專利名稱：含有多拷貝glnB基因的巴西固氮螺菌DraT的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種巴西固氮螺菌工程菌株。本發(fā)明還涉及一種菌肥。
背景技術(shù)：
小麥、玉米和水稻等大多數(shù)農(nóng)作物產(chǎn)量的提高主要依賴于化學(xué)氮肥施用量的增加，以提高產(chǎn)量為唯一目標(biāo)而無節(jié)制的大量施用化肥所帶來的惡果是土壤板結(jié)，肥力下降，環(huán)境特別是水質(zhì)嚴(yán)重污染等問題。
生物固氮是減少氮肥使用，緩解環(huán)境污染，降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本的一條重要途徑。根據(jù)固氮微生物與宿主植物的關(guān)系，將固氮作用分為自生固氮、聯(lián)合固氮和共生固氮(尤崇杓主編，生物固氮，科學(xué)出版社，1987)。自生固氮微生物自由生活在土壤或水域中，其固氮效率易受周圍環(huán)境的影響，它們?cè)诟缓杀焕玫哪茉次镔|(zhì)、缺氮和微氧(或無氧)的土壤中固氮，因而可為森林和草原植物生長提供一些氮素；但在缺乏可被利用的能源(碳水化合物)或有化合態(tài)氮(NH4+或NO3-)時(shí)，是不能固氮生長的。共生固氮微生物與植物共生形成根瘤，它們生活在根瘤內(nèi)，以宿主植物提供的光合產(chǎn)物為能源進(jìn)行固氮，為宿主植物生長提供大量氮素；但其宿主范圍有限，主要限于豆科植物(豆科植物根瘤菌)和某些非豆科樹木(弗氏固氮放線菌)。聯(lián)合固氮微生物，主要生長在植物的根際和根表，有些可進(jìn)入根的皮層組織但不形成根瘤；很多聯(lián)合固氮微生物的宿主是重要的糧食作物如水稻、小麥、玉米等，聯(lián)合固氮為這些糧食作物提供一些氮素。由于聯(lián)合固氮菌不能與宿主形成根瘤而裸露在植物根表，因此易受環(huán)境因素的影響，再加上固定的氮不易分泌到體外，這些因素都是造成聯(lián)合固氮菌固氮效率較低的原因。于是，這些糧食作物的高產(chǎn)，不得不依賴化學(xué)氮肥。因此，提高聯(lián)合固氮菌的固氮效率和改善固氮菌對(duì)宿主的氮素供應(yīng)，是在糧食作物生產(chǎn)中減少氮肥用量的主要途徑。
在自生固氮、聯(lián)合固氮及共生固氮這三種固氮類型中，對(duì)自生固氮的理論研究較為深入，但在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用價(jià)值不大。聯(lián)合固氮較之共生固氮有固氮機(jī)理簡(jiǎn)單、易于進(jìn)行基因工程改造等優(yōu)點(diǎn)。
在聯(lián)合固氮菌中，國內(nèi)外研究較多的是巴西固氮螺菌(Azospirillumbrasilense)。70年代中期巴西學(xué)者Dobereier發(fā)現(xiàn)巴西固氮螺菌大量存在于禾本科牧草根際，并分離出許多菌株。后來的研究表明巴西固氮螺菌廣泛存在于世界上許多地區(qū)(包括熱帶、溫帶甚至寒帶)，不僅能與禾本科牧草聯(lián)合共生，而且還與許多單子葉植物聯(lián)合共生，如玉米、水稻、小麥、高梁、甘蔗等(Dobereiner J，Day J M.Proceeding of the lst InternationalSymposium on Nitrogen Fixation，Newton Weand Nyman CJ(eds.)，Washington State University Press，Pullman，1976，518-538)。由于巴西固氮螺菌能與很多重要的單子葉糧食作物聯(lián)合固氮并為這些作物提供一定的氮素，因此從那時(shí)起，世界各地的科學(xué)家們便傾注了大量的精力，對(duì)該菌的形態(tài)、生理生化、遺傳、田間應(yīng)用等各方面進(jìn)行了全方位的研究。其中A.brasilense Sp7菌株是國外在遺傳、田間應(yīng)用等方面研究最多的標(biāo)準(zhǔn)菌株，該菌株就是70年代從巴西禾本科牧草根際分離獲得的，來源于熱帶地區(qū)。
