專利名稱：次級代謝物同屬物分布調(diào)節(jié)法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供采用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生聚酮化合物(polyketide)的重組方法和材料、通過調(diào)節(jié)氧壓力調(diào)節(jié)聚酮化合物同屬物分布(congener distribution)的方法。本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)、動物飼養(yǎng)、化學(xué)、醫(yī)藥化學(xué)、醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)、藥學(xué)和獸醫(yī)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
聚酮化合物代表由2-碳單元通過一系列縮合反應(yīng)和后續(xù)修飾而合成的一大類不同的化合物。聚酮化合物存在于許多類型的生物體中，包括真菌和菌絲體細(xì)菌，尤其是放線菌。存在各種聚酮化合物結(jié)構(gòu)，而且聚酮化合物包括大量的具有不同活性的化合物。這些化合物的例子包括紅霉素、FK-506、FK-520、巨霉素、那波霉素(narbomycin)、竹桃霉素、苦霉素(pieromycin)、雷帕霉素(rapamycin)、spinoeyn和泰樂菌素。鑒于采用傳統(tǒng)的化學(xué)方法生產(chǎn)聚酮化合物有困難以及在野生型細(xì)胞中非常低的產(chǎn)率，人們在尋找改進(jìn)的或其它生產(chǎn)聚酮化合物的方法上具有極大的興趣。可參見PCT出版物WO93/13663、WO95/08548、WO96/40968、97/02358和98/27203；美國專利號4874748、5063155、5098837、5149639、5672491、5712146和5962290；以及Fu等，1994，Biochemistry，339321-9326；McDaniel等，1993，Science，2621546-1550；和Rohr，1995，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，34(8)881-888。本文將上述各文獻(xiàn)的內(nèi)容納入作為參考。
自然界中，聚酮化合物由聚酮化合物合成酶(PKS)合成。這些酶是多個大蛋白質(zhì)的復(fù)合物，與脂肪酸生物合成中催化2-碳單元縮合的合成酶相類似。PKS酶由PKS基因編碼，該基因通常由3個或多個開放讀框(ORF)組成。已知兩類主要的PKS酶，其不同之處在于它們的組成和合成模式。這兩類主要的PKS酶通常被稱為I型或“定型(modular)”和II型或“迭代(iterative)”PKS酶。第三類PKS酶主要在真菌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，它具有I型和II型酶的特征，被稱為“真菌”PKS酶。
定型PKS負(fù)責(zé)產(chǎn)生大量的12-、14-和16-元大環(huán)內(nèi)酯抗生素，包括紅霉素、巨霉素、酒霉素、那波霉素、竹桃霉素、苦霉素和泰樂菌素。定型PKS的各ORF可含有一個、兩個或多個酮合成酶活性的“模塊”，各模塊由至少兩種(如果是負(fù)荷模塊的話)和多種、通常是三種(對于最簡單的補(bǔ)充模塊)或多種酶活性或“結(jié)構(gòu)域”組成。這些大的多功能酶(＞300000kDa)通過多步驟途徑催化聚酮大環(huán)內(nèi)酯(macrolactone)的生物合成，涉及?；蝓ラg的脫羧縮合，接著進(jìn)行多輪不同的β-碳加工活性循環(huán)〔參見O′Hagan，D.，The polyketidemetabolites；E.Horwood紐約，1991，本文將其納入作為參考〕。
在過去5年，利用6-脫氧赤酮酸內(nèi)酯B(6-dEB)合成酶(DEBS)基因開發(fā)基于質(zhì)粒的天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)表達(dá)系統(tǒng)，大大促進(jìn)了定型PKS的功能和特異性研究〔可參見Kao等，1994，Science，265509-512；McDaniel等，1993，Science，2621546-1557；和美國專利5672491和5712146，本文將各文獻(xiàn)納入作為參考〕。此DEBS的質(zhì)?；蛳到y(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是，它克服了用于操縱天然DEBS宿主生物紅色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)的冗長而有限的技術(shù)，使得構(gòu)建重組PKS更容易，并通過提供“清晰”的宿主背景而減少PKS分析的復(fù)雜性。這個系統(tǒng)還加速了鏈霉菌中的第一組合性定型聚酮化合物庫的構(gòu)建(參見PCT出版物WO98/49315和00/024907，本文將各文獻(xiàn)納入作為參考〕。
通過遺傳操縱PKS而控制聚酮化合物生物合成方面的能力，如單體選擇和β-碳加工的程度，已在新穎抗生素的組合工程方面激發(fā)了極大的興趣(可參見Hutchinson，1998，Curr.Opin.Microbiol.，1319-329；Carreras和Santi，1998，Curr.Opin.Biotech.，9403-411；和美國專利號5712146和5672491，本文將各文獻(xiàn)納入作為參考〕。這種興趣已引起了通過編碼PKS酶的基因的重組DNA技術(shù)而進(jìn)行的克隆、分析和操縱。所產(chǎn)生的技術(shù)使得人們可操縱已知的PKS基因簇，以由該P(yáng)KS以高于自然界的水平合成產(chǎn)生聚酮化合物，或者在本來不產(chǎn)生聚酮化合物的宿主中產(chǎn)生聚酮化合物。該技術(shù)還使得人們可生產(chǎn)其結(jié)構(gòu)與已知PKS基因簇產(chǎn)生的聚酮化合物相近但不相同的分子。
