專利名稱：生產(chǎn)氨基酸的細(xì)菌及制備l－氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、尤其大腸桿菌(Escherichia coli)菌種的生產(chǎn)氨基酸的細(xì)菌，所述細(xì)菌在rpoS基因編碼區(qū)的核苷酸序列中含有選自琥珀、赭石和乳白的至少一個終止密碼子及選自琥珀抑制基因、赭石抑制基因和乳白抑制基因的相應(yīng)終止密碼子抑制基因。本發(fā)明還涉及使用這些細(xì)菌制備氨基酸、尤其是L-蘇氨酸的方法。
現(xiàn)有技術(shù)L-氨基酸、尤其是L-蘇氨酸用于人用藥物和制藥工業(yè)，食品工業(yè)，特別是動物飼料中。
已知L-氨基酸可通過腸桿菌科菌株、尤其是大腸桿菌(E.coli)和粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)的發(fā)酵而生產(chǎn)。由于其極其重要，一直進(jìn)行改良該制備方法的嘗試。方法的改良可涉及發(fā)酵技術(shù)措施，如攪拌和供氧，或營養(yǎng)培養(yǎng)基的組成如發(fā)酵期間的糖濃度，或通過例如離子交換層析對產(chǎn)物形式的加工方法，或微生物本身的固有生產(chǎn)性質(zhì)。
為改良這些微生物的生產(chǎn)性質(zhì)，可使用誘變，選擇及突變體選擇等方法。以此方法可獲得對抗代謝物例如蘇氨酸類似物α-氨基-β-羥戊酸(AHV)有抗性或?qū)χ匾恼{(diào)節(jié)代謝物有缺陷的并產(chǎn)生L-氨基酸如L-蘇氨酸的菌株。
一段時間以來，重組DNA工程方法也用于腸桿菌科生產(chǎn)L-氨基酸菌株的菌株改良，這通過擴(kuò)增各個氨基酸生物合成基因并測試對氨基酸生產(chǎn)的作用而進(jìn)行。
rpoS基因，也稱為katF基因，其編碼稱為σ38因子或σS因子、σ38蛋白或σ38亞基或者RpoS蛋白的一種蛋白質(zhì)。在文獻(xiàn)中也見到如下不常用的關(guān)于rpoS基因的命名abrD、dpeB、appR、sigS、otsX和snrA。σS是RNA聚合酶的一個亞基，其控制多種不同基因的表達(dá)(Loewen等，Canadian Journal of Microbiology 44(8)707-717(1998))，其中調(diào)節(jié)機(jī)制通常未知。
關(guān)于rpoS或katF基因的核苷酸序列的數(shù)據(jù)可見于Mulvey和Loewen(Nucleic Acids Research 17(23)9979-9991(1989))及Blattner等(Science 2771453-1462(1997))所述。相應(yīng)的數(shù)據(jù)也可見于國立醫(yī)學(xué)圖書館(National Library of Medicine)(Bethesda，MD，USA)的國立生物工程信息中心(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)，登錄號為X16400和AE000358。rpoS基因的翻譯起始密碼子由Loewen等確定(Journal of Bacteriology 175(7)2150-2153(1993))。
另外，在大腸桿菌菌株中已知許多rpoS等位基因，例如在W3110類型的菌株中(Ivanova等，Nucleic Acids Research 20(20)5479-5480(1992)及Jishage和Ishihama，Journal of Bacteriology 179(3)959-963(1997))。
WO 01/05939中示出通過在L-谷氨酸的生產(chǎn)菌株的rpoS基因中摻入一個缺失而完全關(guān)閉σ38因子之后，谷氨酸生產(chǎn)被改進(jìn)。
Nagano等(Bioscience Biotechnology and Biochemistry 64(9)2012-2017(2000))報道了大腸桿菌W3110菌株及生產(chǎn)L-賴氨酸的突變體W196均含有一個rpoS等位基因，所述等位基因在相應(yīng)于σ38蛋白的氨基酸序列第33位的位點(diǎn)含有一個琥珀終止密碼子(TAG)。菌株W196在編碼L-絲氨酸t(yī)RNA的serU基因中還含有一個突變，其被稱為supD。
發(fā)明描述當(dāng)在下文中提及氨基酸或L-氨基酸時，包括除了L-賴氨酸之外的所有蛋白原性(proteinogenic)氨基酸。特別是指L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-高絲氨酸、L-甲硫氨酸、L-谷氨酸、L-纈氨酸和L-色氨酸，其中優(yōu)選L-蘇氨酸。
“蛋白原性氨基酸”是指組成蛋白質(zhì)的那些氨基酸。這些氨基酸包括L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸及L-硒代半胱氨酸。
本發(fā)明提供了來自腸桿菌科尤其是大腸桿菌物種的生產(chǎn)氨基酸的尤其是生產(chǎn)L-蘇氨酸的細(xì)菌，其1)在rpoS基因的編碼區(qū)的核苷酸序列中含有選自琥珀、赭石和乳白的至少一個終止密碼子，及2)含有選自琥珀抑制基因、赭石抑制基因和乳白抑制基因的相應(yīng)終止密碼子的抑制基因。
本發(fā)明提供的細(xì)菌可以從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、任選地淀粉、任選地纖維素或者從甘油和乙醇中生產(chǎn)氨基酸。所述細(xì)菌是腸桿菌科的代表，其選自埃希氏菌屬(Escherichia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、普羅威登斯菌屬(Providencia)和沙雷氏菌屬(Serratia)。優(yōu)選埃希氏菌和沙雷氏菌屬。在埃希氏菌屬中特別提及的是大腸桿菌，在沙雷氏菌屬中特別提及的是粘質(zhì)沙雷氏菌。
本發(fā)明提供的生產(chǎn)L-氨基酸的細(xì)菌除了可以生產(chǎn)所需的L-氨基酸之外還可以任選地生產(chǎn)L-賴氨酸作為二級產(chǎn)物。本發(fā)明的細(xì)菌生產(chǎn)的L-賴氨酸的量與所需的L-氨基酸的量相比至多為0到40％或者0到20％，優(yōu)選至多0到10％，特別優(yōu)選至多0到5％。這個百分比數(shù)據(jù)是重量百分比。
來自腸桿菌科生產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株優(yōu)選具有選自如下一組的一或多個遺傳或表型特征α-氨基-β-羥戊酸抗性，硫代賴氨酸(thialysine)抗性，乙硫氨酸抗性，α-甲基絲氨酸抗性，二氨基琥珀酸抗性，α-氨基丁酸抗性，疏螺體素抗性，利福平抗性，纈氨酸類似物如纈氨酸氧肟酸(valine hydroxamate)抗性，嘌呤類似物如6-二甲基氨基嘌呤抗性，需要L-甲硫氨酸，任選地部分及可補(bǔ)償?shù)匦枰狶-異亮氨酸，需要間二氨基庚二酸，針對含蘇氨酸二肽的營養(yǎng)缺陷，L-蘇氨酸抗性，L-高絲氨酸抗性，L-賴氨酸抗性，L-甲硫氨酸抗性，L-谷氨酸抗性，L-天冬氨酸抗性，L-亮氨酸抗性，L-苯丙氨酸抗性，L-絲氨酸抗性，L-半胱氨酸抗性，L-纈氨酸抗性，氟丙酮酸敏感性，缺陷的蘇氨酸脫氫酶，任選地利用蔗糖的能力，蘇氨酸操縱子的增強(qiáng)，高絲氨酸脫氫酶I-天冬氨酸激酶I的增強(qiáng)，優(yōu)選反饋抗性形式，高絲氨酸激酶的增強(qiáng)，蘇氨酸合酶的增強(qiáng)，天冬氨酸激酶的增強(qiáng)，任選地為反饋抗性形式，天冬氨酸半醛脫氫酶的增強(qiáng)，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的增強(qiáng)，任選地為反饋抗性形式，磷酸烯醇丙酮酸合酶的增強(qiáng)，轉(zhuǎn)氫酶的增強(qiáng)，RhtB基因產(chǎn)物的增強(qiáng)，RhtC基因產(chǎn)物的增強(qiáng)，YfiK基因產(chǎn)物的增強(qiáng)，丙酮酸羧化酶的增強(qiáng)及乙酸形成的弱化。
琥珀型終止密碼子已知是DNA分子編碼鏈上具有堿基序列TAG的一種終止密碼子，所述堿基序列TAG相應(yīng)于由這個DNA分子解讀的mRNA上的UAG。
赭石型終止密碼子已知是DNA分子編碼鏈上具有堿基序列TAA的一種終止密碼子，所述堿基序列TAA相應(yīng)于由這個DNA分子解讀的mRNA上的UAA。
乳白型終止密碼子已知是DNA分子編碼鏈上具有堿基序列TGA的一種終止密碼子，所述堿基序列TGA相應(yīng)于由這個DNA分子解讀的mRNA上的UGA。
終止密碼子也稱為無義突變(Edward A.BirgeBacterial andBacteriophage Genetics(Third Edition)，Springer Verlag，德國柏林1994)。
現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域可獲得rpoS基因的核苷酸序列。相應(yīng)于登錄號No.AE000358的rpoS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。相關(guān)RpoS基因產(chǎn)物或蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
SEQ ID NO3示出了rpoS等位基因的核苷酸序列，所述等位基因在分別相應(yīng)于SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的RpoS基因產(chǎn)物或蛋白質(zhì)的氨基酸序列的第33位的核苷酸序列位置含有一個琥珀型終止密碼子。
σ38因子的濃度可以通過定量“Western印跡”方法確定，所述方法如Jishage和Ishima(Journal of Bacteriology 177(23)6832-6835(1995))、Jishage等(Journal of Bacteriology 178(18)5447-5451(1996))及Jishage和Ishima(Journal of Bacteriology 179(3)959-963(1997))所述。
抑制作用一般理解為這樣的作用，即“第一個”基因中的突變作用由“第二個”基因中的突變補(bǔ)償或抑制。突變的第二個基因或第二個突變一般稱為抑制因子或抑制基因。
抑制基因的一特殊情況涉及編碼異常tRNA分子的tRNA基因的等位基因，其可識別終止密碼子以便在翻譯期間發(fā)生氨基酸摻入而不是鏈終止。關(guān)于抑制作用的充分闡述可見于遺傳學(xué)教科書，例如RolfKnippers，《Molekulare Genetik》(第6版，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)，或者Ernst-L.Winnacker，《Gene undKlone，Eine Einführung in die Gentechnologie》(Dritter，amendedreprint，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)，或者F.C.Neidhard(Ed.)，《Escherichia coli and Salmonella，Cellular andMolecular Biology》(2ndEdition，ASM Press，Washington，D.C.，USA，1996)。
表1、2和3列出的抑制基因是現(xiàn)有技術(shù)已知的tRNA基因或等位基因或tRNA抑制基因，其可抑制琥珀、赭石或乳白型終止密碼子并因此稱為琥珀抑制基因、赭石抑制基因或乳白抑制基因。具體基因或等位基因及抑制基因的名稱取自參考文獻(xiàn)。
表1琥珀抑制基因列表


表1的參考文獻(xiàn)1)Neidhard(Ed.)″Escherichia coli and Salmonella，Cellular andMolecular Biology″(2nd.Edition，ASM Press，Washington，D.C.，USA，1996)2)Martin et al，RNA 2(9)919-927，19963)Normanly et al，Proceedings of the National Academy of ScienceUSA，83(17)6548-6552，19864)Accession number K011975)Yarus et al，Proceedings of the National Academy of ScienceUSA，77(9)5092-5096，19906)McClain et al，Proceedings of the National Academy of ScienceUSA，87(23)9260-9264，19907)Raftery et al，Journal of Bacteriology 158(3)849-859，19848)Raftery et al，Journal of Molecular Biology 190(3)513-517，19869)Komatsoulis und Abelson，Biochemistry 32(29)743 5-7444，199310)Martin et al，Nucleic Acids Research 23(5)779-784，199511)Normanly et al，Journal of Molecular Biology 213(4)719-726，199012)McClain und Foss，Journal of Molecular Biology，202(4)697-709，1988
表2赭石抑制基因列表