自70年代以來，人們以A.brasilense作為菌肥進(jìn)行了很多田間接種試驗(yàn)，其中大多數(shù)以小麥作為施肥對(duì)象。從1994年世界各地的統(tǒng)計(jì)結(jié)果來看，用該菌作為菌肥，接種的成功率是60％，其增產(chǎn)幅度為5～30％(Colnaghi R.et al.Plant and soil，1997，194145-150)。而且，接種效果與接種的有效菌數(shù)、土壤肥力等因素有關(guān)。一般在貧瘠的土壤中增產(chǎn)幅度大，在肥沃土壤中增產(chǎn)幅度小，因此認(rèn)為增產(chǎn)效果主要是由于A.brasilense分泌的植物激素促進(jìn)了植物生長和提高了植物對(duì)礦物質(zhì)和水分的吸收而引起的，而由固氮作用提供氮素導(dǎo)致的增產(chǎn)效果是有限的(Okon Y.et al.Soil Biology and Biochemistry，1994，261591-1596)。A.brasilense野生菌只在限銨(小于5mM NH4+)的環(huán)境中固氮，因此土壤中高的銨濃度是發(fā)揮該菌固氮效率的主要限制因子。
1994年美國以苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)PC和2011為出發(fā)菌株，分別構(gòu)建了7株在染色體上克隆有額外拷貝dctABD或/和nifA的重組菌，在美國威斯康星州的四個(gè)試驗(yàn)地上進(jìn)行的小區(qū)田間比較試驗(yàn)結(jié)果表明同時(shí)克隆有dctABD和nifA的菌株RMPBC-2在土壤有機(jī)質(zhì)和化合態(tài)氮素含量較低的Hancock試驗(yàn)點(diǎn)上的苜蓿植株生物量較出發(fā)菌PC高12.9％、較不接種對(duì)照高17.9％，其差異已達(dá)到統(tǒng)計(jì)上的顯著水平(Bosworth A.H.et al.Applied Environmental Microbiology，1994，60(10)3815-3832)。1996年，美國用外源dctABD基因及修飾的nifA基因重組的苜蓿根瘤菌的接種工程菌種實(shí)驗(yàn)已進(jìn)入大田應(yīng)用階段。至今，國內(nèi)外接種實(shí)驗(yàn)用的巴西固氮螺菌都是野生型菌株。國外文獻(xiàn)及國外專利查新都未見有關(guān)巴西固氮螺菌耐銨工程菌進(jìn)行田間試驗(yàn)的報(bào)道，國內(nèi)未見用巴西固氮螺菌耐銨工程菌在田間接種的報(bào)告。
我室于1984年從北京郊區(qū)玉米根部分離到巴西固氮螺菌Yu62菌株，在國家863項(xiàng)目的資助下，本課題組以巴西固氮螺菌Yu62為原始菌株，十幾年來通過對(duì)該菌從遺傳、調(diào)控、生理等各方面的深入研究，使該菌的固氮調(diào)控機(jī)制已趨于明朗化，實(shí)驗(yàn)已證實(shí)NH+4對(duì)該菌固氮作用的調(diào)控是通過兩條途徑而起作用的---阻遏固氮酶的合成和抑制已有固氮酶的活性。在巴西固氮螺菌中，翻譯后的固氮酶活性受DraT-DraG蛋白系統(tǒng)的調(diào)控。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)銨濃度高時(shí)，在DraT酶的作用下，使固氮酶鐵蛋白一個(gè)亞基上的精氨酸殘基被一個(gè)ADP-核糖基團(tuán)共價(jià)修飾而完全喪失活性；當(dāng)細(xì)胞內(nèi)銨濃度低時(shí)，在DraG酶的作用下，將ADP-核糖從鐵蛋白亞基上解離，鐵蛋白恢復(fù)活性。DraT基因突變后，其固氮酶活性則不再受銨的抑制。因此，巴西固氮螺菌DraT-突變株的構(gòu)建將是突破高銨限制固氮效率的一條改造途徑。
NifA蛋白幾乎是所有固氮細(xì)菌中固氮基因轉(zhuǎn)錄的激活因子。巴西固氮螺菌中的nifA基因可以組成型表達(dá)，但表達(dá)出來的NifA蛋白無轉(zhuǎn)錄激活活性，需要在glnB基因編碼的PII蛋白的作用下，才能具有轉(zhuǎn)錄激活活性。我們的研究表明，增加glnB基因的拷貝數(shù)，能提高固氮酶活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過增加glnB基因的拷貝數(shù)和對(duì)draT基因進(jìn)行插入失活，構(gòu)建成的工程菌株抗銨能力增強(qiáng)和固氮效率提高。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種菌肥。
