專利名稱：一種制造新瓊八糖、新瓊十糖和新瓊十二糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種瓊膠寡糖，特別是涉及一種用酶解制造新瓊八糖、新瓊十糖和新瓊十二糖的方法。
背景技術(shù)：
瓊脂糖是由α-1，3連接的β-D-吡喃半乳糖和β-1，4連接的3，6-內(nèi)醚-α-L-吡喃半乳糖反復(fù)交替連接而成。近幾年來，隨著糖生物學(xué)和糖化學(xué)研究的飛速發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)不同聚合度的瓊膠寡糖具有重要的藥用價(jià)值，如抗腫瘤、抗衰老、預(yù)防糖尿病、抗氧化、抗炎癥等，有望發(fā)展為新一代海洋藥物和保健食品。另外，瓊膠寡糖在食品、化工、農(nóng)業(yè)等方面也有廣泛的用途。傳統(tǒng)的瓊膠寡糖制備方法是瓊膠的化學(xué)稀酸水解法，該方法的條件不易控制，并且裂解產(chǎn)物的分子量不均一，不利于高純度寡糖單體的制備。用瓊膠酶降解法所得產(chǎn)物的專一性強(qiáng)，工藝易于控制，有利于單一寡聚糖的制備，為瓊膠寡糖的構(gòu)效關(guān)系研究和應(yīng)用開發(fā)創(chuàng)造了條件。因此，酶降解法取代傳統(tǒng)的化學(xué)降解法制備瓊膠寡糖已成為趨勢。根據(jù)作用方式的不同瓊膠酶可分為α-瓊膠酶和β-瓊膠酶兩大類，前者裂解α-1，3糖苷鍵，生成瓊寡糖系列；后者裂解β-1，4糖苷鍵，生成新瓊寡糖系列。但迄今從海洋微生物中發(fā)現(xiàn)的瓊膠酶特異性差，活性較低，阻礙了瓊膠寡糖單體的制備以及進(jìn)一步的構(gòu)效關(guān)系和應(yīng)用開發(fā)研究的深入開展。到目前為止，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的只有一種從Pseudomonasatlantica中分離的β-瓊膠酶(Morrice，1983)，不但成本高、價(jià)格昂貴，而且降解瓊膠的終產(chǎn)物主要是新瓊二糖、新瓊四糖和新瓊六糖，并無聚合度較高的寡糖產(chǎn)物，應(yīng)用范圍也僅限于科研工作中。目前市場上只有新瓊二糖、新瓊四糖和新瓊六糖的標(biāo)準(zhǔn)品，聚合度八以上的新瓊寡糖的制備方法還沒有報(bào)道和記載。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用酶水解制造新瓊八糖、新瓊十糖和新瓊十二糖的方法，它能彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供高聚合度新瓊寡糖的標(biāo)準(zhǔn)品，為構(gòu)效關(guān)系和應(yīng)用開發(fā)研究提供足量的高純度新瓊寡糖單體。
一種制造新瓊八糖、新瓊十糖、新瓊十二糖的方法，包括利用β-瓊膠酶將瓊膠或瓊脂糖水解為不同大小的新瓊寡糖，并用色譜分離不同聚合度的新瓊寡糖，其特征在于使用β-瓊膠酶agaB基因高效表達(dá)的大腸桿菌BL21(DE3)-pET24-agaB工程菌株所產(chǎn)的瓊膠酶進(jìn)行酶解反應(yīng)。
本發(fā)明使用的重組β-瓊膠酶AgaB是國際上首次發(fā)現(xiàn)的一種新型β-瓊膠酶，降解瓊膠或瓊脂糖產(chǎn)生的主要終產(chǎn)物為新瓊八糖、新瓊十糖和新瓊十二糖，并且其降解終產(chǎn)物中新瓊八糖、新瓊十糖含量都大于30％。另外，酶解反應(yīng)的周期短、條件溫和、成本低廉，適于高純度新瓊寡糖單體的大規(guī)模生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式
1、β-瓊膠酶AgaB高產(chǎn)工程菌株的BL21(DE3)-pET24-agaB的建立根據(jù)已克隆的β-瓊膠酶agaB基因的DNA序列設(shè)計(jì)上游引物(5’-CATATGTTAAAGCGCCACCAAGC-3’)和下游引物(5’-CTCGAGTTGGCAAGTATAACCT-3’)，以假別單胞菌CY24的基因組DNA為模板，利用PCR擴(kuò)增得到β-瓊膠酶AgaB基因的全ORF序列。PCR的條件為首先，94℃預(yù)變性3min；其次94℃30s、60℃30s、72℃60s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)周期；最后在72℃延伸10min后終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳顯示1.4kb處有一特異性條帶，將其從瓊脂糖凝膠上切下回收，重組于大腸桿菌表達(dá)載體pET-24a(+)。利用氯化鈣法將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中，篩選具有卡那霉素抗性的陽性轉(zhuǎn)化子。將所獲得的陽性重組子瓊膠板上培養(yǎng)24h，根據(jù)水解圈的大小挑選高產(chǎn)的菌株，進(jìn)一步在液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，檢測酶活，已確定高產(chǎn)β-瓊膠酶AgaB的工程菌株。用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，測序結(jié)果表明β-瓊膠酶基因AgaB重組于表達(dá)載體pET-24a(+)。最后，將獲得了高效工程菌株命名為BL21(DE3)-pET24-agaB。