在通常不表達(dá)I型和II型PKS酶的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生聚酮化合物方面仍存在大量的興趣。例如，已報(bào)道在異源大腸桿菌、酵母和植物細(xì)胞中生產(chǎn)真菌聚酮化合物6-甲基水楊酸(6-MSA)。參見Kealey等，1998年1月，“不生產(chǎn)聚酮化合物的原核和真核宿主中產(chǎn)生聚酮化合物天然產(chǎn)物”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95505-9；美國專利號6033883和PCT出版物98/27203和99/02669，本文將這些文獻(xiàn)納入作為參考。異源酰基載體蛋白合成酶(ACPS)的共表達(dá)需要或大量增加6-MSA的異源生產(chǎn)，為此，對于大腸桿菌，培養(yǎng)基補(bǔ)充物將有助于增加6-MSA生物合成中利用的丙二酰CoA底物的水平。還可參見PCT出版物97/13845，本文將其納入作為參考。
其它聚酮化合物的生物合成需要除了丙二酰CoA外的其它底物。這些底物包括如丙酰CoA、2-甲基丙二酰CoA、2-羥基丙二酰CoA和2-乙基丙二酰CoA。但在許多可用作生產(chǎn)聚酮化合物的宿主的種種宿主細(xì)胞中，許多細(xì)胞天然不生產(chǎn)這種底物。此外，對于起始底物和補(bǔ)充分子的操縱，需操縱各種宿主中的裁剪(tailoring)酶，以獲得不同的聚酮化合物產(chǎn)物。此外，宿主在聚酮化合物同屬物生產(chǎn)中起著重要的作用。
細(xì)菌被分類為嚴(yán)格需氧菌(對于其生長氧是必需的)、兼性需氧菌(氧不是必需的，但有氧會促進(jìn)生長)、空氣耐受厭氧菌(氧對生長沒有影響)、嚴(yán)格厭氧菌(氧抑制生長)，或者微需氧菌(生長時需要低濃度的氧)。需氧菌的氧依賴性胞內(nèi)加工由氧化酶和加氧酶介導(dǎo)。嚴(yán)格需氧菌的例子是大多數(shù)的粘細(xì)菌和放線菌。需氧菌在微氧(低氧)條件下的生長是令人感興趣的，因?yàn)榕囵B(yǎng)物的生長性能和初級代謝物和次級代謝物的產(chǎn)生通常與在氧過量化的條件下所觀察到的情況不同(Winkelheusen等，1996；Schneider等，1999；Jensen等，2001；Liefke等，1990；Kaiser等，1994；Dick等，1994〕。下文將給出完整的作者引用的參考文獻(xiàn)及其出版年份，本文將各文獻(xiàn)全文納入作為參考。
放線菌目(Actinomycetales)和粘細(xì)菌目(Myxococcales)成員產(chǎn)生噁許多次級代謝物具有強(qiáng)大和不同的生物活性。聚酮化合物是一類由稱為聚酮化合物合成酶(PKS)的大的多功能酶產(chǎn)生的天然產(chǎn)物，通常隨后再經(jīng)酶途徑修飾(Carreras等，2000)。這些裁剪途徑酶的作用可包括糖基化、羥基化、甲基化、環(huán)氧化，或者對分子的核結(jié)構(gòu)進(jìn)行的其它各種變化。
在這些裁剪途徑中產(chǎn)生的各種中間化合物通常具有不同于最終化合物的生物能力。這方面的例子是抗菌化合物紅霉素B、C和D，這些化合物可通過一酶途徑而被加工成更強(qiáng)的紅霉素A同屬物，該酶途徑包括氧依賴性EryK羥化酶(參見

圖1)。可將紅霉素及其13-取代的類似物用作用于胃腸道促動(prokinetic)劑(稱為促胃動素，motilide)的半合成產(chǎn)物的前體。但是，紅霉素B對于EryK酶來說是非常差的底物，且它基本上是此途徑的支路終端產(chǎn)物(Lambalot等，1995)。紅霉素D分子的最終命運(yùn)取決于EryG甲基化酶和氧依賴性EryK羥化酶之間的競爭性反應(yīng)。先前已顯示，紅色糖多孢菌生物轉(zhuǎn)化6-脫氧赤酮酸內(nèi)酯B(6-dEB)類似物過程中，溶氧濃度在決定紅霉素A或B同屬物是否是這些培養(yǎng)的優(yōu)勢終端產(chǎn)物方面是關(guān)鍵的(Carreras等，1990)。
最近人們對埃博霉素(epothilone)類化合物(圖2)產(chǎn)生了興趣，因?yàn)檫@類化合物對于強(qiáng)抗癌化合物紫杉醇而言是潛在的化療繼任者(Bollag等，1995；Gerth等，1996)。紫杉醇(Taxol)和埃博霉素類化合物通過相同的作用機(jī)制使微管穩(wěn)定，但是埃博霉素類化合物能有效抵抗紫杉醇抗性腫瘤，并且更易溶于水(Kowalski等，1997；Su等，1997)。已在能產(chǎn)生其野生型的微生物纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)的發(fā)酵肉湯中鑒定到至少39種不同的埃博霉素變體和相關(guān)化合物(Hardt等，2001)。已報(bào)道在四種主要的埃博霉素同屬物A、B、C和D中，埃博霉素D具有最高的治療指數(shù)(Chou等，1998；Chou等2001)，但纖維堆囊菌產(chǎn)生的量非常低(Gerth等，2000)。埃博霉素PKS的酰基轉(zhuǎn)移酶4(AT4)結(jié)構(gòu)域可摻入丙二酰-CoA或甲基丙二酰-CoA補(bǔ)充單元中，通過這一選擇性而影響埃博霉素A和B之間或埃博霉素C和D之間的最終比例(Gerth等，2000)。埃博霉素D同屬物是環(huán)氧化成埃博霉素B的直接前體(圖3)，此環(huán)氧化反應(yīng)由EpoK單加氧酶催化(Julien等，2000；Gerth等，2001)。
