專(zhuān)利名稱(chēng):新的高靈敏度核酸解析法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及以使用稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑作為發(fā)光色素為特征的高靈敏度的SNP解析方法,更詳細(xì)地講,涉及以使用稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑作為發(fā)光色素,根據(jù)時(shí)間分辨熒光測(cè)定對(duì)熒光發(fā)光進(jìn)行測(cè)定為特征的高靈敏度核酸單核苷酸多態(tài)性解析法。另外,本發(fā)明涉及由特定的稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑以及特定的熒光猝滅標(biāo)記試劑的組合構(gòu)成的熒光發(fā)光控制用組合物。另外,本發(fā)明還涉及在FRET探針等高靈敏度標(biāo)記探針中使用稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑作為發(fā)光色素,而且作為消光物質(zhì)使用熒光猝滅標(biāo)記試劑為特征的高靈敏度標(biāo)記探針,以及含有該探針的SNP解析用試劑盒。
背景技術(shù):
以往,作為人基因組DNA的單核苷酸多態(tài)性(縮寫(xiě)為SNP)解析法,有TaqMan PCR法,MALDI-TOF/MS法,DNA芯片法、Invader法、利用RCA(rolling circle amplification)的方法等方法。這些方法各有其特征,可以用于各種各樣的SNP的解析。
TaqMan PCR法是利用PCR反應(yīng)的SNP解析法,具有解析步驟少的優(yōu)點(diǎn)(T.Morris等,J.Clin.Microbiol.,1996,34,2933.K.J.Livak等,Genet.Anal.,1999,14,143)。然而,該方法對(duì)于解析1種SNP由于需要2種熒光標(biāo)記探針,所以存在著標(biāo)記探針制作費(fèi)用高的缺點(diǎn)。
MALDI-TOF/MS(Matris assisted laser desorption-time offlight/mass spectrometry)法雖然具有對(duì)于1SNP解析只使用一條不標(biāo)記的引物就可完成的優(yōu)點(diǎn)(L.A.Haff,Genome Res.,1997,7,378.P.Ross等,Nat.Biotechnol.,1998,16,1347),但存在著作業(yè)的步驟非常多,涉及到靶區(qū)域的PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物的純化、引物的延伸反應(yīng)、引物延伸反應(yīng)產(chǎn)物的純化、質(zhì)量測(cè)定樣品的點(diǎn)印、質(zhì)量分析等的缺點(diǎn)。
DNA芯片法具有一次可以進(jìn)行大量SNP解析的優(yōu)點(diǎn)(D.G.Wang等,Science,1998,280,1077.J.G.Hacia等,Nat.Genet.,1999,22,164.P.N.Glles等,Nat.Biotechnol.,1999,17,365)。該方法由于在DNA芯片上進(jìn)行雜交前需要PCR,對(duì)于解析大量的SNP存在著事前必需要進(jìn)行大量的PCR的缺點(diǎn)。
Invader法SNP解析的步驟少,不需要PCR和熒光標(biāo)記等位基因特異低聚物,只是將共通的突出端(flap)加到各個(gè)等位基因特異低聚物中即可。
圖1作為模式圖給出了利用Invader法的核酸單核苷酸多態(tài)性解析法的梗概。該方法就象圖1所示的那樣,是判定在被檢體DNA(靶DNA)中的「N」位置存在成為SNP的堿基的方法。為此使用報(bào)告探針(第一探針)、侵略者探針(invader probe)(第二探針)、以及檢測(cè)用的FRET探針(FREP probe)(熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針(FREP(FiorescenceResonance Energy Transfer)探針)。報(bào)告探針在從被檢體DNA的SNP的位置開(kāi)始的5’一側(cè)含有互補(bǔ)的堿基序列,還含有稱(chēng)之為「突出端」的堿基序列部分。該突出端部分的堿基序列成為與FRET探針的3’一側(cè)的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列。另外,侵略者探針是在被檢體DNA的3’一側(cè)含有互補(bǔ)堿基序列的探針。SNP位置(圖1中「N」表示的位置)中的被檢體DNA的堿基「N」是單核苷酸多態(tài)性部位的堿基、A、T、G、C中的一個(gè)。報(bào)告探針的堿基「N1」是可與N形成正常的堿基對(duì)的堿基,而侵略者探針的堿基「N2」是任意的堿基。
FRET探針是在3’側(cè)含有用于結(jié)合突出端部分的單鏈部分的探針。FRET探針的5’側(cè)全部或一部分已經(jīng)形成了雙鏈。在圖1中,5’側(cè)的全部雖然已經(jīng)表示為形成雙鏈,但未必需要全部都變成雙鏈,這里是為了說(shuō)明,按照?qǐng)D1進(jìn)行說(shuō)明。而在FRET探針的5’側(cè)的末端部分,結(jié)合有發(fā)光色素「Ln」和消光物質(zhì)「Q」。消光物質(zhì)「Q」存在于發(fā)光色素「Ln」的一定距離內(nèi)時(shí),發(fā)光色素的發(fā)光被消光,觀察不到發(fā)光。
