專利名稱：底物定量方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用氧化還原酶電化學(xué)定量試樣中所含底物的定量方法。
背景技術(shù)：
已開發(fā)多種簡(jiǎn)易地測(cè)定及定量試樣中存在的特定底物的方法。其中，近年利用酶所具有的底物選擇性的催化作用進(jìn)行高選擇性測(cè)定及定量的方法引人注目，部分方法作為定量體液中特定成分的方法，使用于臨床檢查領(lǐng)域，以及一般人自我檢查的領(lǐng)域。
對(duì)葡萄糖的電化學(xué)定量法進(jìn)行說(shuō)明，作為定量測(cè)定試樣中的底物的方法的一例。葡萄糖氧化酶(以下簡(jiǎn)稱GOx)是選擇性催化葡萄糖氧化的酶。在含GOx和葡萄糖的反應(yīng)液中，如存在一定量的氧化型電子載體(將反應(yīng)中生成的電子從酶?jìng)鬟f到電極的化合物)，隨著葡萄糖的氧化，氧化型電子載體被還原，生成還原型電子載體。利用施加直流電流的電極氧化生成的還原型電子載體，測(cè)定流過(guò)的電流。這時(shí)流過(guò)的電流，跟GOx與葡萄糖反應(yīng)生成的還原型電子載體的量成比例，且該還原型電子載體的量與葡萄糖的含量成比例，通過(guò)這一測(cè)定可定量葡萄糖。
在電極上干燥和載體酶和電子載體，可能制成生物傳感器電極元件?；谶@樣的技術(shù)的一次性葡萄糖傳感器的開發(fā)，近年受到人們關(guān)注。其代表例為日本特許第2517153號(hào)說(shuō)明書所示的生物傳感器。一次性葡萄糖傳感器中，只要在可裝卸的連接于測(cè)定器的傳感器元件中引入試液，便容易測(cè)定葡萄糖濃度。
以上說(shuō)明了簡(jiǎn)單地測(cè)定和定量試樣中存在的特定底物的方法，作為一般的電化學(xué)測(cè)定法之一，而不是底物定量法，因在電極上施加交流電位而不加直流電位，所以存在測(cè)定所得的電信號(hào)的方法(以下稱交流法)。這主要是得到有關(guān)于電極/電解液界面的結(jié)構(gòu)的信息的方法，它是通過(guò)這樣的測(cè)定法例如評(píng)價(jià)二次電池的載體活性物質(zhì)的電極的特性。
如上所述，通過(guò)使用酶可實(shí)現(xiàn)底物選擇性較高的測(cè)定，但至今所用的施加直流電位的電化學(xué)測(cè)定中，試樣中所含的測(cè)定對(duì)象，即底物以外的物質(zhì)的影響會(huì)引起測(cè)定誤差。例如，以血液作為試樣進(jìn)行電化學(xué)測(cè)定的場(chǎng)合，血液中所含的抗壞血酸(維生素C)。尿酸及對(duì)乙酰氨基酚等易氧化的化合物會(huì)成為引起誤差的原因。在施加直流電位的測(cè)定中這樣的會(huì)產(chǎn)生誤差的物質(zhì)稱為干擾性物質(zhì)(interferingsustance)。
以下用圖5說(shuō)明以前的方法中干擾性物質(zhì)產(chǎn)生電流誤差的原因。圖5是表示溶解有GOx、電子載體和葡萄糖的溶液，以及干擾性物質(zhì)的溶液所得的電極電位和電流的關(guān)系的圖。用以前的方法定量葡萄糖時(shí)，通常在電極上施加能使電子載體充分氧化的電位E1，而得到電流。在電極上施加E1的場(chǎng)合，如圖5所示，干擾性物質(zhì)在電極上也充分進(jìn)行電化學(xué)氧化。因該干擾性物質(zhì)的電化學(xué)氧化而流過(guò)的電流(I3)與葡萄糖的相應(yīng)電流(I1)重疊，所以葡萄糖的測(cè)定產(chǎn)生正誤差。假定使用可使電子載體中等程度氧化的電位，例如圖5所示的E2，也不能避免干擾性物質(zhì)的電流，而且干擾性物質(zhì)產(chǎn)生的電流在總電流中所占比例增加，S/N比值惡化。
