一種基于熒光蛋白iRFP的雙分子熒光片段互補(bǔ)系統(tǒng)及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及抑制蛋白相互作用的藥物評價的技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種基于熒光 蛋白i RFP的雙分子熒光片段互補(bǔ)系統(tǒng)及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 熒光片段互補(bǔ)系統(tǒng)是一種以熒光蛋白為材料的片段互補(bǔ)系統(tǒng)。其基本原理是在 合適的位點(diǎn)將熒光蛋白拆分成氮端和碳端片段，并且這兩片段若沒有在相互作用蛋白的作 用下，不能自發(fā)的互補(bǔ)恢復(fù)熒光。若有一對相互作用的蛋白分別與拆分的熒光蛋白的氮端 和碳端片段相融合，在這一對相互作用蛋白的作用下，拆分的熒光蛋白的氮端片段和碳端 片段就會相互靠近，從而恢復(fù)完整熒光蛋白的構(gòu)象而發(fā)出特異性熒光。熒光片段互補(bǔ)系統(tǒng) 能夠特異性的檢測到弱的瞬間相互作用，是一種檢測蛋白相互作用的簡便、直觀、靈敏的方 法。
[0003] 基于熒光片段互補(bǔ)系統(tǒng)的抗病毒藥物篩選和評價體系將為藥物開發(fā)提供簡單、 直觀、可視、定量化的藥物篩選和評價平臺技術(shù)，在藥物研發(fā)中提供重要的評價體系，從而 在控制疫情的發(fā)展與擴(kuò)散，保障人民群眾的生命財(cái)產(chǎn)安全和保障國家安全方面發(fā)揮重要作 用。
[0004] 目前，針對特定靶標(biāo)設(shè)計(jì)和篩選先導(dǎo)化合物等是國內(nèi)外藥物研發(fā)研究的前沿?zé)?點(diǎn)。如利用虛擬篩選方法來篩選靶向HIV-ι的整合酶與人類的LEDGF/P75蛋白相互作用的 抑制劑，從而為治療HIV-1 提供策略（Hu GP et al.J Mol Model. 2012;18:4995-5003)。但 是，這些方法大多數(shù)是基于體外的研究，不能直觀的展示其抑制的效果，而篩選到的先導(dǎo)化 合物需要進(jìn)一步在細(xì)胞水平或活體水平上驗(yàn)證其活性。目前的篩選和驗(yàn)證方法還很缺乏。 事實(shí)上，病毒在入侵細(xì)胞過程或復(fù)制過程中需要許多蛋白的相互作用、以及病毒或其重要 致病因子與宿主細(xì)胞組分的相互作用，而使其得以入侵和生存。這些蛋白相互作用或侵染 細(xì)胞的一些關(guān)鍵步驟是抗病毒藥物設(shè)計(jì)和篩選的主要靶標(biāo)。基于蛋白分子間相互作用成像 及病毒或其關(guān)鍵致病因子在細(xì)胞內(nèi)的影像分析，將為藥物篩選和藥效評價提供最直接、真 實(shí)、可視化的研究體系，為藥物篩選或評價提供重要的技術(shù)支撐。當(dāng)然，基于分子影像的篩 選和評價體系也可以進(jìn)一步和高通量藥物篩選（HTS)或高內(nèi)涵篩選（HCS)相結(jié)合，勢必為 藥物篩選提供一種簡便、可行、實(shí)時、可視化的篩選和評價系統(tǒng)。