在Invader法中,首先在被檢體DNA中結(jié)合報(bào)告探針和侵略者探針,此時(shí)報(bào)告探針的堿基「N1」和被檢體DNA的堿基「N」的堿基對(duì)間象Invader(入侵者)那樣插入了侵略者探針的堿基「N2」。表示這樣狀態(tài)的是圖1最上段給出的狀態(tài)。
如果使特異作用于這樣的3堿基糾纏在一起的狀態(tài)的裂解酶(結(jié)構(gòu)特異性5’核酸酶structure-specific 5’nuclease)作用,則該裂解酶在堿基「N1」的位置切斷報(bào)告探針,只使突出端部分的片段形成。然后該突出端部分與FRET探針的3’側(cè)結(jié)合。表示該狀態(tài)的是圖1的中段。此時(shí),含有突出端部分的堿基「N1」的前端部分變成了插入FRET探針的雙鏈部分那樣的狀態(tài)。該狀態(tài)是與先前的入侵的狀態(tài)同樣,成為裂解酶作用的特異切斷位置。然后,利用該裂解酶,將FRET探針的5’末端側(cè)從插入了突出端部分的部分切斷。
被切斷的FRET探針的5’側(cè)結(jié)合著發(fā)光色素「Ln」,由于該切斷,發(fā)光色素「Ln」與消光物質(zhì)「Q」脫離,結(jié)果可以觀察到發(fā)光色素「Ln」的發(fā)光。表示這樣狀態(tài)的是圖1的最下段給出的狀態(tài)。發(fā)光色素「Ln」由消光物質(zhì)「Q」開(kāi)放,變成顯示出本來(lái)的發(fā)光。
在報(bào)告探針的堿基「N1」與被檢體DNA的堿基「N」不能形成正常的堿基對(duì)時(shí),由于不能形成入侵者那樣的狀態(tài),也就不能被裂解酶切斷。因此,可以通過(guò)發(fā)光判定被檢體DNA的堿基「N」是否是可以與報(bào)告探針的堿基「N1」形成正常堿基對(duì)的堿基。
這樣,在Invader法中,被檢體DNA不用說(shuō)了,無(wú)論是報(bào)告探針還是侵略者探針也都不需要標(biāo)記,需要標(biāo)記的只是FRET探針。而且該FRET探針只與突出端部分的堿基序列有關(guān),特別是與突出端部分的堿基「N1」也沒(méi)有關(guān)系,由于對(duì)被檢體DNA的堿基序列完全沒(méi)有影響,是與被檢體無(wú)關(guān),根據(jù)可任意決定的突出端部分的堿基產(chǎn)生的探針,具有可以大量生產(chǎn),探針制作費(fèi)用大幅度減少的優(yōu)點(diǎn)。
然而,在以往的方法中,由于測(cè)定靈敏度不充分,為了解析1SNP,需要數(shù)十毫微克的基因組DNA,要解析大量的SNP,存在著需要大量基因組DNA的缺點(diǎn)。
發(fā)明的公開(kāi)鑒于上述那樣的狀況,本發(fā)明目的在于提供高靈敏度的SNP解析方法,提供利用微量的被檢體DNA可以迅速進(jìn)行大量的SNP解析的SNP解析方法。另外,本發(fā)明的目的還在于提供高靈敏度的發(fā)光色素,更詳細(xì)地講是提供由高靈敏度的發(fā)光色素和消光物質(zhì)構(gòu)成的熒光發(fā)色組合物。另外,本發(fā)明還提供在核酸SNP解析法中提供使用用高靈敏度的發(fā)光色素和消光物質(zhì)構(gòu)成的FRET探針等高靈敏度標(biāo)記探針,以及使用該探針的時(shí)間分辨熒光測(cè)定的最高靈敏度的SNP解析法。
附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明圖1是表示利用invader法的SNP解析法的梗概的模式圖。
圖2是表示本發(fā)明的FRET探針的例子的梗概的模式圖。
圖3是以用BPTA-Tb3+和Dabcyl構(gòu)成的FRET探針的情形為例模式地表示本發(fā)明的SNP解析法的圖。
圖4表示本發(fā)明的熒光猝滅標(biāo)記試劑Dabcyl的吸收光譜以及本發(fā)明的稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑BPTA-Tb3+的熒光發(fā)光光譜。圖4的橫軸為波長(zhǎng)(nm),左側(cè)的縱軸表示熒光強(qiáng)度,右側(cè)縱軸表示吸收。
圖5表示在本發(fā)明的方法中,伴隨著被檢體DNA的濃度變化而引起的熒光強(qiáng)度的變化。圖5的橫軸為被檢體DNA(靶DNA)的濃度(pM),縱軸表示熒光強(qiáng)度。
實(shí)施發(fā)明的最好方式以往,稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑強(qiáng)烈依賴(lài)于配體的構(gòu)造和組成,有時(shí)也有強(qiáng)的熒光強(qiáng)度,幾種稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑已經(jīng)被用于時(shí)間分解熒光分析中。然而,這些試劑是利用稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑的強(qiáng)的熒光強(qiáng)度的試劑,有關(guān)利用稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑和熒光猝滅標(biāo)記試劑的組合的發(fā)光控制還沒(méi)有開(kāi)發(fā)。本發(fā)明通過(guò)特定稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑和特定熒光猝滅標(biāo)記試劑的組合,發(fā)現(xiàn)可以進(jìn)行發(fā)光的控制。
