專利名稱：鱖魚傳染性脾腎壞死病毒基因診斷試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害的診斷試劑盒及檢測方法，主要是針對鱖魚傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV，Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus)基因診斷的試劑盒及檢測方法。
早期快速診斷鱖魚傳染性脾腎壞死病毒是目前鱖魚養(yǎng)殖的主要預(yù)防措施和減少鱖魚損失的有效途徑，因此，簡便快速、特異性好又靈敏度高的診斷試劑盒及其檢測方法是廣大水產(chǎn)養(yǎng)殖者急切盼望的。
多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，簡稱PCR技術(shù))，是近年來發(fā)展起來的一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)，由于具有快速、敏感、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，所以這種方法建立后，很快被應(yīng)用于實(shí)踐中。
本發(fā)明的鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的基因診斷試劑盒由下列部件構(gòu)成1).樣品稀釋液A液，2管，內(nèi)裝磷酸緩沖液(1×PBS)，pH7.4；2).模板抽提液B液，1管，內(nèi)裝酚/氯仿/異戊醇，比例為25∶24∶1；3).C液，1管，內(nèi)裝5M NaCL；4).D液，1管，內(nèi)裝無水乙醇；5).E液，1管，內(nèi)裝70％乙醇；6).F液，1管，內(nèi)裝滅菌雙蒸水；7).PCR反應(yīng)液G液，1管，內(nèi)裝PCR一擴(kuò)反應(yīng)液，包括ddH2O、10×Buffer(含mg2+)、dNTP、外引物F1、外引物R1和TaqE；8).PCR反應(yīng)液H液，1管，內(nèi)裝PCR二擴(kuò)反應(yīng)液，包括ddH2O、10×Buffer(含mg2+)、dNTP、內(nèi)引物F2、內(nèi)引物R2和TaqE；9).陽性對照I液，1管，內(nèi)裝ISKNV陽性DNA；10).盒子；11).一塊泡沫板，其大小與上述盒子的底面相同，裝于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管數(shù)量的小孔，上述各小管分別對應(yīng)放置于這些小孔中。
上述ISKNV基因診斷試劑盒中所述的內(nèi)外兩對引物是根據(jù)ISKNV基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)的，其DNA序列分別如下F15’-AGA CCC ACT TGT ACG GCGR15’-CCC ATG TCC AAC GTA TAG CF25’-CGT GAG ACC GTG CGT AGTR25’-AGG GTG ACG GTC GAT ATG用本發(fā)明上述試劑盒檢測鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的方法，按下列步驟進(jìn)行1).取樣品，加入樣品稀釋液A液稀釋10～20倍，于勻漿器中冰浴勻漿；2).4000～6000r/min離心10～15min；3).取上清600μl用模板抽提液B液抽提，上下顛倒幾次混勻；4).10000～12000r/min離心10～15min；5).取500ul上清加入20μlC液，再加入1mlD液，于-20℃沉淀1小時(shí)；6).10000～12000r/min離心10～15min；7).棄上清，加E液沖洗，10000～12000r/min離心5～10min，沖洗兩次；8).棄上清，自然干燥或在超凈工作臺(tái)上吹干；9).加20～30μlF液重懸溶解作為模板；10).分別取模板和I液2μl，加入到PCR反應(yīng)液(G液)中，混勻后離心數(shù)秒，置于PCR上；11).按下列條件擴(kuò)增95℃2min預(yù)變性，→94℃30sec 30個(gè)循環(huán)→72℃10min→4℃保存55℃30sec72℃1min12).分別取一擴(kuò)反應(yīng)液，加入到PCR反應(yīng)液H液中，混勻后離心數(shù)秒，置于PCR上。按上述條件擴(kuò)增；13).一擴(kuò)反應(yīng)結(jié)束后取5～10μl加4μl溴酚藍(lán)混勻，經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳20～30分鐘(5V/cm)后于紫外儀上觀察。若在1080bp處出現(xiàn)明亮的反應(yīng)條帶(與陽性對照在同一位置)，則為ISKNV陽性，說明待測樣品攜帶傳染性脾腎壞死病毒，若無反應(yīng)條帶顯示則進(jìn)行PCR二擴(kuò)反應(yīng)。二擴(kuò)反應(yīng)結(jié)束后取5～10μl加4μl溴酚藍(lán)混勻，經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳20～30分鐘(5V/cm)后于紫外儀上觀察。若在562bp處出現(xiàn)明亮的反應(yīng)條帶(與陽性對照在同一位置)，則為ISKNV陽性，說明待測樣品攜帶傳染性脾腎壞死病毒，否則為陰性。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的基因診斷試劑盒及檢測方法，是以根據(jù)ISKNV基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)的兩對引物為主體而設(shè)計(jì)的。利用該兩對引物，可以特異性地?cái)U(kuò)增攜帶ISKNV病毒的待測樣品的有關(guān)基因片段，所建立的優(yōu)化的套式PCR反應(yīng)體系保證檢測結(jié)果的快速性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。因此使用本發(fā)明的試劑盒及檢測方法，可以簡便、快速、靈敏而特異地檢測感染ISKNV的鱖魚，大大高于傳統(tǒng)和常規(guī)的生物學(xué)方法，可運(yùn)用于鱖魚各時(shí)期養(yǎng)殖過程中的病毒跟蹤檢測，也可用于環(huán)境監(jiān)測，避免病毒傳播流行，提高科學(xué)管理效率，具有很高的實(shí)用價(jià)值。