[0005] 所以，本研究構(gòu)建了一種用于活細(xì)胞內(nèi)抑制劑藥物評價的熒光片段互補(bǔ)系統(tǒng)，用 于在活細(xì)胞水平上評價抑制蛋白相互作用的藥物。該新系統(tǒng)基于在同一細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)分別 與iRFP的氮端片段iRN97和碳端片段iRC98相融合表達(dá)的蛋白對，用待評價的抑制劑藥物 處理細(xì)胞。通過測量細(xì)胞內(nèi)iRFP的熒光強(qiáng)度，就可以評價該抑制劑藥物對蛋白對相互作用 的抑制功能。該系統(tǒng)為一種簡單、有效、方便、可靠的用于活細(xì)胞內(nèi)抑制劑藥物評價的熒光 片段互補(bǔ)系統(tǒng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是在于提供了一種基于熒光蛋白iRFP的雙分子熒光片段互補(bǔ)系 統(tǒng)。該系統(tǒng)包括載體piRN97和piRC98,其中piRN97載體為包含有序列SEQ ID N0. 2的 pcDNA3. 1載體，piRC98載體為包含有序列SEQ ID NO. 3的pcDNA3. 1載體。該系統(tǒng)為一種 簡單、有效、方便、可靠的抑制蛋白相互作用的藥物的評價系統(tǒng)。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的在于提供了一種基于熒光蛋白iRFP的雙分子熒光片段互補(bǔ) 系統(tǒng)的應(yīng)用，該系統(tǒng)可以用于蛋白的相互作用，或是用于抑制蛋白相互作用的藥物篩選。
[0008] 本發(fā)明的設(shè)計(jì)思路如下：
[0009] 以來源于細(xì)菌的光敏色素?zé)晒獾鞍譱RFP (其序列為SEQ ID NO. 1所示）為材料，選 取合適的拆分位點(diǎn)，在氨基酸97與98位之間將iRFP拆分為兩段，分別表達(dá)出兩個不發(fā)熒 光的氮端和碳端蛋白片段iRN97和iRC98,當(dāng)這兩個片段分別與一對相互作用的蛋白相融 合并共表達(dá)在同一個細(xì)胞內(nèi)，兩個不發(fā)熒光蛋白片段iRN97和iRC98就可以被相互作用的 蛋白拉近，重新恢復(fù)為蛋白iRFP的完整構(gòu)象而產(chǎn)生熒光；當(dāng)藥物能夠抑制該蛋白-蛋白之 間的相互作用時，iRN97和iRC98則不能被拉近，從而抑制熒光的恢復(fù)。成功構(gòu)建基于iRFP 的雙分子熒光互補(bǔ)系統(tǒng)。由于此雙分子熒光互補(bǔ)系統(tǒng)具有長波長、37度下成熟的優(yōu)點(diǎn)，因 此，可以在正常的生理?xiàng)l件下研究蛋白之間的相互作用，該新系統(tǒng)為一種簡單、有效、方便、 可靠的抑制蛋白相互作用的藥物的評價系統(tǒng)。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：
[0011] -種基于熒光蛋白iRFP的雙分子熒光片段互補(bǔ)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括載體piRN97和 piRC98。
[0012] 所述的piRN97載體為包含有序列SEQ ID NO. 2的pcDNA3. 1載體；piRC98載體為 包含有序列SEQ ID NO. 3的pcDNA3. 1載體。
[0013] 具體的，piRN97載體的制備方法如下：
[0014] 將SEQ ID N0. 2所示的核苷酸序列（本發(fā)明或稱iRN97基因）利用雙酶切位點(diǎn) EcoRV和XhoI，把iRN97基因插入pcDNA3. 1載體的多克隆位點(diǎn)上，即得載體piRN97 (圖1-A)
[0015] 具體的，piRC98載體的制備方法如下：
[0016] 利用雙酶切位點(diǎn)Nhel和Hindlll，將SEQ ID N0. 3所示的核苷酸序列（本發(fā)明或 稱iRC98基因）插入到pcDNA3. 1載體的多克隆位點(diǎn)上，即得piRC98 (圖1-B)。