表2的參考文獻(xiàn)1)Neidhard(Ed.)″Escherichia coli and Salmonella，Cellular andMolecular Biology″(2nd.Edition，ASM Press，Washington，D.C.，USA，1996)2)Raftery und Yarus，EMBO Journal 6(5)1499-1506，19873)Accession number K011974)Raftery et al，Journal of Bacteriology 158(3)849-859，19845)Raftery et al，Journal of Molecular Biology 190(3)513-517，1986
表3乳白抑制基因列表

表3的參考文獻(xiàn)1)Neidhard(Ed.)″Escherichia coli and Salmonella，Cellular andMolecular Biology″(2nd.Edition，ASM Press，Washington，D.C.，USA，1996)2)Schn et al，Nucleic Acids Research 17(18)7159-7165，19893)Weygand-Durasevic et al，Journal of Molecular Biology 240(2)111-118，19944)Raftery et al，Journal of Bacteriology 158(3)849-859，19845)McClain et al，Proceedings of the National Academy of ScienceUSA，87(23)9260-9264，1990在本發(fā)明的第一個方面中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)大腸桿菌物種的生產(chǎn)氨基酸尤其是生產(chǎn)L-蘇氨酸的細(xì)菌中摻入選自琥珀抑制基因、赭石抑制基因和乳白抑制基因的抑制基因tRNA時，其生產(chǎn)氨基酸的能力得以進(jìn)一步改良，所述細(xì)菌在rpoS基因的編碼區(qū)內(nèi)，尤其在分別相應(yīng)于SEQ IDNO1和SEQ ID NO2所示RpoS蛋白的氨基酸序列第2到314位的區(qū)域內(nèi)含有選自琥珀、赭石和乳白的一個終止密碼子。
本發(fā)明的測定結(jié)果顯示RpoS蛋白或σ38因子的活性或濃度與野生型蛋白質(zhì)或者初始微生物中蛋白質(zhì)的活性或濃度相比通常降低＞0到75％，例如1到75％，到＞0到50％，例如0.5到50％，到＞0到25％，例如0.25到25％，到＞0到10％，例如0.1到10％，或者到＞0到5％，例如0.05到5％。所述抑制基因的存在防止RpoS蛋白或σ38因子的活性一直降低至0。
因此，本發(fā)明提供了一種降低腸桿菌科尤其是大腸桿菌物種的生產(chǎn)氨基酸的細(xì)菌中RpoS蛋白或σ38因子的胞內(nèi)活性或濃度的方法，其中在這些細(xì)菌中1)在rpoS基因的編碼區(qū)內(nèi)尤其在相應(yīng)于SEQ ID NO1或2所示RpoS蛋白的氨基酸序列的第2到314位的區(qū)域內(nèi)摻入選自琥珀、赭石和的至少一個終止密碼子，及2)在這些細(xì)菌中摻入相應(yīng)的抑制基因tRNA基因或等位基因，其編碼選自琥珀抑制基因、赭石抑制基因和乳白抑制基因的抑制基因tRNA。
本發(fā)明還提供了一種制備腸桿菌科尤其是大腸桿菌物種的生產(chǎn)氨基酸的細(xì)菌的方法，其中在這些細(xì)菌中1)將選自琥珀、赭石和乳白的終止密碼子摻入rpoS基因的編碼區(qū)中，尤其是摻入相應(yīng)于SEQ IDNO1或2所示RpoS蛋白的氨基酸序列的第2到314位的區(qū)域中，及2)在這些細(xì)菌中摻入一抑制基因tRNA基因或等位基因，其編碼選自琥珀抑制基因、赭石抑制基因和乳白抑制基因的抑制基因tRNA。
最后，本發(fā)明提供了腸桿菌科尤其是大腸桿菌物種的生產(chǎn)氨基酸的細(xì)菌，其在rpoS基因的編碼區(qū)內(nèi)尤其在相應(yīng)于SEQ ID NO1或2所示RpoS蛋白的氨基酸序列的第2到314位的區(qū)域內(nèi)含有選自琥珀、赭石和乳白的至少一個終止密碼子，并含有相應(yīng)的抑制基因tRNA基因或等位基因，其編碼選自琥珀抑制基因、赭石抑制基因和乳白抑制基因的相關(guān)的抑制基因tRNA。
就rpoS基因的編碼區(qū)而言，已證實(shí)如下片段對摻入選自琥珀、赭石和乳白、優(yōu)選琥珀的一個終止密碼子是特別有益的●相應(yīng)于SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示RpoS蛋白的氨基酸序列的第2和95位之間，例如第33位的編碼區(qū)的片段，●相應(yīng)于SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示RpoS蛋白的氨基酸序列的第99和168位之間，例如第148位的編碼區(qū)的片段，●相應(yīng)于SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示RpoS蛋白的氨基酸序列的第190和245位之間的編碼區(qū)的片段，●相應(yīng)于SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示RpoS蛋白的氨基酸序列的第266和281位之間，例如第270位的編碼區(qū)的片段，及●相應(yīng)于SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示RpoS蛋白的氨基酸序列的第287和314位之間，例如第304位的編碼區(qū)的片段。
在rpoS基因的編碼區(qū)具有一個琥珀型終止密碼子的情況中，優(yōu)選使用選自表1所示的琥珀抑制基因。
在rpoS基因的編碼區(qū)具有一個赭石型的終止密碼子的情況中，優(yōu)選使用選自表2所示的赭石抑制基因。
在rpoS基因的編碼區(qū)具有一個乳白類型的終止密碼子的情況中，優(yōu)選使用選自表3所示的乳白抑制基因。
特別優(yōu)選的大腸桿菌物種的那些生產(chǎn)氨基酸的細(xì)菌，其在相應(yīng)于SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示RpoS基因產(chǎn)物的氨基酸序列中第33位的核苷酸序列的位置含有一個琥珀型終止密碼子，并優(yōu)選含有選自表1的一個琥珀抑制基因，特別是抑制基因supE或抑制基因supD，并生產(chǎn)如上述與所需的L-氨基酸量相應(yīng)量的L-賴氨酸。
根據(jù)所使用的抑制基因，所述細(xì)菌形成一種RpoS基因產(chǎn)物或者σ38因子，其在SEQ ID NO2所示氨基酸序列的第33位含有的不是L-谷氨酰胺，而是選自L-絲氨酸，L-酪氨酸，L-亮氨酸，L-色氨酸，L-賴氨酸，L-丙氨酸，L-精氨酸，L-苯丙氨酸，L-半胱氨酸，L-脯氨酸，L-組氨酸，L-蘇氨酸和L-纈氨酸中的一種氨基酸。因此，例如當(dāng)使用抑制基因supD時，摻入L-絲氨酸而不是摻入L-谷氨酰胺。當(dāng)使用在RpoS基因產(chǎn)物或σ38因子的第33位摻入L-谷氨酰胺氨基酸的抑制基因如supE時，所述氨基酸序列不變。
特別優(yōu)選的是大腸桿菌物種的生產(chǎn)L-蘇氨酸的細(xì)菌，其含有SEQID NO3所示rpoS等位基因及SEQ ID NO4所示抑制基因supE。
本發(fā)明還提供了相應(yīng)于與本發(fā)明第一方面的一種制備氨基酸或含有氨基酸的飼料添加劑的方法，其中進(jìn)行如下步驟a)在合適的培養(yǎng)基中發(fā)酵腸桿菌科的細(xì)菌，所述細(xì)菌含有1)在rpoS基因的編碼區(qū)內(nèi)尤其在相應(yīng)于SEQ ID NO1或2所示RpoS蛋白的氨基酸序列的第2到314位的區(qū)域內(nèi)含有選自琥珀、赭石和乳白優(yōu)選琥珀的至少一個終止密碼子，及2)含有選自琥珀抑制基因、赭石抑制基因和乳白抑制基因的相應(yīng)抑制基因tRNA基因，b)富集發(fā)酵肉湯中的氨基酸，c)從發(fā)酵肉湯中分離所述氨基酸或者含有氨基酸的飼料添加劑，任選d)分離發(fā)酵肉湯的成分和/或生物量(≥0到100％)。
一種制備氨基酸或含有氨基酸的飼料添加劑的方法，優(yōu)選其中腸桿菌科在合適的培養(yǎng)基中發(fā)酵，所述腸桿菌科在相應(yīng)于SEQ ID NO1或2所示RpoS蛋白的氨基酸序列第33位的rpoS基因的編碼區(qū)中含有一個琥珀型終止密碼子。
本發(fā)明的飼料添加劑可以在液體及也可以在固體形式中進(jìn)一步加工。
使用致突變物質(zhì)例如N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍通過傳統(tǒng)的誘變方法或者通過紫外光在相關(guān)宿主中可以直接產(chǎn)生將一個終止密碼子導(dǎo)入rpoS基因讀框的突變。
另外，使用分離的rpoS DNA的體外方法例如用羥胺處理可以用于誘變(J.H.MillerA Short Course in Bacterial Genetics，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，1992)。最后，可以利用使用誘變寡核苷酸的定點(diǎn)誘變方法(T.A.BrownGentechnologie fürEinsteiger，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，1993)或者聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，如Newton和Graham所述(PCR，SpektrumAkademischer Verlag，Heidelberg，1994)。產(chǎn)生的突變可以通過DNA測序加以確定并測試，例如使用Sanger等所述方法(Proceedings of theNational Academy of Science USA 74(12)5463-5467(1977))進(jìn)行。
使用通過基因或等位基因置換而進(jìn)行的重組方法可以在所需的菌株中摻入合適的突變。通常使用的方法是使用條件復(fù)制(conditionalreplicating)pSC101衍生物pMAK705的基因置換方法，如Hamilton等所述(Journal of Bacteriology 171(9)4617-4622(1989))。也可以使用現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域中所述的其它方法，例如，Martinez-Morales等的方法(Journal of Bacteriology 181(22)7143-7148(1999))或者Boyd等的方法(Journal of Bacteriology 182(3)842-847(2000))。
通過綴合或轉(zhuǎn)導(dǎo)將突變移至所需的菌株中也是可能的。
最后，可以使用現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域已知的在讀框中含有一個終止密碼子的rpoS基因的等位基因，及使用上述方法將這些基因?qū)胨璧木曛小?br> 以上述方式獲得的菌株優(yōu)選是突變體、轉(zhuǎn)化體、重組體、轉(zhuǎn)導(dǎo)體或轉(zhuǎn)接合子。
為在tRNA基因中產(chǎn)生抑制基因突變，可以使用針對rpoS基因所述基本相同的方法。也可以使用寡核苷酸工程化方法，如Khorana所述方法(Science 203(4381)614-625(1979))。另外，可特別使用現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域中使用的tRNA抑制基因。
查詢、鑒定并確定tRNA抑制基因的效力的方法見現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域中所述，例如Miller和Albertini(Journal of Molecular Biology 164(1)59-71(1983))，McClain和Foss(Journal of Molecular Biology 202(4)697-709(1988))，Normanly等(Journal of Molecular Biology 213(4)719-726(1990))，Kleina等(Journal of Molecular Biology 213705-717(1990))，Lesley等(Promega Notes Magazine 46，p.02.(1994))及Martin等(Nucleic Acids Research 23(5)779-784(1995))所述。
本發(fā)明的第二個方面涉及SEQ ID NO6所示RpoS蛋白的變體。本發(fā)明鑒別了RpoS蛋白的這種變體的編碼區(qū)。該編碼區(qū)如SEQ IDNO5所示。
因此，本發(fā)明提供了腸桿菌科尤其是生產(chǎn)氨基酸的那些菌株，其含有或形成SEQ ID NO6所示的RpoS蛋白。還已知形成的蛋白質(zhì)的N末端甲硫氨酸可以通過宿主中存在的酶斷裂。
另外，本發(fā)明提供了相應(yīng)于第二方面的一種制備氨基酸或含有氨基酸的飼料添加劑的方法，其中進(jìn)行如下步驟a)發(fā)酵腸桿菌科，其含有或形成具有SEQ ID NO6所示氨基酸序列的RpoS蛋白質(zhì)，b)富集發(fā)酵肉湯中的氨基酸，c)從發(fā)酵肉湯中分離氨基酸或含有氨基酸的飼料添加劑，任選d)分離發(fā)酵肉湯的成分和/或生物量(≥0到100％)。
另外，為使用腸桿菌科的細(xì)菌生產(chǎn)L-蘇氨酸，除了在rpoS基因的編碼區(qū)中摻入一個終止密碼子及終止密碼子的一個相應(yīng)的抑制基因之外，或者除了表達(dá)SEQ ID NO6所示RpoS蛋白的變體之外，增強(qiáng)已知的蘇氨酸生物合成途徑種的一或多種酶或者回補(bǔ)代謝(anaplerotic metabolism)的酶或者產(chǎn)生還原的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的酶或者糖酵解的酶或者PTS酶或者硫代謝的酶是有益的。