紅霉素B和埃博霉素D是次級代謝物裁剪途徑的中間產(chǎn)物的例子，此中間產(chǎn)物有時是所需的產(chǎn)物。此外，還有其它許多天然產(chǎn)物的例子，其中單加氧酶反應(yīng)對于途徑中間產(chǎn)物加工成最終產(chǎn)物是必需的。例子包括將密實(shí)菌素生物轉(zhuǎn)化成能降低膽固醇的藥物pravastatin〔Serizawa等，1991；Watanabe等，1995〕、植物激素赤霉素的生產(chǎn)(Tudzynski等，1998)、真菌的霉菌毒素柄曲霉素(sterigmatocystin)的生產(chǎn)(Keller等，2000)和抗癌藥物阿霉素的生產(chǎn)(Lomovskaya等，Walczak等，1999)。
可采用遺傳方法消除這些氧依賴性酶的活性，但由于各種原因，這種遺傳工程方法可能證明是難以或不可能實(shí)現(xiàn)的。單加氧酶的直接遺傳滅活需要知道其序列并獲得其序列，還需要操縱宿主生物體的DNA的能力。本發(fā)明提供一種變通方法，用于生產(chǎn)作為主要產(chǎn)物的這些中間產(chǎn)物，而不需要對裁剪酶進(jìn)行任何的遺傳操縱。
鑒于這種在異源宿主細(xì)胞中大量生產(chǎn)有價(jià)值和有用的聚酮化合物潛力，需要能夠在修飾的同屬物分布中生產(chǎn)聚酮化合物的宿主細(xì)胞。本發(fā)明通過提供重組的宿主細(xì)胞、表達(dá)載體和在多種宿主細(xì)胞中生產(chǎn)聚酮化合物的方法而幫助滿足所述需要。
下述文獻(xiàn)提供了本發(fā)明的背景信息，本文將它們的全文納入作為參考。
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發(fā)明概述在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種不需要基因操縱聚酮化合物合成酶(PKS)基因或裁剪霉來調(diào)節(jié)異源宿主細(xì)胞中聚酮化合物同屬物分布的方法。
在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供代謝功能經(jīng)遺傳工程改造(metabolicallyengineered)的異源宿主細(xì)胞，通過在所述宿主細(xì)胞培養(yǎng)過程中控制氧壓力，可操縱該宿主細(xì)胞產(chǎn)生聚酮化合物同屬物的某種分布。
在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供能生產(chǎn)聚酮化合物的重組宿主細(xì)胞，當(dāng)在調(diào)節(jié)的氧壓力條件下培養(yǎng)時，該細(xì)胞轉(zhuǎn)而產(chǎn)生同屬物。在一個實(shí)施例中，該重組宿主細(xì)胞是纖維堆囊菌宿主細(xì)胞，能生產(chǎn)埃博霉素A和B，且當(dāng)在氧耗盡的條件下培養(yǎng)時轉(zhuǎn)而產(chǎn)生埃博霉素C和D。
在一個實(shí)施例中，異源宿主細(xì)胞產(chǎn)生的聚酮化合物是埃博霉素，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)期間的氧壓力，可調(diào)節(jié)該埃博霉素同屬物分布以產(chǎn)生埃博霉素D。
在一個實(shí)施例中，通過調(diào)節(jié)氧壓力而產(chǎn)生的埃博霉素同屬物分布導(dǎo)致在氧過量壓力條件下產(chǎn)生較高的埃博霉素D/埃博霉素C比例。在另一實(shí)施例中，埃博霉素C與埃博霉素D的比例在氧耗盡的條件下增加。在一個實(shí)施例中，由異源的粘球菌黃色粘球菌(Myxococcus xanthus)K111-32.25株生產(chǎn)埃博霉素同屬物。在一個實(shí)施例中，在K111-32.25株中，在氧過量壓力下生產(chǎn)埃博霉素A和B，而在氧耗盡壓力的條件下生產(chǎn)埃博霉素C和D。
在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種不需要進(jìn)行遺傳操縱而通過調(diào)節(jié)埃博霉素聚酮化合物合成酶(PKS)簇的模型4的氧壓力而改變埃博霉素的乙酰轉(zhuǎn)移酶(AT)結(jié)構(gòu)域的方法。在一個實(shí)施例中，菌株K111-32.25的AT特異性轉(zhuǎn)移為甲基丙二酰CoA，結(jié)果導(dǎo)致向C-12位具有甲基的同屬物(埃博霉素B或D)轉(zhuǎn)移。
在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供代謝功能經(jīng)遺傳工程改造的具有活性EpoK單加氧酶的異源宿主細(xì)胞產(chǎn)生的新的聚酮化合物。
在一個實(shí)施例中，通過調(diào)節(jié)異源宿主細(xì)胞培養(yǎng)期間的氧壓力而產(chǎn)生的新聚酮化合物是埃博霉素506。
附圖的簡要說明圖1顯示紅霉素B、C和D，可通過包括氧依賴性EryK羥化酶的途徑將其加工成更強(qiáng)的紅霉素A同屬物。
圖2顯示各種埃博霉素類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。(a)埃博霉素A(R1＝H；R2＝S)；埃博霉素B(R1＝CH3；R2＝S)；埃博霉素G1(R1＝H；R2＝O)；埃博霉素G2(R1＝CH3；R2＝O)。(b)埃博霉素C(R1＝H；R2＝S)；埃博霉素D(R1＝CH3；R2＝S)；埃博霉素H1(R1＝H；R2＝O)；埃博霉素H2(R1＝CH3；R2＝O)；(c)10，11-二脫氫-埃博霉素A(R1＝H)；10，11-二脫氫-埃博霉素B(R1＝CH3)；(d)10，11-二脫氫-埃博霉素C(R1＝H)；10，11-二脫氫-埃博霉素D(R1＝CH3)。
圖3顯示埃博霉素D同屬物是EpoK單加氧酶催化而環(huán)氧化形成埃博霉素B的直接前體。
圖4顯示在(a)氧過量的或(b)氧耗盡的條件下培養(yǎng)的K111-32.25(EpoK+)株，在氧耗盡的條件下產(chǎn)生的細(xì)胞密度比在氧過量條件下培養(yǎng)相同菌株時產(chǎn)生的細(xì)胞密度高60％。
