的協(xié)同作用效果。
蛋白酶在天然纖維，特別是棉或絲上具有與纖維素酶對(duì)組合物的二次洗滌功效可比的效果。由于它們對(duì)織物表面結(jié)構(gòu)的影響，可以對(duì)該材料產(chǎn)生柔順的影響，并因此防止糾結(jié)。
其它酶通過它們特殊的酶功效增加相應(yīng)產(chǎn)品的清洗功效。這些酶的例子包括半纖維素酶，諸如β-葡聚糖酶(WO99/06515和WO99/06516)，氧還酶，諸如蟲漆酶(WO00/39306)或者果膠溶解酶(WO00/42145)，這些具體用于特殊的清洗產(chǎn)品中。
在本發(fā)明的洗滌或清潔產(chǎn)品中首先考慮使用從微生物例如細(xì)菌或真菌獲得的酶。他們以本身已知的方法從合適的微生物中通過發(fā)酵方法而獲得，這些微生物例如在德國(guó)公開申請(qǐng)DE1940488和DE2121397，在美國(guó)專利US3,623,957和US4,264,738，在歐洲專利申請(qǐng)EP006 638和在國(guó)際專利申請(qǐng)WO91/02792中有所描述。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)和/或其他蛋白質(zhì)特別在儲(chǔ)存期間可用穩(wěn)定劑來保護(hù)，例如避免通過物理作用、氧化或蛋白酶解而造成其變性、分解或失活。這適用于本發(fā)明所有的產(chǎn)品，尤其是洗滌和清潔產(chǎn)品。
一組穩(wěn)定劑是可逆的蛋白酶抑制劑，它能在洗滌劑稀釋之后在洗液中解離。芐脒氫氯化物和亮抑酶肽就為此目的而確立。硼砂、硼酸或它們的鹽或酯也經(jīng)常用于這種目的，它們首先包括例如在WO95/12655中由芳香基鄰位取代的苯基硼酸、在WO92/19707中由芳香基間位取代的苯基硼酸和在US5,972,873中由芳香基對(duì)位取代的苯基硼酸或它們的鹽或酯。在WO98/13460和EP583 534中公開了肽醛，也就是具有還原C末端的寡肽，特別是那些含有2-50個(gè)單體的，用于可逆性抑制洗滌劑蛋白酶。肽的可逆性蛋白酶抑制劑尤其包括卵類粘蛋白(WO93/00418)。例如，WO00/01826公開了針對(duì)蛋白酶枯草桿菌素的特異性可逆的肽抑制劑，用于含蛋白酶的組合物中，而WO00/01831公開了相應(yīng)的蛋白酶和抑制劑的融合蛋白質(zhì)。
其他酶的穩(wěn)定劑有氨基醇，如單-、二-、三-乙醇-和-丙醇胺和它們的混合物、例如從EP0 378 261和WO97/05227中得知的最多達(dá)C12的脂族羧酸，如琥珀酸，其他羧酸或上述酸的鹽。德國(guó)專利申請(qǐng)DE19650537中為此目的公開了封端的脂肪酸酰胺烷氧酸鹽。如WO97/18287中所公開，某些用作助洗劑的有機(jī)酸額外能夠穩(wěn)定存在的酶。
除了多元醇如甘油、乙二醇、丙二醇或山梨醇以外，低級(jí)脂族醇也是其他常用的酶穩(wěn)定劑。同樣可以使用鈣鹽，例如醋酸鈣和在EP0028 865中為此目的公開的甲酸鈣，以及例如根據(jù)歐洲專利申請(qǐng)EP0378 262的鎂鹽也可使用。
聚酰胺寡聚物(WO99/43780)或者聚合物，例如木質(zhì)素(WO97/00932)，水溶性乙烯基共聚物(EP828 762)或者如EP702 712中所公開的纖維素乙醚、丙烯酸聚合物和/或聚酰胺可對(duì)酶制劑產(chǎn)生穩(wěn)定作用，以克服物理影響或者pH值的變化。包含了聚胺-N-氧化物的聚合物(EP587 550和EP581 751)同時(shí)擔(dān)當(dāng)酶穩(wěn)定劑和染料轉(zhuǎn)移抑制劑。其它聚合物穩(wěn)定劑是除了在WO97/05227所公開的其他成分以外的直鏈C8-18聚氧化烯。如WO97/43377和WO98/45396所公開，烷基聚糖苷可穩(wěn)定本發(fā)明產(chǎn)品中的酶成分，甚至提高它們的功效。如WO98/17764所公開，交聯(lián)的含氮化合物擔(dān)當(dāng)著污漬釋放劑和酶穩(wěn)定劑的雙重作用。根據(jù)WO97/32958，疏水性非離子聚合物與其它穩(wěn)定劑的混合物對(duì)纖維素酶有穩(wěn)定的作用，因此這些或者相似的組分也同樣適合本發(fā)明中所必需的酶。
如EP780 466所公開，還原劑和抗氧化劑將增加酶對(duì)氧化分解的穩(wěn)定性。含硫的還原劑例如從EP0 080 748和EP0 080 223中得知。其它的例子是亞硫酸鈉(EP533 239)和還原糖類(EP656 058)。
在很多情況下，還采用穩(wěn)定劑的組合，例如在WO96/31589中多元醇、硼酸和/或硼砂的組合，在EP126 505中硼酸或硼酸鹽、還原鹽與丁二酸或其它二羧酸的組合，或者硼酸或硼酸鹽與多羥基或多氨基化合物的組合以及與如EP080 223中所披露的還原鹽的組合。根據(jù)WO98/13462，肽/乙醛穩(wěn)定劑的效果可通過與硼酸和/或硼酸衍生物和多元醇的組合來增強(qiáng)，根據(jù)WO98/13459，其還可通過添加鈣離子而進(jìn)一步增強(qiáng)。
具有穩(wěn)定的酶活性的產(chǎn)品代是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。特別優(yōu)選的是含有以上面提到的幾種方法而加以穩(wěn)定的酶的產(chǎn)品。
因?yàn)楸景l(fā)明的產(chǎn)品可以任何可想到的形式提供，所以在任何適合于加入特定產(chǎn)品的配方中的本發(fā)明酶，均是本發(fā)明的實(shí)施方案。其例子包括液體制劑、固體顆?；蚰z囊。
膠囊化形式是保護(hù)酶或其它成分免遭其它組分例如漂白劑的影響，或者使緩釋成為可能的途徑。膠囊按照大小可以劃分為毫膠囊、微膠囊或者納膠囊，其中對(duì)于酶來說尤其優(yōu)選微膠囊。例如，這樣的膠囊在專利申請(qǐng)WO97/24177和DE19918267中公開。另一可能的膠囊化方法是從蛋白質(zhì)溶液與淀粉或淀粉衍生物的溶液或懸浮液的混合物開始，將蛋白質(zhì)包封在該物質(zhì)中。申請(qǐng)WO01/38471描述了這樣一種膠囊化方法。
在固體產(chǎn)品的情況下，該蛋白質(zhì)可以以例如干燥的、造粒的和/或膠囊化的形式使用。它們可以單獨(dú)即作為單相添加，或者與其它組分一起在同相中以壓實(shí)或未壓實(shí)形式添加。如果微膠囊化的酶以固態(tài)形式生產(chǎn)，則可按照現(xiàn)有技術(shù)已知的方法從污跡獲得的水溶液中除去水，例如噴霧干燥、離心去除或者再溶解。以這種方式獲得的顆粒大小通常為50-200μm。
可以從按照現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行的蛋白質(zhì)回收和制備開始將酶和本發(fā)明必需的蛋白質(zhì)以濃縮的水或非水溶液、懸浮液或乳液加入本發(fā)明的液體、凝膠狀或膏狀產(chǎn)品中，同樣也可以以凝膠狀或膠囊化或作為干燥粉末加入。本發(fā)明的這種洗滌產(chǎn)品或者清洗產(chǎn)品一般通過簡(jiǎn)單混合成分來制備，所述成分以固體物質(zhì)本身或作為溶液加入自動(dòng)攪拌器中。
除基本洗滌性能外，在洗滌產(chǎn)品中包含的蛋白酶還可以滿足通過蛋白酶解裂解活化其它酶組分或者在相應(yīng)的作用時(shí)間之后使其失活的功能，例如在申請(qǐng)WO94/29426或EP747 471中所公開的。通過本發(fā)明的蛋白也可以獲得可比的調(diào)節(jié)功能。此外，本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及那些具有由蛋白酶敏感材料制成的膠囊的產(chǎn)品，其例如在預(yù)期的時(shí)間點(diǎn)被本發(fā)明蛋白質(zhì)水解并釋放出其內(nèi)容物。在其它多相產(chǎn)品的情況下也可以獲得可比的效果。
用于處理紡織原料或者織物保養(yǎng)的產(chǎn)品，其特征在于，其僅含有或者除其它活性成分外還包含上述的任何本發(fā)明蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物。本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案是這種用于纖維或含有天然組分的織物和特別是用于具有羊毛或絲的織物的產(chǎn)品。