文中術(shù)語“增強(qiáng)”是指微生物中由相應(yīng)的DNA編碼的一或多種酶或蛋白質(zhì)的胞內(nèi)活性或濃度的提高，例如通過提高基因的拷貝數(shù)，使用強(qiáng)啟動子或編碼高活性相應(yīng)酶或蛋白質(zhì)的基因，及任選地組合使用這些方法。
優(yōu)選使用內(nèi)源基因?！皟?nèi)源基因”或“內(nèi)源核苷酸序列”是指在一個物種群體中存在的基因或核苷酸序列。
通過增強(qiáng)方法，尤其是過表達(dá)，所述相應(yīng)蛋白的活性或濃度相對于野生型蛋白質(zhì)或起始微生物中蛋白質(zhì)的活性或濃度一般提高至少10％，25％，50％，75％，100％，150％，200％，300％，400％或500％，直至最大1000％或2000％。
因此，例如選自如下一組的一或多個基因可以增強(qiáng)，尤其是過表達(dá)●編碼天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶和蘇氨酸合酶的thrABC操縱子(US-A-4，278，765)，●編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因(DE-A-19 831 609)，●編碼磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因(Molecular and GeneralGenetics 231(2)332-336(1992))，●編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因(Gene 31279-283(1984))，●編碼轉(zhuǎn)氫酶的pntA和pntB基因(European Journal of Biochemistry158647-653(1986))，●賦予高絲氨酸抗性的rhtB基因(EP-A-0 994 190)，●編碼蘋果酸∶醌氧化還原酶的mqo基因(DE 100 348 33.5)，●賦予蘇氨酸抗性的rhtC基因(EP-A-1 013 765)，●來自谷氨酸棒桿菌的編碼蘇氨酸輸出蛋白的thrE基因(DE 100 26494.8)，●編碼谷氨酸脫氫酶的gdhA基因(Nucleic Acids Research 115257-5266(1983)；Gene 23199-209(1983))，●編碼DNA結(jié)合蛋白HLP-II的hns基因(Molecular and GeneralGenetics 212199-202(1988))，●編碼葡糖磷酸變位酶的pgm基因(Journal of Bacteriology 1765847-5851(1994))，
●編碼果糖二磷酸醛縮酶的fba基因(Biochemical Journal 257529-534(1989))，●來自ptsHIcrr操縱子、編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)中酶I的ptsI基因(Journal of Biological Chemistry 26216241-16253(1987))，●來自ptsHIcrr操縱子、編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)中磷酸組氨酸蛋白己糖磷酸轉(zhuǎn)移酶的ptsH基因(Journal of Biological Chemistry 26216241-16253(1987))，●來自ptsHIcrr操縱子、編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)中葡萄糖特異性IIA成分的crr基因(Journal of Biological Chemistry 26216241-16253(1987))，●編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)中葡萄糖特異性IIBC成分的ptsG基因(Journal of Biological Chemistry 26116398-16403(1986))，●編碼亮氨酸調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)蛋白的lrp基因(Journal of BiologicalChemistry 26610768-10774(1991))，●編碼全局調(diào)節(jié)蛋白的csrA基因(Journal of Bacteriology 1754744-4755(1993))，●編碼fad調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)蛋白的fadR基因(Nucleic Acids Research 167995-8009(1988))，●編碼重要中間代謝(central intermediary metabolism)的調(diào)節(jié)蛋白的iclR基因(Journal of Bacteriology 1722642-2649(1990))，●編碼10Kd陪伴分子的mopB基因(Journal of Biological Chemistry26112414-12419(1986))，其也稱為groES，●來自ahpCF操縱子、編碼烷基氫過氧化物還原酶中小亞基的ahpC基因(Proceedings of the National Academy of Sciences USA 927617-7621(1995))，●來自ahpCF操縱子、編碼烷基氫過氧化物還原酶中大亞基的ahpF基因(Proceedings of the National Academy of Sciences USA 927617-7621(1995))，
●編碼半胱氨酸合酶A的cysK基因(Journal of Bacteriology 1703150-3157(1988))，●編碼cys調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)蛋白的cysB基因(Journal of BiologicalChemistry 2625999-6005(1987))，●來自cysJIH操縱子、編碼NADPH亞硫酸鹽還原酶中黃素蛋白的cysJ基因(Journal of Biological Chemistry 26415796-15808(1989)，Journal of Biological Chemistry 26415726-15737(1989))，●來自cysJIH操縱子、編碼腺苷酰硫酸還原酶的cysH基因(Journalof Biological Chemistry 26415796-15808(1989)，Journal ofBiological Chemistry 26415726-15737(1989))，及●來自cysJIH操縱子、編碼NADPH亞硫酸鹽還原酶中血蛋白的cysI基因(Journal of Biological Chemistry 26415796-15808(1989)，Journal of_Biological Chemistry 26415726-15737(1989))。
另外，為使用腸桿菌科的細(xì)菌生產(chǎn)L-蘇氨酸，除了在rpoS基因的編碼區(qū)中摻入一個終止密碼子及所述終止密碼子的相應(yīng)的抑制基因之外，或者除了表達(dá)SEQ ID NO6所示RpoS蛋白的變體之外，弱化尤其是切斷或降低選自如下一組的一或多個基因的表達(dá)是有益的●編碼蘇氨酸脫氫酶的tdh基因(Ravnikar und Somerville；Journal ofBacteriology 1694716-4721(1987))，●編碼蘋果酸脫氫酶的mdh基因(E.C.1.1.1.37)(Vogel et al.；Archivesin Microbiology 14936-42(1987))，●開放讀框(orf)yjfA的基因產(chǎn)物(Accession Number AAC77 180 for theNational Center for Biotechnology Information(NCBI，Bethesda，MD，USA))，●開放讀框(orf)ytfP的基因產(chǎn)物(Accession Number AAC77179 for theNational Center for Biotechnology Information(NCBI，Bethesda，MD，USA))，
●編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的pckA基因(Medina et al.；Journal ofBacteriology 1727151-7156(1990))，●編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因(Grabau und Cronan；Nucleic AcidsResearch 14(13)5449-5460(1986))，●編碼異檸檬酸裂合酶的aceA基因(Matsuoko und McFadden；Journalof Bacteriology 1704528-4536(1988))，●編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)中DgsA調(diào)節(jié)蛋白的dgsA基因(Hosono et al.；Bioscience，Biotechnology and Biochemistry 59256-261(1995))，其也稱為mlc基因，及●編碼果糖阻抑蛋白的fruR基因(Jahreis et al.；Molecular and GeneralGenetics 226332-336(1991))，其也稱為cra基因。
文中術(shù)語“弱化”是指降低或消除微生物中由相應(yīng)DNA編碼的一或多種酶或蛋白質(zhì)的胞內(nèi)活性或濃度，通過例如使用弱啟動子或使用編碼具有低活性的相應(yīng)酶的基因或等位基因，或失活相應(yīng)酶、蛋白質(zhì)或基因，及任選地組合使用這些方法。
通過弱化措施，包括降低相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)、活性或濃度一般降低至野生型蛋白質(zhì)或起始微生物中蛋白質(zhì)活性或濃度的0到75％，0到50％，0到25％，0到10％或0到5％。
還已經(jīng)證明在上述tdh，mdh，pckA，poxB，aceA，dgsA和fruR基因及開放讀框(ORF)yjfA和ytfP及ugpB基因(編碼sn-甘氨酸-3-磷酸運(yùn)輸系統(tǒng)中周質(zhì)結(jié)合蛋白(periplastic linkage protein)的基因)，aspA(天冬氨酸銨裂合酶基因(＝天冬氨酸酶基因))，aceB(編碼蘋果酸合酶A的基因)及aceK(編碼異檸檬酸脫氫酶激酶/磷酸酶的基因)的情況中，弱化可以通過1)在這些基因的編碼區(qū)中摻入選自琥珀、赭石和乳白的一個終止密碼子，及2)同時使用選自琥珀抑制基因、赭石抑制基因和乳白抑制基因的相應(yīng)終止密碼子的抑制基因而實(shí)現(xiàn)。已經(jīng)證實(shí)使用琥珀型終止密碼子及琥珀抑制基因supE是特別有益的。所述方法可以適于試圖產(chǎn)生弱化或消除的任何基因。
根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的微生物可通過分批法(batch process)、補(bǔ)料分批法(fed batch process)或重復(fù)補(bǔ)料分批法(repeated fed batchprocess)培養(yǎng)。已知培養(yǎng)法見于由Chmiel(Bioprozesstechnik 1，Einführung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))所著教材或由Storhas(Bioreaktoren und periphereEinrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))所著教材中所述。
所用培養(yǎng)基必須以適當(dāng)方式符合各菌株的需求。關(guān)于不同微生物培養(yǎng)基的闡述見于美國細(xì)菌學(xué)會(American Society for Bacteriology)的“Manual of Methods for General Bacteriology”(美國華盛頓D.C.，1981)。
可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉及任選纖維素、油和脂肪如豆油、葵花油、花生油和椰子油、脂肪酸如棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸、醇如甘油和乙醇及有機(jī)酸如乙酸。這些物質(zhì)可單獨(dú)或混合使用。
可使用的氮源包括含有機(jī)氮的化合物如胨、酵母提取物、肉膏、麥芽提取物、玉米浸液、大豆粉和尿素或無機(jī)化物如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨。氮源可單獨(dú)或混合使用。
可使用的磷源是磷酸、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或相應(yīng)鈉鹽。培養(yǎng)基另外還必須含有為生長所需的金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除了上述物質(zhì)之外，必須使用生長必需物質(zhì)如氨基酸和維生素。此外，可將適當(dāng)前體加入培養(yǎng)基中。上述物質(zhì)可以單批形式或在培養(yǎng)期間適當(dāng)補(bǔ)加。
