專利名稱：鋅指蛋白－dna相互作用的遺傳篩選模型及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域的一種遺傳模型及其應(yīng)用，特別是涉及研究鋅指蛋白-DNA相互作用的遺傳模型及其應(yīng)用。
本發(fā)明所提供的鋅指蛋白-DNA相互作用的遺傳篩選模型，是含有報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒的大腸桿菌，所述報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒含有壯觀霉素抗性基因aadA，壯觀霉素抗性基因aadA的上游含有aadA基因自身啟動(dòng)子PaddA，壯觀霉素抗性基因aadA的下游含有方向與啟動(dòng)子PaddA相反，且強(qiáng)度高于PaddA的組成性啟動(dòng)子；在所述組成性啟動(dòng)子的操縱序列中插入鋅指蛋白小鼠轉(zhuǎn)錄因子Zif268的結(jié)合序列。
為了更利于操作，所述報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒是單拷貝的。
本發(fā)明巧妙地以經(jīng)典型鋅指小鼠轉(zhuǎn)錄因子Zif268為材料，利用轉(zhuǎn)錄干擾現(xiàn)象(Elledge SJ，et al.Position and density effects on repression by stationaryand mobile DNA-binding proteins.Genes Dev.1989，3(2)185-197；Elledge SJ，et al.Genetic selection for genes encoding sequence-specific DNA-bindingproteins.Proc Natl Acad Sci U S A.1989，86(10)3689-3693)，在大腸桿菌中建立了一種簡(jiǎn)單、通用的研究鋅指蛋白-DNA相互作用的遺傳篩選模型，可以用來(lái)揭示鋅指蛋白的DNA識(shí)別規(guī)律，篩選、設(shè)計(jì)序列特異性的DNA結(jié)合蛋白，對(duì)特定基因如HIV等致病基因的表達(dá)進(jìn)行人為干預(yù)，實(shí)現(xiàn)特定疾病的有效預(yù)防與治療，具有重要的理論和實(shí)踐意義。
本發(fā)明的原理如

圖1所示報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒上含有壯觀霉素抗性基因aadA，在該基因的上、下游各含有一個(gè)啟動(dòng)子PaddA、PconII，其中上游的啟動(dòng)子PaddA是aadA基因自身的啟動(dòng)子，下游的啟動(dòng)子PconII是一個(gè)合成的組成性啟動(dòng)子，強(qiáng)度上要遠(yuǎn)高于上游的啟動(dòng)子，方向與之相反，因此正常情況下，下游的啟動(dòng)子會(huì)組成性干擾aadA基因的轉(zhuǎn)錄，使得含有報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒的宿主表現(xiàn)為壯觀霉素敏感Sps，此即所謂的轉(zhuǎn)錄干擾。在組成性啟動(dòng)子PconII相應(yīng)于操縱序列Op的位置插入Zif268的結(jié)合序列，使PconII由組成性啟動(dòng)子變成了可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子，用PconII-ZF表示，即構(gòu)建了一個(gè)可被鋅指蛋白調(diào)節(jié)的報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒，含有該報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒的宿主表現(xiàn)為壯觀霉素敏感Sps，如果向宿主中再引進(jìn)一個(gè)表達(dá)文庫(kù)，其中有一個(gè)克隆可以產(chǎn)生一個(gè)鋅指蛋白突變體，該突變體可以特異性的識(shí)別并結(jié)合0p位點(diǎn)，此時(shí)，PconII-ZF啟動(dòng)的轉(zhuǎn)錄就會(huì)被阻斷，aadA基因就會(huì)在自身啟動(dòng)子的作用下轉(zhuǎn)錄，宿主就轉(zhuǎn)變?yōu)閴延^霉素抗性Spr。根據(jù)壯觀霉素抗性的出現(xiàn)，就可以篩選得到識(shí)別特定位點(diǎn)的鋅指蛋白突變體。
本發(fā)明的報(bào)導(dǎo)質(zhì)?？梢蕴禺愋缘貜募s104-105的混合物中將表達(dá)質(zhì)粒篩選出來(lái)，具有充分的靈敏性。本發(fā)明構(gòu)建的體內(nèi)遺傳篩選模型，無(wú)論是在可建立文庫(kù)大小、揭示氨基酸-堿基作用規(guī)律還是在真實(shí)反映生理?xiàng)l件下鋅指蛋白-DNA作用特點(diǎn)等方面都比噬菌體顯示具有一定的優(yōu)越性。