[0017] -種基于熒光蛋白iRFP的雙分子熒光片段互補(bǔ)系統(tǒng)的應(yīng)用，包括用于研究蛋白 的相互作用，或是用于研究抑制蛋白相互作用的藥物篩選，具體過程如下：
[0018] 一種基于熒光蛋白iRFP的雙分子熒光片段互補(bǔ)系統(tǒng)在研究蛋白的相互作用中的 應(yīng)用：
[0019] 1)合成的bjun的基因序列（由上海生工合成，參照文獻(xiàn)Hu⑶et al.Mol Cell. 2002 ;9:789-98.)，利用雙酶切位點(diǎn)Nhel和Hindlll，把bjun基因插入piRN97載體 的多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建成載體pbJun-iRN97 ;
[0020] 2)合成的bFos的基因序列（由上海生工合成，參照文獻(xiàn)Hu⑶et al.Mol Cell. 2002 ;9:789-98.)，利用雙酶切位點(diǎn)ΚρηΙ和Notl，把bFos基因插入質(zhì)粒piRC98的多 克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建成載體piRC98-bFos ;
[0021] 3)質(zhì)粒pbJun-iRN97和piRC98-bFos共同轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞內(nèi)，37°C培養(yǎng)24小時 后，分別表達(dá)出與bjun和bFos融合表達(dá)的蛋白bJun-iRN97和iRC98-bFos，基于bjun和 bFos的相互作用，可以將兩個蛋白片段iRN97和iRC98拉近，使其恢復(fù)原有的iRFP構(gòu)象，并 能產(chǎn)生紅色熒光。而作為對照，將bFos替換成mbFos的質(zhì)粒pbJun-iRN97和piRC98-mbFos 雖然能表達(dá)出兩個蛋白片段iRN97和iRC98,但不會產(chǎn)生熒光。說明基于piRN97和piRC98 的質(zhì)粒系統(tǒng)可以用于研究蛋白互作。
[0022] -種基于熒光蛋白iRFP的雙分子熒光片段互補(bǔ)系統(tǒng)在抑制蛋白相互作用的藥物 篩選中的應(yīng)用：
[0023] 1)以Hela細(xì)胞的RNA為模板，通過隨機(jī)引物擴(kuò)增出的cDNA為下一步 模板，通過PCR擴(kuò)增獲得宿主細(xì)胞蛋白LEDGF/p75的基因序列，PCR使用的上游 引物：5 ' -CGGCTAGCGCCAC CATGACTCGCGAITTCAAACCTGGAGACC-3 '，下游引物： 5 ' -CCCAAGCTTGTTATCTAGT GTAGAATCCTTCAGAGATAITTCAG-3，，利用雙酶切位點(diǎn) Nhe I 和 Hindlll，把 p75 基因插入 pi RN97 獲得質(zhì)粒 pp75-iRN97 ;
[0024] 2)以質(zhì)粒 pAD8 (Theodore TS et al. AIDS Res Hum Retroviruses. 1996 FeblO ； 12(3) : 191-4.)為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得艾滋病毒整合酶（IN)的基因序列，PCR使用的上 游引物：5' -GGGGTACCGAGCCACCCCCTCCTTITTTGGATGGAATAGAT-3 '，下游引物：5' -AITTGC GGCCGCTTAATCCTCATCCTGTCTACTTGC-3 ^，利用雙酶切位點(diǎn)ΚρηΙ和Notl，把整合酶IN基因插 入 piRC98 獲得質(zhì)粒 piRC98-IN.