為控制培養(yǎng)物的pH值，可以適當(dāng)方式使用堿性化合物如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨或氨水或酸性化合物如磷酸或硫酸。為控制泡沫的產(chǎn)生，可使用抗泡沫劑例如脂肪酸聚乙二醇。為保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，適當(dāng)?shù)倪x擇性作用物質(zhì)例如抗生素可加入培養(yǎng)基中。為保持有氧條件，氧氣或含氧混合氣，例如空氣，可充入培養(yǎng)物中。培養(yǎng)溫度通常在25℃到45℃，優(yōu)選30℃到40℃。持續(xù)培養(yǎng)直至L-氨基酸形成最大量。此目的通常在10到160小時范圍內(nèi)達(dá)到。
氨基酸的分析可如Spackman等所述通過使用陰離子交換層析及隨后的茚三酮衍生化作用(Analytical Chemistry 301190-1206(1958)，1190)進(jìn)行，或者如Lindroth等所述通過使用反相HPLC(Analytical Chemistry(1979)511167-1174)進(jìn)行。
以下微生物根據(jù)布達(dá)佩斯條約作為純培養(yǎng)物于2002年9月9日保藏在德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德國)●大腸桿菌菌株DM1690，保藏號DSM 15189。
菌株DSM 15189在相應(yīng)于RpoS蛋白的氨基酸序列的第33位的位置含有一個琥珀型終止密碼子及一個琥珀抑制基因并產(chǎn)生蘇氨酸。
本發(fā)明的方法用于發(fā)酵制備L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-高絲氨酸，尤其是L-蘇氨酸。
本發(fā)明通過如下實(shí)施例得以進(jìn)一步詳細(xì)闡述。
大腸桿菌的基本培養(yǎng)基(M9)和通用培養(yǎng)基(LB)如J.H.Miller所述(A Short Course in Bacterial Genetics(1992)，Cold Spring HarborLaboratory Press)。從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA及關(guān)于限制及Klenow及堿性磷酸酶處理的所有技術(shù)如Sambrook等所述(Molecular Cloning.A Laboratory Manual(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press)進(jìn)行。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化，除非另加說明，均如Chung等所述(Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America 862172-2175(1989))進(jìn)行。P1轉(zhuǎn)導(dǎo)如Lengeler等(Journal of Bacteriology12426-38(1975))所述進(jìn)行。
實(shí)施例1將scr基因座轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腸桿菌K12菌株MG1655中天然發(fā)生的質(zhì)粒pUR400中的scr調(diào)節(jié)子(Schmid et al.，MolecularMicrobiology 21-8(1988))促進(jìn)利用蔗糖作為碳源的能力。借助于在轉(zhuǎn)座子Tn1721(Ubben and Schmitt，Gene 41154-152(1986))的兩個相反序列重復(fù)之間含有scr調(diào)節(jié)子的質(zhì)粒pKJL710(Ulmke et al.，Journal ofBacteriology 1811920-1923(1999))，隨后通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)座、綴合及轉(zhuǎn)導(dǎo)，所述scr調(diào)節(jié)子可以移至大腸桿菌K12的染色體中。一個稱為LJ210的菌株含有scr調(diào)節(jié)子，所述調(diào)節(jié)子根據(jù)Berlyn-Karte所述整合在染色體第6位小片中。將噬菌體P1在這個菌株中增殖并將大腸桿菌K12菌株MG1655(Guyer et al.，Cold Spring Harbor Symp.，Quant.Biology 45135-140(1981))用所述分離的噬菌體溶菌產(chǎn)物感染。通過鋪板于含有蔗糖(2g/l)的基本培養(yǎng)基上，獲得MG1655轉(zhuǎn)導(dǎo)體，其可使用蔗糖作為碳源。將一選擇的克隆命名為MG1655scr。
實(shí)施例2菌株MG1655scr的體內(nèi)誘變從MG1655scr開始，在加入2g/l蔗糖和4g/l DL-β-羥基正纈氨酸(Sigma，Deisenhofen，德國)的基本瓊脂中在37℃孵育后，分離自發(fā)突變體，其對蘇氨酸類似物α-氨基-β-羥戊酸(AHV)有抗性。將一選擇的突變體命名為MG1655scrAHVR1。
實(shí)施例3通過位點(diǎn)特異crAHVR1中的moS基因中摻入一個終止密碼子突變3.1來自MG1655的rpoS基因的克隆大腸桿菌菌株MG1655用作染色體DNA的供體。將含有在中間區(qū)域突變的rpoS基因的區(qū)域的DNA片段使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及合成的寡核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增。從大腸桿菌K12的已知rpoS基因的序列(登錄號AE000358，SEQ ID No1)開始，選擇以下寡核苷酸引物(MWG Biotech，Ebersberg，德國)進(jìn)行PCRrpoS9(SEQ ID No.7)5’CAGTTATAGCGGCAGTACC 3’rpoS4(SEQ ID No.8)
5’GGACAGTGTTAACGACCATTCTC3’根據(jù)廠商數(shù)據(jù)使用Qiagen Genomic-tips 100/G(Qiagen，Hilden，德國)分離大腸桿菌K12染色體DNA。在標(biāo)準(zhǔn)PCR條件下(Innis et al.(1990)PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，AcademicPress)，使用vent聚合酶(New England Biolabs GmbH，F(xiàn)rankfurt，Germany)可以分離長度為大約2kbp的DNA片段。
擴(kuò)增的DNA片段在瓊脂糖凝膠(0.8％)中使用凝膠電泳鑒別，并使用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen，Hilden，德國)純化。將純化的PCR產(chǎn)物根據(jù)廠商數(shù)據(jù)使用載體pCR-Blunt II-TOPO(Zero BluntTOPO PCR Cloning Kit，Invitrogen，Groningen，Holland)連接，并在大腸桿菌菌株TOP10(Invitrogen，Groningen，Holland)中轉(zhuǎn)化。在加入50mg/l卡那霉素的LB瓊脂上選擇含有所述質(zhì)粒的細(xì)胞。在分離質(zhì)粒DNA之后，使用限制裂解及在瓊脂糖凝膠(0.8％)中分離測試所述載體。擴(kuò)增的DNA片段通過序列分析測試。PCR產(chǎn)物中的序列與SEQ ID NO9所示序列一致。將獲得的質(zhì)粒命名為pCRBluntrpoS9-4。
3.2通過位點(diǎn)特異性誘變用琥珀終止密碼子置換谷氨酰胺密碼子定點(diǎn)誘變使用QuikChange定點(diǎn)誘變試劑盒(Stratagene，LaJolla，USA)進(jìn)行。選擇以下寡核苷酸引物進(jìn)行線性擴(kuò)增rpoSamber1(SEQ ID No.10)5′GGCCTTAGTAGAA(TAG)GAACCCAGTGATAACG 3′rpoSamber2(SEQ ID No.11)5′CGTTATCACTGGGTTC(CTA)TTCTACTAAGGCC 3′這些引物是由MWG Biotech公司合成的。用于置換所述氨基酸序列第33位谷氨酰胺的琥珀終止密碼子在以上所示核苷酸序列中用括號標(biāo)示。使用實(shí)施例3.1中所述質(zhì)粒pCRBluntrpoS9-4及與所述質(zhì)粒中的一個鏈互補(bǔ)的所述兩個引物之一，通過PfuTurbo DNA聚合酶進(jìn)行線性擴(kuò)增。在所述引物的延伸期間產(chǎn)生斷裂環(huán)形鏈的突變質(zhì)粒。將所述線性擴(kuò)增的產(chǎn)物用DpnI處理。這個內(nèi)切核酸酶特異性切割甲基化和半甲基化的模板DNA。將新合成的、斷裂的突變載體DNA在大腸桿菌菌株XL1 Blue(Bullock，F(xiàn)ernandez and Short，BioTechniques5(4)376-379(1987))中轉(zhuǎn)化。在轉(zhuǎn)化之后，所述XL1 Blue細(xì)胞修復(fù)突變質(zhì)粒中的斷裂。在具有50mg/l卡那霉素的LB培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體。獲得的質(zhì)粒通過限制切割及在瓊脂糖凝膠(0.8％)中分離DNA進(jìn)行測試。突變的DNA片段的DNA序列通過序列分析測試。在rpoS基因的區(qū)域中，該序列與SEQ ID NO3所示序列一致。將獲得的質(zhì)粒命名為pCRBluntrpoSamber。
3.3置換載體pMAK705rpoSamber的構(gòu)建將實(shí)施例3.2中所述的質(zhì)粒pCRBluntrpoSamber用限制酶BamHI和XbaI(Gibco Life Technologies GmbH，Karlsruhe，德國)切割。在瓊脂糖凝膠(0.8％)中分離后，用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，Hilden，德國)分離含有所述突變的長度為大約2.1kbp的rpoS片段。將Hamilton等所述質(zhì)粒pMAK705(Journal of Bacteriology 1714617-4622(1989))用限制酶BamHI和XbaI切割并與分離的rpoS片段連接(T4-DNA-Ligase，Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)。然后將大腸桿菌菌株DH5α(Grant et al.；Proceedings of the National Academy ofSciences USA 874645-4649(1990))用該連接混合物(ligation batch)轉(zhuǎn)化(Hanahan，In.DNA Cloning.A Practical Approach.Vol.1，ILR-Press，Cold Spring Habor，New York，1989)。通過將該批轉(zhuǎn)化物鋪板于補(bǔ)加了20mg/l氯霉素的LB瓊脂(Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual.2ndEd.，Cold Spring Habor，New York，1989)上選擇含有所述質(zhì)粒的細(xì)胞。
使用Qiagen公司的QIAquick Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并通過用酶BamHI、EcoRI、EcoRV、StuI和XbaI限制切割及隨后通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行測試。將該質(zhì)粒命名為pMAK705rpoSamber。該質(zhì)粒圖示于

圖1。
3.4大腸桿菌菌株MG1655scrAHVR1的rpoS基因的位點(diǎn)特異性誘變?yōu)檫M(jìn)行rpoS基因的位點(diǎn)特異性誘變，將實(shí)施例2所述菌株MG1655scrAHVR1用質(zhì)粒pMAK705rpoSamber轉(zhuǎn)化。使用Hamilton等所述選擇方法(Journal of Bacteriology 1714617-4622(1989))進(jìn)行基因置換。使用Roche Diagnostics公司的LightCycler(Mannheim，Germany)驗證染色體中已經(jīng)發(fā)生rpoSamber等位基因突變。所述LightCycler是由熱循環(huán)儀和熒光計組成的一種組合儀器。
在第一階段，將含有所述突變位點(diǎn)的長度為大約0.3kbp的DNA片段使用如下寡核苷酸引物通過PCR擴(kuò)增(Innis et al.，PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)rpoSLC1(SEQ ID No.12)5′CGGAACCAGGCTTTTGCTTG 3′rpoSLC2(SEQ ID No.13)5′GCGCGACGCGCAAAATAAAC 3′在第二階段，使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence ResonanceEnergy Transfer)方法(FRET)，通過解鏈曲線分析(melting curveanalysis)(Lay et al.；Clinical Chemistry 432262-2267(1997))證實(shí)所述突變的存在，所述分析使用不同長度的及用不同的熒光染料(LightCycler(LC)-Red640及熒光素)標(biāo)記的兩個額外的寡核苷酸并使其在所述突變位點(diǎn)的區(qū)域中雜交。
rpoSamberC(SEQ ID No.14)5′LC-Red640-CTTAGTAGAACAGGAACCCAGTG-(P)3′rpoSamberA(SEQ ID No.15)5′GATGAGAACGGAGTTGAGGTTTTTGACGAAAAGG-熒光素3′PCR的引物由MWG Biotech(Ebersberg，德國)合成，進(jìn)行雜交的寡核苷酸由TIB MOLBIOL(Berlin，德國)合成。