2、β-瓊膠酶AgaB的制備挑取實(shí)施例1中得到大腸桿菌基因工程菌株BL21(DE3)-pET24-agaB單克隆接種在2ml含有濃度為30μg/ml卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃200r/min振蕩培養(yǎng)過夜。按1∶50的體積比接種至100ml含有濃度為50μg/ml卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃200r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4-1.0，加入IPTG至終濃度為1mmol/mL，繼續(xù)培養(yǎng)5h，4℃5000×g離心30min收集發(fā)酵液。于冰水浴中逐步加入飽和度為70％的固體硫酸銨粉末，并加轉(zhuǎn)子攪拌，加完后繼續(xù)攪拌1小時(shí)，于12000×g，4℃離心15min，收集沉淀用原發(fā)酵液十分之一體積的0.2mol/mL磷酸鹽緩沖液(pH7.0)溶解即得初步純化瓊膠酶酶液，保存于-20℃。將初步純化的酶液上至用結(jié)合緩沖液(Native Binding Buffer pH7.8)平衡好的PreBondTMResin column(Invitrogen)，依次用結(jié)合緩沖液和pH值分別為6.0和5.5的洗滌緩沖液(Native Wash Buffer)洗滌親和柱至洗出液OD280＜0.01，最后用pH為4.0的洗脫液(Native Elution Buffer)洗脫親和柱，收集洗脫液。SDS-PAGE檢測洗脫液中蛋白分布，合并含單一目的帶的洗脫液即可得到純化的重組β-瓊膠酶。
3、新瓊八糖、新瓊十糖和新瓊十二糖的制造將瓊脂糖用水配成重量百分濃度為0.1-0.5的溶膠，加入0.5％-2％(體積百分比)初步純化的瓊膠酶液或者0.1％-0.5％(體積百分比)純化的瓊膠酶液，于25℃-40℃溫育2-12小時(shí)，于4℃冷卻后以10000×g，4℃離心10min，將上清液過孔徑為0.22μm或0.45μm微孔濾膜，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干后用0.2-0.5mol/mL碳酸氫銨水溶液溶解，在Bio-Gel-P6或Bio-Gel-P4或安法馬西亞的superdex30上進(jìn)行色譜分離，洗脫緩沖液為0.2-0.5mol/mL碳酸氫銨水溶液，得到不同聚合度的新瓊寡糖，經(jīng)分別脫鹽、凍干后，即為本發(fā)明的寡糖產(chǎn)品，其中新瓊八糖產(chǎn)率為37％，新瓊十糖產(chǎn)率為32％，新瓊十二糖產(chǎn)率為17％，純度均達(dá)99％以上。
權(quán)利要求
1.一種制造新瓊八糖、新瓊十糖、新瓊十二糖的方法，包括利用β-瓊膠酶將瓊膠或瓊脂糖水解為不同大小的新瓊寡糖，并用色譜分離不同聚合度的新瓊寡糖，其特征在于使用β-瓊膠酶agaB基因高效表達(dá)的大腸桿菌BL21(DE3)-pET24-agaB工程菌株所產(chǎn)的瓊膠酶進(jìn)行酶解反應(yīng)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將所述的瓊脂糖配制成0.1％-0.5％的溶膠，加入β-瓊膠酶AgaB進(jìn)行降解反應(yīng)。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的β-瓊膠酶AgaB為初步純化產(chǎn)物或純化產(chǎn)物，其用量為瓊膠或瓊脂糖溶膠總反應(yīng)液的0.5％-2％或0.1％-0.5％。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的色譜分離是以Bio-Gel-P6或Bio-Gel-P4或安法馬西亞的superdex30為填料，以碳酸氫銨為緩沖液洗脫分離。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是在于水解反應(yīng)的溫度為25℃-40℃，反應(yīng)時(shí)間2-12小時(shí)。
6.如權(quán)利要求1所述的制造方法，其特征在于能夠大量生產(chǎn)純度99％以上的新瓊寡糖單體化合物。
7.如權(quán)利要求3所述方法，所述的酶為基因工程菌株發(fā)酵液的硫酸銨沉淀或進(jìn)一步用親和層析分離的純酶。
全文摘要
一種制造新瓊八糖、新瓊十糖、新瓊十二糖的方法，包括利用β－瓊膠酶將瓊膠或瓊脂糖水解為不同大小的新瓊寡糖，并用色譜分離不同聚合度的新瓊寡糖，其特征在于使用β－瓊膠酶agaB基因高效表達(dá)的大腸桿菌BL21(DE3)－pET24－agaB工程菌株所產(chǎn)的瓊膠酶進(jìn)行酶解反應(yīng)。本發(fā)明使用的重組β－瓊膠酶AgaB是國際上首次發(fā)現(xiàn)的一種新型β－瓊膠酶，降解瓊膠或瓊脂糖產(chǎn)生的主要終產(chǎn)物為新瓊八糖、新瓊十糖和新瓊十二糖，并且其降解終產(chǎn)物中新瓊八糖、新瓊十糖含量都大于30％。另外，酶解反應(yīng)的周期短、條件溫和、成本低廉，適于高純度新瓊寡糖單體的大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P19/04GK1487090SQ0313910
公開日2004年4月7日 申請(qǐng)日期2003年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月12日
發(fā)明者于文功, 李京寶, 褚艷, 馬翠萍, 韓峰, 路新枝 申請(qǐng)人:中國海洋大學(xué)