專利名稱：土生曲霉的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物技術領域，特別是涉及一種以三七為基質通過發(fā)酵而獲得的具有抗人類血栓形成藥用成份的微生物。
三七是中國的傳統(tǒng)名貴中藥材，與人參有著相似的性質和功效，可以滋補、鎮(zhèn)靜、抗溶血、抗疲勞、抗糖尿病、抗血小板、促進癌細胞轉化、抑制癌細胞成長等，目前，使原植物三七藥用成分的含量得以提高，并改變其原藥用成分的種類，成為較有研究價值的課題。
本發(fā)明的目的是提供一種使三七發(fā)酵，產(chǎn)生抗人類心腦血管疾病或抗腫瘤的發(fā)酵產(chǎn)物的微生物——土生曲霉。
本發(fā)明所述的土生曲霉命名為土生曲霉Aspergillus sp.Ym31966土生曲霉Ym31966，是從我國云南省土壤樣品中分離得到，該菌株已在國家知識產(chǎn)權局專利局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2002年3月27日，保藏單位名稱中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO.M202016。
本發(fā)明所述的土生曲霉的培養(yǎng)基培養(yǎng)特征為下列之一一、PDA培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)7天，菌落直徑28mm，13天38mm。菌落淺咖啡色，扁平疏松粉狀，邊緣稍不整齊，中間凸起，背面黃褐色，有同心環(huán)，有淺黃色素。
二、麥芽汁培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)7天，菌落直徑33mm，13天40mm，菌落淺咖啡色，扁平疏松粉狀，邊緣不齊，中部有放射溝紋，背面褐色。
三、察貝克培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)7天，菌落直徑23mm，13天37mm。菌落淺淺黃帶肉紅色，粉狀，中間絨狀，稍緊密，邊緣不齊，有黃色水珠，背面橘紅色，稍有溝紋。
形態(tài)特征一、無性世代，菌絲無色有隔膜，孢子梗從壁厚而膨大的的足細胞垂直生出，光滑無色；頂囊半球形，頂部2/3密生小梗；小梗雙層；分生孢子穗圓筒形，肉桂色；分生孢子球形光滑，孢子直徑1.8微米。
二、有性世代，未發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明所述的土生曲霉的發(fā)酵培養(yǎng)特征為一、培養(yǎng)基三七粉50％，鮮豆渣50％，按重量比計。
二、培養(yǎng)溫度28℃±2℃。
三、發(fā)酵時間12天。
四、發(fā)酵培養(yǎng)特征培養(yǎng)第1天，有零星的白菌絲點生長。培養(yǎng)第2天，長滿白色菌絲，菌絲短，發(fā)酵物結塊。培養(yǎng)第3天，有土紅色孢子生長，發(fā)酵物致密呈土黃色。培養(yǎng)第4天，有大量土紅色孢子生長。發(fā)酵物緊密呈土黃色。培養(yǎng)第5天，發(fā)酵物同第5天。培養(yǎng)第7天，發(fā)酵物表面長滿土紅色孢子，發(fā)酵物上四分之三部分呈土色，下四分之一部分呈土黃色。培養(yǎng)第8天，發(fā)酵物表面長滿粉粉的土紅色孢子，發(fā)酵物上五分之四左右部分呈土色，下五分之一左右部分呈土黃色。培養(yǎng)第9天，發(fā)酵物呈土紅色，表面長滿孢子，發(fā)酵物致密。培養(yǎng)第10天，發(fā)酵物上部分呈米糠色，下部分呈黃綠色，發(fā)酵物致密，表面長滿糠麩色孢子。培養(yǎng)第11天，發(fā)酵物同第10天。培養(yǎng)第12天，發(fā)酵物表面長滿糠麩色孢子。發(fā)酵物致密，上部分呈糠麩色，靠近瓶底部分呈黃綠色。
本發(fā)明所述的土生曲霉，經(jīng)發(fā)酵原植物三七成分中的三七總皂甙含量平均提高20％；其工藝步驟為菌種→一級種子培養(yǎng)→二級種子培養(yǎng)→發(fā)酵→培養(yǎng)烘干→三七發(fā)酵物→提取→總皂甙。本工藝適合于半知菌類的其它絲狀真菌類微生物。
其中，發(fā)酵原料為有數(shù)或無數(shù)頭三七中藥材，發(fā)酵方式為固體發(fā)酵；一級種子培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基(固體PDA)，二級種子培養(yǎng)為馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(液體PDA)。馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)的制備取新鮮馬鈴薯200克，去皮切成小塊，加水1升煮沸30分鐘，過濾棄馬鈴薯，濾液加水補足一升，加入葡萄糖20克，PH自然。