在這種方式中鑒別了一個克隆，其在rpoS PCR產(chǎn)物的DNA序列(SEQ ID No9)第952位含有一個胸苷而不是胞嘧啶。堿基三聯(lián)體胸腺嘧啶—腺嘌呤—鳥嘌呤存在于rpoS等位基因編碼序列(SEQ ID No3)的第97-99位，并編碼導(dǎo)致翻譯終止的一個琥珀終止密碼子。將這個克隆命名為MG1655scrAHVR1rpoS。
實(shí)施例4菌株MG1655scrAHVR1rpoS中琥珀抑制基因突變的體內(nèi)選擇4.1在Cat基因中具有琥珀終止密碼子的載體的構(gòu)建為選擇一個抑制基因突變，將一個琥珀終止密碼子摻入編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶并賦予氯霉素抗性的的cat基因中。
為此，將Cat基因模塊(block)在HindIII線性化的載體pTrc99A中連接(均得自Pharmacia Biotech，F(xiàn)reiburg，德國)。將大腸桿菌菌株DH5α(Grant et al.；Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 874645-4649(1990))用該連接混合物轉(zhuǎn)化(Hanahan，In.DNACloning.A Practical Approach.Vol.1，ILR-Press，Cold Spring Habor，New York，1989)。通過將該批轉(zhuǎn)化體鋪板于補(bǔ)加了50mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂(Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual.2ndEd.，Cold Spring Habor，New York，1989)上選擇含有所述質(zhì)粒的細(xì)胞。使用Qiagen公司的QIAquick Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并通過限制切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行測試。將該質(zhì)粒命名為pTrc99Acat。
為在cat基因的編碼區(qū)中摻入一個琥珀終止密碼子，從所述cat基因的序列開始，由德國Ebersberg的MWG Biotech公司合成含有限制酶AccIII和MscI的切割位點(diǎn)的引物。所述限制酶的識別位點(diǎn)在如下所示的核苷酸序列中用下劃線標(biāo)示。在catAccIII引物中，在AccIII切割位點(diǎn)之后，編碼cat蛋白質(zhì)中第75和77位的甲硫氨酸的兩個ATG密碼子改變?yōu)門AG密碼子。琥珀密碼子在如下核苷酸序列中在括號內(nèi)標(biāo)示。
catAccIII5’GCTCATCCGGAATTCCGT(TAG)GCA(TAG)AAAG 3’
(SEQ ID No16)catMscI5’GTCCATATTGGCCACGTTTAAATC 3’(SEQ ID No17)來自載體pTrc99Acat的質(zhì)粒DNA用于PCR。在標(biāo)準(zhǔn)PCR條件下(Innis et al.(1990)PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，Academic Press)，使用Pfu DNA聚合酶(Promega Corporation，Madison，USA)及特異性引物擴(kuò)增一個長度為大約300bp的DNA片段。將該P(yáng)CR產(chǎn)物用限制酶AccIII和MscI切割。載體pTrc99Acat也用酶AccIII和MscI消化，在凝膠中分離并使用QIAquick凝膠提取試劑盒分離一個長度為4.7kbp的片段。將這兩個片段用T4 DNA連接酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)連接。將大腸桿菌菌株XL1-Blue MRF‘(Stratagene，La Jolla，USA)用該連接混合物轉(zhuǎn)化，并在加入了50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂上選擇含有質(zhì)粒的細(xì)胞。在分離質(zhì)粒DNA之后，通過使用酶EcoRI、PvuII、SspI和StyI控制切割可以證實(shí)成功克隆。將該質(zhì)粒命名為pTrc99Acatamber。該質(zhì)粒圖示于圖2。
4.2具有琥珀抑制基因克隆的選擇將實(shí)施例3中所述的菌株MG1655scrAHVR1rpoS用載體pTrc99Acat和pTrc99Acatamber轉(zhuǎn)化。在補(bǔ)加了20或50μg/ml氯霉素的LB瓊脂上進(jìn)行選擇。用牙簽將已經(jīng)用載體pTrc99Acatamber轉(zhuǎn)化的氯霉素抗性克隆移至已經(jīng)加入50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂中。從氯霉素和氨芐青霉素抗性克隆中分離質(zhì)粒DNA。所述載體pTrc99Acatamber通過限制切割鑒別。
一氯霉素抗性轉(zhuǎn)化體MG1655scrAHVRrpoS/pTrc99Acatamber通過質(zhì)粒pTrc99Acatamber在LB培養(yǎng)基中過度接種(over-inoculating)幾次而處理，并將其命名為DM1690。
4.3DM1690中琥珀抑制基因突變的鑒別4.3.1測試supD突變編碼絲氨酸t(yī)RNA-2的serU基因中存在導(dǎo)致琥珀密碼子抑制的一已知突變。該等位基因稱為supD，所述tRNA識別琥珀密碼子并摻入絲氨酸。在supD60基因的序列中(登錄號M10746)，野生型serU基因中的胞嘧啶—腺嘌呤—腺嘌呤反密碼子通過堿基置換修飾為胞嘧啶—胸腺嘧啶—腺嘌呤，由此識別尿嘧啶—腺嘌呤—鳥嘌呤密碼子。
染色體serU基因中的一可能突變可使用Roche Diagnostics公司的LightCycler(Mannheim，德國)檢測。所述LightCycler是由熱循環(huán)儀和熒光計組成的一種組合儀器。
在第一階段，將含有所述突變位點(diǎn)的長度為大約0.3kbp的一DNA片段使用如下寡核苷酸引物通過PCR擴(kuò)增(Innis et al.，PCRProtocols.A Guide to Methods and Applications，1990，AcademicPress)serULC1(SEQ ID No.18)5′CTTGTACTTTCCAGGGCCAC 3′serULC2(SEQ ID No.19)5′TTTAGGAAAAGCAAGGCGGG 3′在第二階段，使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移方法(FRET)，使用解鏈曲線分析(Lay et al.；Clinical Chemistry 432262-2267(1997))證實(shí)所述突變的存在，所述分析使用不同長度的及用不同的熒光染料(LightCycler(LC)-Red640及熒光素)標(biāo)記的兩個額外的寡核苷酸并使其在所述突變位點(diǎn)的區(qū)域中雜交。
serUC(SEQ ID No.20)5’LC-Red640-TCCGGTTTTCGAGACCGGTC-(P)3’serUA(SEQ ID No.21)5’GAGGGGGATTTGAACCCCCGGTAGAGTTGCCCCTA-熒光素3’PCR的引物由MWG Biotech公司(Ebersberg，德國)合成，進(jìn)行所示雜交的寡核苷酸由TIB MOLBIOL公司(Berlin，德國)合成。
可以示出野生型serU基因存在于DM1690中及因此無supD突變。
4.3.2DM1690中supE等位基因的序列分析編碼谷氨酰胺tRNA-2的glnV基因中存在導(dǎo)致琥珀密碼子抑制的另一個已知突變。該等位基因稱為supE，所述tRNA識別琥珀密碼子并摻入谷氨酰胺。在glnV基因的序列中(登錄號AE000170)，野生型glnV基因中胞嘧啶—胸腺嘧啶—鳥嘌呤反密碼子通過堿基置換修飾為胞嘧啶—胸腺嘧啶—腺嘌呤，其識別尿嘧啶—腺嘌呤—鳥嘌呤密碼子。
從大腸桿菌K12(登錄號AE000170)的glnV區(qū)域的已知序列開始，選擇如下寡核苷酸引物(MWG Biotech，Ebersberg，Germany)進(jìn)行PCRglnX1(SEQ ID No.22)5‘CTGGCGTGTTGAAACGTCAG 3‘glnX2(SEQ ID No.23)5‘CACGCTGTTCGCAACCTAACC 3‘用于進(jìn)行PCR的DM1690的染色體DNA根據(jù)廠商數(shù)據(jù)使用“Qiagen Genomic-tips 100/G”(Qiagen，Hilden，Germany)分離。一長度為大約1kpb的DNA片段可以在標(biāo)準(zhǔn)PCR條件下(Innis et al.(1990)PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，AcademicPress)，使用特異性引物及vent聚合酶(New England Biolabs GmbH，F(xiàn)rankfurt，Germany)分離。將該P(yáng)CR產(chǎn)物使用QIAquick PCR純化試劑盒純化并通過Qiagen Sequencing Services(Qiagen GmbH，Hilden，Germany)測序。獲得的序列與glnV基因的區(qū)域中SEQ ID NO4所示序列一致。
所述菌株DM1690具有supE等位基因并通過摻入谷氨酰胺而抑制琥珀密碼子。
實(shí)施例5使用菌株MG1655scrAHVR1，MG1655scrAHVR1rpoS和DM1690制備L-蘇氨酸將菌株MG1655scrAHVR1，MG1655scrAHVR1rpoS和DM1690在具有如下成分的基本培養(yǎng)基上增殖3.5g/l Na2HPO4*2H2O，1.5g/lKH2PO4，1g/l NH4Cl，0.1g/l MgSO4*7H2O，2g/l蔗糖，20g/l瓊脂。將所述培養(yǎng)物在37℃孵育5天。在于100ml Erlenmeyer燒瓶中10ml的分批培養(yǎng)物中監(jiān)測L-蘇氨酸的形成。為此，接種具有如下成分的10ml預(yù)培養(yǎng)基(preculture)2g/l酵母提取物，10g/l(NH4)2SO4，1g/l KH2PO4，0.5g/l MgSO4*7H2O，15g/l CaCO3，20g/l蔗糖，并將該混合物在Kühner AG公司的ESR培養(yǎng)箱(Birsfelden，Switzerland)中在37℃及180rpm孵育16小時。將每種情況中該預(yù)培養(yǎng)物的250μl移至10ml的生產(chǎn)培養(yǎng)基(25g/l(NH4)2SO4，2g/l KH2PO4，1g/lMgSO4*7H2O，0.03g/l FeSO4*7H2O，0.018g/lMnSO4*1H2O，30g/lCaCO3，20g/l蔗糖)中，在37℃孵育48小時。孵育后，使用Dr.Lange公司(德國柏林)的LP2W光度計確定所述培養(yǎng)懸浮液在660nm測定波長的光密度(OD)。
然后使用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析儀(漢堡，德國)經(jīng)離子交換層析和用茚三酮檢測柱后反應(yīng)而確定無菌過濾上清中形成的L-蘇氨酸的濃度。
表4提供了試驗結(jié)果。
表4

附圖簡述圖1pMAK705rpoSamber圖2pTrc99Acatamber長度數(shù)據(jù)是近似數(shù)據(jù)?？s寫及名稱如下限定cat氯霉素抗性基因rep-ts質(zhì)粒pSC101的溫度敏感性復(fù)制區(qū)rpoSrpoS基因的編碼區(qū)Amp氨芐青霉素抗性基因LacItrc啟動子中阻抑基因的基因Ptrctrc啟動子區(qū)域，IPTG可誘導(dǎo)的5S5SrRNA區(qū)域rrnBTrRNA終止子區(qū)域限制性酶的縮寫含義如下●AccIII來自乙酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)的限制性內(nèi)切核酸酶●BamHI來自解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的限制性內(nèi)切核酸酶●EcoRI來自大腸桿菌的限制性內(nèi)切核酸酶●EcoRV來自大腸桿菌的限制性內(nèi)切核酸酶●MscI來自微球菌屬(Microcossus)的限制性內(nèi)切核酸酶●PvuII來自普通變形菌(Proteus vulgaris)的限制性內(nèi)切核酸酶●SspI來自球衣菌屬(Sphaerotilus)的限制性內(nèi)切核酸酶●StuI來自殺結(jié)核鏈霉菌(Streptomyces tubercidius)的限制性內(nèi)切核酸酶●StyI來自傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)的限制性內(nèi)切核酸酶●XbaI來自巴氏黃單胞菌(Xanthomonas badrii)的限制性內(nèi)切核酸酶序列表序列表<110>德古薩股份公司<120>生產(chǎn)氨基酸的細(xì)菌及制備L-氨基酸的方法<130>010319 BT<160>23<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>993<212>DNA<213>Escherichia coli<220>
<221>CDS<222>(1)..(990)<223>