如使用具有比干擾性物質(zhì)不被氧化的電位E3負(fù)的氧化還原電位的化合物作電子載體，理論上不發(fā)生誤差。用這樣的化合物進(jìn)行葡萄糖定量已作了幾次嘗試。但在該情況下，由于GOx與該化合物間的電位差變小，它們之間的電子移動(dòng)速度非常慢，或者根本不發(fā)生。結(jié)果是進(jìn)行葡萄糖定量的電流，其檢出的可能限度并沒(méi)變大，或者為檢出電流要很長(zhǎng)時(shí)間，而且不能得到全部電流，這是它的問(wèn)題。
而且干擾性物質(zhì)的血濃度因人而異，且同一個(gè)體也每天有所變化。因此預(yù)測(cè)干擾性物質(zhì)的血中濃度產(chǎn)生的測(cè)定誤差，對(duì)其進(jìn)行校正，在以前的測(cè)定中是非常困難的。
為校正或除去干擾性物質(zhì)的影響，已嘗試了各種方法。例如美國(guó)專利6340428號(hào)公報(bào)中揭示了除了工作電極和對(duì)電極以外，還設(shè)置測(cè)定干擾性物質(zhì)用的第三電極校正干擾性物質(zhì)的影響，和傳感器。通過(guò)在進(jìn)行酶反應(yīng)以及其后用工作電極測(cè)定底物之前，用第三電極進(jìn)行試樣中所含干擾性物質(zhì)的測(cè)定，可實(shí)現(xiàn)良好的校正。
作為除去干擾性物質(zhì)的影響的方法，開發(fā)了通過(guò)將阻滯干擾性物質(zhì)向電極擴(kuò)散的膜配置在電極上，抑制干擾性物質(zhì)所產(chǎn)生的電流的方法。例如Wang，J.等在Electroanalysis 1996，8，1127-1130中揭示了聚(鄰苯二胺)膜的使用。
這樣，用于測(cè)定和定量試樣中存在的特定底物的以前使用直流電位的電化學(xué)方法中，為實(shí)現(xiàn)干擾性物質(zhì)的影響校正或除去，必須使傳感器元件或電極的結(jié)構(gòu)變得復(fù)雜。
本發(fā)明考慮到以前的上述問(wèn)題，目的在于提供一種通過(guò)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的測(cè)定體系，能正確定量試液中所含底物而不產(chǎn)生干擾性物質(zhì)引起的測(cè)定誤差的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及底物的定量方法，它是使用電極系統(tǒng)和試劑系統(tǒng)，定量含有溶解的干擾性物質(zhì)和底物的試液的上述底物的方法，其特征為包括下列工序(a)在含氧化還原酶及電子載體的試劑系統(tǒng)存在下，向包括工作電極和對(duì)電極的電極系統(tǒng)中供給含溶解的干擾性物質(zhì)和底物的試液的工序，(b)在上述工作電極上施加交流電位，使上述電子載體發(fā)生氧化還原反應(yīng)的工序，(c)用上述電極系統(tǒng)測(cè)定上述氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的電信號(hào)的工序，以及(d)根據(jù)上述電信號(hào)定量上述底物的工序。
在上述工序(a)中，較好將上述工作電極和上述對(duì)電極配置在同一平面上。
在上述工序(a)中，較好將上述工作電極和上述對(duì)電極隔著空間相對(duì)配置。
上述底物的定量方法，較好再包括在上述工作電極上施加直流電位的工序(e)，以及測(cè)定上述工序(e)中產(chǎn)生的電信號(hào)的工序(f)。
上述工序(b)中，較好是上述交流電位的中心電位，相對(duì)于上述電子載體的氧化還原電位，在-0.1V～+0.1V的范圍內(nèi)，并且在上述干擾性物質(zhì)的上述工作電極上的反應(yīng)處于擴(kuò)散控速區(qū)域的電位范圍中，是比最負(fù)的電位負(fù)0.05V的電位更正的電位。
上述電信號(hào)較好是阻抗。
上述電極系統(tǒng)較好還包括參比電極。
上述工作電極較好是旋轉(zhuǎn)圓盤電極或微電極。
上述氧化還原酶較好是葡萄糖氧化酶或吡咯并喹啉醌依賴性葡萄糖脫氫酶，上述電子載體較好是二茂鐵羧酸。
上述氧化還原酶較好是吡咯并喹啉醌依賴性葡萄糖脫氫酶，上述電子載體較好是六氰酸釕。