圖5顯示(a)在產(chǎn)生最大活性的EpoK酶和埃博霉素A和B作為主要的最終產(chǎn)物的氧過量條件下，(b)在限制該酶的活性和埃博霉素C和D作為主要最終產(chǎn)物的條件下，和(c)在氧耗盡的條件下這些培養(yǎng)的結(jié)果與另一菌株(K111-40.1)在氧過量條件下(其中EpoK酶的活性已通過遺傳工程消除)獲得的結(jié)果類似的條件下，從培養(yǎng)的菌株K111-40.1(EpoK+)發(fā)酵液獲得的樹脂抽提物的HPLC色譜。
圖6顯示在氧過量條件下(a)10，11-二脫氫-埃博霉素B的插烯Payne重排(vinylogous Payne rearrangement)轉(zhuǎn)變成(b)Epo506。
圖7顯示在氧耗盡和氧過量條件下K165-79.7株的培養(yǎng)，產(chǎn)生10，11-二脫氫-埃博霉素D和Epo506間同屬物比例的轉(zhuǎn)移。
圖8顯示培養(yǎng)纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)Soce K111-150.17期間氧壓力的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移了埃博霉素產(chǎn)物分布。(a)在50％溶氧(DO)條件下的細(xì)胞生長；(b)和(c)低氧壓力。
圖9顯示三種不同的溶氧條件下的滴度時間過程。
圖10為顯示在t＝112小時時50％溶氧條件下獲得的epo A和epo B同屬物分布的HPLC色譜圖。
圖11顯示在112小時時0％溶氧條件下獲得的埃博霉素A、B、C和D峰值的HPLC色譜圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種生產(chǎn)作為主要產(chǎn)物的聚酮化合物中間產(chǎn)物的變通方法，該方法不需要對裁剪酶進(jìn)行任何基因操縱。本發(fā)明方法利用根據(jù)布達(dá)佩斯條約在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)保藏的宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞已獲得保藏號。黃色粘球菌(Myxococcus xanthus)K111-32.25株已于2000年5月1日保藏，保藏號為PTA-1700，黃色粘球菌(Myxococcus xanthus)K111-40.1株已于2001年1月18日保藏，保藏號為PTA-2712。纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)K111-150.17株已于＿＿＿＿＿＿＿保藏，保藏號為＿＿＿＿＿＿。
先前已描述了用于在異源的黃色粘球菌系統(tǒng)中生產(chǎn)埃博霉素D的進(jìn)料批次培養(yǎng)法(fed batch cultivation process)。在該進(jìn)料批次培養(yǎng)過程中，可調(diào)節(jié)或調(diào)整溶氧壓力，由過量的約50％的溶氧飽和度調(diào)整到氧耗盡或0％溶氧(測量的)，以轉(zhuǎn)移同屬物的生產(chǎn)。在進(jìn)料批次培養(yǎng)過程中，通過自動控制攪拌速率，將溶氧壓力維持在50％的空氣飽和度。當(dāng)攪拌速率的上限值被限定在不足以維持該溶氧壓力的值時，通過增加細(xì)胞密度而產(chǎn)生的連續(xù)增加培養(yǎng)物代謝需求，可最終耗盡培養(yǎng)肉湯中的氧。該培養(yǎng)物然后處于以下的代謝狀態(tài)，在該狀態(tài)中氧溶解到培養(yǎng)肉湯中的速率等于其被細(xì)胞消耗的速率。此代謝狀態(tài)導(dǎo)致溶氧探針的讀數(shù)為0，表明在該培養(yǎng)肉湯中沒有檢測到殘余的氧活性。然后，可開發(fā)此培養(yǎng)狀態(tài)用于將該加工途徑的氧依賴性裁剪酶的活性減到最小，同時仍提供足夠的氧以維持培養(yǎng)物的活力。
在生產(chǎn)埃博霉素的整個過程中，通過控制攪拌速率，將產(chǎn)生埃博霉素B的菌株(EpoK+)K111-32.25(ATCC保藏號PTA-1700，2000年5月1日)的培養(yǎng)物維持在過量的(50％的飽和度)和耗盡的(0％)溶氧壓力的條件下(圖4a、4b)。氧過量的條件導(dǎo)致EpoK酶的活性最大，并產(chǎn)生埃博霉素A和B作為主要的最終產(chǎn)物(圖5a)。氧耗盡條件限制了該酶的活性，產(chǎn)生埃博霉素C和D作為主要的最終產(chǎn)物(圖5b)。在氧耗盡化條件下的這些培養(yǎng)結(jié)果與使用另一菌株(K111-40.1，ATCC保藏號PTA-2712，2001年1月18日)在氧過量條件下(其中EpoK酶的活性已通過遺傳工程消除)產(chǎn)生的結(jié)果類似(圖5c)。
調(diào)節(jié)溶氧壓力除了影響埃博霉素類化合物的最大總滴度外，還影響埃博霉素A和B(或C和D)同屬物間的比例(可參見實(shí)施例2，表1)。但是，獲得這些最大滴度的時間不依賴于菌株類型或生物反應(yīng)器中的氧水平，因?yàn)楸?中所述的所有三種培養(yǎng)條件都在第12天前后獲得它們的最大總埃博霉素滴度?？蓪⒈oA或甲基丙二酰CoA補(bǔ)充單元(extender unit)摻入埃博霉素PKS的?；D(zhuǎn)移酶4(AT4)結(jié)構(gòu)域中，這種選擇性將影響這些埃博霉素同屬物間的最終比例(17)。氧濃度可能或?qū)Ρ：图谆?CoA的胞內(nèi)匯集分布產(chǎn)生間接的影響。K111-40.1(EpoK+)和K111-32.25(EpoK+)在氧過量條件下的培養(yǎng)導(dǎo)致向在C-12(埃博霉素B或D)具有甲基的同屬物的明顯轉(zhuǎn)移，表明細(xì)胞偏愛在此條件下生產(chǎn)和/或摻入甲基丙二酰-CoA(表1)。
