專利名稱：海綿共附生土曲霉及制備(+)-terrein的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種綿共附生土曲霉及制備(+)-terrein的用途。
背景技術(shù)：
土曲霉已被廣泛應(yīng)用于降脂藥物洛伐他汀以及化工原料衣康酸的生產(chǎn)，但尚未被用于(+)_terrein的生產(chǎn)。(+)_terrein是一種環(huán)戍烯酮類化合物，結(jié)構(gòu)如圖I所示，最初即從土曲霉發(fā)酵液中分離得到，近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)(+hterrein的活性十分多樣，不僅具有抗細(xì)菌、真菌、雜草的活性，還可以抑制腫瘤細(xì)胞血管新生素的分泌，抑制黑色素合成，抑制皮膚角質(zhì)增生，抑制牙髓細(xì)胞炎癥反應(yīng)，促進(jìn)成骨細(xì)胞與鈦支架融合等。可以預(yù)見(jiàn)(+)-terrein將來(lái)在醫(yī)療、美容、農(nóng)業(yè)等眾多領(lǐng)域會(huì)有良好的應(yīng)用前景。
化學(xué)合成制備(+)_terrein的技術(shù)往往有總產(chǎn)率不高，且需要采用高溫高壓等極端反應(yīng)條件，需要昂貴的反應(yīng)試劑，或是終產(chǎn)物不具備立體結(jié)構(gòu)的選擇性。而目前采用微生物發(fā)酵制備(+)-terrein的產(chǎn)量又十分有限，少則數(shù)百μ g/L(Phattanawasin P, etal. Weed growth inhibitors from Aspergillus fischeri TISTR 3272. Natural ProductResearch 2007 ;21 :1286-1291)，多則數(shù)百mg/L(M. Demasi，et al. Studies on (+) -terreinas a New Class of Proteasome Inhibitors.Journal of the Brazilian ChemicalSociety 2010 ；21 :229-305)，而未能達(dá)到具備生產(chǎn)價(jià)值的g/L量級(jí)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種海綿共附生土曲霉及制備(+)-terrein的用途。本發(fā)明的海綿共附生土曲霉分離自中國(guó)南海永興島Phakellia fusca海綿,其(+)_terrein產(chǎn)量相較于現(xiàn)有其他菌株有較大提高，可達(dá)到3. 71g/L。本發(fā)明是通過(guò)以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的海綿共附生土曲霉菌株為土曲霉(Aspergillus terreus)PF26已經(jīng)于2011年8月31日遞交中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC NO. 5208。該微生物經(jīng)分子生物學(xué)18S及ITS rDNA基因序列分析，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，確定其分類學(xué)地位屬于曲霉屬(Aspergillus)的土曲霉(Aspergillus terreus),菌株編號(hào)為PF26。所述的18S rDNA基因序列已提交GenBank,序列號(hào)為JN831364,最相似序列為土曲霉序列⑶227345，最大相似度為99%，以18S rDNA基因序列同源性為基礎(chǔ)構(gòu)建形成包括菌株P(guān)F26在內(nèi)的相關(guān)真菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖2所不。所述的ITS rDNA基因序列已提交GenBank,序列號(hào)為JN831365,最相似序列為土曲霉序列JN194186，最大相似度為100%，以ITS rDNA基因序列同源性為基礎(chǔ)構(gòu)建形成包括菌株P(guān)F26在內(nèi)的相關(guān)真菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖3所不。