特別是天然纖維例如羊毛或絲的特征為其獨(dú)特的微觀表面結(jié)構(gòu)。正如R.Breier在其文章“Melliand Textilberichte”1.4.2000(第263頁)中用羊毛的實(shí)例所說明的，所述表面結(jié)構(gòu)能長(zhǎng)期能導(dǎo)致不希望的效果，例如一些糾結(jié)。為了避免這種效果，使用本發(fā)明的產(chǎn)品處理這些天然原材料，這些產(chǎn)品例如有助于使基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的魚鱗狀表面結(jié)構(gòu)光滑并因此防止糾結(jié)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，含有本發(fā)明蛋白酶的產(chǎn)品被這樣設(shè)計(jì)，即其一般可以作為保養(yǎng)劑使用，例如通過在洗滌過程中加入，在洗滌之后使用或者其應(yīng)用不依賴于洗滌。所需的效果是長(zhǎng)時(shí)間獲得光滑的織物表面結(jié)構(gòu)和/或預(yù)防和/或減少對(duì)織物的損壞。
本發(fā)明的一個(gè)單獨(dú)主題是機(jī)械清潔織物或硬表面的方法，其特征在于，在洗滌方法的至少一個(gè)步驟中使上述本發(fā)明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物活化，其加入量每次應(yīng)用是40μg至4g，優(yōu)選50μg至3g，更優(yōu)選100μg至2g，以及最優(yōu)選200μg至1g。
這些方法包括手工和機(jī)械方法，優(yōu)選機(jī)械方法，因?yàn)樗鼈兛蓪?duì)例如用量和作用時(shí)間更精確加以控制。
織物清洗的方法的特征通常在于若干個(gè)方法步驟，所述步驟包括將各種不同的具有清潔活性的物質(zhì)施用到待清洗物上，并且在作用時(shí)間之后漂洗，或者以其它的方式將該待清洗物用清潔劑或該清潔劑的溶液處理。這同樣適合于機(jī)械清洗其他所有如織物的材料，這些材料被概括為術(shù)語硬表面。這種方法可以在所有可想到的洗滌或清潔方法中的至少一個(gè)洗滌步驟中加入本發(fā)明的蛋白質(zhì)，并且這些方法成為本發(fā)明的實(shí)施方案。
因?yàn)楸景l(fā)明優(yōu)選的酶已經(jīng)自然具有溶解蛋白質(zhì)的活性，并且它們也可以在本來不具有清洗力的介質(zhì)(例如單純的緩沖液)中顯示所述活性，所以這種機(jī)械清洗織物的方法中的單個(gè)分步驟可由在所需的情況下除穩(wěn)定的化合物、鹽或緩沖物質(zhì)外加入本發(fā)明的酶作為唯一具有清洗活性的組分所組成。這是本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案。
在這種方法的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的相關(guān)酶提供在本發(fā)明產(chǎn)品，尤其是本發(fā)明的洗滌或清潔產(chǎn)品的上述一種配方中。
本發(fā)明主題的優(yōu)選實(shí)施方案是處理紡織原料或用于紡織品保養(yǎng)的方法，其特征在于，在至少一個(gè)方法步驟中，使本發(fā)明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物活化，尤其是對(duì)紡織原料，纖維或含有天然組分的紡織品，更尤其是對(duì)那些含有羊毛或絲的紡織品。
上述本發(fā)明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物對(duì)清潔紡織品或硬表面的應(yīng)用是本發(fā)明的單獨(dú)主題。
上述濃度范圍優(yōu)選適用于此用途。
根據(jù)上述特性和上述方法，本發(fā)明的蛋白尤其可用于從紡織品或硬表面上去除類蛋白質(zhì)(proteinaceous)污漬。實(shí)施方案例如由從紡織品或硬表面上手洗或手工去除斑點(diǎn)或者與機(jī)械方法相結(jié)合的用途來代表。
在此應(yīng)用的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的相關(guān)酶提供在本發(fā)明產(chǎn)品，尤其是洗滌或清潔產(chǎn)品的上述一種配方中。
上述本發(fā)明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物對(duì)激活或鈍化洗滌或清潔產(chǎn)品中的成分的應(yīng)用是本發(fā)明主題的其他實(shí)施方案。
正如所知，洗滌或清潔產(chǎn)品的蛋白組分可由蛋白酶的作用而失活。本發(fā)明具體涉及使用這種本來不希望的作用。如上所述，通過蛋白酶解同樣可能真正使其它的組分活化，例如當(dāng)所述組分是一種由真正的酶和其相應(yīng)的抑制劑組成的雜合蛋白質(zhì)時(shí)，如在申請(qǐng)WO00/01831中所公開。這種調(diào)節(jié)的另一實(shí)例是其中的活性組分已包封在一種易受蛋白水解酶攻擊的材料中以保護(hù)或控制其活性。因此本發(fā)明的蛋白質(zhì)可用于鈍化、活化或釋放反應(yīng)，尤其在多相產(chǎn)品中。
盡管有多樣性，將洗滌和清潔問題之外的所有其他技術(shù)方法，用途和相應(yīng)試劑組合在下文本發(fā)明的一個(gè)主題中，只要其特征為本發(fā)明的蛋白。該匯編不應(yīng)理解成唯一目錄，而只是列出了本發(fā)明蛋白酶最重要的當(dāng)前可辨別的可能的應(yīng)用。其他同樣包括的可能應(yīng)用指示例如由下列手冊(cè)提供H.Uhlig，“工業(yè)用酶及其應(yīng)用(Industrial enzymes andtheir applications)”，Wiley，紐約，1998。如果通過利用本發(fā)明的蛋白酶，其他應(yīng)用領(lǐng)域證明能夠進(jìn)一步加以開發(fā)，則所述領(lǐng)域也包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明主題的一個(gè)實(shí)施方案由上述本發(fā)明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物在生化分析或合成低分子量化合物或蛋白中的應(yīng)用來表示。
該用途優(yōu)選發(fā)生在相應(yīng)產(chǎn)品或方法的范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明和Rmpp，“Lexikon Chemie”(Version 2.0，Stuttgart/New YorkGeorgThieme Verlag，1999)，酶分析是指利用特定的酶或底物來一方面測(cè)定底物身份或其濃度或者另一方面測(cè)定酶身份或活性的任何生物化學(xué)分析。應(yīng)用領(lǐng)域是所有與生物化學(xué)相關(guān)的領(lǐng)域，尤其是與分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)化學(xué)相關(guān)的領(lǐng)域。該用途優(yōu)選發(fā)生在酶分析方法的范圍之內(nèi)。本發(fā)明主題的優(yōu)選實(shí)施方案是在序列分析領(lǐng)域中用于測(cè)定端基。
本發(fā)明的主題是本發(fā)明蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物的應(yīng)用，其用于制備、純化或合成天然物質(zhì)或生物價(jià)值物質(zhì)。
該用途優(yōu)選發(fā)生在相應(yīng)產(chǎn)品或方法的范圍內(nèi)。所以，例如在天然物質(zhì)或生物價(jià)值物質(zhì)的純化過程中需要從所述物質(zhì)中清除蛋白質(zhì)污染物，其例子為低分子量化合物，任何細(xì)胞組分或儲(chǔ)存物質(zhì)或蛋白質(zhì)。這不但在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模而且在工業(yè)規(guī)模上，例如在價(jià)值物質(zhì)的生物技術(shù)生產(chǎn)后來進(jìn)行。
例如當(dāng)計(jì)劃把蛋白質(zhì)片段相互結(jié)合或者將氨基酸連接到不是主要由蛋白質(zhì)組成的化合物上時(shí)，本發(fā)明的蛋白水解酶通過使其天然催化的反應(yīng)逆向，用于合成蛋白質(zhì)或其它低分子量化合物。例如根據(jù)申請(qǐng)EP380362，這種應(yīng)用是可能的。