EpoK+菌株在氧耗盡的條件下培養(yǎng)產(chǎn)生的細(xì)胞密度比相同菌株在氧過量下培養(yǎng)中獲得的細(xì)胞密度高60％(圖4a、4b)。氧過量培養(yǎng)的指數(shù)生長期在第7天停止，之后細(xì)胞密度維持為相對恒定的水平(圖4a)。在此指數(shù)生長期的比生長速率(μ)為0.7d-1。但是，當(dāng)氧耗盡培養(yǎng)時溶氧壓力由于攪拌級聯(lián)反應(yīng)的限制而在第4天達(dá)到0時，此培養(yǎng)物從其指數(shù)生長期轉(zhuǎn)為相對緩慢的生長(μ＝0.15d-1)，持續(xù)到第12天(圖4b)。用EpoK-菌株在氧耗盡條件下培養(yǎng)，以及用能產(chǎn)生新的埃博霉素類化合物的其它經(jīng)遺傳工程改造的黃色粘球菌菌株進(jìn)行培養(yǎng)，也觀察到類似的生長行為模式和最大細(xì)胞密度的增加。
在氧耗盡培養(yǎng)條件下細(xì)胞密度的增加可能歸因于(i)在因氧限制而強(qiáng)加的緩慢生長期間，細(xì)胞可能以不同的速率或不同的選擇模式利用養(yǎng)分，從而推遲了關(guān)鍵養(yǎng)分的耗盡；(ii)在氧限制過程中，培養(yǎng)物可產(chǎn)生不同類型或水平的潛在性抑制生長的代謝物，與氧過量條件下分泌的不同；或(iii)氧限制增加或壓制了參與細(xì)菌生長和呼吸過程的基因的表達(dá)和酶的活性。
培養(yǎng)細(xì)菌培養(yǎng)物過程中控制溶氧濃度可對培養(yǎng)物的細(xì)胞密度和次級代謝物滴度及其同屬物分布產(chǎn)生顯著的影響。這種氧限制性培養(yǎng)策略可用于生產(chǎn)氧依賴性裁剪途徑中的中間產(chǎn)物，作為主要產(chǎn)物。但是，單加氧酶活性不能完全被消除，而僅僅被減少到通常在氧過量條件下看到的最大速率的一部分。為了防止這些中間產(chǎn)物仍舊以緩慢的速率被加工，可能需要它們以一些方式穩(wěn)定化。這方面的一個例子是EryK羥化酶和紅霉素D底物的EryG甲基化酶間的競爭性反應(yīng)(圖1)。如果EryK活性下降，EryG則能夠催化紅霉素D轉(zhuǎn)化成紅霉素B，后者是EryK羥化酶的一種差的底物。這將產(chǎn)生該酶途徑中間產(chǎn)物——紅霉素B的積累。此途徑還包括另一樣氧依賴性裁剪酶EryF(如1)，該酶在限制性氧條件下保持了將6-脫氧赤酮酸內(nèi)酯B(6-dEB)加工成紅霉素B的能力。
這種中間產(chǎn)物積累的另一例子是具有活性EpoK酶的異源黃色粘球菌系統(tǒng)培養(yǎng)過程中埃博霉素D的產(chǎn)生。氧耗盡EpoK酶活性的下降顯然足以減緩催化埃博霉素D中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)變成其埃博霉素B同屬物，并使埃博霉素D擴(kuò)散出細(xì)胞，被生物反應(yīng)器中的XAD-16樹脂結(jié)合和固定。已顯示，在沒有樹脂存在時，將埃博霉素C和D加到保留EpoK活性、但是為非生產(chǎn)性的纖維堆囊菌菌株的搖瓶培養(yǎng)物中將導(dǎo)致這些化合物擴(kuò)散回細(xì)胞中，并轉(zhuǎn)化成埃博霉素A和B.Julien及其合作者發(fā)現(xiàn)，使用其埃博霉素PKS為非功能性、但EpoK活躍的黃色粘球菌菌株也存在相同的情況。
使用其埃博霉素聚酮化合物合成酶序列被操縱的菌株生產(chǎn)新的埃博霉素類化合物(Julien等，2000；Tang等，2000)。調(diào)節(jié)溶氧壓力，并與將特異性前體如乙酸鹽(acetate)、丙酸鹽(propionate)加到生產(chǎn)培養(yǎng)基中相結(jié)合，將允許四種主要埃博霉素同屬物A、B、C或D中的每一種的生產(chǎn)(圖2，F(xiàn)rykman等，2002)，作為具有活性EpoK酶的單個黃色粘球菌菌株的主要產(chǎn)物。
增加生產(chǎn)培養(yǎng)基中絲氨酸濃度將增加其被埃博霉素非核糖體肽合成酶(NRPS)摻入埃博霉素中替換半胱氨酸的相對程度(Frykman等，2002)。向K111-32.25株和生長培養(yǎng)基中補(bǔ)充絲氨酸，以及調(diào)節(jié)溶氧濃度，將導(dǎo)致噁唑埃博霉素G2或H2的產(chǎn)生，作為主要產(chǎn)物(圖2)。除了控制溶氧壓力外還將絲氨酸、乙酸鹽和/或丙酸鹽補(bǔ)充到生長培養(yǎng)基中，則可積累八種噻唑和噁唑類主要化合物(埃博霉素A、B、C、D、G1、G2、H1和H2)的任一種，作為單一黃色粘球菌菌株的主要產(chǎn)物。這種方法還能使噁唑配對物10，11-二脫氫-埃博霉素D和Epo506得以生產(chǎn)和同屬物調(diào)節(jié)。
已顯示野生型埃博霉素PKS能生產(chǎn)除埃博霉素A-D外的大約35種其它的埃博霉素變體(Hardt等，2001)。類似地，已發(fā)現(xiàn)埃博霉素PKS和遺傳工程產(chǎn)生的變體的異源表達(dá)產(chǎn)生了除預(yù)期產(chǎn)物外的大量新化合物。這些產(chǎn)物的濃度可根據(jù)通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件而得到提高或被抑制。通過操縱在其PKS序列中具有單一遺傳變化的菌株的培養(yǎng)條件而產(chǎn)生新化合物和調(diào)節(jié)其分布的能力證明，當(dāng)與合適的生理學(xué)調(diào)節(jié)結(jié)合時，工具PKS的工程改造在快速產(chǎn)生具有強(qiáng)生物活性的新天然產(chǎn)物中可能發(fā)揮強(qiáng)有力的作用。
以上詳細(xì)描述了本發(fā)明。給出下述實(shí)施例，這些實(shí)施例僅為闡述目的，不應(yīng)認(rèn)為這些實(shí)施例限制了本發(fā)明或權(quán)利要求書的范圍。
實(shí)施例1調(diào)節(jié)氧壓力條件下宿主細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)菌菌株。從纖維堆囊菌SMP44克隆得到埃博霉素聚酮化合物合成酶，將其導(dǎo)入黃色粘球菌DZ1株中(Julien等，在出版中)。黃色粘球菌的埃博霉素B生產(chǎn)者(K111-32.25)具有功能性EpoK環(huán)氧化酶(EpoK+)，但在埃博霉素D生產(chǎn)菌株(K111-40.1)中此酶已被遺傳滅活(EpoK-)。通過在K111-32.25和K111-40.1株中導(dǎo)入點(diǎn)突變而消除埃博霉素PKS的烯?；€原酶(ER5)結(jié)構(gòu)域的活性，分別得到K165-79.7和K165.76.2株。將K165-79.7和K165.76.2株工程改造，分別產(chǎn)生10，11-二脫氫-埃博霉素B和D(圖2)。