實(shí)施例1鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的基因診斷試劑盒該試劑盒由下列部件構(gòu)成(10樣份)1.釋液(A液)，2管，5ml/管，內(nèi)裝磷酸緩沖液(1×PBS)，pH7.4。2.模板抽提液(B液)，自備或配制，酚/氯仿/異戊醇，比例為25∶24∶1。3.C液，1管，200μl/管，內(nèi)裝5M NaCL。4.D液，自備，1ml/份×10份，10ml，主要為無水乙醇。5.E液，自備，主要為70％乙醇。6.F液，1管，30μl/份×10份，300μl/管，內(nèi)裝滅菌雙蒸水。7.PCR反應(yīng)液(G液)，1管，25μl/份×10份，250μl/管，內(nèi)裝PCR一擴(kuò)反應(yīng)液(25μl體系)，包括ddH2O、10×Buffer(含mg2+)、dNTP、外引物F1、外引物R1和TaqE。8.PCR反應(yīng)液(H液)，1管，25μl/份×10份，250μl/管，內(nèi)裝PCR二擴(kuò)反應(yīng)液(25μl體系)，包括ddH2O、10×Buffer(含mg2+)、dNTP、內(nèi)引物F2、內(nèi)引物R2和TaqE。9.陽性對照(I液)，1管，20μl/管，內(nèi)裝ISKNV陽性DNA。10.長方體盒子，8.5×5.8×6.2cm3。11.一塊泡沫板，其大小與長方體盒子的底面相同，高2.2cm，有四排孔，第一排四個(gè)孔，孔徑1.3cm，第二排五個(gè)孔，孔徑1.0cm，第三、四排分別六個(gè)孔，孔徑0.6cm。上述各小管分別對應(yīng)放置于泡沫板的孔內(nèi)，裝于長方體盒子中。
該試劑盒中的內(nèi)外兩對引物的DNA序列如下F15’-AGA CCC ACT TGT ACG GCGR1. 5’-CCC ATG TCC AAC GTA TAG CF25’-CGT GAG ACC GTG CGT AGTR25’-AGG GTG ACG GTC GAT ATG該試劑盒中的I液為陽性對照液，包含ISKNV病毒的DNA質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)。具體操作是在PCR反應(yīng)后，用試劑盒回收相關(guān)片段，然后酶切，通過載體連接到質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli，經(jīng)氨芐培養(yǎng)基平板擴(kuò)大培養(yǎng)，挑取陽性克隆，進(jìn)一步酶切檢查驗(yàn)證，測定質(zhì)粒DNA的濃度，稀釋到106比例即為陽性對照標(biāo)準(zhǔn)。
PCR一擴(kuò)反應(yīng)液體系(25μl體系)如下ddH2O20μl10×Buffer(含mg2+) 2.5μldNTP 0.4μl外引物F1 0.4μl外引物R1 0.4μlTaqE 0.3μlPCR二擴(kuò)反應(yīng)液體系(25μl體系)如下ddH2O20μl10×Buffer(含mg2+) 2.5μldNTP 0.4μl內(nèi)引物F2 0.4μl內(nèi)引物R2 0.4μlTaqE 0.3μl實(shí)施例2鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的檢測方法使用實(shí)施例1的試劑盒，按下列步驟進(jìn)行1.樣品0.1g，加入樣品稀釋液(A液)1ml稀釋10倍，于勻漿器中冰浴勻漿。2.4000r/min離心10min。3.取上清600μl/用模板抽提液(B液)抽提，上下顛倒幾次混勻。4.12000r/min離心10min。5.取500ul上清加入20μl/C液，再加入1mlD液，于-20℃沉淀1小時(shí)。6.12000r/min離心10min。7.棄上清，加E液沖洗，12000r/min離心5min，沖洗兩次。8.棄上清，自然干燥或在超凈工作臺(tái)上吹干。9.加20～30μlF液重懸溶解作為模板。10.分別取模板和I液2μl，加入到PCR反應(yīng)液(G液)中，混勻后離心數(shù)秒，置于PCR上。11.按下列條件擴(kuò)增95℃ 2min預(yù)變性，→94℃ 30sec 30個(gè)循環(huán)→72℃ 10min→4℃保存55℃ 30sec72℃ 1min12.分別取一擴(kuò)反應(yīng)液2μl，加入到PCR反應(yīng)液(H液)中，混勻后離心數(shù)秒，置于PCR上。按上述條件擴(kuò)增。13.一擴(kuò)反應(yīng)結(jié)束后取5～10μl加4μl溴酚藍(lán)混勻，經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳20～30分鐘(5V/cm)后于紫外儀上觀察。若在1080bp處出現(xiàn)明亮的反應(yīng)條帶(與陽性對照在同一位置)，則為ISKNV陽性，說明待測樣品攜帶傳染性脾腎壞死病毒，若無反應(yīng)條帶顯示則進(jìn)行PCR二擴(kuò)反應(yīng)。二擴(kuò)反應(yīng)結(jié)束后取5～10μl加4μl溴酚藍(lán)混勻，經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳20～30分鐘(5V/cm)后于紫外儀上觀察。若在562bp處出現(xiàn)明亮的反應(yīng)條帶(與陽性對照在同一位置)，則為ISKNV陽性，說明待測樣品攜帶傳染性脾腎壞死病毒，否則為陰性(見