<400>1atg agt cag aat acg ctg aaa gtt cat gat tta aat gaa gat gcg gaa48Met Ser Gln Asn Thr Leu Lys Val His Asp Leu Asn Glu Asp Ala Glu1 5 10 15ttt gat gag aac gga gtt gag gtt ttt gac gaa aag gcc tta gta gaa96Phe Asp Glu Asn Gly Val Glu Val Phe Asp Glu Lys Ala Leu Val Glu20 25 30cag gaa ccc agt gat aac gat ttg gcc gaa gag gaa ctg tta tcg cag144Gln Glu Pro Ser Asp Asn Asp Leu Ala Glu Glu Glu Leu Leu Ser Gln35 40 45gga gcc aca cag cgt gtg ttg gac gcg act cag ctt tac ctt ggt gag192Gly Ala Thr Gln Arg Val Leu Asp Ala Thr Gln Leu Tyr Leu Gly Glu50 55 60att ggt tat tca cca ctg tta acg gcc gaa gaa gaa gtt tat ttt gcg240Ile Gly Tyr Ser Pro Leu Leu Thr Ala Glu Glu Glu Val Tyr Phe Ala65 70 75 80cgt cgc gca ctg cgt gga gat gtc gcc tct cgc cgc cgg atg atc gag288Arg Arg Ala Leu Arg Gly Asp Val Ala Ser Arg Arg Arg Met Ile Glu85 90 95agt aac ttg cgt ctg gtg gta aaa att gcc cgc cgt tat ggc aat cgt336Ser Asn Leu Arg Leu Val Val Lys Ile Ala Arg Arg Tyr Gly Asn Arg100 105 110ggt ctg gcg ttg ctg gac ctt atc gaa gag ggc aac ctg ggg ctg atc384
Gly Leu Ala Leu Leu Asp Leu Ile Glu Glu Gly Asn Leu Gly Leu Ile115 120 125cgc gcg gta gag aag ttt gac ccg gaa cgt ggt ttc cgc ttc tca aca 432Arg Ala Val Glu Lys Phe Asp Pro Glu Arg Gly Phe Arg Phe Ser Thr130 135 140tac gca acc tgg tgg att cgc cag acg att gaa cgg gcg att atg aac 480Tyr Ala Thr Trp Trp Ile Arg Gln Thr Ile Glu Arg Ala Ile Met Asn145 150 155 160caa acc cgt act att cgt ttg ccg att cac atc gta aag gag ctg aac 528Gln Thr Arg Thr Ile Arg Leu Pro Ile His Ile Val Lys Glu Leu Asn165 170 175gtt tac ctg cga acc gca cgt gag ttg tcc cat aag ctg gac cat gaa 576Val Tyr Leu Arg Thr Ala Arg Glu Leu Ser His Lys Leu Asp His Glu180 185 190cca agt gcg gaa gag atc gca gag caa ctg gat aag cca gtt gat gac 624Pro Ser Ala Glu Glu Ile Ala Glu Gln Leu Asp Lys Pro Val Asp Asp195 200 205gtc agc cgt atg ctt cgt ctt aac gag cgc att acc tcg gta gac acc 672Val Ser Arg Met Leu Arg Leu Asn Glu Arg Ile Thr Ser Val Asp Thr210 215 220ccg ctg ggt ggt gat tcc gaa aaa gcg ttg ctg gac atc ctg gcc gat 720Pro Leu Gly Gly Asp Ser Glu Lys Ala Leu Leu Asp Ile Leu Ala Asp225 230 235 240gaa aaa gag aac ggt ccg gaa gat acc acg caa gat gac gat atg aag 768Glu Lys Glu Asn Gly Pro Glu Asp Thr Thr Gln Asp Asp Asp Met Lys245 250 255cag agc atc gtc aaa tgg ctg ttc gag ctg aac gcc aaa cag cgt gaa 816Gln Ser Ile Val Lys Trp Leu Phe Glu Leu Asn Ala Lys Gln Arg Glu260 265 270gtg ctg gca cgt cga ttc ggt ttg ctg ggg tac gaa gcg gca aca ctg 864Val Leu Ala Arg Arg Phe Gly Leu Leu Gly Tyr Glu Ala Ala Thr Leu275 280 285gaa gat gta ggt cgt gaa att ggc ctc acc cgt gaa cgt gtt cgc cag 912Glu Asp Val Gly Arg Glu Ile Gly Leu Thr Arg Glu Arg Val Arg Gln290 295 300att cag gtt gaa ggc ctg cgc cgt ttg cgc gaa atc ctg caa acg cag 960Ile Gln Val Glu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Glu Ile Leu Gln Thr Gln305 310 315 320ggg ctg aat atc gaa gcg ctg ttc cgc gag taa 993Gly Leu Asn Ile Glu Ala Leu Phe Arg Glu325 330<210>2<211>330<212>PRT
<213>Escherichia coli<400>2Met Ser Gln Asn Thr Leu Lys Val His Asp Leu Asn Glu Asp Ala Glu1 5 10 15Phe Asp Glu Asn Gly Val Glu Val Phe Asp Glu Lys Ala Leu Val Glu20 25 30Gln Glu Pro Ser Asp Asn Asp Leu Ala Glu Glu Glu Leu Leu Ser Gln35 40 45Gly Ala Thr Gln Arg Val Leu Asp Ala Thr Gln Leu Tyr Leu Gly Glu50 55 60Ile Gly Tyr Ser Pro Leu Leu Thr Ala Glu Glu Glu Val Tyr Phe Ala65 70 75 80Arg Arg Ala Leu Arg Gly Asp Val Ala Ser Arg Arg Arg Met Ile Glu85 90 95Ser Asn Leu Arg Leu Val Val Lys Ile Ala Arg Arg Tyr Gly Asn Arg100 105 110Gly Leu Ala Leu Leu Asp Leu Ile Glu Glu Gly Asn Leu Gly Leu Ile115 120 125Arg Ala Val Glu Lys Phe Asp Pro Glu Arg Gly Phe Arg Phe Ser Thr130 135 140Tyr Ala Thr Trp Trp Ile Arg Gln Thr Ile Glu Arg Ala Ile Met Asn145 150 155 160Gln Thr Arg Thr Ile Arg Leu Pro Ile His Ile Val Lys Glu Leu Asn165 170 175Val Tyr Leu Arg Thr Ala Arg Glu Leu Ser His Lys Leu Asp His Glu180 185 190Pro Ser Ala Glu Glu Ile Ala Glu Gln Leu Asp Lys Pro Val Asp Asp195 200 205Val Ser Arg Met Leu Arg Leu Asn Glu Arg Ile Thr Ser Val Asp Thr210 215 220Pro Leu Gly Gly Asp Ser Glu Lys Ala Leu Leu Asp Ile Leu Ala Asp225 230 235 240Glu Lys Glu Asn Gly Pro Glu Asp Thr Thr Gln Asp Asp Asp Met Lys245 250 255Gln Ser Ile Val Lys Trp Leu Phe Glu Leu Asn Ala Lys Gln Arg Glu260 265 270Val Leu Ala Arg Arg Phe Gly Leu Leu Gly Tyr Glu Ala Ala Thr Leu275 280 285Glu Asp Val Gly Arg Glu Ile Gly Leu Thr Arg Glu Arg Val Arg Gln
290 295 300Ile Gln Val Glu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Glu Ile Leu Gln Thr Gln305 310 315 320Gly Leu Asn Ile Glu Ala Leu Phe Arg Glu325 330<210>3<211>993<212>DNA<213>Escherichia coli<220>
<221>Allele<222>(1)..(990)<223>rpoS-Allel<220>
<221>misc_feature<222>(97)..(99)<223>amber-codon<400>3atgagtcaga atacgctgaa agttcatgat ttaaatgaag atgcggaatt tgatgagaac60ggagttgagg tttttgacga aaaggcctta gtagaatagg aacccagtga taacgatttg120gccgaagagg aactgttatc gcagggagcc acacagcgtg tgttggacgc gactcagctt180taccttggtg agattggtta ttcaccactg ttaacggccg aagaagaagt ttattttgcg240cgtcgcgcac tgcgtggaga tgtcgcctct cgccgccgga tgatcgagag taacttgcgt300ctggtggtaa aaattgcccg ccgttatggc aatcgtggtc tggcgttgct ggaccttatc360gaagagggca acctggggct gatccgcgcg gtagagaagt ttgacccgga acgtggtttc420cgcttctcaa catacgcaac ctggtggatt cgccagacga ttgaacgggc gattatgaac480caaacccgta ctattcgttt gccgattcac atcgtaaagg agctgaacgt ttacctgcga540accgcacgtg agttgtccca taagctggac catgaaccaa gtgcggaaga gatcgcagag600caactggata agccagttga tgacgtcagc cgtatgcttc gtcttaacga gcgcattacc660tcggtagaca ccccgctggg tggtgattcc gaaaaagcgt tgctggacat cctggccgat720gaaaaagaga acggtccgga agataccacg caagatgacg atatgaagca gagcatcgtc780
aaatggctgt tcgagctgaa cgccaaacag cgtgaagtgc tggcacgtcg attcggtttg 840ctggggtacg aagcggcaac actggaagat gtaggtcgtg aaattggcct cacccgtgaa 900cgtgttcgcc agattcaggt tgaaggcctg cgccgtttgc gcgaaatcct gcaaacgcag 960gggctgaata tcgaagcgct gttccgcgag taa 993<210>4<211>75<212>DNA<213>Escherichia coli<220>
<221>tRNA<222>(1)..(75)<223>supE-allele<400>4tggggtatcg ccaagcggta aggcaccgga ttctaattcc ggcattccga ggttcgaatc 60ctcgtacccc agcca 75<210>5<211>714<212>DNA<213>Escherichia coli<220>
<221>CDS<222>(1)..(711)<223>
<400>5atg atc gag agt aac ttg cgt ctg gtg gta aaa att gcc cgc cgt tat48Met Ile Glu Ser Asn Leu Arg Leu Val Val Lys Ile Ala Arg Arg Tyr1 5 10 15ggc aat cgt ggt ctg gcg ttg ctg gac ctt atc gaa gag ggc aac ctg96Gly Asn Arg Gly Leu Ala Leu Leu Asp Leu Ile Glu Glu Gly Asn Leu20 25 30ggg ctg atc cgc gcg gta gag aag ttt gac ccg gaa cgt ggt ttc cgc144Gly Leu Ile Arg Ala Val Glu Lys Phe Asp Pro Glu Arg Gly Phe Arg35 40 45ttc tca aca tac gca acc tgg tgg att cgc cag acg att gaa cgg gcg192