圖1是本發(fā)明一實(shí)施例所用的生物傳感器除去試劑系統(tǒng)后的立體圖。
圖2是顯示圖1的生物傳感器主要部分的縱截面圖(X-X線截面圖)。
圖3是標(biāo)出本發(fā)明實(shí)施例中阻抗Z的實(shí)數(shù)部分和虛數(shù)部分的圖。
圖4是顯示用于實(shí)施本發(fā)明底物的定量方法的測(cè)定裝置的一例的結(jié)構(gòu)的圖。
圖5是表示以前的方法，由溶解有GOx、電子載體及葡萄糖的溶液以及干擾性物質(zhì)的溶液所得的電極電位和電流的關(guān)系的圖。
發(fā)明實(shí)施方式本發(fā)明的底物定量方法，其特征在于，包括(a)在含氧化還原酶及電子載體的試劑系統(tǒng)存在下，向包括工作電極和對(duì)電極的電極系統(tǒng)供給含溶解有干擾性物質(zhì)和底物的試液的工序，(b)在上述工作電極上施加交流電位，使上述電子載體發(fā)生氧化還原反應(yīng)的工序，(c)用上述電極系統(tǒng)測(cè)定上述氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的電位號(hào)的工序，以及(d)根據(jù)上述電信號(hào)定量上述底物的工序。
使用這樣的本發(fā)明的底物定量方法，可能不受干擾性物質(zhì)影響而進(jìn)行底物的測(cè)定。其理由說(shuō)明如下交流測(cè)定是用某個(gè)恒定的直流電位作中心電位，使振幅微小的交流電位成分與該中心電位重疊，使所含的交流電位施加在工作電極上，測(cè)定所得電信號(hào)的測(cè)定法?？捎美鐖D4所示的裝置作測(cè)定裝置。
圖4所示的測(cè)定裝置包括波發(fā)生器2、i/E轉(zhuǎn)換器(converter)3、鎖定放大器4、恒電位計(jì)(穩(wěn)壓器)5及低通濾波器6。用波形發(fā)生器2生成交流電位，以恒電流計(jì)5控制中心電位。然后生物傳感器1的工作電極上的反應(yīng)產(chǎn)生的電流由i/E轉(zhuǎn)換器3轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，經(jīng)鎖定放大器4及低通濾波器6，分別得到交流成分和直流成分。通過(guò)利用這些成分，如后所述，可進(jìn)行底物的定量。
以下一邊與直流循環(huán)伏安法相比較，一邊對(duì)交流測(cè)定進(jìn)行說(shuō)明。首先考慮用干擾性物質(zhì)不溶解的試液，而使用與上述本實(shí)施方式的底物定量方法同樣的電極系統(tǒng)和試劑系統(tǒng)的場(chǎng)合的直流循環(huán)伏安法。這一場(chǎng)合觀測(cè)電流(I)與電位(E)之間的所謂催化波。即使在電位掃描速度快的場(chǎng)合，通常也可得到不含電子載體引起的陽(yáng)極(或陰極)峰的S形波形。在得到此S形波形的系統(tǒng)中，如用較慢的電位掃描速度進(jìn)行直接循環(huán)伏安法測(cè)定，幾乎不能觀測(cè)到陽(yáng)極波與陰極波之間的滯后。因此這一場(chǎng)合電流變化對(duì)電位變化的比(dI/dE)，根據(jù)歐姆定律，實(shí)際上表示系統(tǒng)的電阻成分(R)的倒數(shù)。
下面考慮同樣系統(tǒng)進(jìn)行交流測(cè)定的情況。如上所述，在用較慢的電位掃描速度的直流循環(huán)伏安法中幾乎不存在滯后，與此同樣，在用較低頻率進(jìn)行交流測(cè)定時(shí)，交流電流(Iac)和交流電位(Eac)之間幾乎不產(chǎn)生相位差。因而這時(shí)系統(tǒng)的電阻成分阻抗(Z)來(lái)自dIac/dEac。測(cè)定后，將其實(shí)數(shù)部分標(biāo)給于橫軸，負(fù)的虛數(shù)部分標(biāo)給于縱軸(復(fù)阻抗標(biāo)給)。由于如上所述，在較低頻率時(shí)電流—電位間幾乎沒(méi)有相位差，標(biāo)給的數(shù)據(jù)組存在于實(shí)數(shù)軸附近，有某一較大的|Z0|。如慢慢提高頻率，系統(tǒng)的電容成分出現(xiàn)影響，因而Z的大小減小，標(biāo)繪的數(shù)據(jù)組形成近似于直徑|Z0|的圓弧的曲線。