本發(fā)明提供了一種含有多拷貝glnB基因的巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)DraT-抗銨工程菌株YuMB，該菌株已于2003年1月22日由中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏。保藏中心地址中國，北京，中關(guān)村。保藏號(hào)為CGMCC No.0875。
本發(fā)明還提供了一種菌肥，它含有本發(fā)明的含有多拷貝glnB基因的巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)DraT-抗銨工程菌株YuMB。
本發(fā)明的巴西固氮螺菌工程菌株YuMB是通過對(duì)1984年由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物系從北京郊區(qū)玉米根際土壤中分離獲得的巴西固氮螺菌Yu62進(jìn)行遺傳改造而獲得的，其形態(tài)特征和分類地位仍然與野生型出發(fā)菌株巴西固氮螺菌Yu62相同。巴西固氮螺菌工程菌株YuMB在分類上屬于假單孢桿菌目(Pseudomonadales)，螺旋菌科(Spirillaceae)，固氮螺菌屬(Azospirillum)，巴西固氮螺菌種(Azospirillum brasilense)。該菌形態(tài)為桿狀，略有彎曲，菌體為0.5-0.9×2-3mm，有的更長些，革蘭氏染色陰性，在液體培養(yǎng)基中靠一根極生鞭毛游動(dòng)，在固體培養(yǎng)基上可產(chǎn)生數(shù)根側(cè)生鞭毛，細(xì)胞內(nèi)含有PHB(聚β-羥基丁酸鹽)顆粒，DNA G+C含量為70％。最適生長溫度是30℃，可以積累類胡蘿卜素，老的培養(yǎng)物呈粉紅色。對(duì)氨卞青霉素和奈啶酮酸具有自然的抗性。其生長不需要生物素，屬于需氧的化能有機(jī)營養(yǎng)菌，在含有葡萄糖或核糖的基本培養(yǎng)基中不產(chǎn)酸?？梢岳糜袡C(jī)酸作為唯一碳源，如蘋果酸、乳酸、丙酮酸和瑚珀酸等?？梢岳弥参锝諚U(含有大量的半纖維素和木聚糖)進(jìn)行固氮，在微好氧條件下進(jìn)行固氮。巴西固氮螺菌工程菌株YuMB對(duì)人蓄無毒，無致病性。
本發(fā)明的工程菌進(jìn)行培養(yǎng)后作為菌肥，應(yīng)用在玉米、小麥禾本科作物的田間種植業(yè)中，能降低尿素的使用量，同時(shí)由于該菌能分泌IAA等植物激素而刺激植物生長，因此能達(dá)到增產(chǎn)節(jié)肥的目的。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供了一種巴西固氮螺菌工程菌株，菌株號(hào)為YuMB。該菌株已于2003年1月22日由中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC No.0875。
以下通過工程菌株YuMB的構(gòu)建實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
1.巴西固氮螺菌工程菌株YuMB的構(gòu)建巴西固氮螺菌工程菌株YuMB的構(gòu)建主要包括下面3個(gè)步驟(1)巴西固氮螺菌DraT-突變株的構(gòu)建本發(fā)明將巴西固氮螺菌Yu62接種到LD液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g，NaCl 2.5g，酵母粉5g，蒸餾水1000ml，pH 6.8)中，置于200轉(zhuǎn)/min恒溫?fù)u床，30℃振蕩培養(yǎng)48小時(shí)，離心收集菌體，并從中抽提DNA。然后用Sau3A酶切總DNA，回收8-20kb的DNA片段，與噬菌體載體EMBL3A(華美生物工程公司)連接并在體外進(jìn)行包裝，構(gòu)建成巴西固氮螺菌Yu62的基因文庫。用巴西固氮螺菌Sp7菌株的部分draT基因片段做探針，從巴西固氮螺菌Yu62基因文庫中篩選到一個(gè)陽性克隆，該陽性克隆的長度為8.0kb。用SalI對(duì)陽性克隆進(jìn)行酶切，并回收含有draT基因的8.0kb的外源片段，并克隆到pUC19(購自華美生物工程公司)上，得到重組質(zhì)粒pLYM106。質(zhì)粒pLYM106(含有draT基因)用EcoRI+KpnI酶切，回收3.0kb的draTG基因片段，與BamHI酶切后經(jīng)Klenow補(bǔ)平的自殺型質(zhì)粒pSUP202(Promega公司)連接，得到重組質(zhì)粒pSUTG。將從pUC4K質(zhì)粒上用PstI酶切后回收的1.4kb卡那霉素(Km)片段，插入到重組質(zhì)粒pSUTG的draT基因的PstI位點(diǎn)，造成draT基因失活，從而得到了質(zhì)粒pSUTG-1(draT::Km)。將質(zhì)粒pSUTG-1(draT::Km)通過轉(zhuǎn)化作用而導(dǎo)入大腸桿菌S17-1(華美生物工程公司)中。