上述馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中加入瓊脂15克，即為固體PDA培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵的培養(yǎng)基為80-100目三七粉50％，新鮮黃豆渣50％，水份65％，PH自然。培養(yǎng)時間菌種活化培養(yǎng)96小時，一級種子靜止培養(yǎng)時間96小時，二級種子搖床培養(yǎng)時間96小時，發(fā)酵培養(yǎng)時間12天。培養(yǎng)溫度一級種子培養(yǎng)溫度28℃±1℃，二級種子搖床培養(yǎng)溫度28℃±2℃，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為28℃±2℃。烘干發(fā)酵完畢，發(fā)酵產(chǎn)物置60℃下烘干，備用。
本發(fā)明所述的土生曲霉，其顯著的有益效果在于發(fā)酵能使原三七皂甙元Rc、Re(人參二醇型)及nR1~6、Rb2、3、Rg2(人參三醇型)等組分降低或消失，發(fā)酵三七產(chǎn)物總甙含量為92.5％，三七發(fā)酵產(chǎn)物總甙主要組分由Rg1、Rd和Rb1三種皂甙元構成，其中，原人參二醇型皂甙元Rb1含量占總成分的25％；原人參三醇型皂甙元Rg1含量為35％；Rd含量15％左右，三組分(Rg1、Rb1、Rd)含量總和75％。皂甙元Rg1、Rd和Rb1的化學結構與三七原植物皂甙組分相同。
本發(fā)明所述的土生曲霉，已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏單位地址中國.武漢.武漢大學，分類命名Aspergillus sp.Ym31966土生曲霉Ym31966。


圖1為本發(fā)明所述的土生曲霉PDA培養(yǎng)基菌落形態(tài)圖。
圖2為本發(fā)明所述的土生曲霉分生孢子穗顯微圖。
圖3為本發(fā)明所述的土生曲霉分生孢子及菌絲顯微圖。
實施例取土生曲霉Aspergillus sp.Ym3 1966土生曲霉Ym31966，Aspergillus terreusThom在無菌條件下(無菌室或超凈工作臺)，用接種針挑取少許菌種，轉接于已滅菌的固體PDA培養(yǎng)基試管(15×150mm)中，置培養(yǎng)箱內(nèi)28℃±1℃活化培養(yǎng)96小時。取出活化96小時的菌種，在無菌條件下，以同樣方式接入活化好的菌種到已滅菌的一組種子固體PDA培養(yǎng)基中，在28℃±1℃下培養(yǎng)96小時，即為YM31966一級種子。
采用500毫升玻璃三角瓶，裝入配制好的液體PDA培養(yǎng)基100毫升，15磅滅菌30分鐘后，取YM31966一級種子，在無菌條件下，接種于裝有100毫升液體PDA培養(yǎng)基500毫升玻璃三角瓶中，一級種子接種量為每支斜面接三個三角瓶，置28℃±2℃搖床培養(yǎng)96小時后，作為三七發(fā)酵二級種子用。
根據(jù)發(fā)酵規(guī)模大小，發(fā)酵料按重量比率，稱取50％三七粉，加入50％的新鮮黃豆渣，充分，發(fā)酵料水分不低于65％，三七發(fā)酵料配制好后，裝入500毫升罐頭瓶中，塑料薄膜、牛皮紙封口，置滅菌鍋內(nèi)15磅滅菌60分鐘后，取出待冷卻至30℃，接入液體二級種子，二級種子接用量為5％(V/W)。搖勻后放置后28℃±2℃下，靜止發(fā)酵12天。在發(fā)酵期間，注意發(fā)酵室保濕不低于80％相對濕度，第2天分別進行搖瓶一次，并注意檢查有無染菌現(xiàn)象。發(fā)酵完畢，發(fā)酵產(chǎn)物置60℃下烘干，得到三七發(fā)酵產(chǎn)物。
本發(fā)明所述的土生曲霉生物學特征表現(xiàn)為18rRNA基因組由1729個堿基組成TTTGACCAAC TTTCCGGCTC TGGGGGGTCG TTGCCAACCC CCTGGAGCCA GTCCGAAGGCCTCACCGAGC CATTCAATCG GTAGTAGCGA CGGGCGGTGT GTACAAAGGG CAGGGACGTAATCGGCACGA GCTGATGACT CGTGCCTACT AGGCATTCCT CGTTGAAGAG CAATAATTGCAATGCTCTAT CCCCAGCACG ACAGGGTTTA ACAAGATTAC CCAGACCTCT CGGCCAAGGTGATGTACTCG CTGGCCCTGT CAGTGTAGCG CGCGTGCGGC CCAGAACATC TAAGGCCATCACAGACCTGT TATTGCCGCG CACTTCCATC GGCTTGAGCC GATAGTCCCC CTAAGAAGCCAGCGGCCCGC AAATGCGGAC CGGGCTATTT AAGGGCCGAG GTCTCGTTCG TTATCGCAATTAAGCAGACA AATCACTCCA CCAACTAAGA ACGGCCATGC ACCACCATCC AAAAGATCAAGAAAGAGCTC TCAATCTGTC AATCCTTATT TTGTCTGGAC CTGGTGAGTT TCCCCGTGTTGAGTCAAATT