Phe Ser Thr Tyr Ala Thr Trp Trp Ile Arg Gln Thr Ile Glu Arg Ala50 55 60att atg aac caa acc cgt act att cgt ttg ccg att cac atc gta aag 240Ile Met Asn Gln Thr Arg Thr Ile Arg Leu Pro Ile His Ile Val Lys65 70 75 80gag ctg aac gtt tac ctg cga acc gca cgt gag ttg tcc cat aag ctg 288Glu Leu Asn Val Tyr Leu Arg Thr Ala Arg Glu Leu Ser His Lys Leu85 90 95gac cat gaa cca agt gcg gaa gag atc gca gag caa ctg gat aag cca 336Asp His Glu Pro Ser Ala Glu Glu Ile Ala Glu Gln Leu Asp Lys Pro100 105 110gtt gat gac gtc agc cgt atg ctt cgt ctt aac gag cgc att acc tcg 384Val Asp Asp Val Ser Arg Met Leu Arg Leu Asn Glu Arg Ile Thr Ser115 120 125gta gac acc ccg ctg ggt ggt gat tcc gaa aaa gcg ttg ctg gac atc 432Val Asp Thr Pro Leu Gly Gly Asp Ser Glu Lys Ala Leu Leu Asp Ile130 135 140ctg gcc gat gaa aaa gag aac ggt ccg gaa gat acc acg caa gat gac 480Leu Ala Asp Glu Lys Glu Asn Gly Pro Glu Asp Thr Thr Gln Asp Asp145 150 155 160gat atg aag cag agc atc gtc aaa tgg ctg ttc gag ctg aac gcc aaa 528Asp Met Lys Gln Ser Ile Val Lys Trp Leu Phe Glu Leu Asn Ala Lys165 170 175cag cgt gaa gtg ctg gca cgt cga ttc ggt ttg ctg ggg tac gaa gcg 576Gln Arg Glu Val Leu Ala Arg Arg Phe Gly Leu Leu Gly Tyr Glu Ala180 185 190gca aca ctg gaa gat gta ggt cgt gaa att ggc ctc acc cgt gaa cgt 624Ala Thr Leu Glu Asp Val Gly Arg Glu Ile Gly Leu Thr Arg Glu Arg195 200 205gtt cgc cag att cag gtt gaa ggc ctg cgc cgt ttg cgc gaa atc ctg 672Val Arg Gln Ile Gln Val Glu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Glu Ile Leu210 215 220caa acg cag ggg ctg aat atc gaa gcg ctg ttc cgc gag taa 714Gln Thr Gln Gly Leu Asn Ile Glu Ala Leu Phe Arg Glu225 230 235<210>6<211>237<212>PRT<213>Escherichia coli<400>6Met Ile Glu Ser Asn Leu Arg Leu Val Val Lys Ile Ala Arg Arg Tyr1 5 10 15Gly Asn Arg Gly Leu Ala Leu Leu Asp Leu Ile Glu Glu Gly Asn Leu20 25 30
Gly Leu Ile Arg Ala Val Glu Lys Phe Asp Pro Glu Arg Gly Phe Arg35 40 45Phe Ser Thr Tyr Ala Thr Trp Trp Ile Arg Gln Thr Ile Glu Arg Ala50 55 60Ile Met Asn Gln Thr Arg Thr Ile Arg Leu Pro Ile His Ile Val Lys65 70 75 80Glu Leu Asn Val Tyr Leu Arg Thr Ala Arg Glu Leu Ser His Lys Leu85 90 95Asp His Glu Pro Ser Ala Glu Glu Ile Ala Glu Gln Leu Asp Lys Pro100 105 110Val Asp Asp Val Ser Arg Met Leu Arg Leu Asn Glu Arg Ile Thr Ser115 120 125Val Asp Thr Pro Leu Gly Gly Asp Ser Glu Lys Ala Leu Leu Asp Ile130 135 140Leu Ala Asp Glu Lys Glu Asn Gly Pro Glu Asp Thr Thr Gln Asp Asp145 150 155 160Asp Met Lys Gln Ser Ile Val Lys Trp Leu Phe Glu Leu Asn Ala Lys165 170 175Gln Arg Glu Val Leu Ala Arg Arg Phe Gly Leu Leu Gly Tyr Glu Ala180 185 190Ala Thr Leu Glu Asp Val Gly Arg Glu Ile Gly Leu Thr Arg Glu Arg195 200 205Val Arg Gln Ile Gln Val Glu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Glu Ile Leu210 215 220Gln Thr Gln Gly Leu Asn Ile Glu Ala Leu Phe Arg Glu225 230 235<210>7<211>19<212>DNA<213>synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(19)<223>rpoS9<400>7cagttatagc ggcagtacc 19<210>8
<211>23<212>DNA<213>synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(23)<223>rpoS4<400>8ggacagtgtt aacgaccatt ctc 23<210>9<211>2012<212>DNA<213>Escherichia coli<220>
<221>DNA<222>(1)..(2012)<223>rpoS9-4<400>9cagttatagc ggcagtacct ataccgtgaa aaaaggcgac acacttttct atatcgcctg60gattactggc aacgatttcc gtgaccttgc tcagcgcaac aatattcagg caccatacgc120gctgaacgtt ggtcagacct tgcaggtggg taatgcttcc ggtacgccaa tcactggcgg180aaatgccatt acccaggccg acgcagcaga gcaaggagtt gtgatcaagc ctgcacaaaa240ttccaccgtt gctgttgcgt cgcaaccgac aattacgtat tctgagtctt cgggtgaaca300gagtgctaac aaaatgttgc cgaacaacaa gccaactgcg accacggtca cagcgcctgt360aacggtacca acagcaagca caaccgagcc gactgtcagc agtacatcaa ccagtacgcc420tatctccacc tggcgctggc cgactgaggg caaagtgatc gaaacctttg gcgcttctga480ggggggcaac aaggggattg atatcgcagg cagcaaagga caggcaatta tcgcgaccgc540agatggccgc gttgtttatg ctggtaacgc gctgcgcggc tacggtaatc tgattatcat600caaacataat gatgattacc tgagtgccta cgcccataac gacacaatgc tggtccggga660acaacaagaa gttaaggcgg ggcaaaaaat agcgaccatg ggtagcaccg gaaccagttc720aacacgcttg cattttgaaa ttcgttacaa ggggaaatcc gtaaacccgc tgcgttattt780gccgcagcga taaatcggcg gaaccaggct tttgcttgaa tgttccgtca agggatcacg840
ggtaggagcc accttatgag tcagaatacg ctgaaagttc atgatttaaa tgaagatgcg 900gaatttgatg agaacggagt tgaggttttt gacgaaaagg ccttagtaga acaggaaccc 960agtgataacg atttggccga agaggaactg ttatcgcagg gagccacaca gcgtgtgttg 1020gacgcgactc agctttacct tggtgagatt ggttattcac cactgttaac ggccgaagaa 1080gaagtttatt ttgcgcgtcg cgcactgcgt ggagatgtcg cctctcgccg ccggatgatc 1140gagagtaact tgcgtctggt ggtaaaaatt gcccgccgtt atggcaatcg tggtctggcg 1200ttgctggacc ttatcgaaga gggcaacctg gggctgatcc gcgcggtaga gaagtttgac 1260ccggaacgtg gtttccgctt ctcaacatac gcaacctggt ggattcgcca gacgattgaa 1320cgggcgatta tgaaccaaac ccgtactatt cgtttgccga ttcacatcgt aaaggagctg 1380aacgtttacc tgcgaaccgc acgtgagttg tcccataagc tggaccatga accaagtgcg 1440gaagagatcg cagagcaact ggataagcca gttgatgacg tcagccgtat gcttcgtctt 1500aacgagcgca ttacctcggt agacaccccg ctgggtggtg attccgaaaa agcgttgctg 1560gacatcctgg ccgatgaaaa agagaacggt ccggaagata ccacgcaaga tgacgatatg 1620aagcagagca tcgtcaaatg gctgttcgag ctgaacgcca aacagcgtga agtgctggca 1680cgtcgattcg gtttgctggg gtacgaagcg gcaacactgg aagatgtagg tcgtgaaatt 1740ggcctcaccc gtgaacgtgt tcgccagatt caggttgaag gcctgcgccg tttgcgcgaa 1800atcctgcaaa cgcaggggct gaatatcgaa gcgctgttcc gcgagtaagt aagcatctgt 1860cagaaaggcc agtctcaagc gaggctggcc ttttctgtgc acaataaaag gtccgatgcc 1920catcggacct ttttattaag gtcaaattac cgcccatacg caccaggtaa ttaagaatcc 1980ggtaaaaccg agaatggtcg ttaacactgt cc 2012<210>10<211>31<212>DNA<213>synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(31)<223>rpoSamber1<400>10ggccttagta gaataggaac ccagtgataa c 31<210>11
<211>31<212>DNA<213>synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(31)<223>rpoSamber2<400>11gttatcactg ggttcctatt ctactaaggc c 31<210>12<211>20<212>DNA<213>synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(20)<223>rpoSLC1<400>12cggaaccagg cttttgcttg 20<210>13<211>20<212>DNA<213>synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(20)<223>rpoSLC2<400>13gcgcgacgcg caaaataaac 20<210>14<211>23<212>DNA<213>synthetic sequence