交流法中的dIac/dEac與直流循環(huán)伏安法同樣，隨著系統(tǒng)所含底物量的增加而增大。因此復(fù)阻抗標(biāo)繪中的|Z0|隨底物量的增加而減少，結(jié)果，所得圓弧直徑的大小隨底物量的增加而減少。因而通過(guò)測(cè)定交流法所得的電信號(hào)，可能測(cè)定或定量試液中所含底物的量。這里，如設(shè)定施加在工作電極的交流電位的中心電位在電子載體的氧化還原電位附近(例如圖5中E2附近)，dIac/dEac變大，且隨著底物的量發(fā)生變化，電信號(hào)的變化量變大，較為理想。
另一方面，考慮使用僅含干擾性物質(zhì)的場(chǎng)合。這一場(chǎng)合，在干擾性物質(zhì)在電極上的反應(yīng)幾乎處于擴(kuò)散控速的電位范圍(如圖5中E4～E1)內(nèi)，直流循環(huán)伏安法中的dI/dE的大小變得實(shí)際上幾乎可以忽略。因此，在交流測(cè)定中，施加在工作電極上的交流電位的中心電位處在上述電位范圍內(nèi)的場(chǎng)合，干擾性物質(zhì)引起的電流變化(dIac/dEac)相對(duì)于電位調(diào)制實(shí)際上幾乎不存在。
在電極上并行地進(jìn)行多個(gè)電化學(xué)反應(yīng)的場(chǎng)合，所得的電流基本上是各電化學(xué)反應(yīng)流過(guò)的電流的簡(jiǎn)單的和。例如，在圖5中兩個(gè)溶液組成組合起來(lái)的電解液中，用電位E1的場(chǎng)合，所得電流為I＝I1+I3.這樣，關(guān)于電流與電位的關(guān)系以及由此關(guān)系所得的R和Z的討論，即使使用底物和干擾性物質(zhì)混合而成的試液，并使用與上述本實(shí)施方式的底物定量方法同樣的電極系統(tǒng)和試劑系統(tǒng)的場(chǎng)合，上述含底物的電解液，并單獨(dú)含干擾性物質(zhì)的電解液的說(shuō)明，對(duì)底物及干擾性物質(zhì)仍分別成立，其結(jié)果，例如電位E2附近的dIac/dEac與上述含底物而不含干擾性物質(zhì)的電解液所得結(jié)果實(shí)際上基本相同，干擾性物質(zhì)對(duì)dIac/dEac基本沒(méi)有影響。
根據(jù)以上理由，按照本發(fā)明一實(shí)施方式的底物定量方法，可能進(jìn)行底物的定量而不受干擾性物質(zhì)影響。
本發(fā)明的底物定量方法的上述工序(a)中，較好將上述工作電極和上述對(duì)電極配置在同一平面上。這樣可能更簡(jiǎn)便地定量底物。
該情況下，可使用包括絕緣性的(第1的)基板、含配置在上述(第1的)基板上的工作電極及對(duì)電極的電極系統(tǒng)，以及含氧化還原酶及電子載體的試劑系統(tǒng)的生物傳感器。
上述工序(a)中，較好將上述工作電極和上述對(duì)電極隔著空間相對(duì)配置。
這一場(chǎng)合，可使用包括絕緣性的第1基板、絕緣性的第2基板、含有配置在上述第1基板上的工作電極和配置在上述第2基板上的對(duì)電極的電極系統(tǒng)，以及含氧化還原酶及電子載體的試劑系統(tǒng)的生物傳感器。
這里，本發(fā)明的底物定量方法，較好還包括在上述工作電極上施加直流電位的工序(e)、測(cè)定上述工序(e)產(chǎn)生的上述電信號(hào)的工序(f)。這樣，工序(f)中測(cè)得的上述電信號(hào)，由于含有有關(guān)底物和干擾性物質(zhì)的信息，通過(guò)與交流測(cè)定組合，可能根據(jù)工序(c)中測(cè)定的電信號(hào)及工序(f)中測(cè)定的電信號(hào)，不僅定量底物，還可定量干擾性物質(zhì)。
交流電位的中心電位，較好設(shè)定在電子載體的氧化還原電位附近。上述中心電位，相對(duì)于電子載體的氧化還原電位，較好是在-0.4V～+0.4V的范圍內(nèi)，更好是在-0.1V～+0.1V的范圍內(nèi)。