圖2為報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒pConII-ΔZB的序列測(cè)定電泳圖。
圖3為Zif268的DNA結(jié)合區(qū)的PCR擴(kuò)增電泳圖。
圖4為表達(dá)質(zhì)粒pGEX-D的雙酶切鑒定(EcoR I+BamH I)電泳圖譜。
圖5為表達(dá)質(zhì)粒pGEX-D的序列測(cè)定圖譜。
圖6為融合蛋白GST-D純化后的電泳圖譜。
圖7為鋅指蛋白DNA結(jié)合區(qū)的凝膠滯留試驗(yàn)電泳圖譜。
圖8為鋅指蛋白突變文庫(kù)的重疊式PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖。
表達(dá)鋅指蛋白的LB-Zif培養(yǎng)基其組成為在LB的基礎(chǔ)上添加100μM ZnCl2，100μg/ml L-酪氨酸，20mM的HEPES(用NaOH調(diào)pH 7.0)以及不同濃度的IPTG，氨芐青霉素100μg/ml。工具酶、常用生化試劑等為Biolab、Promega等公司及國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社，1992)
實(shí)施例1、報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒的構(gòu)建選擇Zif268的核心識(shí)別序列5’-AGCGTGGGCGG-3’作為操縱序列，合成兩條互補(bǔ)的寡核苷酸片段P1、P2。合成片段混合退火，DNA聚合酶大片段聚合延伸。延伸片段經(jīng)Not I、Hind III酶切消化、15％聚丙烯酰胺凝膠純化后，與用同樣限制性內(nèi)切酶消化并經(jīng)電泳純化的質(zhì)粒pNN389大片段連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑取單克隆，經(jīng)酶切鑒定、序列測(cè)定，得到序列正確的報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒pConII-ΔZB(其鑒定圖譜如圖2所示)。在報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒中，Zif268的結(jié)合位點(diǎn)作為啟動(dòng)子ConII的操縱序列，位于-4位。
P15’-GGTGGCAAGCTTGCATG-3’P25’-GGTAGCGGCCGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGCAAGCGTGGGCGGCTGCAGGCATGCAAGCTTGCCACC-3’P2中自5’端第5-12位堿基為Not I位點(diǎn)，自5’端第70-75位堿基為HindIII位點(diǎn)，自5’端第47-57位堿基為Zif268的結(jié)合位點(diǎn)ZB。
實(shí)施例2、報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒的壯觀霉素敏感性試驗(yàn)將報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒pConII-ΔZB轉(zhuǎn)化JM109后，挑取單克隆培養(yǎng)過(guò)夜，取過(guò)夜培養(yǎng)物稀釋后進(jìn)行鋪板試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。
表1、不同報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒的壯觀霉素敏感性實(shí)驗(yàn) 質(zhì)粒 抗生素濃度(μg/ml)組別 Cm40 Sp50Sp80 Sp120 Sp150 Sp200 Sp3001pNN389 + ++ + + + +2pConII-ΔZB+ ++ - - - -3pConII-1 + +- - - - -+grow；- not grow pConII-1positive contra由表1可以看出由于pNN389含有氯霉素抗性基因，壯觀霉素抗性基因aadA正常表達(dá)，因此JM109(pNN389)在所有抗性平板上都穩(wěn)定生長(zhǎng)(實(shí)驗(yàn)2)，與預(yù)期一致。報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒pConII-ΔZB與陽(yáng)性對(duì)照pConII-1一樣(pConII-1的操縱序列為434抑制物的結(jié)合位點(diǎn))，對(duì)壯觀霉素的敏感性(120μg/ml，80μg/ml)都低于原始質(zhì)粒pNN389(300μg/ml)，說(shuō)明在沒(méi)有轉(zhuǎn)錄抑制物即Zif268時(shí)，含有ZB作為操縱序列的啟動(dòng)子能夠有效啟動(dòng)，反向干擾壯觀霉素抗性基因aadA的轉(zhuǎn)錄，使得報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒表現(xiàn)為不同程度的壯觀霉素敏感性，而且pConII-ΔZB具有較寬的篩選“窗口”(120-300μg/ml)。