圖1)。
權(quán)利要求
1.一種鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的基因診斷試劑盒，其特征是該試劑盒包括下列部件1).樣品稀釋液A液，2管，內(nèi)裝磷酸緩沖液(1×PBS)，pH7.4；2).模板抽提液B液，1管，內(nèi)裝酚/氯仿/異戊醇，比例為25∶24∶1；3).C液，1管，內(nèi)裝5M NaCL；4).D液，1管，內(nèi)裝無水乙醇；5).E液，1管，內(nèi)裝70％乙醇；6).F液，1管，內(nèi)裝滅菌雙蒸水；7).PCR反應(yīng)液G液，1管，內(nèi)裝PCR一擴(kuò)反應(yīng)液，包括ddH2O、含mg2+的10×Buffer、dNTP、外引物F1、外引物R1和TaqE F1為5’-AGA CCC ACT TGT ACG GCG，R1為5’-CCC ATGTCC AAC GTA TAG C；8).PCR反應(yīng)液H液，1管，內(nèi)裝PCR二擴(kuò)反應(yīng)液，包括ddH2O、含mg2+的10×Buffer、dNTP、內(nèi)引物F2、內(nèi)引物R2和TaqE；F2為5’-CGT GAG ACC GTG CGT AGT，R25’-AGG GTGACG GTC GAT ATG；9).陽性對照I液，1管，內(nèi)裝ISKNV陽性DNA。10).盒子；11).一塊泡沫板，其大小與上述盒子的底面相同，裝于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管數(shù)量的小孔，上述各小管分別對應(yīng)放置于這些小孔中。
2.一種檢測鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的方法，其特征是使用權(quán)利要求1所述試劑盒，按下列步驟進(jìn)行1).取樣品，加入樣品稀釋液A液稀釋10～20倍，于勻漿器中冰浴勻漿；2).4000～6000r/min離心10～15min；3).取上清600μl用模板抽提液B液抽提，上下顛倒幾次混勻；4).10000～12000r/min離心10～15min；5).取500ul上清加入20μlC液，再加入1mlD液，于-20℃沉淀1小時(shí)；6).10000～12000r/min離心10～15min；7).棄上清，加E液沖洗，10000～12000r/min離心5～10min，沖洗兩次；8).棄上清，自然干燥或在超凈工作臺(tái)上吹干；9).加20～30μlF液重懸溶解作為模板；10).分別取模板和I液，加入到PCR反應(yīng)液G液中，混勻后離心數(shù)秒，置于PCR上；11).按下列條件擴(kuò)增95℃2min預(yù)變性，→94℃30sec 30個(gè)循環(huán)→72℃10min→4℃保存55℃30sec72℃1min12).分別取一擴(kuò)反應(yīng)液，加入到PCR反應(yīng)液H液中，混勻后離心數(shù)秒，置于PCR上。按上述條件擴(kuò)增；13).一擴(kuò)反應(yīng)結(jié)束后取5～10μl加4μl溴酚藍(lán)混勻，經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳20～30分鐘后于紫外儀上觀察；若在1080bp處出現(xiàn)明亮的反應(yīng)條帶，則為ISKNV陽性，說明待測樣品攜帶傳染性脾腎壞死病毒，若無反應(yīng)條帶顯示則進(jìn)行PCR二擴(kuò)反應(yīng)；二擴(kuò)反應(yīng)結(jié)束后取5～10μl加4μl溴酚藍(lán)混勻，經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳20～30分鐘后于紫外儀上觀察；若在562bp處出現(xiàn)明亮的反應(yīng)條帶，則為ISKNV陽性，說明待測樣品攜帶傳染性脾腎壞死病毒，否則為陰性。
全文摘要
本發(fā)明提供一種鱖魚傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV，Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus)的基因診斷試劑盒及檢測方法。該試劑盒及檢測方法是以根據(jù)鱖魚傳染性脾腎壞死病毒基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)的兩對引物為主體而設(shè)計(jì)的。本發(fā)明采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，對傳染性脾腎壞死病毒的特異性DNA核酸片段進(jìn)行定性檢測，簡便快速，特異性好，靈敏度高?？蛇\(yùn)用于鱖魚各時(shí)期養(yǎng)殖過程中的病毒跟蹤檢測，也可用于環(huán)境監(jiān)測，避免病毒傳播流行，提高科學(xué)管理效率，具有很高的實(shí)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK1448518SQ0311436
公開日2003年10月15日 申請日期2003年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月6日
發(fā)明者何建國, 鄧敏, 翁少萍, 黃志堅(jiān), 呂玲 申請人:中山大學(xué)