生物反應(yīng)器接種擴(kuò)增。所有的培養(yǎng)基組分從Sigma(St.Louis，MO)獲得，除非另有說明。在28℃和175rpm，將1毫升存儲瓶中的冷凍細(xì)胞加入含有3毫升CYE-MOM培養(yǎng)基〔10g/L的酪胨(酪蛋白的一種胰腺消化物，Difco，Detroit，MI)、5g/L酵母抽提物(Difco)、1g/L MgSO4·7H2O(EM Science，Gibbstown，NJ)和2mL/L的油酸甲酯(Emerest 2301，Cognis公司，Cincinnati，OH)〕的25毫升無菌玻璃管中恢復(fù)，從而開始所有的黃色粘球菌培養(yǎng)。在含有50毫升CYE-MOM的250毫升帶有擋板的Erlenmyeyer燒瓶中擴(kuò)增該試管中的全部內(nèi)容物1天，然后，將此瓶中的內(nèi)容物接種到2.8升帶有擋板的Fernbach燒瓶中的500毫升CYE-MOM中，培養(yǎng)1天。
進(jìn)料批次生物反應(yīng)器培養(yǎng)。將100克XAD-16疏水性樹脂(Eohm和Haas，Philadelphia，PA)和10克MgSO4·7H2O與4.5升去離子水混合，然后在5升生物反應(yīng)器(B.Braun，Allentown，PA)中進(jìn)行無菌處理(90分鐘，121℃)。將該樹脂加入生長培養(yǎng)基中，以結(jié)合埃博霉素和使它們穩(wěn)定而不降解。將兩個分離的進(jìn)料回路與生物反應(yīng)器連接，分別提供酪蛋白消化物和油酸甲酯的250g/L溶液，并向生物反應(yīng)器加入足量的這兩種營養(yǎng)成分，以使最初的酪蛋白消化物和油酸甲酯的濃度分別達(dá)到5g/L和2mL/L。最后，在無菌條件下加入25毫升經(jīng)0.22微米濾膜無菌過濾的微量元素溶液〔1％(v/v)濃H2SO4，14.6g/LFeCl3·6H2O、2.0g/L ZnCl3、1.0g/L MnCl2·4H2O、0.43g/L CuCl2·2H2O、0.31g/LH3BO3、0.24g/L CaCl2·6H2O和0.24g/L Na2MO4·2H2O〕。然后在生物反應(yīng)器中接種CYE-MOM種子培養(yǎng)物(5％v/v)，接種后的最初48小時加入酪蛋白消化物(2g/L/天)和油酸甲酯(3mL/L/天)。維持生物反應(yīng)器中的氣流恒定在0.4vvm(氣流體積/容器體積/分鐘)。
使用原位極譜法氧傳感器監(jiān)測生物反應(yīng)器中溶氧壓力。通過用100％氮?dú)馄胶馍a(chǎn)培養(yǎng)基而在0％溶氧壓力校準(zhǔn)該探針，以及通過用空氣平衡該生產(chǎn)培養(yǎng)基而在100％溶氧壓力校準(zhǔn)該探針。將最初的攪拌速率設(shè)定在400rpm，在培養(yǎng)過程中不使用額外的生物反應(yīng)器背景壓力。氧在28℃的飽和濃度大約為7.7mg/L(Pirt，S.J.，1975)。通過在氧過量培養(yǎng)中的攪拌級聯(lián)而將溶氧壓力維持在最小50％的空氣飽和度(3.9mg/L O2)，在氧耗盡的培養(yǎng)中將攪拌速率限制在最大450rpm。通過自動加入2.5N H2SO4和2.5N KOH而將pH設(shè)定為7.4。每天對生物反應(yīng)器采樣，共12-14天，接著收獲樹脂。
細(xì)胞密度和埃博霉素滴度的定量測定。每天從生物反應(yīng)器中取出50毫升的培養(yǎng)基樣品，放到錐形試管中，將肉湯從樹脂中傾清。將1mL等份的肉湯在1.5毫升eppendorf管中離心5分鐘(12000g)，用移液管除去上清液。用去離子水再懸浮細(xì)胞沉積物，得到1毫升的總體積，用分光光度計(jì)(Genesys 20，Thermo Spectronic，Rochester，NY)在600nm測量該細(xì)胞懸液的吸光度。黃色粘球菌培養(yǎng)物生長成分散的單細(xì)胞棒狀，這有利于精確的光密度(OD)測量。1.0吸光度單位的OD測量值與大約0.3g/L的干細(xì)胞重量相關(guān)，線性相關(guān)性的范圍為0-40OD單位。
用45毫升去離子水洗滌XAD-16樹脂一次，接著將水傾清。在25毫升試劑級甲醇中抽提樹脂30分鐘，然后采用HPLC或LC/MS定量測定埃博霉素的滴度。使用Hewlett Packard 1090 HPLC(Palo Alto，CA)作UV檢測，在250nm進(jìn)行HPLC分析。將50微升等份的甲醇抽提溶液注射通過兩個4.6×10毫米規(guī)格的預(yù)柱(MetaChem Inertsil C18 ODS 3，5μm，Ansys，Lake Forest，CA)，另一較長的柱(相同材料)用作色譜分離(4.6×150毫米)。此方法用70％乙腈和30％水進(jìn)行12分鐘的等度(isocratic)洗脫。對相同的樣品進(jìn)行LC/MS分析，將樣品注入PE Sciex API100LC(Perkin-Elmer，Shelton，CT)，使用APCI來源和與上述相同的預(yù)柱和色譜柱。色譜方法是用線性梯度從35％遞增到100％的乙腈/水，時間為10分鐘。