作為一個(gè)報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒，還有一個(gè)需要考慮的問(wèn)題就是由于與染色體整合、拷貝數(shù)增加、回復(fù)突變等導(dǎo)致的“背景噪聲”，而表2則進(jìn)一步表明pConII-ΔZB在壯觀霉素為120μg/ml時(shí)的“回復(fù)”突變頻率極低，完全可以用作遺傳篩選的報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒，為下一步進(jìn)行胞內(nèi)的實(shí)驗(yàn)打下了基礎(chǔ)。
表2、報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒pConII-ΔZB的“背景噪聲”克隆數(shù)目*質(zhì)粒 Cm40 Sp120pConII-ΔZB1 (25±3.2)×10-6pNN389 1 1pConII-1 1 (13.1±4.2)×10-6*以Cm平板對(duì)應(yīng)的克隆數(shù)為1 N＝3實(shí)施例3、Zif268的DNA結(jié)合區(qū)在大腸桿菌中的表達(dá)Zif268的DNA結(jié)合區(qū)域由三個(gè)串聯(lián)的鋅指蛋白組成，根據(jù)Zif268的序列，合成引物PDN、PDC，兩端分別添加EcoR I、BamH I酶切位點(diǎn)，PDC的末尾添加終止密碼TGA、TAA。其序列如下PDN5’-AAGGATCCGAACGCCCATATGCTTG-3’，對(duì)應(yīng)于DNA結(jié)合區(qū)的氨基端PDC5’-ACGGAATTCTTATCAGTCCTTCTGTCTTAAATGG-3’，對(duì)應(yīng)于DNA結(jié)合區(qū)的羧基端以PDN、PDC為引物，以含有zif268全長(zhǎng)cDNA的質(zhì)粒pBKS-Zif268為模板，53℃退火，72℃延伸得到含有三個(gè)鋅指的DNA結(jié)合區(qū)片段D(結(jié)果如圖3所示)。PCR擴(kuò)增片段采用Promega公司W(wǎng)izardTMPCR Preps DNA純化系統(tǒng)進(jìn)行純化，純化后的產(chǎn)物經(jīng)BamH I、EcoR I酶切以后插入到pGEX-2T的相應(yīng)位點(diǎn)，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5αMCR，挑取單克隆，進(jìn)行質(zhì)粒大小、酶切鑒定及序列測(cè)定，得到序列完全正確的表達(dá)質(zhì)粒pGEX-D，檢驗(yàn)結(jié)果如圖4、圖5所示)。
挑選單克隆接種5ml LB-Zif培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜，按2％的比例取過(guò)夜培養(yǎng)物接種于搖瓶培養(yǎng)2-3小時(shí)至OD600＝0.3-0.5，用40μM的IPTG誘導(dǎo)，25-30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)3-4hr，結(jié)果證實(shí)(如圖6所示)目的蛋白在大腸桿菌中獲得了表達(dá)。
實(shí)施例4、融合蛋白的純化離心收集培養(yǎng)菌體，菌體超聲破菌，添加Triton X-100至終濃度1％，溫和攪拌助溶。離心，保留含有目的蛋白的上清，與準(zhǔn)備好的谷胱甘肽Sepharose 4B混合，使目的蛋白與之結(jié)合。一部份用含有谷胱甘肽的洗脫液洗脫，得到融合蛋白，另一部份用凝血酶切割，再行洗脫分離，分別得到谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶及鋅指DNA結(jié)合區(qū)，純化結(jié)果表明(如圖6所示)利用親和層析可以得到特異的融合蛋白GST-D，而且融合蛋白在凝血酶的作用下，可在融合位點(diǎn)處特異的被切割，得到游離的目的蛋白D。此外，在超聲破菌上清含有明顯的融合蛋白，這表明在特定的培養(yǎng)條件下，目的蛋白在胞內(nèi)呈部份可溶性表達(dá)。