18S rDNA基因與ITS rDNA基因的鑒定結(jié)果吻合，最相似序列均為土曲霉序列，且在兩個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上PF26的序列也均與土曲霉序列聚類在一起，因此通過(guò)分子生物學(xué)的鑒定可以說(shuō)明PF26是一株土曲霉。本發(fā)明還涉及上述的海綿共附生土曲霉菌株在制備化合物(+)-terrein中的用途。優(yōu)選的，所述制備包括將海綿共附生土曲霉菌株進(jìn)行發(fā)酵的步驟。優(yōu)選的，所述發(fā)酵具體為將發(fā)酵培養(yǎng)基于115°C滅菌30min ;將土曲霉PF26的孢子接入滅菌后的所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為4 X IO6個(gè)孢子/mL，于28°C，ISOrpm的搖床培養(yǎng)24天。優(yōu)選的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配置方法包括如下步驟取葡萄糖28.41g、麥芽糖23. 18g、甘露醇20. 00g、麥芽提取物8. 52g、谷氨酸鈉10. 00g、氯化銨10. 00g，之后溶于IL 人工海水中，即得所述發(fā)酵培養(yǎng)基。優(yōu)選的，所述人工海水的配置方法包括如下步驟將26. 518g氯化鈉、2. 447g氯化鎂、3. 305g硫酸鎂、I. 141g氯化鈣、0. 725g氯化鉀、0. 202g碳酸氫鈉以及O. 083g溴化鈉溶解于IL蒸餾水中，即得，所述配制好的人工海水的pH值為7. O 7. 2。本發(fā)明具有的有益效果為本發(fā)明提供了海綿共附生土曲霉(Aspergillusterreus)PF26CGMCC NO. 5208 ;其用于化合物(+)-terrein 的生產(chǎn)時(shí)，(+)-terrein 的產(chǎn)量相較于現(xiàn)有其他菌株有較大提高，可達(dá)到3. 71g/L。


圖I 為(+)-terrein 的結(jié)構(gòu)圖；圖2為土曲霉PF26與相關(guān)真菌18S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖；圖3為土曲霉PF26與相關(guān)真菌ITS rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖；圖4為土曲霉PF26分生孢子絲的400倍放大光鏡照片；圖5為土曲霉PF26分生孢子頭的掃描電鏡照片。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook 等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例本實(shí)施例是采用土曲霉(Aspergillusterreus)PF26CGMCC NO. 5208 制備化合物(+)-terrein,包括如下步驟I、取海綿共附生土曲霉菌株為土曲霉(Aspergillus terreus)PF26CGMCCNO. 5208所述土曲霉PF26的形態(tài)學(xué)特征如下(a)在人工海水察氏培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)時(shí)，菌落平坦，質(zhì)地致密，菌落黃色與淺褐色相間，菌落周圍可產(chǎn)生黃色水溶性色素，生長(zhǎng)較為緩慢，培養(yǎng)4天菌落直徑達(dá)到2. 9cm, 7天可達(dá)6. Ocm ；(b)在人工海水PDA培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)時(shí)，菌落平坦，質(zhì)地致密，菌落褐色，分生孢子更多，菌落周圍可產(chǎn)生黃色水溶性色素，生長(zhǎng)較快，培養(yǎng)4天菌落直徑達(dá)到5. 7cm, 7天可布滿平板；(C)該菌株的顯微特征在于菌絲有隔，分生孢子頭的頂囊半球形，小梗雙層，第一層短，第二層長(zhǎng)，呈放射狀排列，分布頂囊表面2/3，頂端有鏈形孢子，如圖4、5所示；(d) 土曲霉PF26的發(fā)酵特征在于該菌株在含有葡萄糖28. 41g、麥芽糖23. 18g、甘露醇20. 00g、麥芽提取物8. 52g、谷氨酸鈉10. 00g、氯化銨10. OOg及IL人工海水的發(fā)酵培養(yǎng)基中，可以產(chǎn)生單一結(jié)構(gòu)的(+)-terrein，當(dāng)接種量為4X IO6個(gè)孢子/mL，在28°C，180rpm的搖床培養(yǎng)24天，(+)-terrein的產(chǎn)量可以達(dá)到3. 71g/L。前述中的人工海水，其配置方法包括如下步驟將26. 518g氯化鈉、2. 447g氯化鎂、3. 305g硫酸鎂、I. 141g氯化鈣、O. 725g氯化鉀、O. 202g碳酸氫鈉以及O. 083g溴化鈉溶 解于IL蒸餾水中，即得，所述配制好的人工海水的pH值為7. O 7. 2。2、制備發(fā)酵培養(yǎng)基所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配置方法包括如下步驟取葡萄糖28. 41g、麥芽糖23. 18g、甘露醇20. 00g、麥芽提取物8. 52g、谷氨酸鈉10. 