專利名稱：固定化酶的再生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及有效利用油脂水解反應(yīng)中使用過的固定化酶的殘存活性，使油脂水解用固定化酶再生的方法。
背景技術(shù)：
當(dāng)使用油脂分解酶使油脂進(jìn)行水解時(shí)，為了有效地使用酶，使用將油脂分解酶固定在無機(jī)或者有機(jī)的載體上的固定化酶。該固定化酶，隨著長期在水解反應(yīng)中使用，其活性降低，因此在活性降低至某種程度的時(shí)刻需要進(jìn)行回收，交換成新的固定化酶。
作為有效利用被回收的使用過的固定化酶的手段，容易考慮到完全去除附著在其上的油分和蛋白質(zhì)，作為載體再利用的方法。但是，該方法產(chǎn)生酶載體的數(shù)百倍這樣大量的洗滌廢液，存在環(huán)境上的問題，同時(shí)也存在不能完全利用殘存在使用過的固定化酶中的活性這樣的問題。
另外，有下述方法，即，由在酯交換反應(yīng)或酯轉(zhuǎn)移反應(yīng)中使用的活性已降低的固定化脂酶，通過溶劑洗滌排除酶反應(yīng)的阻礙因素的方法(特開平5-137574號公報(bào))，以及對利用低水分下的反應(yīng)脫離了水的酶，通過使用溶劑、或者溶劑和磷脂進(jìn)行濕潤處理而控制有助于反應(yīng)的水分，從而使殘存的脂酶再活化的方法(特開平9-56379號公報(bào)、特開平11-75834號公報(bào))。但是，這些方法不是通過一部分脂酶的脫離使活性已降低的固定化酶進(jìn)行再生，歸根到底是使殘存的脂酶再活化的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供油脂水解用固定化酶的再生方法，其在油脂的水解反應(yīng)中使用過的油脂分解用固定化酶中添加溶劑進(jìn)行洗滌，調(diào)整該洗滌液中的脂肪酸平衡濃度后，去除洗滌液，使油脂水解酶被吸附。


圖1是表示在各實(shí)施例和比較例中使用過的固定化酶的洗滌液中的脂肪酸濃度和得到的再生固定化酶的表達(dá)活性的關(guān)系的圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的目的在于，提供在有效利用油脂水解反應(yīng)中使用過的固定化酶的殘存活性的同時(shí)，以廉價(jià)而且少的廢液量，再生成具有和使用前同等性能的油脂水解用固定化酶的方法。
當(dāng)使油脂水解酶固定化時(shí)，通過使脂肪酸預(yù)先吸附在酶載體上，得到高活性的固定化酶是已知的(特開平1-153090號公報(bào))。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，不完全去除附著在油脂水解反應(yīng)中使用過的固定化酶上的大量脂肪酸，用溶劑進(jìn)行處理，使之殘存對上述活化有效的量，然后吸附由于酶的脫離而降低了活性的酶，能夠在環(huán)境上及經(jīng)濟(jì)上有利地使使用過的固定化酶再生成和新的固定化酶同等的活性。
作為成為本發(fā)明的再生方法對象的固定化酶中的固定化用載體，可舉出水合無定形硅藻土、硅藻土、高嶺土、硅膠、分子篩、多孔玻璃、活性炭、碳酸鈣、陶瓷等無機(jī)載體，陶瓷粉末，聚乙烯醇、聚丙烯、殼聚糖、離子交換樹脂、疏水吸附樹脂、螯合樹脂、合成吸附樹脂等有機(jī)高分子等，但特別希望是離子交換樹脂。
作為離子交換樹脂，最好是多孔性的陰離子交換樹脂。這樣的多孔性載體具有大的表面積，因此能夠得到酶的更大吸附量。樹脂的粒徑最好是100～1000μm，細(xì)孔徑最好是10～150nm。作為材質(zhì)，可舉出酚醛系、聚苯乙烯系、丙烯酰胺系、二乙烯基苯系等，特別希望是酚醛系樹脂(例如Rohm and Hass公司制Duolite A-568)。