實(shí)施例5、Zif268 DNA結(jié)合區(qū)的DNA結(jié)合特性取純化得到的含有Zif268的DNA結(jié)合區(qū)的融合蛋白GST-D、或單獨(dú)DNA結(jié)合區(qū)蛋白，進(jìn)行DNA結(jié)合凝膠遷移遲滯實(shí)驗(yàn)，對(duì)其體外的結(jié)合特性進(jìn)行分析。結(jié)果如圖7所示，圖中A部分是單獨(dú)的DNA結(jié)合區(qū)，B部分是融合蛋白，表明無(wú)論是融合蛋白，還是單獨(dú)的DNA結(jié)合區(qū)，都保持了與特定靶位點(diǎn)結(jié)合的特性，由于整個(gè)純化過(guò)程中，并沒(méi)有對(duì)目的蛋白進(jìn)行復(fù)性等步驟，這表明Zif268 DNA結(jié)合區(qū)在大腸桿菌中得到了功能性表達(dá)，并且GST與DNA結(jié)合區(qū)的融合，沒(méi)有明顯影響鋅指蛋白的DNA結(jié)合特性。
實(shí)施例6、體內(nèi)遺傳篩選模型的建立取pGEX-D(鋅指蛋DNA結(jié)合區(qū)的表達(dá)質(zhì)粒)、pGEX-2T(谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶融合表達(dá)載體)分別轉(zhuǎn)化含有報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒pConII-ΔZB以及pConII-1、pNN389的大腸桿菌JM109，進(jìn)行鋪板實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。
表3、鋅指蛋白的體內(nèi)遺傳篩選模型實(shí)驗(yàn) JM109所含不同質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化子數(shù)目％組別 AprCmrAprSprAprSpr/AprCmr1無(wú)質(zhì)粒0 0-2pGEX-2T 0 0-3pGEX-D0 0-4pNN3890 0-5pConII-1 0 0-6pConII-ΔZB 0 0-7pNN389+pGEX-2T1/1 1/1 100/1008pNN389+pGEX-D 1/1 1/1 100/1009pConII-1+pGEX-2T 1/1 10-5/10-5010 pConII-1+pGEX-D 1/1 10-5/10-5011 pConII-ΔZB+pGEX-2T 1/1 10-5/10-5012 pConII-ΔZB+pGEX-D1/1 1/10-5100/0N/MIPTG誘導(dǎo)/IPTG不誘導(dǎo)下的克隆數(shù)目或百分比，以AprCmr上的轉(zhuǎn)化子數(shù)為1由實(shí)驗(yàn)1-6發(fā)現(xiàn)單獨(dú)JM109或只含有一種質(zhì)粒時(shí)，在雙抗平板AprSpr、AprCmr均不能生長(zhǎng)，與預(yù)期一致，這表明所選擇的宿主、質(zhì)粒不存在明顯的“背景噪聲”。
在組別7-11中，JM109同時(shí)含有表達(dá)、報(bào)導(dǎo)兩種質(zhì)粒時(shí)，在AprCmr上穩(wěn)定生長(zhǎng)，說(shuō)明兩種質(zhì)粒的抗性標(biāo)記良好，且是相容性質(zhì)粒，可在JM109中穩(wěn)定共存，而且無(wú)論有無(wú)IPTG誘導(dǎo)，在兩種雙抗平板上生長(zhǎng)無(wú)明顯差別，說(shuō)明GST及其融合蛋白的表達(dá)，不會(huì)非特異地影響質(zhì)粒pNN389、pConII-1、pConII-ΔZB的復(fù)制、抗性基因的表達(dá)等功能。
在實(shí)驗(yàn)7-8中，JM109在AprSpr、AprCmr兩種雙抗平板上生長(zhǎng)無(wú)差異，而實(shí)驗(yàn)9-11中，AprSpr平板上幾乎無(wú)菌落出現(xiàn)。這是由于pNN389中無(wú)反向啟動(dòng)子，壯觀霉素抗性基因會(huì)組成性表達(dá)，因此表現(xiàn)為壯觀霉素抗性，而質(zhì)粒pConII-1、pConII-ΔZB由于含有反向啟動(dòng)子，壯觀霉素基因的表達(dá)得到抑制，因此在AprSpr平板上只有極少量菌落出現(xiàn)(10-5)，這也同時(shí)表明報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒pConII-1、pConII-ΔZB的“背景噪聲”極低，與實(shí)施例2結(jié)果相符。