[0025] 3)質(zhì)粒pp75-iRN97和piRC98-IN共同轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞內(nèi)，37°C培養(yǎng)24小時后， 分別表達(dá)出融合表達(dá)的蛋白p75-iRN97和iRC98-IN，基于細(xì)胞蛋白p75和整合酶IN的相互 作用，可以將兩個蛋白片段iRN97和iRC98拉近，使其恢復(fù)原有的iRFP構(gòu)象，并能產(chǎn)生紅色 熒光。
[0026] 4)將分別表達(dá)與iRN97和iRC98相融合的蛋白對的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到哺乳動物細(xì)胞，換 液時加入抑制劑藥物，經(jīng)過20-24小時的共孵育，通過測定iRFP的熒光強(qiáng)度，并與對照組相 比較，就可以在活細(xì)胞內(nèi)對抑制劑藥物進(jìn)行可視化評價。
[0027] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點(diǎn)：
[0028] A、含有需共轉(zhuǎn)染的兩個質(zhì)粒piRN97和piRC98,可分別表達(dá)出細(xì)菌來源的熒光蛋 白iRF P的氮端片段iRN97和碳端片段iRC98 ;
[0029] B、含有氨芐霉素抗性基因，可以用于轉(zhuǎn)化有該共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)菌在抗性培養(yǎng)基上 的篩選及培養(yǎng)；
[0030] C、在質(zhì)粒piRN97和piRC98的相應(yīng)多克隆位點(diǎn)上分別插入待研究的相互作用蛋白 對，可實(shí)現(xiàn)待研究相互作用蛋白對相互作用的研究；
[0031] D、將分別表達(dá)與iRN97和iRC98相融合的蛋白對的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到哺乳動物細(xì)胞，換 液時加入抑制劑藥物，經(jīng)過20-24小時的共孵育，通過測定iRFP的熒光強(qiáng)度，并與對照組相 比較，就可以在活細(xì)胞內(nèi)對抑制劑藥物進(jìn)行可視化評價。
[0032] E、該系統(tǒng)用于活細(xì)胞內(nèi)抑制劑藥物評價時，只需共轉(zhuǎn)染兩個質(zhì)粒用于表達(dá)分別與 iRFP氮端片段iRN97和碳端片段iRC98相融合的蛋白對，另加一個作為內(nèi)參的EGFP質(zhì)粒， 即可實(shí)現(xiàn)對待研究的抑制劑藥物進(jìn)行篩選。由于此雙分子熒光互補(bǔ)系統(tǒng)可以在37度下成 熟，所以可以在細(xì)胞正常的生理?xiàng)l件下來研究蛋白間的相互作用。同時，由于基于光敏色素 熒光蛋白i RFP的雙分子熒光互補(bǔ)系統(tǒng)具有長波長的優(yōu)勢，可以很好地在動物活體上研究 蛋白間的相互作用，因此，此評價系統(tǒng)可能應(yīng)用于動物活體上來評價抑制劑藥物。由于iRFP 和EGFP的熒光檢測無需破壞細(xì)胞，可以在熒光顯微鏡下直接檢測，通過測定iRFP的熒光信 號即可簡便地評價抑制劑藥物對蛋白相互作用的抑制效果。
[0033] F、此系統(tǒng)是基于對iRFP在97-98之間拆分而構(gòu)建的熒光互補(bǔ)系統(tǒng)，與通?？紤]的 在iRF P的PAS和GAF域之間進(jìn)行拆分有很大的不同，97-98位點(diǎn)并不位于兩域之間而是存 在于偏離兩域的一個loop環(huán)內(nèi)，所以在最開始選擇拆分位點(diǎn)時很容易被忽略，同時，此位 點(diǎn)的拆分而獲得的熒光互補(bǔ)效率要顯著的高于在兩域之間獲得的互補(bǔ)效率。
【附圖說明】
[0034] 圖1-A為載體piRN97的構(gòu)建示意圖。
[0035] 圖1-B為載體piRC98的構(gòu)建示意圖。
[0036] 圖1-C為不同位點(diǎn)的熒光互補(bǔ)效率的統(tǒng)計(jì)圖。
[0037] 圖2為基于熒光蛋白iRFP的雙分子熒光片段互補(bǔ)系統(tǒng)研究p75與IN相互作用的 突光示意圖。
[0038] 圖3-A為化合物6 (HIV-1 integrase inhibitor 2)驗(yàn)證突光片段互補(bǔ)系統(tǒng)用于 活細(xì)胞內(nèi)抑制劑藥物評價可行性的熒光圖；
[0039] 圖3-B為化合物6 (HIV-1 integrase inhibitor 2)劑量與熒光強(qiáng)度的對應(yīng)關(guān)系 圖。
[0040] 圖4-A為基于iRFP的熒光片段互補(bǔ)系統(tǒng)在活細(xì)胞內(nèi)評價卡比多巴的熒光圖。
[0041] 圖4-B為卡比多巴劑量與熒光強(qiáng)度的對應(yīng)關(guān)系圖。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 本發(fā)明實(shí)施例所述技術(shù)方案，如未特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方案。
[004