將含有質(zhì)粒pSUTG-1(draT::Km)的大腸桿菌S17-1接種到含有卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)16小時(shí)；同時(shí)，將巴西固氮螺菌Yu62接種到含有氨芐青霉素(Amp)和萘叮酮酸的液體LD培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)20小時(shí)。取大腸桿菌S17-1菌液和巴西固氮螺菌Yu62菌液各500μl，加入到，1.5ml Eppendorf管中，1000rpm離心30秒，棄上清，用移液器將菌泥混合物移入到一LD固體平板中央，30℃正置培養(yǎng)過夜。然后，用接種環(huán)刮下少許菌泥，在含有卡那霉素、氨芐青霉素和萘叮酮酸的LB平板上劃單菌落，30℃培養(yǎng)，分離純化2-3次后長出的單菌落即為DraT-突變株。由于質(zhì)粒pSUTG-1屬于自殺型質(zhì)粒，所以DraT-突變株中不含有外源質(zhì)粒。
(2)多拷貝glnB基因的構(gòu)建用PCR法從巴西固氮螺菌Yu62中獲得glnB基因編碼區(qū)339bp(從起始密碼子ATG到終止密碼子TGA)，并克隆到pVK100(購自Promega公司)載體中，使之在卡那霉素抗性啟動(dòng)子下組成型表達(dá)，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pVK-II。該重組質(zhì)粒仍然具有四環(huán)素抗性。將該重組質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入到E.coli S17-1中。
(3)通過雙親雜交法將多拷貝glnB基因?qū)隓raT-突變株將含有pVK-II的大腸桿菌S17-1與受體菌巴西固氮螺菌Yu62分別接種于3ml無抗生素培養(yǎng)基中(大腸桿菌用LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，巴西固氮螺菌Yu62用LD培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng))振蕩培養(yǎng)過夜。取上述兩個(gè)菌各500ul培養(yǎng)液，混合于Eppendorf管中，離心，棄大部分上清，用剩余的40-50μl上清懸浮菌體。將菌液滴在LB或LD平板中央，30℃靜置過夜或24h。然后，從平板上刮菌到1ml LB或LD液體培養(yǎng)基中，混勻后涂抗性平板，培養(yǎng)48-72h后，篩選具有四環(huán)素和卡那霉素抗性的接合子，該接合子就是工程菌YuMB。
2.工程菌株的固氮酶活性將本發(fā)明涉及的工程菌株YuMB與野生型Yu62菌株及巴西固氮螺菌DraT-突變株一同進(jìn)行固氮酶活性的測(cè)定，然后比較它們的固氮酶活性。固氮酶活性的測(cè)定按半固體法固氮酶測(cè)定方法和液體法固氮酶測(cè)定方法兩種方法同時(shí)測(cè)定。
(i)半固體法固氮酶活性的測(cè)定(1)將待測(cè)的工程菌株YuMB與野生型菌株Yu62及巴西固氮螺菌DraT-突變株同時(shí)活化，保持其生長狀態(tài)一致；(2)將活化后的工程菌株YuMB與野生型菌株Yu62及巴西固氮螺菌DraT-突變株分別接入含相應(yīng)抗生素的液體LD培養(yǎng)基(LD液體培養(yǎng)基10g胰蛋白胨，2.5g氯化鈉，5g酵母粉，1000ml蒸餾水。15磅，121℃滅菌15分鐘滅菌)中，30℃振蕩培養(yǎng)20小時(shí)。培養(yǎng)工程菌株YuMB的LD培養(yǎng)基中需要添加卡那霉素(濃度為10μg/ml)、四環(huán)素(12.5μg/ml)和氨芐青霉素(25μg/ml)；培養(yǎng)野生型Yu62菌株的LD培養(yǎng)基中需要添加氨芐青霉素(25μg/ml)和萘啶酮酸(5μg/ml)；培養(yǎng)巴西固氮螺菌DraT-突變株的LD培養(yǎng)基中需要添加卡那霉素(濃度為10μg/ml)和氨芐青霉素(25μg/ml)；(3)分別測(cè)定工程菌株YuMB和野生型菌株Yu62及巴西固氮螺菌DraT-突變株的OD600值，并將OD600值調(diào)節(jié)為1。