本發(fā)明主題的其他實(shí)施方案由上述本發(fā)明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物在處理天然原料，尤其是對(duì)于處理表面，更尤其是在處理皮革的方法中的應(yīng)用所代表。
該用途優(yōu)選發(fā)生在相應(yīng)產(chǎn)品或方法的范圍內(nèi)。例如當(dāng)?shù)鞍孜廴疚镆欢ㄒ獜奶烊辉现腥コ龝r(shí)，這是必需的。這意思主要是非生物方法獲得的原料，例如那些來自農(nóng)業(yè)的原料，但是也可以是通過發(fā)酵由生物技術(shù)方法生產(chǎn)的物質(zhì)，如抗生素。
優(yōu)選的實(shí)施方案是用于表面處理，特別是在處理經(jīng)濟(jì)上有意義的原料皮革的方法中。因此，在鞣革處理過程中，特別是在堿性柔化步驟中借助于蛋白水解酶從皮革材料中除去水溶性蛋白質(zhì)(Rmpp，“Lexikon Chemie”，Version 2.0，Stuttgart/New YorkGeorg ThiemeVerlag，1999)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)，尤其在堿性條件下和/或采用變性劑時(shí)，對(duì)此是特別適合的。
本發(fā)明主題的另一實(shí)施方案是將上述本發(fā)明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物在制造紡織品中用于獲得或處理原料或中間體，尤其是用于從織物中去除保護(hù)層。
該用途優(yōu)選發(fā)生在相應(yīng)產(chǎn)品或方法的范圍內(nèi)。在制造紡織品中獲取或處理原料的例子是加工棉花，在被稱作制漿的步驟中需要從中去除莢組分；另一實(shí)例是處理羊毛；類似地也可用于加工粗絲。酶方法或應(yīng)用，特別對(duì)環(huán)境相容性而言，優(yōu)于可比的化學(xué)方法。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)用于除去紡織品，特別是中間產(chǎn)品或有價(jià)值物質(zhì)的保護(hù)層，或者使其表面光滑，接著在隨后的工藝步驟中進(jìn)行進(jìn)一步處理。
在本發(fā)明主題的其他實(shí)施方案由上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)，蛋白片段，融合蛋白或衍生物在處理紡織原料或用于紡織品保養(yǎng)，特別是用于處理羊毛或絲或含羊毛或絲的混紡織品中的應(yīng)用來表示。
該用途優(yōu)選發(fā)生在相應(yīng)產(chǎn)品或方法的范圍內(nèi)。根據(jù)上文所述，相關(guān)紡織品原料通過蛋白酶處理后不含污染物；此外，至少部分由蛋白組成的材料得益于蛋白水解酶的表面光滑和保養(yǎng)特性。為此原因，用于保養(yǎng)相關(guān)材料的用途也包括在內(nèi)。因此，尤其要求保護(hù)羊毛或絲或含有羊毛或絲的混紡織品的表面處理。這不但適用于這種紡織品的生產(chǎn)而且也適用于使用期間的保養(yǎng)，例如在該紡織品清洗時(shí)(參見上文)。
本發(fā)明主題的另一實(shí)施方案是本發(fā)明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物用于處理照相膠片，特別是除去含明膠或類似的保護(hù)層。
該用途優(yōu)選發(fā)生在相應(yīng)產(chǎn)品或方法的范圍內(nèi)。膠片例如X線膠片被這樣的保護(hù)層，特別是由含銀鹽的明膠乳液制成的保護(hù)層涂覆。這些層在背景材料曝光之后必須去除。為此，特別是在堿性或略微變性的反應(yīng)條件下可以使用本發(fā)明的蛋白酶。
本發(fā)明主題的另一實(shí)施方案是上述本發(fā)明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物在制備食品或動(dòng)物飼料中的應(yīng)用。
該用途優(yōu)選發(fā)生在相應(yīng)產(chǎn)品或方法的范圍內(nèi)。所以，自古以來蛋白酶已經(jīng)被用于食品生產(chǎn)。對(duì)此的實(shí)例是凝乳酶用于奶酪或其它奶制品的熟化過程。可以加入本發(fā)明的蛋白質(zhì)或者完全采用本發(fā)明的蛋白質(zhì)進(jìn)行該過程。用于非營(yíng)養(yǎng)目的富含碳水化合物的食品或食品原料，例如面粉或糊精，同樣可以用合適的蛋白酶處理，以便從其中除去相伴的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的蛋白酶也適合于這種應(yīng)用，尤其當(dāng)其在堿性或略微變性的條件下進(jìn)行時(shí)。
相應(yīng)地也適用于動(dòng)物飼料的生產(chǎn)。這里除完全除去蛋白質(zhì)外，還感興趣的是用蛋白酶僅短時(shí)間地處理類蛋白質(zhì)原料或原料混合物，以便使其對(duì)于家禽來說更易消化。這樣的處理也可用于例如生產(chǎn)培養(yǎng)基成分，例如用于發(fā)酵微生物。
在本發(fā)明主題的另一實(shí)施方案中，上述本發(fā)明的蛋白用于化裝品目的。
本發(fā)明要求保護(hù)的主題是含有上述本發(fā)明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物的化妝品或者摻入上述本發(fā)明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物的化妝用方法，或者上述本發(fā)明的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物用于化妝目的，特別是在相應(yīng)的方法或相應(yīng)的產(chǎn)品的框架內(nèi)。
因?yàn)榈鞍酌冈谌祟惼つw的細(xì)胞再生過程中扮演重要的角色(T.Egelrud等，Acta Derm.Venerol.，第71卷(1991)，第471至474頁)，因此蛋白酶也作為生物活性組分被用于護(hù)膚產(chǎn)品中以便促進(jìn)干性皮膚中日益增多的橋粒結(jié)構(gòu)的退化，例如根據(jù)申請(qǐng)WO95/07688或WO99/18219。例如在WO97/07770中描述了枯草桿菌素蛋白酶用于化妝目的。本發(fā)明的蛋白酶，特別是那些例如在突變后或由于添加合適的與其相互作用的物質(zhì)來控制其活性的蛋白酶同樣適合在皮膚或頭發(fā)洗滌或氧護(hù)產(chǎn)品中作為活性組分。特別優(yōu)選這些酶的制品，其如上所述，例如通過連接在大分子支持物上而被穩(wěn)定(參照US5230891)和/或通過在高變應(yīng)原性位置的點(diǎn)突變而被衍生化，所以它們與人皮膚的相容性增加。
因此，本發(fā)明的主題還包括這種蛋白水解酶用于化妝目的，特別是在相應(yīng)產(chǎn)品中的應(yīng)用，例如香波、皂或洗浴液，或者在以霜的形式提供的護(hù)理產(chǎn)品中的應(yīng)用。同樣在脫皮藥物或其制劑中的應(yīng)用也包括在本發(fā)明的權(quán)利要求中。
實(shí)施例所有分子生物學(xué)操作步驟遵循如下列手冊(cè)所述的標(biāo)準(zhǔn)方法，F(xiàn)ritsch，Sambrook和Maniatis，“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”，Cold SpringHarbour Laboratory Press，New York，1989，或者可比較的相關(guān)著作。根據(jù)各個(gè)生產(chǎn)商的說明書使用酶和試劑盒。
實(shí)施例1具有蛋白水解活性的細(xì)菌菌株的分離和鑒定將0.1g的土壤樣品懸浮在1ml的無菌0.9％NaCl溶液中，并涂鋪于含有奶粉的瓊脂平板(1.5％瓊脂，0.5％NaCl，0.1％K2HPO4，0.1％酵母提取物，2％蛋白胨(來自ICN，Eschwede，目錄號(hào)104808)，1％奶粉(脫脂乳；來自Difco，Heidelberg，目錄號(hào)232100)，pH10)上。在30℃保溫72小時(shí)后，帶有透明區(qū)的菌落在乳狀瓊脂中顯而易見。從中移出單菌落，并培養(yǎng)在Horikoshi培養(yǎng)基(0.1％K2HPO4，0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，0.02％MgSO4，0.3％Na2CO3，pH9)的錐形瓶(Erlenmeyer flask)中37℃下以200rpm振蕩。