作為在本發(fā)明中使用的油脂分解酶，最好是脂酶。不用說脂酶來自動物、植物，也可以使用來自微生物的市售脂酶。作為來自微生物的脂酶，可舉出起源于根霉屬(Rizopus)、曲霉屬(Aspergillus)、毛霉屬(Mucor)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、地霉屬(Geotrichum)、青霉屬(Penicillium)、假絲酵母屬(Candida)等的脂酶。
成為本發(fā)明的再生方法對象的使用過的固定化酶，是在油脂的水解反應(yīng)中使用的活性降低的固定化酶。作為油脂，可舉出大豆油、橄欖油、棕櫚油、菜子油等植物油，牛油、豬油、魚油等動物油。
作為在使用過的固定化酶的洗滌中使用的溶劑，可舉出乙醇、正己烷、丙酮等，尤其以乙醇、正己烷為佳。另外，在沒有殘存酶的脫離·失活、能夠減低酶使用量這方面，以正己烷為最佳。
如果用這些溶劑將使用過的固定化酶洗滌一定時(shí)間(30分鐘左右)，洗滌液中的脂肪酸濃度和固定化酶的殘存(吸附)脂肪酸量就達(dá)到平衡。洗滌液中的脂肪酸濃度例如以每單位重量溶液的溶解脂肪酸重量表示。另外，殘存在固定化酶中的脂肪酸量例如以每單位重量固定化酶的脂肪酸重量表示。在本發(fā)明中，為了得到高活性的再生固定化酶，需要調(diào)整洗滌液中的脂肪酸平衡濃度。該脂肪酸平衡濃度可以根據(jù)去除洗滌液后被吸附的酶的形態(tài)適宜地進(jìn)行調(diào)整，較好是4～28重量％，更好是5～25重量％，特別是5～22重量％，尤其最好是5～20重量％。對于溶劑的使用量，考慮洗滌前的固定化酶含有的脂肪酸量，洗滌液的脂肪酸平衡濃度達(dá)到成為上述范圍的量即可，但一般來說，以使用過的固定化酶的3～20重量倍左右為佳，較好是3～15重量倍，更好是3～10重量倍，特別是5～10重量倍，尤其最好是5～8重量倍。使用溶劑的固定化酶的洗滌溫度，最好是不引起殘存的酶失活的0～60℃，特別最好是5～40℃。
使用溶劑洗滌后，通過過濾等去除洗滌液后，用緩沖液將固定化酶洗滌。通過使用該緩沖液的洗滌完全去除殘存的溶劑，但此時(shí)，也可以利用蒸餾去除溶劑。尤其，在溶劑是正己烷的情況下，最好進(jìn)行蒸餾。該蒸餾可以是常壓蒸餾，也可以是減壓蒸餾。作為緩沖液，可以使用在下面進(jìn)行的酶的固定化中使用的緩沖液。
進(jìn)行酶的固定化的溫度可以根據(jù)酶的特性決定，但最好是不引起酶失活的0～60℃，特別最好是5～40℃。并且在固定化時(shí)使用的酶溶液的pH值，只要是不引起酶的改性的范圍即可，與溫度同樣可以根據(jù)酶的特性決定，但pH最好是3～9。為了維持該pH，使用緩沖液，作為緩沖液，可舉出乙酸緩沖液、磷酸緩沖液、tris鹽酸緩沖液等。
上述酶溶液中的酶濃度，從固定化效率這點(diǎn)考慮，希望是酶的飽和溶解度以下且足夠的濃度。并且被吸附的酶量，可以根據(jù)使用過的固定化酶的殘存活性進(jìn)行調(diào)整。作為酶溶液，根據(jù)需要，可以使用用離心分離去除不溶部分后的上清液或通過超濾等進(jìn)行純化得到的酶溶液。
酶的固定化后，通過過濾回收濕潤狀態(tài)的固定化酶，也可以直接在下面的油脂水解反應(yīng)中使用，并且根據(jù)需要，也可以通過使用特開平12-166552號公報(bào)中記載的油脂進(jìn)行處理的方法或干燥等去除水分。
再者，固定化酶的活性(1U)表示在40℃，一邊攪拌混合油脂∶水＝100重量份∶25重量份的混合液，一邊進(jìn)行30分鐘水解時(shí)，在1分鐘生成1μmol的游離脂肪酸的酶的分解能力。