即,本發(fā)明涉及SNP的解析方法,其特征是在通過(guò)使用含有發(fā)光色素和消光物質(zhì)的FRET探針的invader法的SNP的解析方法或通過(guò)使用發(fā)卡結(jié)構(gòu)的探針的分子信標(biāo)(molecular beacon)法的SNP的解析方法等方法中,作為在高靈敏度標(biāo)記探針中的發(fā)光色素使用稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑。更詳細(xì)地講,本發(fā)明涉及以使用含有以下通式(1)~(6)表示的任一種配體形成的稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑為特征的SNP的解析方法。再詳細(xì)地講,涉及以作為消光物質(zhì)使用以下通式(7)~(9)表示的任一個(gè)熒光猝滅標(biāo)記試劑為特征的SNP的解析方法。再詳細(xì)地講,本發(fā)明涉及作為熒光測(cè)定法以使用時(shí)間分辨熒光測(cè)定為特征的高靈敏度SNP的解析方法。
另外,本發(fā)明還涉及由特定的稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑以及特定的熒光猝滅標(biāo)記試劑的組合構(gòu)成的熒光發(fā)光控制用組合物。更詳細(xì)地講,涉及到含有由以下通式(1)~(6)表示的配體和稀土類(lèi)元素構(gòu)成的稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑的1種或2種或其以上,以及由以下通式(7)~(9)構(gòu)成的熒光猝滅標(biāo)記試劑的1種或2種或其以上構(gòu)成的熒光發(fā)光控制用組合物。
(1)~(6)中,n表示1~4的整數(shù),R表示含有取代基的芳基,R’表示氨基、羥基、羧基、磺酸基、或異硫氰酸酯基)。
(式(7)~(9)中,m表示1~4的整數(shù),R1、R2中任一方表示用于與載體或核酸進(jìn)行固定的連接基,而另一方表示氫原子或烷基,R3表示用于對(duì)載體或核酸進(jìn)行固定的連接基)。
另外,本發(fā)明涉及作為發(fā)光色素使用稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑,且作為消光物質(zhì)使用熒光猝滅標(biāo)記試劑的FRET探針等高靈敏度標(biāo)記探針,更詳細(xì)講,作為發(fā)光色素使用1種或2種或其以上由上述通式(1)~(6)表示的配體和稀土類(lèi)元素構(gòu)成的稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑,且作為消光物質(zhì)使用1種或2種或其以上由上述通式(7)~(9)構(gòu)成的熒光猝滅標(biāo)記試劑的高靈敏度標(biāo)記探針。
另外,本發(fā)明涉及含有上述本發(fā)明的高靈敏度標(biāo)記探針的SNP解析用組合物或SNP解析試劑盒。
本發(fā)明的特征是作為圖1中的發(fā)光色素,使用稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑「Ln」、更詳細(xì)講使用由上述通式(1)~(6)表示的配體和稀土類(lèi)離子構(gòu)成的稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑,且作為消光物質(zhì)使用熒光猝滅標(biāo)記試劑「Q」,更詳細(xì)地講,使用由上述通式(7)~(9)構(gòu)成的熒光猝滅標(biāo)記試劑。
圖2給出了本發(fā)明的FRET探針的例子。在該例子中,稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑「Ln」被表示在探針的5’末端,但本發(fā)明的FRET探針并不限定于此。本發(fā)明的FRET探針只要是熒光猝滅標(biāo)記試劑「Q」位于對(duì)由稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑「Ln」引起的熒光進(jìn)行消光的充分的距離,而且稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑「Ln」或熒光猝滅標(biāo)記試劑「Q」位于當(dāng)變成入侵者(invader)狀態(tài)時(shí)被裂解酶切斷后游離的位置,通過(guò)裂解,兩者分離,兩者的距離被保持在對(duì)于觀察發(fā)光充分的距離即可,并不限定于圖2例舉的位置。
為了更具體說(shuō)明本發(fā)明,作為稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑,使用鋱離子和有機(jī)配體N,N,N1,N1-[2,6-雙(3-氨基甲基-1’-吡唑基)-4-苯基吡啶]四乙酸(N,N,N1,N1-[2,6-bis(3’-aminomethyl-1’-pyrazolyl)-4-phenylpyridine]tetrakis(acetic acid))(上述通式(2)中的置換基R為苯基的物質(zhì),以下縮寫(xiě)為BPTA)構(gòu)成的鋱絡(luò)合物熒光標(biāo)記試劑(以下縮寫(xiě)為BPTA-Tb3+),作為熒光猝滅標(biāo)記試劑使用式(9)表示的化合物(以下縮寫(xiě)為Dabcyl)進(jìn)行說(shuō)明。BPTA以及其N(xiāo)-羥基酰琥珀酰亞胺單酯(縮寫(xiě)為NHS-BPTA)的合成根據(jù)本發(fā)明人報(bào)道的方法(J.Yuan,G.Wang,K.Majima,K.Matsumoto,Anal.Chem.,2001,73,1869)進(jìn)行。BPTA-Tb3+的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下。