這些菌落之一于2001年3月1日保藏在DSMZ。在此其命名為ID01-192，保藏號(hào)為DSM14391。有關(guān)該生物材料的特征的標(biāo)準(zhǔn)信息，如DSMZ保藏結(jié)構(gòu)于2001年4月19日所確定，編輯在下表1中。
表1Bacillus gibsonii(DSM 14391)的微生物特性。
(于2001年4月19日由DSMZ所確定)
實(shí)施例2成熟蛋白酶的克隆和測(cè)序?qū)⑼ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)方法從Bacillus gibsonii(DSM 14391)制備染色體DNA，經(jīng)限制性酶Sau 3A處理后，將得到的片段克隆到載體pAWA22中。這是一種衍生自pBC16的表達(dá)載體，用于芽孢桿菌種(Bernhard等(1978)，J.Bacteriol.，第133卷(2)，第897-903頁)中。使該載體轉(zhuǎn)化到不含蛋白酶的宿主菌株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)DB 104(Kawamura和Doi(1984)，J.Bacteriol.，第160卷(1)，第442-444頁中。
將轉(zhuǎn)化子首先再生在DM3培養(yǎng)基(8g/l瓊脂，0.5M丁二酸，3.5g/lK2HPO4，1.5g/l KH2PO4，20mM MgCl2，5g/l酪蛋白氨基酸(casiaminoacids)，5g/l酵母提取物，6g/l葡萄糖，0.1g/l BSA)中，然而轉(zhuǎn)移到TBY脫脂乳平板(10g/l蛋白胨，10g/l奶粉(參見上文)，5g/l酵母提取物，5g/l NaCl，15g/l瓊脂)上。含有蛋白酶水解活性的克隆從其裂解區(qū)中鑒定出來。從所得的具有蛋白酶水解活性(p/TII-5)的菌落中挑選一種，并通過標(biāo)準(zhǔn)方法分離其質(zhì)粒，以及對(duì)插入物進(jìn)行測(cè)序。
插入物的大小約為3.4kb，含有1kb左右的可讀框。其序列顯示在序列表中，標(biāo)題為SEQ ID No.1。它包含1152bp。從其衍生的氨基酸序列包括383個(gè)氨基酸，后面為終止密碼子。其以SEQ ID NO.2顯示在序列表中。前114個(gè)氨基酸極有可能不存在于成熟蛋白中，從而成熟蛋白的長(zhǎng)度預(yù)計(jì)為269個(gè)氨基酸。
2001年8月，將這些序列與從通?？蛇_(dá)的數(shù)據(jù)庫(kù)Swiss-Prot(Geneva Bioinformatics(GeneBio)S.A.，Geneva，Switzerland；http://www.genebio.com/sprot.html)和GenBank(National Center forBiotechnology Information NCBI，National Institutes of Health，Bethesda，MD，USA)中獲得的蛋白酶序列進(jìn)行比較。由此鑒定的最相似的酶總結(jié)在下表2中。
表2Bacillus gibsonii(DSM 14391)的堿性蛋白酶與最相似蛋白和其他代表性蛋白的同源性(百分比數(shù)據(jù)四舍五入)。
其中的意思為ID 數(shù)據(jù)庫(kù)Genbank和Swiss-Prot中的登錄號(hào)；Ident.DNA DNA水平上的同一性％；Ident.propre. 氨基酸水平上的同一性，基于前體蛋白的前體，以％表示；Ident.mat.prot.氨基酸水平上的同一性，基于成熟蛋白，以％表示；n.未示于數(shù)據(jù)庫(kù)中。
這些蛋白酶的氨基酸序列在圖1的比對(duì)中也相互進(jìn)行比較。
實(shí)施例3堿性蛋白酶的純化和鑒定將100ml的Horikoshi培養(yǎng)基(參見上文)加入到500ml錐形瓶(Erlenmeyer flask)，用實(shí)施例2中轉(zhuǎn)化的細(xì)菌菌株的一個(gè)菌落接種，并且在37℃下培養(yǎng)72小時(shí)直到達(dá)到生長(zhǎng)的靜止期。
通過下列純化步驟，可從該培養(yǎng)物的上清液中分離到單個(gè)蛋白水解酶將上清液對(duì)pH7.6的20mM HEPES/NaOH緩沖液透析；在Q-Sepharose上進(jìn)行陰離子交換層析(來自Pharmacia-Amersham Biotech，Sweden)；在S-Sepharose上通過陽離子交換層析(來自Pharmacia-Amersham)，用pH為7.6，梯度為0-1M NaCl的HEPES/NaOH緩沖液洗脫。在0.2M NaCl處洗脫蛋白酶，然后在Resource S(來自Pharmacia-Amersham)上通過陽離子交換層析，并以HEPES/NaOH(pH7.6)為洗脫劑而得以濃縮。
根據(jù)SDS凝膠電泳和考馬斯亮蘭染色，以此方式獲得純的蛋白。
實(shí)施例4SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和等電聚焦如實(shí)施例2和3中所獲得的B.gibsonii(DSM 14391)的堿性蛋白酶通過Pharmacia-Amersham Biotech，Sweden提供的PHAST系統(tǒng)在變性SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳條件下所顯示的分子量為26kD。
根據(jù)等電聚焦，同樣通過Pharmacia-Amersham Biotech，Sweden提供的PHAST系統(tǒng)，B.gibsonii(DSM 14391)的堿性蛋白酶的等電點(diǎn)為11。
實(shí)施例5酶特性比活如實(shí)施例2或3中所純化的B.gibsonii(DSM 14391)的堿性蛋白的比活利用Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-對(duì)硝基苯胺(AAPF；來自BachemBiochemica GmbH，Heidelberg)底物進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，在pH8.6和25℃下溫育5分鐘后的活性為21U/mg。在此情況下，1U等于每分鐘切割1μmol的底物。
pH依賴性Bacillus gibsonii(DSM 14391)的堿性蛋白酶的pH分布圖在pH為6-12的范圍內(nèi)進(jìn)行記錄。為此，以酪蛋白為底物，在50℃對(duì)各個(gè)pH整數(shù)值下的活性進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)該測(cè)定，最適pH為11。在50℃溫育15分鐘后的活性分別為在pH12時(shí)2％，在pH6時(shí)14％以及在pH9時(shí)70％。
實(shí)施例6對(duì)洗滌性能的貢獻(xiàn)織物以標(biāo)準(zhǔn)化的方式已被污漬處理，并獲自EidgenssischeMaterial-Prüfungs-und-Versuchsanstalt，St.Gallen，Switzerland(EMPA)或Wschereiforschungsanstalt，Krefeld，Germany，用于該實(shí)施例。使用下列污漬和織物A(在棉織物上的血跡/牛奶/墨汁)、B(在聚酯混棉織物上的血跡/牛奶/墨汁)，C(在棉織物上的血跡)和D(在棉織物上的蛋/煙灰)。
利用耐洗牢度試驗(yàn)儀(launderometer)，將這些試驗(yàn)材料用于檢測(cè)各種洗滌產(chǎn)品配方的清洗功效。為此目的，調(diào)整清洗液比為1∶12，并將織物在40℃下清洗30分鐘。劑量為每升清洗液中特定洗滌產(chǎn)品為5.88g。水硬度為16°德國(guó)制硬度。
具有下列組成的洗滌產(chǎn)品基本配方作為對(duì)照洗滌產(chǎn)品(用重量百分比表示)4％直鏈烷基苯磺酸鹽(鈉鹽)、4％C12-18脂肪醇硫酸鹽(鈉鹽)、5.5％C12-18脂肪醇X7 EO、1％皂鈉、11％碳酸鈉、2.5％無定型二硅酸鈉(sodium disilicate)、20％過硼酸鈉四水合物、5.5％TAED、25％沸石A、4.5％聚羧酸酯、0.5％膦酸鹽、2.5％粒狀泡沫抑制劑、5％硫酸鈉，其余為水、熒光增白劑和鹽。對(duì)于各種測(cè)試系列，將下列的蛋白酶加入到對(duì)照洗滌產(chǎn)品中，從而在每升清洗液中蛋白酶解活性的最終濃度分別為2.250PE遲緩芽胞桿菌堿性蛋白酶F49(WO 95/23221；制造商Biozym，Kundl，Australia)、Savinase(Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark)以及本發(fā)明來自B.gibsonii(DSM 14391)的蛋白酶。