實(shí)施例使用過的固定化酶的準(zhǔn)備在N/10的氫氧化鈉水溶液100重量份中將10重量份Duolite A-568(Rohmand Hass公司)攪拌1小時(shí)。過濾后，用100重量份的離子交換水進(jìn)行洗滌，用500mM的磷酸緩沖液(pH7)100重量份進(jìn)行pH的平衡化。此后，用50mM的磷酸緩沖液(pH7)100重量份每2小時(shí)進(jìn)行2次pH的平衡化。此后進(jìn)行過濾，回收載體后，用40重量份乙醇進(jìn)行乙醇置換。過濾后，加入10重量份蓖麻油酸和31.6重量份乙醇的混合液，在30分鐘使蓖麻油酸吸附在載體上。此后，回收載體，用50mM磷酸緩沖液(pH7)50重量份每30分鐘進(jìn)行4次洗滌，去除乙醇，進(jìn)行過濾，回收載體。此后，使3.88重量份的脂酶(脂酶AY amano30，天野制藥公司)與溶解在50mM的磷酸緩沖液(pH7)180重量份中的酶液接觸2小時(shí)，進(jìn)行固定化。此時(shí)，由固定化后的酶液的殘存活性和固定化前的酶液的活性之差求出固定化率，是70％。固定化后進(jìn)行過濾，回收固定化酶后，用50mM的磷酸緩沖液(pH7)50重量份進(jìn)行30分鐘洗滌，去除未固定化的酶或蛋白質(zhì)。在洗滌后進(jìn)行過濾，回收濕潤狀態(tài)的固定化酶。接著使回收的固定化酶和40重量份的菜子油接觸2小時(shí)，進(jìn)行過濾，回收油處理過的固定化酶。以上操作全部在20℃進(jìn)行。
通過以上的操作調(diào)制成的固定化酶，初期的表達(dá)活性是2800U/g。將該固定化酶填充在柱中，一邊混合反應(yīng)基質(zhì)(菜子油∶水＝100重量份∶60重量份)，一邊在柱中循環(huán)進(jìn)行水解，該操作連續(xù)地反復(fù)進(jìn)行。酶的表達(dá)活性隨反應(yīng)操作的反復(fù)而降低，回收具有各種殘存活性的使用過的固定化酶(活性降低酶)。
實(shí)施例1對殘存活性770U/g的使用過的固定化酶10重量份(干燥基準(zhǔn))，加入72重量份乙醇進(jìn)行分散，攪拌30分鐘。此時(shí)，攪拌操作后的洗滌液中的脂肪酸濃度是12.9重量％。過濾后，用50mM的磷酸緩沖液(pH7)50重量份每30分鐘進(jìn)行4次洗滌，去除乙醇，進(jìn)行過濾，回收載體。此后，使3.88重量份的脂酶(脂酶AYamano30，天野制藥公司)與溶解在50mM的磷酸緩沖液(pH7)180重量份中的酶液接觸2小時(shí)，進(jìn)行固定化。此時(shí)，由固定化后的酶液的殘存活和固定化前的酶液的活性之差求出固定化率，是67％。固定化后進(jìn)行過濾，回收固定化酶后，用50mM的磷酸緩沖液(pH7)50重量份進(jìn)行30分鐘洗滌，去除未固定化的酶或蛋白質(zhì)。在洗滌后進(jìn)行過濾，回收濕潤狀態(tài)的固定化酶。以上的操作全部在20℃進(jìn)行。
通過以上操作再生的固定化酶初期的表達(dá)活性是2600U/g。
實(shí)施例2除所用的乙醇是40重量份以外，和實(shí)施例1相同地進(jìn)行。洗滌液中的脂肪酸濃度是22.3重量％，酶的固定化率是73.1％，表達(dá)活性是2401U/g。
實(shí)施例3除使用過的固定化酶的殘存活性是800U/g、所用的乙醇是40重量份以外，和實(shí)施例1相同地進(jìn)行。洗滌液中的脂肪酸濃度是19.7重量％，酶的固定化率是70.9％，表達(dá)活性是2910U/g。
實(shí)施例4除使用過的固定化酶的殘存活性是1440U/g、所用的乙醇是72重量份以外，和實(shí)施例1相同地進(jìn)行。洗滌液中的脂肪酸濃度是13.1重量％，酶的固定化率是69.6％，表達(dá)活性是3014U/g。
實(shí)施例5代替乙醇使用正己烷，和實(shí)施例1相同地使使用過的固定化酶分散，進(jìn)行30分鐘攪拌操作。此時(shí)，攪拌操作后的溶液中的脂肪酸濃度是12.8重量％。過濾后，投入50mM的磷酸緩沖液(pH7)50重量份，在20℃、于30托的減壓下攪拌30分鐘，去除溶劑。過濾后，用50mM的磷酸緩沖液(pH7)50重量份每30分鐘洗滌3次，進(jìn)行過濾，回收載體。此后的脂酶吸附和實(shí)施例1相同地進(jìn)行。酶的固定化率是70％，再生后的表達(dá)活性是2672U/g。