在實(shí)驗(yàn)12中，JM109中含有鋅指蛋白特異的表達(dá)質(zhì)粒和報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒，當(dāng)沒(méi)有IPTG誘導(dǎo)時(shí)，在AprSpr平板上也只有少量菌落生長(zhǎng)，屬于pConII-ΔZB的“背景噪聲”，但是當(dāng)有IPTG誘導(dǎo)時(shí)，所有AprCmr克隆都會(huì)呈現(xiàn)為AprSpr抗性(AprSpr/AprCmr＝100％)。實(shí)驗(yàn)1-12共同表明質(zhì)粒pGEX-D介導(dǎo)的鋅指蛋白DNA結(jié)合區(qū)的表達(dá)特異性地與報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒pConII-ΔZB上的鋅指結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，阻止反向啟動(dòng)子PconII-ΔZB的組成性啟動(dòng)，使得抗性基因aadA得以在自身啟動(dòng)子的啟動(dòng)下表達(dá)，表現(xiàn)為壯觀霉素抗性，這也說(shuō)明至此已經(jīng)建立了鋅指蛋白的體內(nèi)遺傳篩選模型。
實(shí)施例7、體內(nèi)遺傳篩選模型的篩選效率評(píng)估由于最終目的是利用上述實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行突變體的篩選，因此需要確定整個(gè)試驗(yàn)的特異性、敏感性。為了考察利用上述試驗(yàn)從巨大文庫(kù)中篩選稀有克隆的潛力，將質(zhì)粒pGEX-D用不同量的pGEX-2T稀釋，然后進(jìn)行鋪板，探討能否特異性地將表達(dá)鋅指蛋白的質(zhì)粒從一個(gè)混合物中篩選出來(lái)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)報(bào)導(dǎo)質(zhì)?？梢蕴禺愋缘貜募s104-105的混合物中將表達(dá)質(zhì)粒篩選出來(lái)，具有充分的靈敏性，已經(jīng)足夠突變文庫(kù)的篩選之用。對(duì)于那些稀有克隆(1/108)，經(jīng)過(guò)多輪篩選(3-4輪)，即可以從一個(gè)文庫(kù)中被篩選出來(lái)。
實(shí)施例8、鋅指1關(guān)鍵位置完全隨機(jī)化突變文庫(kù)的建立為較為徹底地探討識(shí)別螺旋中氨基酸—堿基之間的相互作用，同時(shí)考慮到可操作文庫(kù)的大小，在維持識(shí)別螺旋中保守性His+7不變的情況下，使+4位的氨基酸為leu或Arg，+9位的氨基酸為Arg或Lys，將-1-+8位其它位置隨機(jī)化。據(jù)此設(shè)計(jì)引物PMS、PMR，用于鋅指1的突變，其序列如下PMS3’ CGC CTA -5’PMR5’- CT/CTKNN (KNN)2AA/CG(KNN)4AGAAAAGCGGCGCTAGCAGGA-3’采用重疊式PCR技術(shù)，通過(guò)三次PCR反應(yīng)，對(duì)鋅指1(ZF1)的關(guān)鍵位置的核苷酸進(jìn)行突變，其PCR結(jié)果如圖8所示。由圖中可以發(fā)現(xiàn)在重疊式PCR中，第二次擴(kuò)增產(chǎn)物約為240bp，與預(yù)期一致，以第一、二次產(chǎn)物為模板的第三次擴(kuò)增產(chǎn)物D*雖然大小上約280bp，但不是呈現(xiàn)緊密單一條帶，推測(cè)是因?yàn)镻CR產(chǎn)物本身具有較大的分子多樣性，達(dá)到1011，而不同分子之間的電荷性質(zhì)具有微小的差別，因此在泳動(dòng)性上表現(xiàn)不均一。
PCR產(chǎn)物回收后，經(jīng)E.coR I、BamH I酶切，與經(jīng)同樣限制性內(nèi)切酶處理過(guò)的表達(dá)載體pGEX-2T連接，連接產(chǎn)物經(jīng)用0.5×TE重新溶解降低電導(dǎo)以后，選擇2.4KV、4kΩ條件電擊、轉(zhuǎn)化MC1061。同時(shí)電擊轉(zhuǎn)化10次，獲得了約108-109的轉(zhuǎn)化子，此即初級(jí)文庫(kù)。
回收所有轉(zhuǎn)化子，在含有100μg/ml的1L LB培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)過(guò)夜，擴(kuò)增初級(jí)文庫(kù)。收集過(guò)夜培養(yǎng)物，進(jìn)行質(zhì)粒的大量制備與純化，得到表達(dá)質(zhì)粒文庫(kù)pGEX-D*，分成不同等份，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例9、識(shí)別保守亞位點(diǎn)GCG同功突變體的篩選取含有報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒的大腸桿菌JM109(pConII-ΔZB)，制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)，然后用制備好的表達(dá)質(zhì)粒文庫(kù)DNA進(jìn)行電轉(zhuǎn)化、篩選。