實(shí)施例2新埃博霉素類化合物的生產(chǎn)埃博霉素PKS已經(jīng)基因工程改造，以產(chǎn)生本發(fā)明的能產(chǎn)生新埃博霉素類化合物的菌株，該化合物潛在地具有增加的水溶性和/或有力的抗腫瘤細(xì)胞系。將本發(fā)明的氧控制方法施用于經(jīng)工程處理的黃色粘球菌生產(chǎn)菌株(K165-79.7株，EpoK+)，該菌株已被基因工程加工成生產(chǎn)新的埃博霉素——10，11-二脫氫-埃博霉素B(圖2)。當(dāng)其配對物K165-76.2(EpoK-)株在氧過量條件下培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)10，11-二脫氫-埃博霉素C和D是唯一的產(chǎn)物(圖2)。K165-79.7株中活性EpoK酶預(yù)期在氧過量存在下催化此10，11-二脫氫-埃博霉素D中間產(chǎn)物環(huán)氧化成10，11-二脫氫-埃博霉素B(圖6a)。但是，此化合物沒有被檢測到，相反，一種新穎的異構(gòu)體(Epo506)反而是這些培養(yǎng)的主要產(chǎn)物(圖6b)。采用高分辨率質(zhì)譜和一維、二維NMR確定這種四氫呋喃產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)(參見實(shí)施例1)。
所觀察到的這種結(jié)果可能是一個過程的產(chǎn)物，籍此過程該10，11-二脫氫-埃博霉素B在這些氧過量條件下形成，然后被通過插烯Payne重排而被轉(zhuǎn)化成Epo506，如圖6所歸納的。這種反應(yīng)是有利的，因?yàn)榄h(huán)氧化物被開環(huán)，產(chǎn)生了相對穩(wěn)定的烯丙基碳陽離子中間產(chǎn)物。K165-79.7株在氧耗盡和氧過量條件下的培養(yǎng)導(dǎo)致10，11-二脫氫-埃博霉素D和Epo506之間的同屬物比例的轉(zhuǎn)移(圖7)，這與在所述兩種溶氧水平條件下培養(yǎng)親代K111-32.25菌株所獲得的環(huán)氧化的和未環(huán)氧化的埃博霉素化合物之間的同屬物轉(zhuǎn)移類似(表1)。
用裝配有成陽離子狀態(tài)的渦輪-離子噴射源的Mariner TOF分光計(jì)(AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，CA)獲得了Epo506的高分辨率質(zhì)譜圖。在裝備了QNPz-軸梯度探頭(probehead)的DRX 400分光計(jì)(Bruker，Billerica，MA)記錄300K處Epo506的1-D和2-D NMR譜圖?；瘜W(xué)漂移分別參見1H和13C光譜圖的δ7.26和77.0。
采用HREIMS測定在m/z 506.25887(根據(jù)C27H40NO6S 506.25709計(jì)算)的[M+H]+峰值，測得Epo506的分子式為C27H39NO6，表明相對于10，11-二脫氫-埃博霉素D有一個氧摻入。13C光譜表明，Epo506具有一個雙鍵，少于10，11-二脫氫-埃博霉素D，提示Epo506含有一個額外的環(huán)。HSQC、HMBC、COSY和TOCSY數(shù)據(jù)明確了碳的連接性排列。第3、7、10和13位碳的化學(xué)漂移表明所有這四個碳都結(jié)合有氧原子。這些氧化的碳中，推測有兩個成為占據(jù)了該分子式的環(huán)醚的一部分。在1-D和2-D光譜中可看出碳3和13上的羥基質(zhì)子，它們與相鄰原子的HMBC和COSY相關(guān)性證實(shí)了它們的排列。因此，該環(huán)醚必須包括碳7和碳10，表明其為四氫呋喃結(jié)構(gòu)。該質(zhì)譜中顯著的Na+和K+加合物也證實(shí)，LC/MS在506.3觀察到的離子是真實(shí)的分子性離子，而不是推測的親代二醇離子化后產(chǎn)生的片段。
表1.K111-40.1株中埃博霉素同屬物的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)條件(菌 峰值埃博霉峰值埃博霉 總(A-D)埃博埃博霉素 埃博霉素株，氧水平) 素B滴度 素D滴度 霉素滴度 B∶A同屬物D∶C同屬物(mg/L)(mg/L) (mg/L) 比率 比率K111-32.25 48 3 60 5.8∶13.6∶1(EpoK+)氧過量K111-32.25 3 19 34 2.5∶11.7∶1(EpoK+)氧耗盡K111-40.10 30 36 - 5.2∶1(EpoK-)氧過量實(shí)施例3在纖維堆囊菌Soce90 K111-150.17株中調(diào)節(jié)埃博霉素同屬物生產(chǎn)已顯示，在異源宿主細(xì)胞培養(yǎng)過程中調(diào)節(jié)溶氧可轉(zhuǎn)移聚酮化合物的同屬物分布。在此實(shí)施例中，當(dāng)在氧耗盡的條件下培養(yǎng)時，使產(chǎn)生埃博霉素的菌株接受導(dǎo)致埃博霉素同屬物分布轉(zhuǎn)移的氧壓力。纖維堆囊菌(Sorangiumcellulosum)Soce90 K111-150.17(ATCC保藏號＿＿＿＿)是通過UV誘變從Soce90親代株衍生得到的利福霉素抗性變體(B.Julien，未公開的結(jié)果)。本實(shí)施例采用的培養(yǎng)方法和分析方法與實(shí)施例1所述的相同。
纖維堆囊菌Soce90 K111-150.17株是具有活性epoK基因的埃博霉素A和B的生產(chǎn)菌株。圖8a闡述了隨著時間推移的細(xì)胞生長，通過在三種不同的溶氧(DO)和氣流(測量為1pm，即升/分鐘)條件下在600nm測量光密度(OD)而獲得。圖8b顯示溶氧調(diào)節(jié)對埃博霉素產(chǎn)物分布的影響。埃博霉素A和B的生產(chǎn)菌株——纖維堆囊菌Soce90 K111-150.17株在0％耗盡溶氧的條件下產(chǎn)生埃博霉素C和D。表2顯示該K111-150.17株在不同氧壓力條件下產(chǎn)生的觀察到的埃博霉素滴度。對于K111-150.17株而言，在0％耗盡溶氧的條件下觀察到的埃博霉素D的生產(chǎn)量比在50％過量溶氧條件下觀察到的高幾倍。
表2.K111-150.17株在氧耗盡條件下埃博霉素同屬物比例的轉(zhuǎn)移
圖9顯示K111.150.17株在三種不同的溶氧方案中產(chǎn)生埃博霉素A、B、C和D的時間過程，顯示在低氧壓方案中埃博霉素D具有較高的生產(chǎn)。在50％溶氧壓力和0％溶氧壓力下進(jìn)行發(fā)酵所獲得的發(fā)酵物的HPLC色譜顯示，在50％氧壓力下幾乎唯一產(chǎn)生埃博霉素A和B，但在低氧壓力先產(chǎn)生了較高量的埃博霉素C和D。