清洗后，以硫酸鋇的白度作為標(biāo)準(zhǔn)100％，與之對(duì)比測(cè)出洗過織物的白度。測(cè)量用的是Datacolor SF500-2分光光度計(jì)，測(cè)試條件為460nm(紫外阻擋濾光片3)、孔徑30mm、無光澤面、光源類型D65、10°、d/8°。下表3中給出了測(cè)試結(jié)果，以反射率％表示，即和硫酸鋇比較的百分?jǐn)?shù)，表3還列出各自的起始值。所示值分別是4次測(cè)量的平均值。它們是其中包含的酶對(duì)所用洗滌產(chǎn)品的清洗功效貢獻(xiàn)的直接指標(biāo)。
表3
數(shù)據(jù)顯示，本發(fā)明的B.gibsonii(DSM 14391)的蛋白酶與確定的蛋白酶遲緩芽胞桿菌堿性蛋白酶F49和Savinase相比在所有測(cè)試的污漬上均表現(xiàn)出明顯更好的性能，或者至少與它們接近。
實(shí)施例7當(dāng)使用的活性低時(shí)，對(duì)洗滌性能的貢獻(xiàn)在標(biāo)準(zhǔn)化條件下將具有硬的光滑表面的容器與軟煮蛋(E和F)和蛋/牛奶(G和H)接觸，并采用市售的家用洗碗機(jī)洗滌。樣品E和G在45℃下分別用MieleG 676型洗碗機(jī)的正常操作程序清洗，而樣品F和H在55℃下分別用BoschSGS 4002型洗碗機(jī)的正常操作程序清洗。洗碗劑的用量每一洗碗循環(huán)為20g。水的硬度為16°德國(guó)制硬度。
下列基本配方用于洗碗劑(所有值按重量百分比計(jì))55％三聚磷酸鈉(以無水計(jì)算)、4％無定型二硅酸鈉(以無水計(jì)算)、22％碳酸鈉、9％過硼酸鈉、2％TAED、2％非離子表面活性劑，其余為水、染料和香精。對(duì)于各種測(cè)試，將各種蛋白酶酶，即遲緩芽胞桿菌堿性蛋白酶F49、Properase以及本發(fā)明Bacillus gibsonii(DSM 14391)的蛋白酶以相同活性加入到基本配方中，每一洗碗循環(huán)活性分別為10000PE。這相當(dāng)于每克洗滌產(chǎn)品濃縮物中有約0.1毫克的蛋白酶。
清洗后，污漬的去除按重量測(cè)定，以％表示。為此，受污然后清洗的容器的重量與所述容器的初始重量之間的差異和未清洗的容器與其初始重量之間的差異有關(guān)。這種關(guān)系可看成是去除百分率。下表4列出了所獲得的結(jié)果。這里給出的是8次測(cè)量的平均值。它們是包含的酶對(duì)所用洗滌產(chǎn)品的清洗功效貢獻(xiàn)的直接指標(biāo)。
表4
這些結(jié)果顯示，本發(fā)明Bacillus gibsonii(DSM 14391)的蛋白酶在機(jī)洗碗劑中的性能好于或但至少等于其他測(cè)試蛋白酶的性能，甚至在使用相對(duì)低活性下也是如此。
實(shí)施例8當(dāng)使用較高活性時(shí)，對(duì)洗滌性能的貢獻(xiàn)以標(biāo)準(zhǔn)化方式，將容器用軟蛋(I)，蛋/牛奶(J)和牛奶(K)進(jìn)行污漬處理，并分別以相同的清洗產(chǎn)品配方和方式在45℃下利用MieleG676型洗碗機(jī)的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行清洗。唯一區(qū)別在于，在每種情況下各個(gè)蛋白酶的用量是20000PE。這相當(dāng)于在每種情況下洗滌產(chǎn)品濃縮物中含有約0.2毫克的蛋白酶。
以實(shí)施例7中的相同方式，獲得樣品I和J的結(jié)果。對(duì)于污漬K，清洗后按照0(＝不變，即十分嚴(yán)重的污漬)到10(＝無可辨別的污漬)等級(jí)進(jìn)行目測(cè)評(píng)估。下表5列出了所獲得的結(jié)果。這里給出的是8次測(cè)量的平均值。
表5
當(dāng)所用的蛋白酶活性較高時(shí)，顯而易見，本發(fā)明的蛋白酶對(duì)相關(guān)產(chǎn)品的總體清潔性能的貢獻(xiàn)與對(duì)機(jī)洗碗產(chǎn)品來說確立的遲緩芽孢桿菌堿性蛋白酶F49和蛋白酶Properase相比，是更高的。
附圖描述圖1來自Bacillus gibsonii(DSM 14391)的本發(fā)明蛋白酶的氨基酸序列與表2中所列的相似和最重要的已知枯草桿菌素分別在成熟即加工形式下的比對(duì)。
下列數(shù)字代表下列蛋白酶(括號(hào)分別為數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)入的ID；也參照
11枯草桿菌素 來自短小芽孢桿菌(B.pumilus)(SUBT_BACPU)12枯草桿菌素 來自B.amylosacchariticus(SUBT_BACSA)13枯草桿菌素J 來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobacillusstearothermophilus)(SUBT_BACST)14枯草桿菌素E 來自枯草芽孢桿菌(B.subtilis)(SUBT_BACSU)圖2表達(dá)載體pAWA22，其衍生自pBCl6并具有地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)(PromPLi)的啟動(dòng)子及其下游，BclI限制性切割位點(diǎn)(參照實(shí)施例2和Bernhard等(1978)，J.Bacteriol.，133(2)，第897-903頁)。
有關(guān)保藏的微生物或其它生物材料的說明(PCT細(xì)則13之二)
表PCT/RO/134(1992年7月)
序列表<110>漢高兩合股份公司(Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien)<120>Bacillus gibsonii(DSM 14391)的新型堿性蛋白酶以及包含該新型堿性蛋白酶的洗滌產(chǎn)品和清潔產(chǎn)品(Neue Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii(DSM14391)und Wasch-und Reinigungsmittel enthaltend dieseneue Alkalische Protease)<130>SCT041996-47<140>
<141>
<150>DE 10162727.0<151>2001-12-20<160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1152<212>DNA<213>Bacillus gibsonii(DSM 14391)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1152)<220>
<221>mat_肽<222>(343)..(1152)<400>1atg aaa aga aga gta gga aag cta gtg gta ggg ctt gta tgt gtg aca 48Met Lys Arg Arg Val Gly Lys Leu Val Val Gly Leu Val Cys Val Thr-110-105-100gct cta gta aca gtg aca gat tct gca tcg gca gca gaa gaa aag gta 96Ala Leu Val Thr Val Thr Asp Ser Ala Ser Ala Ala Glu Glu Lys Val-95 -90 -85aag tac tta ata gga ttt gaa gaa gaa gca gag ctt gaa gcc ttc acg 144Lys Tyr Leu Ile Gly Phe Glu Glu Glu Ala Glu Leu Glu Ala Phe Thr-80 -75 -70gag gaa gtt gac caa gta ggc gtg ttt tct gtt gaa gaa caa agt tta 192Glu Glu Val Asp Gln Val Gly Val Phe Ser Val Glu Glu Gln Ser Leu-65 -60 -55gta gag gat acg tta gat att gat gta gac att att gat gaa tat gat 240Val Glu Asp Thr Leu Asp Ile Asp Val Asp Ile Ile Asp Glu Tyr Asp-50 -45 -40 -35tat att gat gtg tta tct gta gaa tta gat ccg gaa gat gta gat gcg 288Tyr Ile Asp Val Leu Ser Val Glu Leu Asp Pro Glu Asp Val Asp Ala