由于報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒偶爾會(huì)由于拷貝數(shù)增加、整合以及點(diǎn)突變等導(dǎo)致表型由壯觀霉素敏感改變?yōu)閴延^霉素抗性即假陽(yáng)性的出現(xiàn)，使“背景噪聲”提高，為排除這一干擾，我們?cè)诿恳惠喓Y選以后，都將表現(xiàn)為壯觀霉素抗性的克隆重新制備質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到含有報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒的菌株中，進(jìn)行下一輪的篩選。另外，由于抗性轉(zhuǎn)化子中同時(shí)含有表達(dá)質(zhì)粒和報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒，在制備DNA重新轉(zhuǎn)化時(shí)，有可能會(huì)同時(shí)將含有的報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)同一個(gè)大腸桿菌宿主，為克服這一影響，選擇報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒上特有的限制性內(nèi)切酶Hind III進(jìn)行消化，使之變成線形，然后再轉(zhuǎn)化。
經(jīng)過(guò)以上處理以后，如表5所示，隨著篩選的進(jìn)行，抗性克隆所占的比例(AprSpr/Apr比值)明顯增高。四輪以后，富集倍數(shù)達(dá)到104，AprSpr/Apr比值已經(jīng)接近1，挑取單克隆，進(jìn)行質(zhì)粒制備，Hind III消化，轉(zhuǎn)化JM109，再進(jìn)行質(zhì)粒制備，序列測(cè)定，得到20個(gè)克隆，其序列及相關(guān)特性如表6、7所示。
表5、突變體的篩選篩選輪數(shù) 富集效率(Aprspr/AprCmr)1 10-62 2×10-43 0.024 0.85表6、突變體的序列及特性 fGCG體內(nèi)結(jié)合特異性常數(shù)，用不同突變體重新轉(zhuǎn)化含有報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒的JM109時(shí)陽(yáng)性克隆所占比例即AprSpr/ApfCmr表7、鋅指1中不同位置上氨基酸的偏性位置 氨基酸PePfδ32(Pf-Pe)/δ32-1 R(Arg) 3/32 12/20 0.052 9.73K(Lys) 1/32 6/20 0.031 8.68D(Asp) 1/32 1/20 0.031 0.61Q(Gln) 1/32 1/20 0.031 0.61+2 D(Asp) 1/32 9/20 0.031 13.5C(Cys) 1/32 3/20 0.031 3.84Q(Gln) 1/32 1/20 0.031 0.61+3 D(Asp) 1/32 6/20 0.031 8.68E(Glu) 1/32 5/20 0.031 7.06V(Val) 2/32 6/20 0.043 5.52+4 L(Leu) 3/32 17/20 0.052 14.5R(Arg) 3/32 3/20 0.052 1.08+6 R(Arg) 3/32 15/20 0.052 12.6T(Thr) 2/32 2/20 0.043 1.23K(Lys) 1/32 1/20 0.031 0.61+9 R(Arg) 3/32 14/20 0.052 11.7K(Lys) 1/32 6/20 0.031 8.68Pe在完全隨機(jī)文庫(kù)中，預(yù)期出現(xiàn)頻率；Pf在所有20個(gè)克隆中實(shí)際出現(xiàn)頻率，δ標(biāo)準(zhǔn)方差，[Pe(1-Pe)/n]1/2，n＝32即NNK所代表的32種密碼子。
實(shí)施例10、識(shí)別保守亞位點(diǎn)GCG同功突變體的序列分析由表6、表7中的統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)于識(shí)別GCG亞位點(diǎn)的同功鋅指突變體，+4、+9位相對(duì)固定，此外，-1、+2、+3、+6四個(gè)位置顯示出對(duì)特定氨基酸的偏愛(ài)，具有較大的保守性，由于保守性意味著功能性，說(shuō)明上述四個(gè)位置在DNA識(shí)別中具重要作用。