另外,作為DNA寡核苷酸使用如下序列。作為被檢體DNA使用如下的序列,3TGTGTCACAGGAGGGCGAGGAGGACTCGTGGGAGGAGGAGAAGG5′作為報(bào)告探針使用如下序列5′AACGAGGCGCACCCCTCCTCCTCTTCC3′作為侵略者探針使用如下序列。
5′ACACAGTGTCCTCCCCGCTCCTCCTGAGCAC3′作為對(duì)稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑BPTA-Tb3+以及熒光猝滅標(biāo)記試劑Dabcyl進(jìn)行了固定化的FRET探針使用如下結(jié)構(gòu)的探針。
使用這些試劑,根據(jù)圖1所示的invader法的概要,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。圖3給出了具體方法的概要。圖3的被檢體DNA(靶DNA)的下劃線(xiàn)部分表示要檢測(cè)SNP的位置。
測(cè)定了Dabcyl的吸收光譜和BPTA-Tb3+的熒光發(fā)光光譜,結(jié)果如圖4所示。圖4的橫軸為波長(zhǎng)(nm),左側(cè)的縱軸表示熒光強(qiáng)度,右側(cè)縱軸表示吸收。圖4的虛線(xiàn)表示Dabcyl的吸收光譜,實(shí)線(xiàn)表示BPTA-Tb3+的熒光發(fā)光光譜。
通過(guò)將Dabcyl的吸收光譜和BPTA-Tb3+的熒光發(fā)光光譜重合,兩者一靠近,BPTA-Tb3+的熒光發(fā)光被Dabcyl消光。反之,兩者一離開(kāi),BPTA-Tb3+可以發(fā)出強(qiáng)熒光。即,在FRET探針中,由于Dabcyl和BPTA-Tb3+處于近距離,BPTA-Tb3+的熒光被消光。然而,隨著圖3所示的反應(yīng),BPTA-Tb3+標(biāo)記堿基部位依次被切斷,當(dāng)BPTA-Tb3+與Dabcyl一分離,隨之BPTA-Tb3+的熒光隨著切斷反應(yīng)逐漸增強(qiáng)。通過(guò)用時(shí)間分辨熒光測(cè)定法測(cè)定該熒光,可以對(duì)處于靶DNA的SNP進(jìn)行解析。
相反,當(dāng)靶DNA中沒(méi)有SNP時(shí),由于不會(huì)發(fā)生第一探針、第二探針和靶DNA雜交反應(yīng)后的切斷反應(yīng),其突出端和FRET探針的雜交反應(yīng)和其反應(yīng)后的切斷反應(yīng)也不會(huì)發(fā)生,所以雖然可以測(cè)定由非特異反應(yīng)引起的少量的熒光增強(qiáng),但測(cè)不到象有SNP時(shí)那樣的BPTA-Tb3+的強(qiáng)熒光增強(qiáng)。
圖5表示伴隨著被檢體DNA的濃度變化而引起的熒光強(qiáng)度的變化。圖5的橫軸為被檢體DNA(靶DNA)的濃度(pM),縱軸表示熒光強(qiáng)度。被檢體DNA(靶DNA)的濃度為0的位置表示背景的熒光強(qiáng)度。結(jié)果,檢測(cè)靈敏度如果以背景+2SD(標(biāo)準(zhǔn)偏差)作為基準(zhǔn),大約是0.008pM(8×10-15M)。這與以往的使用有機(jī)物標(biāo)記試劑的方法相比,可知是約2個(gè)數(shù)量級(jí)的高靈敏度。
因此,作為發(fā)光色素使用稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑,且作為消光物質(zhì)使用熒光猝滅標(biāo)記試劑的本發(fā)明方法與以往的使用有機(jī)熒光標(biāo)記試劑的方法相比,靈敏度極高,而且反應(yīng)后的熒光信號(hào)/噪音比也大。這是由于稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑引起的熒光壽命非常長(zhǎng),所以反應(yīng)后的熒光信號(hào)長(zhǎng),可以利用時(shí)間分解測(cè)定法,而且可以有效地除去具有短熒光壽命的背景噪音的緣故。在使用以往的用有機(jī)熒光色素構(gòu)成的FRET探針時(shí),例如使用熒光素和Cy3構(gòu)成的FRET探針時(shí)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97,8272),對(duì)于反應(yīng)后的熒光素的熒光測(cè)定,由于Cy3對(duì)于熒光素的熒光極大波長(zhǎng)也有強(qiáng)的熒光,所以產(chǎn)生大的背景噪音。而在本發(fā)明的方法中,由于可以使用時(shí)間分解測(cè)定法,可完全除去只有短熒光壽命的Cy3的熒光,獲得最高靈敏度的測(cè)定。另外,作為稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑使用銪熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑以及作為熒光猝滅標(biāo)記試劑使用Cy5時(shí)也可以獲得同樣的結(jié)果。