上述實(shí)施例僅僅是闡述性的。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，它們并非是本發(fā)明的限制性實(shí)施例，如發(fā)明人在以下的權(quán)利要求書中所要求的那樣。
權(quán)利要求
1.一種在受控的氧壓力條件下培養(yǎng)的重組粘細(xì)菌宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有聚酮化合物合成酶(PKS)基因，該基因在表達(dá)控制序列的控制之下，其中，當(dāng)所述宿主細(xì)胞在導(dǎo)致所述聚酮化合物產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)時，所述PKS基因表達(dá)產(chǎn)生聚酮化合物，所述宿主細(xì)胞還含有編碼有活性的氧敏感細(xì)胞色素P-450單加氧酶裁剪酶的基因。
2.如權(quán)利要求1所述的粘細(xì)菌宿主細(xì)胞，其特征在于，所述聚酮化合物是埃博霉素。
3.如權(quán)利要求2所述的粘細(xì)菌宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)K111-150.17株，所述氧敏感細(xì)胞色素P-450單加氧酶是EpoK環(huán)氧化酶。
4.一種將宿主細(xì)胞中埃博霉素聚酮化合物合成酶(PKS)中的乙酰轉(zhuǎn)移酶(AT)結(jié)構(gòu)域補(bǔ)充單元特異性從丙二酰-CoA改便為甲基丙二酰-CoA的方法，其特征在于，所述方法包括在能產(chǎn)生埃博霉素的條件下在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，并將氧壓力調(diào)節(jié)為過量的溶氧。
5.一種調(diào)節(jié)粘細(xì)菌宿主細(xì)胞中聚酮化合物同屬物分布產(chǎn)生比例的方法，其特征在于，所述方法包括在能產(chǎn)生聚酮化合物的條件下在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，并在培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞的過程中調(diào)節(jié)氧壓力，使所述聚酮化合物同屬物的種類的產(chǎn)生發(fā)生轉(zhuǎn)移。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法還包括給所述生長培養(yǎng)基補(bǔ)充絲氨酸。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法還包括給所述生長培養(yǎng)基補(bǔ)充乙酸鹽。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法還包括給所述生長培養(yǎng)基補(bǔ)充丙酸鹽。
9.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述聚酮化合物是埃博霉素。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，將所述氧壓力調(diào)節(jié)為低氧壓力，所產(chǎn)生的聚酮化合物同屬物為埃博霉素D。
11.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是黃色粘球菌(Myxococcus xanthus)，具有活性EpoK+單加氧酶。
12.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)K111-150.17株。
13.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為黃色粘球菌(Myxococcus xanthus)K111-32.25株。
14.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，在低氧壓力下獲得所述埃博霉素D同屬物。
15.如權(quán)利要求10所述的方法，所述埃博霉素D同屬物的濃度比在氧過量壓力條件下產(chǎn)生的濃度高4倍。
16.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，在氧耗盡培養(yǎng)條件下所述埃博霉素同屬物從埃博霉素A和B轉(zhuǎn)移成為埃博霉素C和D同屬物分布。
17.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，在氧過量條件下所述埃博霉素D與埃博霉素C同屬物的比例至少為3∶1。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述粘細(xì)菌宿主細(xì)胞是EpoK-。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述粘細(xì)菌宿主細(xì)胞是黃色粘球菌(Myxococcus xanthus)K111-40.1株。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述氧壓力為低于50％溶氧。
全文摘要
本發(fā)明提供一種通用的氧限制性培養(yǎng)方法，用于培養(yǎng)經(jīng)基因工程改造的能在不同氧壓力條件下異源表達(dá)聚酮化合物合成酶(PKS)基因簇的粘細(xì)菌菌株，調(diào)節(jié)聚酮化合物同屬物分布。
文檔編號C12N1/21GK1639319SQ03804528
公開日2005年7月13日 申請日期2003年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月25日
發(fā)明者P·J·利卡, B·朱利恩, S·弗呂克曼, H·斯路塔 申請人:高山生物科學(xué)股份有限公司