AAGCCGCAGG CTCCACGCCT TGTGGTGCCC TTCCGTCAAT TTCTTTAAGTTTCAGCCTTG CGACCATACT CCCCCCAGAA CCCAAAAACT TTGATTTCTC GTAAGGTGCCGAGCGGGTCA TCATAGAAAC ACCGCCCGAT CCCTAGTCGG CATAGTTTAT GGTTAAGACTACGACGGTAT CTGATCGTCT TCGATCCCCT AACTTTCGTT CCCTGATTAA TGAAAACATCCTTGGCGAAT GCTTTCGCAG TAGTTAGTCT TCAGCAAATC CAAGAATTTC ACCTCTGACAGCTGAATACT GACGCCCCCG ACTATCCCTA TTAATCATTA CGGCGGTCCT AGAAACCAACAAAATAGAAC CGCACGTCCT ATTCTATTAT TCCATGCTAA TGTATTCGAG CAAAGGCCTGCTTTGAACAC TCTAATTTTT TCACAGTAAA AGTCCTGGTT CCCCCCACAG CCAGTGAAGGCCATGGGATT CCCCAGAAGG AAAGGTCCAG CCGGACCAGT ACTCGCGGTG AGGCGGACCGGCCAGCCAGA CCCAAGGTTC AACTACGAGC TTTTTAACTG CAACAACTTT AATATACGCTATTGGAGCTG GAATTACCGC GGCTGCTGGC ACCAGACTTG CCCTCCAATT GTTCCTCGTTAAGGGATTTA GATTGTACTC ATTCCAATTA CGAGACCCGA AAGAGCCCCG TATCAGTATTTATTGTCACT ACCTCCCCGT GTCGGGATTG GGTAATTTGC GCGCCTGCTG CCTTCCTTGGATGTGGTAGC CGTTTCTCAG GCTCCCTCTC CGGAATCGAA CCCTAATTCC CCGTTACCCGTTGCCACCAT GGTAGGCCAC TATCCTACCA TCGAAAGTTG ATAGGGCAGA AATTTGAATGAACCATCGCC GGCGCAAGGC CATGCGATTC GTTAAGTTAT TATGAATCAC CAAGGAGCCCCGAAGGGCAT TGGTTTTTTA TCTAATAAAT ACACCCCTTC CGAAGTCGGG GTTTTTAGCATGTATTAGCT CTAGAATTAC CACAGGTATC CATGTAGTAA GGTACTATCA AATAAACGATAACTGATTTA ATGAGCCATT CGCAGTTTCA CAGTATAAAG TGCTTATACT TAGACATGCATGGCTTAATC TTTGAGACAA GCATATGACT ACTGGCAGAA TCAACCAGA
權利要求
1.一種土生曲霉，其特征在于命名為土生曲霉Aspergillus sp.Ym31966土生曲霉Ym31966，該菌株已在國家知識產(chǎn)權局專利局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2002年3月27日，保藏單位名稱中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO.M202016。
2.根據(jù)權利要求1所述的土生曲霉，其特征在于其18rRNA基因組由1729個堿基組成TTTGACCAAC TTTCCGGCTC TGGGGGGTCG TTGCCAACCC CCTGGAGCCA GTCCGAAGGCCTCACCGAGC CATTCAATCG GTAGTAGCGA CGGGCGGTGT GTACAAAGGG CAGGGACGTAATCGGCACGA GCTGATGACT CGTGCCTACT AGGCATTCCT CGTTGAAGAG CAATAATTGCAATGCTCTAT CCCCAGCACG ACAGGGTTTA ACAAGATTAC CCAGACCTCT CGGCCAAGGTGATGTACTCG CTGGCCCTGT CAGTGTAGCG CGCGTGCGGC CCAGAACATC TAAGGGCATCACAGACCTGT TATTGCCGCG CACTTCCATC GGCTTGAGCC GATAGTCCCC CTAAGAAGCCAGCGGCCCGC AAATGCGGAC CGGGCTATTT AAGGGCCGAG GTCTCGTTCG TTATCGCAATTAAGCAGACA AATCACTCCA CCAACTAAGA ACGGCCATGC ACCACCATCC AAAAGATCAAGAAAGAGCTC TCAATCTGTC AATCCTTATT TTGTCTGGAC CTGGTGAGTT TCCCCGTGTTGAGTCAAATT AAGCCGCAGG CTCCACGCCT TGTGGTGCCC TTCCGTCAAT TTCTTTAAGTTTCAGCCTTG