<220>
<221>Primer<222>(1)..(23)<223>rpoSamberC<400>14cttagtagaa caggaaccca gtg 23<210>15<211>34<212>DNA<213>synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(34)<223>rpoSamberA<400>15gatgagaacg gagttgaggt ttttgacgaa aagg 34<210>16<211>31<212>DNA<213>synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(31)<223>catAccIII<400>16gctcatccgg aattccgtta ggcatagaaa g 31<210>17<211>24<212>DNA<213>synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(24)
<223>catMscI<400>17gtccatattg gccacgttta aatc 24<210>18<211>20<212>DNA<213>synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(20)<223>serULC1<400>18cttgtacttt ccagggccac 20<210>19<211>20<212>DNA<213>synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(20)<223>serULC2<400>19tttaggaaaa gcaaggcggg 20<210>20<211>20<212>DNA<213>synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(20)<223>serUC<400>20tccggttttc gagaccggtc 20<210>21
<211>35<212>DNA<213>synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(35)<223>serUA<400>21gagggggatt tgaacccccg gtagagttgc cccta 35<210>22<211>20<212>DNA<213>synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(20)<223>glnX1<400>22ctggcgtgtt gaaacgtcag 20<210>23<211>21<212>DNA<213>synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(21)<223>glnX2<400>23cacgctgttc gcaacctaac c2權(quán)利要求
1.來自腸桿菌科尤其是來自大腸桿菌物種的生產(chǎn)氨基酸的細(xì)菌，其中這些細(xì)菌含有1)在rpoS基因的編碼區(qū)內(nèi)的至少一個選自琥珀、赭石和乳白的終止密碼子及2)選自琥珀抑制基因、赭石抑制基因和乳白抑制基因的相應(yīng)抑制基因。
2.權(quán)利要求1的生產(chǎn)氨基酸的細(xì)菌，其中這些細(xì)菌在rpoS基因的編碼區(qū)內(nèi)含有至少一個琥珀型終止密碼子及至少一個琥珀抑制基因。
3.權(quán)利要求2的生產(chǎn)氨基酸的細(xì)菌，其中所述琥珀型終止密碼子位于相應(yīng)于SEQ ID NO2所示RpoS蛋白質(zhì)的氨基酸序列的第2-314位的rpoS基因編碼區(qū)內(nèi)。
4.權(quán)利要求3的生產(chǎn)氨基酸的細(xì)菌，其中所述琥珀型終止密碼子位于相應(yīng)于SEQ ID NO2所示RpoS蛋白質(zhì)的氨基酸序列的第2-95位的rpoS基因編碼區(qū)內(nèi)。
5.權(quán)利要求4的生產(chǎn)氨基酸的細(xì)菌，其中所述琥珀型終止密碼子位于相應(yīng)于SEQ ID NO2所示RpoS蛋白質(zhì)的氨基酸序列的第33位的rpoS基因編碼區(qū)內(nèi)。
6.權(quán)利要求5的生產(chǎn)氨基酸的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌含有選自supD和supE的至少一個琥珀抑制基因。
7.權(quán)利要求6的生產(chǎn)氨基酸的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌至少含有琥珀抑制基因supE。
8.權(quán)利要求1的生產(chǎn)氨基酸的細(xì)菌，其中它們生產(chǎn)與所需L-氨基酸的量相比不超過40％的L-賴氨酸作為二級產(chǎn)物。
9.權(quán)利要求8的生產(chǎn)氨基酸的細(xì)菌，其中它們生產(chǎn)與所需L-氨基酸的量相比不超過10％的L-賴氨酸作為二級產(chǎn)物。
10.權(quán)利要求8的生產(chǎn)氨基酸的細(xì)菌，其中它們生產(chǎn)與所需L-氨基酸的量相比不超過5％的L-賴氨酸作為二級產(chǎn)物。
11.權(quán)利要求1的生產(chǎn)氨基酸的細(xì)菌，其中所述氨基酸是選自L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-高絲氨酸、L-甲硫氨酸、L-谷氨酸、L-纈氨酸和L-色氨酸的一種氨基酸。
12.權(quán)利要求1的生產(chǎn)氨基酸的細(xì)菌，其中所述氨基酸是L-蘇氨酸。
13.來自腸桿菌科尤其大腸桿菌物種的生產(chǎn)L-蘇氨酸的細(xì)菌，其中這些細(xì)菌在相應(yīng)于SEQ ID NO2所示RpoS蛋白質(zhì)的氨基酸序列中第33位的rpoS基因的編碼區(qū)內(nèi)含有一個琥珀型終止密碼子，及琥珀抑制基因supE。
14.權(quán)利要求13的生產(chǎn)L-蘇氨酸的細(xì)菌，其中一或多個選自如下一組的基因被同時增強(qiáng)、尤其是過表達(dá)14.1編碼天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶和蘇氨酸合酶的thrABC操縱子，14.2編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因，14.3編碼磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因，14.4編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因，14.5編碼轉(zhuǎn)氫酶的pntA和pntB基因，14.6授予高絲氨酸抗性的rhtB基因，14.7編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因，14.8授予蘇氨酸抗性的rhtC基因，14.9來自谷氨酸棒桿菌的編碼蘇氨酸輸出蛋白的thrE基因，14.10編碼谷氨酸脫氫酶的gdhA基因，14.11編碼DNA結(jié)合蛋白HLP-II的hns基因，14.12編碼葡糖磷酸變位酶的pgm基因，14.13編碼果糖二磷酸醛縮酶的fba基因，14.14編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)中酶I的ptsHIcrr操縱子內(nèi)的ptsI基因，14.15編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)中磷酸組氨酸蛋白己糖磷酸轉(zhuǎn)移酶的ptsHIcrr操縱子中的ptsH基因，14.16編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)中葡萄糖特異性IIA成分的ptsHIcrr操縱子中的crr基因，14.17編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)中葡萄糖特異性IIBC成分的ptsG基因，14.18編碼亮氨酸調(diào)節(jié)子中調(diào)節(jié)蛋白的lrp基因，14.19編碼全局調(diào)節(jié)蛋白的csrA基因，14.20編碼fad調(diào)節(jié)子中調(diào)節(jié)蛋白的fadR基因，14.21編碼重要中間代謝中調(diào)節(jié)蛋白的iclR基因，14.22編碼10Kd陪伴分子的mopB基因，其還稱為groES，14.23編碼烷基氫過氧化物還原酶的小亞基的ahpCF操縱子內(nèi)的ahpC基因，14.24編碼烷基氫過氧化物還原酶的大亞基的ahpCF操縱子內(nèi)的ahpF基因，14.25編碼半胱氨酸合酶A的cysK基因，14.26編碼cys調(diào)節(jié)子中調(diào)節(jié)蛋白的cysB基因，14.27編碼NADPH亞硫酸鹽還原酶中黃素蛋白的cysJIH操縱子中的cysJ基因，14.28編碼腺苷酰硫酸還原酶的cysJIH操縱子中的cysH基因，及14.29編碼NADPH亞硫酸鹽還原酶中血蛋白的cysJIH操縱子中的cysI基因。
15.權(quán)利要求13的生產(chǎn)氨基酸的細(xì)菌，其中其它基因被弱化。
16.一種降低腸桿菌科尤其是大腸桿菌物種中RpoS蛋白或σ38因子的胞內(nèi)活性的方法，其中1)將選自琥珀、赭石和乳白的至少一個終止密碼子摻入rpoS基因的編碼區(qū)中，及2)摻入編碼選自琥珀抑制基因、赭石抑制基因和乳白抑制基因的抑制基因tRNA的相應(yīng)抑制基因tRNA基因或等位基因。
17.權(quán)利要求16的方法，其中RpoS蛋白或σ38因子的活性或濃度降低到＞0至75％。
18.權(quán)利要求16的方法，其中RpoS蛋白或σ38因子的活性或濃度降低到＞0至5％。
19.來自腸桿菌科尤其是大腸桿菌物種的生產(chǎn)氨基酸的細(xì)菌，其形成RpoS蛋白或σ38因子，所述蛋白或因子在SEQ ID NO2所示氨基酸序列中第33位含有選自如下的一種氨基酸L-絲氨酸，L-酪氨酸，L-亮氨酸，L-色氨酸，L-賴氨酸，L-丙氨酸，L-精氨酸，L-苯丙氨酸，L-半胱氨酸，L-脯氨酸，L-組氨酸，L-蘇氨酸及L-纈氨酸，其中所述細(xì)菌生產(chǎn)選自如下的一或多種氨基酸L-蘇氨酸，L-異亮氨酸，L-高絲氨酸，L-甲硫氨酸，L-谷氨酸，L-纈氨酸和L-色氨酸。
20.一種制備氨基酸或含有這些氨基酸的食品添加劑的方法，包括如下步驟a)發(fā)酵來自腸桿菌科尤其是大腸桿菌物種的細(xì)菌，所述細(xì)菌1)在rpoS基因的編碼區(qū)內(nèi)含有選自琥珀、赭石和乳白的至少一個終止密碼子及2)具有選自琥珀抑制基因、赭石抑制基因和乳白抑制基因的相應(yīng)抑制基因，b)富集培養(yǎng)基或微生物細(xì)胞中的氨基酸，及c)分離所述氨基酸，其中任選發(fā)酵肉湯的成分和/或全部或部分生物量(≥0至100)留在產(chǎn)物中。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述氨基酸是選自如下的一種氨基酸L-蘇氨酸，L-異亮氨酸，L-高絲氨酸，L-甲硫氨酸，L-谷氨酸，L-纈氨酸和L-色氨酸。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述氨基酸是L-蘇氨酸。
23.一種制備L-蘇氨酸的方法，其包括如下步驟a)發(fā)酵來自腸桿菌科尤其是大腸桿菌物種的細(xì)菌，所述細(xì)菌1)在rpoS基因的編碼區(qū)內(nèi)相應(yīng)于SEQ ID NO2所示氨基酸序列的第33位含有至少一個琥珀型終止密碼子及2)至少具有相應(yīng)的琥珀抑制基因supE，b)富集培養(yǎng)基或微生物細(xì)胞中L-蘇氨酸，及c)分離L-蘇氨酸，其中任選地發(fā)酵肉湯中的成分和/或全部或部分生物量(≥0至100)留在產(chǎn)物中。
24.來自腸桿菌科尤其是大腸桿菌物種的生產(chǎn)氨基酸的細(xì)菌，其含有或形成SEQ ID NO6所示的RpoS蛋白。
25.一種制備氨基酸或包含氨基酸的食品添加劑的方法，其中進(jìn)行如下步驟a)發(fā)酵含有或形成具有SEQ ID NO6所示氨基酸序列的RpoS蛋白的腸桿菌科，b)富集發(fā)酵肉湯中的氨基酸，c)從發(fā)酵肉湯中分離氨基酸或含有氨基酸的食品添加劑，任選地d)分離發(fā)酵肉湯中的成分和/或生物量(≥0至100％)。
26.大腸桿菌菌株DM1690，其保藏在德國微生物及細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，Germany)，保藏號DSM 15189。
27.權(quán)利要求23的方法，其中使用保藏號為DSM 15189的大腸桿菌菌株DM1690。
28.一種弱化或關(guān)閉腸桿菌科尤其是大腸桿菌物種中的一或多個基因或開放讀框的方法，所屬基因選自tdh，mdh，pckA，poxB，aceA，dgsA，fruR，ugpB，aspA，aceB，aceK，yjfA和ytfP，其中1)在所述基因的編碼區(qū)中摻入選自琥珀、赭石和乳白的至少一個終止密碼子，及2)同時摻入選自琥珀抑制基因、赭石抑制基因和乳白抑制基因的相應(yīng)抑制基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及來自腸桿菌科尤其大腸桿菌物種的生產(chǎn)氨基酸的細(xì)菌，其在rpoS基因編碼區(qū)核苷酸序列中含有選自琥珀、赭石或乳白的一種終止密碼子及選自琥珀抑制基因，赭石抑制基因或乳白抑制基因的一種終止密碼子抑制基因。本發(fā)明還涉及使用這些細(xì)菌制備氨基酸尤其L－蘇氨酸的方法。
文檔編號C12N1/21GK1639350SQ03805271
公開日2005年7月13日 申請日期2003年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月7日
發(fā)明者梅希特希爾德·里平, 妮科爾·西貝爾特 申請人:德古薩股份公司