-30 -25 -20tta agt gag gaa gaa ggt att tct tat atc gaa gaa gac ttt gaa cta336Leu Ser Glu Glu Glu Gly Ile Ser Tyr Ile Glu Glu Asp Phe Glu Leu-15 -10 -5tcg ata caa caa acc gtt cca tgg ggt att aca cgt gta caa gct ccc384Ser Ile Gln Gln Thr Val Pro Trp Gly Ile Thr Arg Val Gln Ala Pro-1 1 5 10act gtg cat aat cgt gga ata aca gga tct gga gtt aaa gtc gct ata432Thr Val His Asn Arg Gly Ile Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Ile15 20 25 30ctt gat aca ggt ata gct cag cat agt gat tta acc att cgt ggg gga480Leu Asp Thr Gly Ile Ala Gln His Ser Asp Leu Thr Ile Arg Gly Gly35 40 45gca agc ttt gta cca gga gag tca aca acg gct gat cta aat ggt cat528Ala Ser Phe Val Pro Gly Glu Ser Thr Thr Ala Asp Leu Asn Gly His50 55 60ggt act cac gtt gct gga aca gtg gcc gct ctt aat aat tca att ggt576Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly65 70 75gtg atc ggt gtg gca cca agt gct gac cta tac gct gta aag gta tta624Val Ile Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu80 85 90gga gca aat ggt aga gga agc gtg agt ggg att gct caa ggt cta gag672Gly Ala Asn Gly Arg Gly Ser Val Ser Gly Ile Ala Gln Gly Leu Glu95 100 105 110tgg gct gca acg aat aac atg cat att gca aac atg agt ctc ggt agt720Trp Ala Ala Thr Asn Asn Met His Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Ser115 120 125gat gca cct agc act aca tta gag cgt gca gtt aac tat gcg aca agc768Asp Ala Pro Ser Thr Thr Leu Glu Arg Ala Val Asn Tyr Ala Thr Ser130 135 140cgt gga gtt ctc gtc att gcg gct act ggt aac aat ggt act ggt tcc816Arg Gly Val Leu Val Ile Ala Ala Thr Gly Asn Asn Gly Thr Gly Ser145 150 155att ggc tac cca gct cgt tat gca aac gca atg gct gta gga gcg act864Ile Gly Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr160 165 170gac caa aac aac aga cgt gcg agc ttt tct caa tat ggc aca gga att912Asp Gln Asn Asn Arg Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Thr Gly Ile175 180 185 190gat att gtt gca cct ggt gtt gga att caa agc aca tac cta aat aat960Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Gly Ile Gln Ser Thr Tyr Leu Asn Asn195 200 205
agc tat gct agt atg cct gga aca tca atg gct aca cct cat gtt gct1008Ser Tyr Ala Ser Met Pro Gly Thr Ser Met Ala Thr pro His Val Ala210 215 220gga gta gct gcg ctt gtt aaa caa aaa aat cca tct tgg aat gcg act1056Gly Val Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Asn Ala Thr225 230 235caa att cgt aat cat ttg aaa aat act gcg acg aat cta gga aac tca1104Gln Ile Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Asn Leu Gly Asn Ser240 245 250tct caa ttt ggt agt gga cta gtt aat gca gat gca gca acg cgc taa1152Ser Gln Phe Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Asp Ala Ala Thr Arg255 260 265 270<210>2<211>383<212>PRT<213>Bacillus gibsonii(DSM 14391)<400>2Met Lys Arg Arg Val Gly Lys Leu Val Val Gly Leu Val Cys Val Thr1 5 10 15Ala Leu Val Thr Val Thr Asp Ser Ala Ser Ala Ala Glu Glu Lys Val20 25 30Lys Tyr Leu Ile Gly Phe Glu Glu Glu Ala Glu Leu Glu Ala Phe Thr35 40 45Glu Glu Val Asp Gln Val Gly Val Phe Ser Val Glu Glu Gln Ser Leu50 55 60Val Glu Asp Thr Leu Asp Ile Asp Val Asp Ile Ile Asp Glu Tyr Asp65 70 75 80Tyr Ile Asp Val Leu Ser Val Glu Leu Asp Pro Glu Asp Val Asp Ala85 90 95Leu Ser Glu Glu Glu Gly Ile Ser Tyr Ile Glu Glu Asp Phe Glu Leu100 105 110Ser Ile Gln Gln Thr Val Pro Trp Gly Ile Thr Arg Val Gln Ala Pro115 120 125Thr Val His Asn Arg Gly Ile Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Ile130 135 140Leu Asp Thr Gly Ile Ala Gln His Ser Asp Leu Thr Ile Arg Gly Gly145 150 155 160Ala Ser Phe Val Pro Gly Glu Ser Thr Thr Ala Asp Leu Asn Gly His165 170 175Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly180 185 190Val Ile Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu195 200 205Gly Ala Asn Gly Arg Gly Ser Val Ser Gly Ile Ala Gln Gly Leu Glu210 215 220Trp Ala Ala Thr Asn Asn Met His Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Ser225 230 235 240Asp Ala Pro Ser Thr Thr Leu Glu Arg Ala Val Asn Tyr Ala Thr Ser245 250 255Arg Gly Val Leu Val Ile Ala Ala Thr Gly Asn Asn Gly Thr Gly Ser260 265 270Ile Gly Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr
275 280 285Asp Gln Asn Asn Arg Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Thr Gly Ile290 295 300Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Gly Ile Gln Ser Thr Tyr Leu Asn Asn305 310 315 320Ser Tyr Ala Ser Met Pro Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala325 330 335Gly Val Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Asn Ala Thr340 345 350Gln Ile Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Asn Leu Gly Asn Ser355 360 365Ser Gln Phe Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Asp Ala Ala Thr Arg370 375 380
權(quán)利要求
1.一種枯草桿菌素型堿性蛋白酶，其氨基酸序列與SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列具有至少70％的同一性。
2.一種枯草桿菌素型堿性蛋白酶，其氨基酸序列與SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列具有至少85％的同一性。
3.一種枯草桿菌素型堿性蛋白酶，其氨基酸序列在位置115到位置384與SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性。
4.一種枯草桿菌素型堿性蛋白酶，其氨基酸序列在位置115到位置384與SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列具有至少90％的同一性。
5.一種枯草桿菌素型堿性蛋白酶，其衍生自一種核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列具有至少70％的同一性，尤其在對(duì)應(yīng)于SEQ IN NO.2中的位置115到位置384的部分區(qū)域上。
6.一種枯草桿菌素型堿性蛋白酶，其衍生自一種核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列具有至少85％的同一性，尤其在對(duì)應(yīng)于SEQ IN NO.2中的位置115到位置384的部分區(qū)域上。
7.一種枯草桿菌素型堿性蛋白酶，其氨基酸序列與SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列整體上相同，優(yōu)選是在位置115到位置384，和/或其氨基酸序列與衍生自SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列的氨基酸序列整體上相同，優(yōu)選是在位置343到位置1152。
8.一種蛋白或片段，通過片段化或缺失突變而衍生自如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的枯草桿菌素型堿性蛋白酶，并且具有至少20，優(yōu)選至少50，尤其優(yōu)選至少100個(gè)已經(jīng)連接在出發(fā)分子中的氨基酸。
9.一種蛋白，通過插入突變，通過替換突變和/或通過與至少一種其他蛋白或蛋白片段融合而衍生自枯草桿菌素型堿性蛋白酶，或來自如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的衍生蛋白或片段。
10.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的蛋白，蛋白片段或融合蛋白，其特征在于其本身能夠水解蛋白。
11.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的蛋白，蛋白片段或融合蛋白，其特征在于其另外被衍生化。
12.如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物，其特征在于其另外被穩(wěn)定化。
13.一種蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物，其特征在于其與權(quán)利要求1-12中所定義的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物之一共同具有至少一種的抗原決定簇。
14.如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物，其特征在于其可從天然來源獲得，尤其是從微生物獲得。
15.如權(quán)利要求14所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物，其特征在于所述微生物為革蘭氏陽性細(xì)菌。
16.權(quán)利要求15所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物，其特征在于所述革蘭氏細(xì)菌為芽孢桿菌屬中的一種。
17.權(quán)利要求16所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物，其特征在于芽孢桿菌種為Bacillus gibsonii，尤其是Bacillus gibsonii(DSM 14391)。
18.一種核酸，其編碼枯草桿菌素型堿性蛋白酶，并且其核苷酸序列與SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列具有至少70％的同一性，尤其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO.2的氨基酸115到氨基酸384的部分區(qū)域上。
19.一種核酸，其編碼枯草桿菌素型堿性蛋白酶，并且其核苷酸序列與SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列具有至少85％的同一性，尤其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO.2的氨基酸115到氨基酸384的部分區(qū)域上。
20.一種核酸，其編碼枯草桿菌素型堿性蛋白酶，并且其核苷酸序列與SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列相同，尤其在對(duì)應(yīng)于SEQ IDNO.2的氨基酸115到氨基酸384的部分區(qū)域上。
21.一種核酸，其編碼權(quán)利要求1-14所定義的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物之一。
22.如權(quán)利要求18-21中任一項(xiàng)所述的核酸，其特征在于其從天然來源獲得，尤其是從一種微生物獲得。
23.如權(quán)利要求22所述的核酸，其特征在于所述微生物為革蘭氏陽性細(xì)菌。
24.如權(quán)利要求23所述的核酸，其特征在于所述革蘭氏細(xì)菌為芽孢桿菌屬中的一種。
25.如權(quán)利要求24所述的核酸，其特征在于所述芽孢桿菌種為Bacillus gibsonii，尤其為Bacillus gibsonii(DSM 14391)。