實(shí)施例6除所用的正己烷是110重量份以外，和實(shí)施例5相同地進(jìn)行。洗滌液中的脂肪酸濃度是8.9重量％，酶的固定化率是81.4％，表達(dá)活性是2489U/g。
實(shí)施例7除使用過的固定化酶的殘存活性是1440U/g、所用的正己烷是68重量份以外，和實(shí)施例5相同地進(jìn)行。洗滌液中的脂肪酸濃度是13.7重量％，酶的固定化率是67.5％，表達(dá)活性是2768U/g。
實(shí)施例8使用過的固定化酶的殘存活性是605U/g，所用的正己烷是182重量份，使36.8重量份脂酶(脂酶AYamano25L，天野制藥公司)與溶解在50mM的磷酸緩沖液(pH7)148重量份中的酶液接觸2小時(shí)，進(jìn)行固定化，除此以外和實(shí)施例5相同地進(jìn)行。洗滌液中的脂肪酸濃度是6.0重量％，酶的固定化率是81.8％，表達(dá)活性是2814U/g。
實(shí)施例9除使用過的固定化酶的殘存活性是604U/g、所用的正己烷是89重量份以外，和實(shí)施例8相同地進(jìn)行。洗滌液中的脂肪酸濃度是11.7重量％，酶的固定化率是76.3％，表達(dá)活性是3016U/g。
比較例1除使用過的固定化酶的殘存活性是700U/g、所用的乙醇是530重量份以外，和實(shí)施例1相同地進(jìn)行。洗滌液中的脂肪酸濃度是2重量％，酶的固定化率是81.8％，表達(dá)活性是1744U/g。
比較例2除所用的正己烷是24重量份以外，和實(shí)施例5相同地進(jìn)行。洗滌液中的脂肪酸濃度是30.4重量％，酶的固定化率是59.8％，表達(dá)活性是2167U/g。
比較例3除所用的正己烷是337重量份以外，和實(shí)施例5相同地進(jìn)行。洗滌液中的脂肪酸濃度是3.1重量％，酶的固定化率是83.8％，表達(dá)活性是2200U/g。
比較例4除使用過的固定化酶的殘存活性是607U/g、所用的正己烷是552重量份以外，和實(shí)施例8相同地進(jìn)行。洗滌液中的脂肪酸濃度是2.0重量％，酶的固定化率是79.0％，表達(dá)活性是2334U/g。
在圖1中示出各實(shí)施例和比較例中的使用過的固定化酶洗滌液中的脂肪酸濃度和得到的再生固定化酶的表達(dá)活性的關(guān)系。
權(quán)利要求
1.油脂水解用固定化酶的再生方法，該再生方法是在油脂的水解反應(yīng)中使用的油脂分解用固定化酶中添加溶劑進(jìn)行洗滌，調(diào)整該洗滌液中的脂肪酸平衡濃度后，去除洗滌液，使油脂水解酶被吸附。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的油脂水解用固定化酶的再生方法，其中，將該洗滌液中的脂肪酸平衡濃度調(diào)節(jié)成4～28重量％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的再生方法，其中，溶劑是乙醇或者正己烷。
全文摘要
在油脂的水解反應(yīng)中使用的油脂分解用固定化酶中添加溶劑進(jìn)行洗滌，調(diào)整該洗滌液中的脂肪酸平衡濃度后，去除洗滌液，使油脂水解酶被吸附的油脂水解用固定化酶的再生方法。根據(jù)本發(fā)明方法，能夠有效地利用油脂水解反應(yīng)中使用過的固定化酶的殘存活性，以廉價(jià)而且少的廢液量，再生成具有和使用前同等性能的油脂水解用固定化酶。
文檔編號C12P7/64GK1495256SQ0313275
公開日2004年5月12日 申請日期2003年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月6日
發(fā)明者小松利照, 仙田良孝, 宇治田吾朗, 吾朗, 孝 申請人:花王株式會社