本發(fā)明的稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑是由稀土類(lèi)元素的絡(luò)合物構(gòu)成的。作為稀土類(lèi)元素可列舉鑭系的各種元素,優(yōu)選釤(Sm)、銪(Eu)、鋱(Tb)、或鏑(Dy)等。這些稀土類(lèi)元素即使是0價(jià)的狀態(tài)也可以,通常為離子狀態(tài),優(yōu)選以3價(jià)陽(yáng)離子的狀態(tài)形成絡(luò)合物。
作為本發(fā)明的稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑的優(yōu)選配體,可列舉上述通式(1)~(6)表示的配體。在上述通式(1)~(6)表示的配體中,作為取代基R的芳基,可列舉苯基或萘基等碳環(huán)式芳香族基、環(huán)中含有1~3個(gè)氮原子、氧原子或硫原子的5~7員的雜環(huán)芳香族基。這些芳香族基可以是單環(huán)式、多環(huán)式、或縮合環(huán)式的。作為優(yōu)選的芳基,可列舉苯基、噻酚基、吡啶基等。取代基R的芳基含有取代基時(shí),作為該取代基優(yōu)選氨基、羥基、羧基、磺酸基、異硫氰酸酯基等極性官能團(tuán)。也可以是這些官能團(tuán)的烷基衍生物或鹵化衍生物。作為更優(yōu)選的取代基,可列舉氨基、羧基、異硫氰酸酯基等。
在上述通式(1)~(6)表示的配體中,取代基R’可以例示氨基、羥基、羧基、磺酸基或異硫氰酸酯基,但并不限定于這些,優(yōu)選極性的官能團(tuán)。另外,也可以是這些官能團(tuán)的烷基衍生物或鹵化衍生物。作為更優(yōu)選的取代基,可列舉氨基、羧基、異硫氰酸酯基等。
作為本發(fā)明的熒光猝滅標(biāo)記試劑的優(yōu)選例子,可列舉上述通式(7)~(9)表示的化合物。
本發(fā)明的通式(7)表示的熒光猝滅標(biāo)記試劑的取代基R1、R2至少有一方是用于與載體或核酸進(jìn)行固定的連接基。取代基R1、R2的另一方不是連接基時(shí),剩下的一方表示氫原子或烷基,優(yōu)選是表示烷基。作為本說(shuō)明書(shū)中的烷基,是碳數(shù)1~20、優(yōu)選是碳數(shù)1~10、碳數(shù)1~7的直鏈或支鏈狀的烷基。作為優(yōu)選的烷基,可列舉甲基、乙基、異丙基等。另外作為通式(7)~(9)中的取代基R1、R2或R3的用于固定于載體或核酸的連接基,只要是具有用于固定于載體或核酸的適當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)度和用于固定化的反應(yīng)性的基團(tuán)的連接基都可以,可以根據(jù)載體或核酸的種類(lèi)適當(dāng)選擇。作為這樣的連接基是通過(guò)碳數(shù)3~30、碳數(shù)5~20,優(yōu)選是碳數(shù)5~15的直鏈狀的亞烷基與目的載體或核酸結(jié)合的連接基,這些亞烷基的1個(gè)或2個(gè)或其以上的碳原子可以用氧原子、氮原子、硫原子等其他原子取代,另外這些亞烷基的1個(gè)或2個(gè)或其以上的碳原子、氮原子或硫原子也可以被氧代(=O)、鹵素、羥基、氨基、烷基等取代。
本發(fā)明中使用的修飾FRET核酸探針(修飾DNA寡核苷酸)的制備法可以根據(jù)任一個(gè)眾所周知的核酸探針制備法進(jìn)行。例如,寡核苷酸的合成可以通過(guò)任一個(gè)磷酰亞胺法(ホスホロァミダイト法)使用DNA自動(dòng)合成儀進(jìn)行。純化可以利用反相HPLC進(jìn)行。另外熒光猝滅標(biāo)記試劑的導(dǎo)入可以使用例如下面的化學(xué)式(10)表示的Dabcyl-dT,
或下面化學(xué)式(11)表示的TAMRA-dT, 或下面化學(xué)式(12)表示的Cy3-dC, 或下面化學(xué)式(13)表示的Cy5-dC等色素的衍生物,
(式(10)~(13)中,DMTO表示4-單甲氧基三苯甲基,iPr表示2-丙基),按照常規(guī)方法進(jìn)行。
另外,稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑的導(dǎo)入,使用5’末端等氨基修飾了的寡核苷酸,與由化學(xué)式(1)、(2)、(3)、(4)、(5)或(6)表示的任一個(gè)配體和稀土類(lèi)離子構(gòu)成的熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑反應(yīng)即可,純化可以通過(guò)反相HPLC或電泳、凝膠過(guò)濾色譜進(jìn)行。
作為本發(fā)明的高靈敏度標(biāo)記探針,是在SNP解析用中使用的標(biāo)記探針,是使本發(fā)明的稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑和熒光猝滅標(biāo)記試劑組合后可以使用的標(biāo)記探針。作為本發(fā)明的高靈敏度標(biāo)記探針,可列舉例如,invader法中的FRET探針、分子信標(biāo)法中的具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的探針、TaqManPCr法中的TaqMan探針,但并不限定于這些探針。
另外,日本專(zhuān)利申請(qǐng)2002-063960說(shuō)明書(shū)、以及日本專(zhuān)利申請(qǐng)2003-061958說(shuō)明書(shū)記載的內(nèi)容都收入到了本說(shuō)明書(shū)。