00g、氯化銨10. OOg,之后溶于IL人工海水中，即得所述發(fā)酵培養(yǎng)基；3、發(fā)酵制備化合物(+)-terrein培養(yǎng)基在250mL三角瓶中裝液量為IOOmL,于115°C滅菌30min ;將土曲霉PF26的孢子接入滅菌后的培養(yǎng)基，使接種量為4X IO6個(gè)孢子/mL，在28°C、180rpm的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，pH自然；培養(yǎng)24天，發(fā)酵液上清中的(+)-terrein產(chǎn)量可以達(dá)到3. 71g/L。培養(yǎng)結(jié)束后將發(fā)酵液抽濾，分離上清與菌體。上清用等體積乙酸乙酯萃取3輪，減壓蒸餾回收乙酸乙酯后，得到乙酸乙酯提取物。該提取物經(jīng)ODS柱水甲醇=7 3(v/v)洗脫及反相HPLC純化制備得到純化的主發(fā)酵產(chǎn)物。該主發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)譜測(cè)定分子量為154. 1，其核磁數(shù)據(jù)如表I所示，其0. 1%和1%(w/v)的水溶液的比旋光值分別為[a ]D =+168° (c = 0. 1,H20)和[a ]D =+163。(c =I，H2O)，與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對(duì)，可以確定該主發(fā)酵產(chǎn)物為(+)-terrein。表I.發(fā)酵產(chǎn)物的核磁數(shù)據(jù)(400MHz，DMS0_d6)
權(quán)利要求
1.一種海綿共附生土曲霉菌株，其特征在于，所述海綿共附生土曲霉菌株為土曲霉(Aspergillus terreus)PF26CGMCC NO. 5208。
2.一種海綿共附生土曲霉菌株在制備化合物(+hterrein中的用途。
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述制備包括將海綿共附生土曲霉菌株進(jìn)行發(fā)酵的步驟。
4.如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述發(fā)酵包括如下步驟將發(fā)酵培養(yǎng)基于115°C滅菌30min ;將土曲霉PF26的孢子接入滅菌后的所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為4 X IO6個(gè)孢子/mL，于28°C，180rpm的搖床培養(yǎng)24天。
5.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配置方法包括如下步驟取葡萄糖28. 41g、麥芽糖23. 18g、甘露醇20. 00g、麥芽提取物8. 52g、谷氨酸鈉10. 00g、氯化銨10. 00g，之后溶于IL人工海水中，即得所述發(fā)酵培養(yǎng)基。
6.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述人工海水的配置方法包括如下步驟將26. 518g氯化鈉、2. 447g氯化鎂、3. 305g硫酸鎂、I. 141g氯化鈣、0. 725g氯化鉀、0. 202g碳酸氫鈉以及0. 083g溴化鈉溶解于IL蒸餾水中，即得，所述配制好的人工海水的pH值為.7.O 7. 2。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種海綿共附生土曲霉及制備(+)-terrein的用途。所述海綿共附生土曲霉菌株為土曲霉(Aspergillus terreus)PF26CGMCC NO.5208。所述海綿共附生土曲霉菌株用于制備化合物(+)-terrein時(shí)包括將海綿共附生土曲霉菌株進(jìn)行發(fā)酵的步驟，具體為將發(fā)酵培養(yǎng)基于115℃滅菌30min；將土曲霉PF26的孢子接入滅菌后的所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為4×106個(gè)孢子/mL，于28℃，180rpm的搖床培養(yǎng)24天。本發(fā)明的海綿共附生土曲霉分離自中國(guó)南海永興島Phakellia fusca海綿，其(+)-terrein產(chǎn)量相較于現(xiàn)有其他菌株有較大提高，可達(dá)到3.71g/L。
文檔編號(hào)C12R1/66GK102827777SQ20121000794
公開(kāi)日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月11日
發(fā)明者殷穎, 李志勇, 張風(fēng)麗, 孫偉, 余智生, 丁博 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)