26.一種載體，其包括權(quán)利要求18-25中所定義的核酸區(qū)域，尤其是一種編碼權(quán)利要求1-17中所定義的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物之一的核酸區(qū)域。
27.一種克隆載體，如權(quán)利要求26中所述。
28.一種表達(dá)載體，如權(quán)利要求26中所述。
29.一種細(xì)胞，其包括權(quán)利要求18-25所定義的核酸區(qū)域，尤其是一種編碼權(quán)利要求1-17所定義的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物之一的核酸區(qū)域，優(yōu)選在如權(quán)利要求26-28中任一項(xiàng)所述的載體上。
30.一種宿主細(xì)胞，其表達(dá)或可被誘導(dǎo)表達(dá)任何權(quán)利要求1-17所定義的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物，尤其通過利用權(quán)利要求18-25中任一項(xiàng)所述的核酸區(qū)域，更尤其通過利用如權(quán)利要求28所述的表達(dá)載體。
31.如權(quán)利要求30所述的宿主細(xì)胞，其特征在于其是一種細(xì)菌，尤其是一種將產(chǎn)生的蛋白分泌到周圍介質(zhì)中的細(xì)菌。
32.如權(quán)利要求31所述的細(xì)菌，其特征在于其是一種革蘭氏陽性細(xì)菌，尤其是芽孢桿菌屬中的一種，更尤其是遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)，地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或親堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)。
33.如權(quán)利要求29或30所述的細(xì)胞，其特征在于其是一種真核細(xì)胞，尤其是一種翻譯后對(duì)產(chǎn)生的蛋白進(jìn)行修飾的真核細(xì)胞。
34.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1-17所定義的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物之一的方法，所述方法利用如權(quán)利要求18-25中任一項(xiàng)所述的核酸和/或利用如權(quán)利要求26-28中任一項(xiàng)所述的載體和/或利用如權(quán)利要求29-33中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞。
35.一種產(chǎn)品，其特征在于其包括如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物。
36.一種洗滌或清潔產(chǎn)品，其特征在于其包括如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物。
37.如權(quán)利要求36所述的產(chǎn)品，其特征在于其包括的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物的量每克產(chǎn)品為2μg至20mg，優(yōu)選5μg至17.5mg，尤其優(yōu)選20μg至15mg，更尤其優(yōu)選50μg至10mg。
38.如權(quán)利要求36或37所述的產(chǎn)品，其特征在于其另外包括其他酶，尤其是其他蛋白酶，淀粉酶，纖維素酶，半纖維素酶，氧化還原酶和/或脂肪酶。
39.一種用于處理紡織品原料或用于紡織品保養(yǎng)的產(chǎn)品，其特征在于其單獨(dú)包括或除了其他活性成分外還包括如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物，尤其是用于處理含有天然組分的纖維或紡織品，并且更尤其用于處理那些含有羊毛或絲的纖維或紡織品。
40.一種用于機(jī)械清潔紡織品或硬表面的方法，其特征在于在至少一個(gè)方法步驟中，使如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物活化，每次應(yīng)用的量?jī)?yōu)選為40μg至4g，優(yōu)選50μg至3g，尤其優(yōu)選100μg至2g，以及更尤其優(yōu)選200μg至1g。
41.一種用于處理紡織品原料或用于紡織品保養(yǎng)的方法，其特征在于在至少一個(gè)方法步驟中，使如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物活化，尤其用于處理紡織品原料，含有天然組分的纖維或紡織品，以及更尤其用于那些含有羊毛或絲的纖維或紡織品。
42.如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的酶水解活性蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物在清潔紡織品或硬表面上的應(yīng)用，每次應(yīng)用的量尤其為40μg至4g，優(yōu)選50μg至3g，尤其優(yōu)選100μg至2g，以及更尤其優(yōu)選200μg至1g。
43.如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物在激活或鈍化洗滌或清潔產(chǎn)品成分中的應(yīng)用。
44.如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物在生化分析或合成低分子量化合物或蛋白中的應(yīng)用。
45.如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物在制備，純化或合成天然物質(zhì)或生物價(jià)值物質(zhì)中的應(yīng)用。
46.如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物在處理天然原料，尤其在處理表面，更尤其在處理皮革的方法中的應(yīng)用。
47.如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物的應(yīng)用，用于在制造紡織品中獲得或處理原料或中間體，尤其用于從織物中去除保護(hù)層。
48.如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物在處理紡織品原料或紡織品保養(yǎng)，尤其在處理羊毛，絲，或含有羊毛或絲的混紡織品中的應(yīng)用。
49.如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物在處理照相膠片，尤其在去除含凝膠或類似保護(hù)層中的應(yīng)用。
50.如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物在制備食物或動(dòng)物飼料中的應(yīng)用。
51.一種化妝品，其含有如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物，或者一種化妝用方法，其摻入如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物，或者如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的蛋白，蛋白片段，融合蛋白或衍生物在化妝用目的，尤其在相應(yīng)方法的框架中或在相應(yīng)產(chǎn)品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的來自Bacillus gibsonii(DSM14391)的芽孢桿菌素型堿性蛋白酶及其充分相關(guān)的蛋白和衍生物。本發(fā)明還涉及包含此新的枯草桿菌素型蛋白酶及其充分相關(guān)的蛋白和衍生物的洗滌劑和清洗劑，相應(yīng)的洗滌和清潔方法，以及所述蛋白酶，其充分相關(guān)的蛋白和衍生物在洗滌劑和清洗劑中的應(yīng)用，和其它技術(shù)用途。
文檔編號(hào)A23C9/12GK1606619SQ02825722
公開日2005年4月13日 申請(qǐng)日期2002年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月20日
發(fā)明者安格里特·韋伯, 安哥拉·黑勒布蘭特, 蘇珊·施米茨, 卡爾-海因茨·毛雷爾, 貝婭特麗克絲·科特維茨 申請(qǐng)人:漢高兩合股份公司