-1位，主要是Arg、Lys兩個(gè)帶正電荷的氨基酸，二者幾乎以同樣頻率出現(xiàn)，但是也出現(xiàn)了帶負(fù)電荷的Asp以及中性的Gln。在Zif268與保守DNA結(jié)合位點(diǎn)形成復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)中[8]，-1位的氨基酸是與5’-GCG-3’中3’的G作用，由于在G∶C堿基配對(duì)中，電荷分布不均勻，G呈負(fù)電性，因此帶正電荷的Arg、Lys與G之間會(huì)通過(guò)氫健HB相互作用。但是早期的噬菌體顯示實(shí)驗(yàn)中，-1位的氨基酸或者多為Arg、或者多為L(zhǎng)ys(Jamieson AC，et al.In vitro selection of zinc fingers with alteredDNA-binding specificity.Biochemistry.1994 May 17；33(19)5689-5695)，理論上，二者都可以很好地與G作用，出現(xiàn)上述差異的原因可能是噬菌體顯示實(shí)驗(yàn)中樣本數(shù)較小，也可能是文庫(kù)構(gòu)建方法不同。
與-1位相反，+2位主要是帶負(fù)電荷的Asp，其次是Cys。正負(fù)電荷之間正可以形成鹽橋，而且Asp還可以對(duì)Arg-1、Lys-1的長(zhǎng)的側(cè)鏈起到支撐作用，穩(wěn)定整個(gè)DNA-蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，這與晶體結(jié)構(gòu)中的結(jié)果相一致。但是在MT15中，情況剛好相反，是Gln-1His+2，+2位的His帶正電荷，很可能在咪唑基與酰胺基之間也可以形成HB。
+3位，主要是Asp、Glu、Val，三者出現(xiàn)頻率幾乎一致，此外也出現(xiàn)了Leu、Thr、Gin等其它氨基酸，與Barbas CF 3 rd、Klug A(Choo Y，et al. Selection of DNAbinding sites for zinc fingers using rationally randomized DNA reveals codedinteractions.Proc Natl Acad Sci U S A.1994 Nov 8；91(23)11168-11172，WuH，et al.Building zinc fingers by selectiontoward a therapeutic application.Proc Natl Acad Sci U S A.1995 Jan 17；92(2)344-348)等人的結(jié)果一致。在晶體結(jié)構(gòu)中，+3位的氨基酸與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)最接近，因此該位置上氨基酸可能會(huì)受到空間位阻效應(yīng)的影響，由于在GCG中，中間的C較小，所以既可以接納較大的氨基酸如Leu、Gln、Glu，也可以接納較小的氨基酸如Val、Thr、Asp，但是由于C帶有正電極性，帶負(fù)電荷的Asp、Glu在該位置的高頻出現(xiàn)，說(shuō)明+3位的氨基酸在與堿基作用中，可能同時(shí)受到化學(xué)互補(bǔ)、立體化學(xué)互補(bǔ)的雙重因素的限制，這是以前的實(shí)驗(yàn)所未揭示的。此外，Jamieson AW等利用噬菌體顯示實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該位置主要是Asp，但是其在文庫(kù)構(gòu)建中只是將-1、+2、+3、+6位突變，其它位置固定不變(Jamieson AC，et al.In vitroselection of zinc fingers with altered DNA-binding specificity.Biochemistry.1994May 17；33(19)5689-5695)，而本發(fā)明則是將更多位置突變，得到了更為多樣的氨基酸分布，滿足構(gòu)建更大文庫(kù)之必要，而且也表明在鋅指蛋白中，的確存在識(shí)別螺旋內(nèi)的氨基酸間的相互作用，這種作用又會(huì)間接地影響鋅指蛋白的DNA識(shí)別。
+4位，顯示對(duì)Leu的強(qiáng)烈偏愛(ài)，+9位，Arg、Lys同等頻率出現(xiàn)。+6位主要是Arg，可以與G相互作用，與晶體結(jié)構(gòu)一致。+1、+5位則具有較大的隨意性，在DNA識(shí)別中可能不具直接作用。