取1ml OD600值為1的菌液，12,000rpm離心1min，收集菌體；用液體K-lac培養(yǎng)基(K-Lac基本培養(yǎng)基每升含K2HPO41.67g，KH2PO40.87g，MgSO47H2O 0.29g，NaCl0.48g，60％乳酸鈉溶液6.3ml，10磅滅菌30min。使用前每100ml加入200×CaCl2溶液1ml、100×微量元素溶液1ml、1000×FeCl3溶液0.1ml、1000×NaMoO4溶液0.1ml，根據(jù)需要加入5M NH4Cl溶液至所需終濃度。半固體的K-Lac加入0.2％的瓊脂)洗兩遍后充分懸浮于100μl液體K-Lac培養(yǎng)基中；然后將100μl菌液接種到含有的K-Lac半固體培養(yǎng)基的小管，30℃培養(yǎng)48小時(shí)。設(shè)3個(gè)重復(fù)，即用工程菌株YuMB和野生型菌株Yu62及巴西固氮螺菌DraT-突變株各接種3個(gè)半固體小管；(4)向每個(gè)半固體小管中塞入一個(gè)小棉塞，再將試管帽全部換成膠塞，各注入1ml新制的乙炔，30℃反應(yīng)10-12小時(shí)；(5)從每個(gè)半固體小管中用微量進(jìn)樣器取出100μl氣體用氣相色譜法測(cè)定乙烯含量，根據(jù)各樣品乙烯峰的高低來比較其固氮酶活性高低。
(ii)液體法測(cè)定固氮酶活性(1)將待測(cè)的工程菌株YuMB與野生型菌株Yu62及巴西固氮螺菌DraT-突變株同時(shí)活化，保持其生長狀態(tài)一致；(2)將活化后的各菌株接入含相應(yīng)抗生素的液體LD培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)20小時(shí)；(3)測(cè)各菌株的OD600值，并將OD600值調(diào)節(jié)為1。取1ml OD600值為1的菌液，12,000rpm離心1min，收集菌體；用液體K-lac培養(yǎng)基洗兩遍后充分懸浮于100μl液體K-lac培養(yǎng)基中；接著將100μl菌液接入到10ml小血清瓶，30℃劇烈震蕩培養(yǎng)，脅迫3~4小時(shí)；(4)向每個(gè)小血清瓶注入10％體積新制的乙炔，每隔30分鐘從每個(gè)小血清瓶中用微量進(jìn)樣器取出100μl氣體用氣相色譜法測(cè)定乙烯含量，根據(jù)各樣品乙烯峰的高低來比較其固氮酶活性高低。
(iii)nmol乙烯的標(biāo)定
(1)準(zhǔn)備120ml血清瓶?jī)蓚€(gè)，標(biāo)為1#、2#瓶；(2)將血清瓶灌滿水，并用插有針頭的膠塞塞好，防止氣泡產(chǎn)生，取下膠塞，倒出100ml水(用容量瓶量取)，換上新膠塞，這樣瓶中的空氣體積即為100ml；(3)向1#瓶中注射2.24ml(標(biāo)況下為2.24ml，非標(biāo)準(zhǔn)狀況下，根據(jù)PV＝nRT來計(jì)算注入量)乙烯，再從1#瓶中取出1ml氣體注入2#瓶中，從2#瓶中取出100μl氣體打入氣相色譜儀，所顯示的峰高即為1nmol乙烯的量，據(jù)此可計(jì)算出記錄紙上每單位峰高代表多少nmol乙烯。
通過用半固體固氮酶活性測(cè)定方法和液體固氮酶活性測(cè)定方法兩種方法測(cè)定的結(jié)果都表明，工程菌YuMB的固氮酶活性是野生型的2.7倍，是DraT-突變株的1.34倍(表1)。
表1 多拷貝glnB在野生型巴西固氮螺菌Yu62和DraT-中的固氮酶活性比較

權(quán)利要求
1.一種含有多拷貝glnB基因的巴西固氮螺菌(Azospirillumbrasilense)DraT-抗銨工程菌，保藏號(hào)為CGMCC No.08765。
2.一種菌肥，它含有權(quán)利要求1所述的含有多拷貝glnB基因的巴西固氮螺菌DraT-抗銨工程菌。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種含有多拷貝glnB基因的巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)DraT
文檔編號(hào)C12N1/21GK1552847SQ0313843
公開日2004年12月8日 申請(qǐng)日期2003年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月2日
發(fā)明者陳三鳳, 劉元, 李季倫 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)