實(shí)施例以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體地說(shuō)明,但本發(fā)明并不限定于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1(鋱熒光標(biāo)記試劑BPTA-Tb3+的制造)鋱熒光標(biāo)記試劑BPTA-Tb3+是由鋱離子和有機(jī)配體BPTA構(gòu)成的絡(luò)合物,BPTA以及其N(xiāo)-羥基琥珀酰亞胺單酯(縮寫(xiě)為NHS-BPTA)根據(jù)本發(fā)明人報(bào)道的方法(J.Yuan,G.Wang,K.Majima,K.Matsumoto,Anal.Chem..2001,73,1869)制造。
實(shí)施例2(DNA寡核苷酸的制備)圖3所示寡核苷酸都是通過(guò)磷酰亞胺法使用DNA自動(dòng)合成儀合成的。純化使用反相HPLC進(jìn)行。被檢體DNA(靶DNA)中帶下劃線(xiàn)的堿基表示SNP的部位。
FRET探針的制備首先通過(guò)DNA自動(dòng)合成儀合成用5’氨基和Dabcyl修飾的DNA寡核苷酸,再用NHS-BPTA-Tb3+標(biāo)記其5’氨基制備的。
實(shí)施例3(SNP測(cè)定)被檢體DNA(靶DNA)的SNP測(cè)定根據(jù)以往方法(例如文獻(xiàn)NatureBiotechnology,1999,17,292以及Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97,8272所述的方法)進(jìn)行。圖3給出了其原理。即,向含有報(bào)告探針(第一探針)、侵略者探針(第二探針)、被檢體DNA(靶DNA)和FRET探針的溶液中作為裂解酶加入突出端內(nèi)切核酸酶I同功酶,于63℃下溫育4小時(shí)后,進(jìn)行時(shí)間分辨熒光測(cè)定。
測(cè)定裝置是ARVO 1420(Wallac公司生產(chǎn))。測(cè)定條件延遲時(shí)間為0.4毫秒,窗口時(shí)間(window time)為0.4毫秒,循環(huán)時(shí)間(cycle time)為1.0毫秒,激發(fā)波長(zhǎng)=320nm,測(cè)定波長(zhǎng)=545nm。
實(shí)施例4 BPTA在分子信標(biāo)法中的應(yīng)用(1)為了使BPTA應(yīng)用于使用分子信標(biāo)法的分子雜交信號(hào)的檢測(cè)中,進(jìn)行了如下所述的實(shí)驗(yàn)。
作為希望檢測(cè)的靶序列合成了含有5’-GCTGGAGGGATGATACTTTGCA-3’序列的寡核苷酸。
作為分子信標(biāo)使用的探針制備在5’末端通過(guò)(CH2)6間隔結(jié)合BPTA,在3’末端作為消光劑含有付加了DABCYL(4-二甲基氨基偶氮苯-4’-磺酰基)基團(tuán)的5’-CCAAGCGCAAAGTATCATCCCTCCAGGCTTGG-3’序列的寡核苷酸。另外該序列中的5’-末端一側(cè)和3’-末端一側(cè)的6個(gè)殘基是互補(bǔ)的,當(dāng)這些序列間的序列與互補(bǔ)的堿基序列不雜交時(shí),設(shè)計(jì)成形成莖結(jié)構(gòu),BPTA和DABYL應(yīng)當(dāng)存在于分子中、附近,BPTA激發(fā)的波長(zhǎng)區(qū)域的光被DABCYL基吸收,結(jié)果來(lái)自BPTA的熒光被消光。
另外,作為非靶寡核苷酸使用5′-CCATGGTGTCTGTTTAAGGTTGCT-3′序列。
反應(yīng)在含有50μl的2mM MgCl2-0.6μM TbCl3的15mM Tris-HCl(pH7.0)的緩沖液中,使用上述0.2μM的分子信標(biāo)和0.6μM的靶序列(或非靶的)寡核苷酸,于室溫下進(jìn)行5分鐘。反應(yīng)后,作為雜交信號(hào)來(lái)自BPTA的熒光用WALLAC公司生產(chǎn)的ARVOTMSX 1420MultilabelCounter進(jìn)行測(cè)定。另外,將沒(méi)有添加靶序列(或非靶的)寡核苷酸的反應(yīng)液作為反應(yīng)的空白。
表I給出了測(cè)定結(jié)果。靶序列與非靶序列的熒光強(qiáng)度相比可以獲得有意義的高信號(hào)。
表I序列 熒光強(qiáng)度靶序列 803,760非靶序列 95,728實(shí)施例5 BPTA在分子信標(biāo)法中的應(yīng)用(2)應(yīng)用實(shí)施例4中使用的DABCYL的消光功能,使用BPTA標(biāo)記寡DNA,檢測(cè)DNA-堿基的差別。
在本實(shí)施例中,作為靶DNA,合成具有表II所示的堿基序列的4種寡核苷酸。
表II靶序列 堿基序列A5′-CCATGGTGTCTGTTTGAGGTTGCT-3 ′B5′-CCATGGTGTCTGTTTCAGGTTGCT-3′C5′-CCATGGTGTCTGTTTAAGGTTGCT-3′D5′-CCATGGTGTCTGTTTTAGGTTGCT-3′這些寡核苷酸設(shè)計(jì)成只是從5’末端開(kāi)始的第16個(gè)堿基不同,其他序列都一樣。作為BPTA標(biāo)記探針,制備在5’末端含有通過(guò)(CH2)6間隔付加了BPTA的5’-AGCAACCTCAAACAGACACCATGG-3’序列的寡核苷酸。該序列與表II的靶序列A完全互補(bǔ)。而且,在適當(dāng)?shù)臈l件下,與存在1堿基錯(cuò)配(mismatch)的靶序列B~D相比,可以與靶序列A進(jìn)行特異雜交。