比較而言，在-1、+2、+3、+6四個(gè)位置中，-1、+6位的保守性明顯強(qiáng)于+2、+3位，而且+6為最嚴(yán)格，在所用15個(gè)突變體中，絕大多數(shù)為Arg，與WT的一致。結(jié)構(gòu)上，由于-1、+6位分別與GCG的5’、3’端的堿基作用，因此在穩(wěn)定單一鋅指-三聯(lián)體亞位點(diǎn)識(shí)別中起錨定作用，有更重要的地位。早期的噬菌體顯示實(shí)驗(yàn)指出對(duì)于識(shí)別任何一個(gè)三聯(lián)體亞位點(diǎn)的單一鋅指，實(shí)際上只有-1、+3、+6位中的兩個(gè)位置比較保守(Rebar EJ，et al.Zinc finger phageaffinity selection of fingers with new DNA-bindingspecificities.Science.1994 Feb 4；263(5147)671-673)，而我們的結(jié)果卻證實(shí)上述三個(gè)位置都比較固定，且+2位起輔助性作用。我們的結(jié)果還說(shuō)明，在鋅指蛋白與DNA作用過(guò)程中，有些堿基可同不止一個(gè)氨基酸接觸如G可以與Arg、His、Gln、Ser、Lys等作用，在氨基酸---堿基之間并不存在一個(gè)簡(jiǎn)單的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，也反映出鋅指蛋白DNA識(shí)別作用中的復(fù)雜性。
此外，在電荷性質(zhì)上，本發(fā)明得到的克隆其整個(gè)識(shí)別螺旋帶有強(qiáng)的正電荷，而Jamieson AW等認(rèn)為主要是電中性的(Jamieson AC，et al.In vitro selection of zincfingers with altered DNA-binding specificity.Biochemistry.1994 May 17；33(19)5689-5695)。由于在DNA大槽中，GC配對(duì)中的電極性分布，GCG亞位點(diǎn)總體上帶有負(fù)電性質(zhì)，因此帶正電荷的識(shí)別螺旋深入到大槽中，與帶負(fù)電的GCG作用，識(shí)別作用會(huì)更加穩(wěn)定，也更合理。這又一次說(shuō)明對(duì)更多位置進(jìn)行突變，是完全必要的。
而且，所有噬菌體顯示實(shí)驗(yàn)，都未能篩選到野生型的序列，而本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)卻兩次得到，表明體內(nèi)篩選模型的確比噬菌體顯示更真實(shí)地反映了生理?xiàng)l件下的作用過(guò)程。利用噬菌體顯示進(jìn)行親和篩選時(shí)，根據(jù)的是一種群體作用，最終的結(jié)果完全有可能是低特異性、低親和力卻具有高表達(dá)優(yōu)勢(shì)的個(gè)體，相反那些高特異、高親和力、表達(dá)劣勢(shì)的個(gè)體卻有可能被淘汰。
權(quán)利要求
1.鋅指蛋白-DNA相互作用的遺傳篩選模型，是含有報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒的大腸桿菌，所述報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒含有壯觀霉素抗性基因aadA，壯觀霉素抗性基因aadA的上游含有aadA基因自身啟動(dòng)子PaddA，壯觀霉素抗性基因aadA的下游含有方向與啟動(dòng)子PaddA相反，且強(qiáng)度高于PaddA的組成性啟動(dòng)子；在所述組成性啟動(dòng)子的操縱序列中插入鋅指蛋白小鼠轉(zhuǎn)錄因子Zif268的結(jié)合序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的遺傳篩選模型，其特征在于所述報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒是單拷貝的。
3.權(quán)利要求1所述遺傳篩選模型在篩選鋅指蛋白突變體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了鋅指蛋白－DNA相互作用的遺傳篩選模型及其應(yīng)用，目的是提供一種建立在大腸桿菌中的，簡(jiǎn)單、通用的研究鋅指蛋白－DNA相互作用的遺傳篩選模型。本發(fā)明所提供的鋅指蛋白－DNA相互作用的遺傳篩選模型，是含有報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒的大腸桿菌，所述報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒含有壯觀霉素抗性基因aadA，壯觀霉素抗性基因aadA的上游含有aadA基因自身啟動(dòng)子P
文檔編號(hào)C12N1/21GK1438323SQ0310017
公開(kāi)日2003年8月27日 申請(qǐng)日期2003年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月8日
發(fā)明者趙志虎, 馬清鈞 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所