CGACCATACT CCCCCCAGAA CCCAAAAACT TTGATTTCTC GTAAGGTGCCGAGCGGGTCA TCATAGAAAC ACCGCCCGAT CCCTAGTCGG CATAGTTTAT GGTTAAGACTACGACGGTAT CTGATCGTCT TCGATCCCCT AACTTTCGTT CCCTGATTAA TGAAAACATCCTTGGCGAAT GCTTTCGCAG TAGTTAGTCT TCAGCAAATC CAAGAATTTC ACCTCTGACAGCTGAATACT GACGCCCCCG ACTATCCCTA TTAATCATTA CGGCGGTCCT AGAAACCAACAAAATAGAAC CGCACGTCCT ATTCTATTAT TCCATGCTAA TGTATTCGAG CAAAGGCCTGCTTTGAACAC TCTAATTTTT TCACAGTAAA AGTCCTGGTT CCCCCCACAG CCAGTGAAGGCCATGGGATT CCCCAGAAGG AAAGGTCCAG CCGGACCAGT ACTCGCGGTG AGGCGGACCGGCCAGCCAGA CCCAAGGTTC AACTACGAGC TTTTTAACTG CAACAACTTT AATATACGCTATTGGAGCTG GAATTACCGC GGCTGCTGGC ACCAGACTTG CCCTCCAATT GTTCCTCGTTAAGGGATTTA GATTGTACTC ATTCCAATTA CGAGACCCGA AAGAGCCCCG TATCAGTATTTATTGTCACT ACCTCCCCGT GTCGGGATTG GGTAATTTGC GCGCCTGCTG CCTTCCTTGGATGTGGTAGC CGTTTCTCAG GCTCCCTCTC CGGAATCGAA CCCTAATTCC CCGTTACCCGTTGCCACCAT GGTAGGCCAC TATCCTACCA TCGAAAGTTG ATAGGGCAGA AATTTGAATGAACCATCGCC GGCGCAAGGC CATGCGATTC GTTAAGTTAT TATGAATCAC CAAGGAGCCCCGAAGGGCAT TGGTTTTTTA TCTAATAAAT ACACCCCTTC CGAAGTCGGG GTTTTTAGCATGTATTAGCT CTAGAATTAC CACAGGTATC CATGTAGTAA GGTACTATCA AATAAACGATAACTGATTTA ATGAGCCATT CGCAGTTTCA CAGTATAAAG TGCTTATACT TAGACATGCATGGCTTAATC TTTGAGACAA GCATATGACT ACTGGCAGAA TCAACCAGA
3.根據(jù)權利要求1所述的土生曲霉，其特征在于培養(yǎng)基培養(yǎng)特征為PDA培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)7天，菌落直徑28mm，13天38mm。菌落淺咖啡色，扁平疏松粉狀，邊緣稍不整齊，中間凸起，背面黃褐色，有同心環(huán)，有淺黃色素。
4.根據(jù)權利要求1所述的土生曲霉，其培養(yǎng)基培養(yǎng)特征在于麥芽汁培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)7天，菌落直徑33mm，13天40mm，菌落淺咖啡色，扁平疏松粉狀，邊緣不齊，中部有放射溝紋，背面褐色。
5.根據(jù)權利要求1所述的土生曲霉，其培養(yǎng)基培養(yǎng)特征在于察貝克培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)7天，菌落直徑23mm，13天37mm。菌落淺淺黃帶肉紅色，粉狀，中間絨狀，稍緊密，邊緣不齊，有黃色水珠，背面橘紅色，稍有溝紋。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物技術領域，特別是涉及一種以三七為基質通過發(fā)酵而獲得的具有抗人類心腦血管疾病或抗腫瘤藥用成份的微生物。所述的土生曲霉命名為土生曲霉Aspergillussp.Ym31966土生曲霉Ym31966，是從我國云南省土壤樣品中分離得到，該菌株已在國家知識產(chǎn)權局專利局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2002年3月27日，保藏單位名稱中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO.M202016。其顯著的有益效果在于能使三七藥用成分的含量得以提高，并改變其原藥用成分的種類。
文檔編號C12N1/14GK1454988SQ03103059
公開日2003年11月12日 申請日期2003年1月22日 優(yōu)先權日2002年4月30日
發(fā)明者陳有為, 李紹蘭, 李治瀅, 楊麗源, 周斌, 張琦 申請人:云南省微生物研究所