另一方面,制備具有5’-GGTGTCTGTTTGAGGTTGCT-3’序列,3’末端付加了DABCYL的寡核苷酸(消光用寡核苷酸)。該序列由于與上述的BPTA標(biāo)記探針的5’末端一側(cè)1~20堿基序列互補(bǔ),可以進(jìn)行雜交,預(yù)期可以使來(lái)自游離的BPTA標(biāo)記探針的熒光消光。因此,可以通過(guò)靶序列A(完全互補(bǔ)的序列)與B~D(有一個(gè)堿基不同的序列)間的信號(hào)強(qiáng)度差區(qū)分一個(gè)堿基的差別。
反應(yīng)在含有50μl的2mM MgCl2-3μM TbCl3的15mM Tris-HCl(pH7.0)的緩沖液中,使用上述1μM的BPTA標(biāo)記探針和2μM的具有靶序列的寡核苷酸,2μM的消光用寡核苷酸,于室溫下進(jìn)行30分鐘。反應(yīng)后,作為雜交信號(hào)的來(lái)自BPTA的熒光用WALLAC公司生產(chǎn)的ARVOTMSX 1420 Multilabel Counter進(jìn)行測(cè)定。另外,將沒(méi)有添加靶序列(或非靶的)寡核苷酸的反應(yīng)液作為反應(yīng)的空白。
結(jié)果III所示。
表III靶序列熒光強(qiáng)度A 5,526,292B 344,573C 432,303D 496,235結(jié)果,完全互補(bǔ)的序列的信號(hào)與差別一個(gè)堿基的序列的信號(hào)相比可以獲得有意義的高信號(hào)。即可以區(qū)分堿基序列中的一個(gè)堿基的差別。
產(chǎn)業(yè)上應(yīng)用的可能性本發(fā)明提供利用用稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑和熒光猝滅標(biāo)記試劑構(gòu)成的FRET探針,基于時(shí)間分辨熒光測(cè)定的高靈敏度核酸SNP解析法。利用本發(fā)明的方法即使被檢體DNA的濃度約為0.008pM(8×10-15M)也可以解析,可以用極少量被檢體DNA解析大量的SNP。
另外,利用本發(fā)明的方法,由于可以有效地除去具有短熒光壽命的背景噪音,所以,反應(yīng)后的熒光信號(hào)/噪音比大,可以使解析精度顯著提高。
序列表<110>松本和子<120>新的高靈敏度核酸解析法<130>JA924409<150>JP2002-063960<151>2002-03-08<150>JP2003-061958<151>2003-03-07<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>44<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>靶DNA<400>1ggaagaggag gagggtgctc aggaggagcg ggaggacact gtgt 44
<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>第一探針<400>2aacgaggcgc acccctcctc ctcttcc27<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>第二探針<400>3acacagtgtc ctcccgctcc tcctgagcac 30<210>4<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FRET探針
<400>4tcttgtctcg gtttttccga gacaagagtg cgcctcgtt 39<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>靶DNA<400>5gctggaggga tgatactttg ca 22<210>6<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>分子信標(biāo)<400>6ccaagcgcaa agtatcatccctc caggcttgg 32
<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>靶DNA<400>7ccatggtgtc tgtttgaggt tgct 24<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>靶DNA<400>8ccatggtgtc tgtttcagg ttgct 24<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列
<400>9ccatggtgtc tgtttaaggt tgct 24<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>靶DNA<400>10ccatggtgtc tgttttaggt tgct 2權(quán)利要求
1.一種SNP解析方法,其特征是在通過(guò)使用含有發(fā)光色素和消光物質(zhì)的FRET探針的invader法的SNP的解析方法中,作為FRET探針中的發(fā)光色素使用稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑。
2.權(quán)利要求1所述的方法,其中稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑作為配體是含有以下通式(1)~(6)表示的任一種化合物, (式(1)~(6)中,n表示1~4的整數(shù),R表示含有取代基的芳基,R’表示氨基、羥基、羧基、磺酸基、或異硫氰酸酯基)。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法,其中稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑的稀土類(lèi)元素是釤(Sm)、銪(Eu)、鋱(Tb)、或鏑(Dy)。
4.權(quán)利要求1~3中的任一項(xiàng)所述的方法,其中FRET探針中的消光物質(zhì)是熒光猝滅標(biāo)記試劑。
5.權(quán)利要求4所述的方法,其中熒光猝滅標(biāo)記試劑是以下通式(7)~(9)表示的物質(zhì), (式(7)~(9)中,m表示1~4的整數(shù),R1、R2中任一方表示用于與載體或核酸進(jìn)行固定的連接基,而另一方表示氫原子或烷基,R3表示用于與載體或核酸進(jìn)行固定的連接基)。
6.一種SNP解析方法,其特征是在權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述的方法中,利用時(shí)間分辨熒光測(cè)定法測(cè)定熒光發(fā)光。
7.一種熒光發(fā)光控制用組合物,是由稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑和熒光猝滅標(biāo)記試劑的組合構(gòu)成的,其中稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑是由含有以下通式(1)~(6)表示的配體中的至少1種的稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑的1種或2種以上構(gòu)成的, (式(1)~(6)中,n表示1~4的整數(shù),R表示含有取代基的芳基,R’表示氨基、羥基、羧基、磺酸基、或異硫氰酸酯基),而熒光猝滅標(biāo)記試劑是由以下通式(7)~(9)表示的物質(zhì)的1種或2種以上構(gòu)成的, (式(7)~(9)中,m表示1~4的整數(shù),R1、R2中任一方表示用于與載體或核酸進(jìn)行固定的連接基,而另一方表示氫原子或烷基,R3表示用于與載體或核酸進(jìn)行固定的連接基)。
8.權(quán)利要求7所述熒光發(fā)光控制用組合物,其中稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑的稀土類(lèi)元素是釤(Sm)、銪(Eu)、鋱(Tb)、或鏑(Dy)。
9.權(quán)利要求7或8所述熒光發(fā)光控制用組合物,熒光發(fā)光控制用組合物是SNP的解析用的物質(zhì),該SNP解析的特征是在通過(guò)使用含有發(fā)光色素和消光物質(zhì)的FRET探針的invader法的SNP解析方法中,作為FRET探針中的發(fā)光色素使用稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑。
10.一種高靈敏度標(biāo)記探針,其特征是在含有發(fā)光色素和消光物質(zhì)的SNP解析用高靈敏度標(biāo)記探針中,作為發(fā)光色素使用稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑,作為消光物質(zhì)使用熒光猝滅標(biāo)記試劑。
11.權(quán)利要求10所述的高靈敏度標(biāo)記探針,其中稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑和熒光猝滅標(biāo)記試劑是由權(quán)利要求7~9中任一項(xiàng)所述的稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑和熒光猝滅標(biāo)記試劑的組合構(gòu)成的。
12.權(quán)利要求10或11所述的高靈敏度標(biāo)記探針,其中高靈敏度標(biāo)記探針是FRET探針。
13.權(quán)利要求10或11所述的高靈敏度標(biāo)記探針,其中高靈敏度標(biāo)記探針是分子信標(biāo)的探針。
14.一種SNP解析用試劑盒,含有權(quán)利要求10~13中任一項(xiàng)所述的高靈敏度標(biāo)記探針形成。
全文摘要
本發(fā)明目的在于提供高靈敏度的SNP解析方法,更詳細(xì)地講,目的是提供利用微量的被檢體DNA可以迅速進(jìn)行大量的SNP解析的SNP解析方法。本發(fā)明還涉一種SNP解析方法,其特征是在通過(guò)使用含有發(fā)光色素和消光物質(zhì)的FRET探針的invader法的SNP的解析方法中,作為FRET探針中的發(fā)光色素使用銪或鋱等稀土類(lèi)元素形成的稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑。另外,本發(fā)明還涉及由特定的稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑以及特定的熒光猝滅標(biāo)記試劑的組合構(gòu)成的熒光發(fā)光控制用組合物。另外,本發(fā)明還涉及在FRET探針等高靈敏度標(biāo)記探針中使用稀土類(lèi)熒光絡(luò)合物標(biāo)記試劑作為發(fā)光色素,而且作為消光物質(zhì)使用熒光猝滅標(biāo)記試劑為特征的高靈敏度標(biāo)記探針,以及含有該探針的SNP解析用試劑盒。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1639334SQ0380552
公開(kāi)日2005年7月13日 申請(qǐng)日期2003年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月8日
發(fā)明者松本和子, 袁景利 申請(qǐng)人:松本和子, 三菱麗陽(yáng)株式會(huì)社