交流電位的中心電位(Ecen(V))較好設(shè)定在干擾性物質(zhì)在工作電極上的反應(yīng)為擴(kuò)散控速區(qū)域的電位范圍內(nèi)或在其附近。特別好是相對(duì)于干擾性物質(zhì)的在工作電極上的反應(yīng)為擴(kuò)散控速區(qū)域的電位范圍中最負(fù)的電位(Emin(V))負(fù)0.05V的電位更正的電位，即上述中心電位和上述最負(fù)電位，滿足Ecen＞Emin-5(V)。這樣，相對(duì)于施加在工作電極上的電位的調(diào)制，可使電子載體產(chǎn)生的電流變化變大，且干擾性物質(zhì)產(chǎn)生的電流變化幾乎沒(méi)有。因此用底物和干擾性物質(zhì)混合的試液以交流法測(cè)定底物，可能更完全地排除干擾性物質(zhì)的影響。
這些電子載體的氧化還原電位、以及干擾性物質(zhì)的反應(yīng)成為擴(kuò)散控速的電位，可用溶解了上述物質(zhì)的0.1M磷酸緩沖液(pH＝7.0)制成電解液，與適當(dāng)?shù)膮⒈入姌O組合，而用玻璃碳或金屬電極作工作電極，根據(jù)循環(huán)伏安法估算。
生物傳感器載持的電子載體的氧化還原電位，可通過(guò)用上述磷酸緩沖液從生物傳感器中與共存物一起溶解、提取電子載體，用所得的液體進(jìn)行循環(huán)伏安法估算。
施加在工作電極上的交流電位是指相對(duì)于與上述工作電極一起組合而使用的對(duì)電極或參比電極的電位(電壓)。而本發(fā)明中的交流電位(電壓)，可以是具有依賴于時(shí)間t而連續(xù)或離散地調(diào)制的波形的電位，是包含近似的交流電位的概念。即本發(fā)明中的交流電位，可以是至少周期地滿足E(t1)＜E(t2)及E(t2)＞E(t3)或者E(t1)＞E(t2)及E(t2)＞E(t3)(其中t1＜t2＜t3)的電位。作為含有這種波形的波，可例舉正弦波、矩形波及階梯形波等。
本發(fā)明底物定量方法中所用的電信號(hào)，只要是隨著電化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行發(fā)生變化的電信號(hào)即可，例如可列舉電流、導(dǎo)納、阻抗等。其中，在施加的電位具有正弦波、或?qū)嶋H上近似正弦波的階梯形波的波形時(shí)，電信號(hào)較好是阻抗。作為電信號(hào)也可用電流或?qū)Ъ{，但較好是將它們轉(zhuǎn)換成阻抗，根據(jù)所得的阻抗輸出底物的量。在施加矩形波的場(chǎng)合，得到電流作為電信號(hào)，根據(jù)該電信號(hào)的時(shí)間和對(duì)交流電位的依賴性(變化)，可得到關(guān)于底物的量的信息。
電極系統(tǒng)較好還包括參比電極。這樣，由于施加在工作電極上的電位穩(wěn)定，可更穩(wěn)定地進(jìn)行底物測(cè)定。作為所用的參比電極，可用Ag/AgCl或飽和甘汞電極(SCE)等，但并不限于此，只要是電位穩(wěn)定的電極，也可使用其他電極。
本發(fā)明的底物定量方法中所用的工作電極，可無(wú)特別限制地使用以前公知的工作電極。其中，工作電極較好是旋轉(zhuǎn)圓盤電極(以下簡(jiǎn)稱RDE)或微電極。如使用以一定速度旋轉(zhuǎn)的RDE，或者其電極面積使電子載體向電極表面的側(cè)向擴(kuò)散對(duì)電化學(xué)反應(yīng)影響程度小的微電極，與使用靜止的大電極(bulk electrode)的情況比較，可使電子載體對(duì)于施加于工作電極的電位的調(diào)制產(chǎn)生的電流變化變得更大。因此可使對(duì)于底物的敏感性更加提高。微電極的半徑(圓形的場(chǎng)合)較好是50μm，更好在50μm以下、20μm以上。另外，在使用這些電極的直流伏安圖中，即使在無(wú)催化反應(yīng)的場(chǎng)合以及電位掃描速度較大的場(chǎng)合，陽(yáng)極和陰極波之間的滯后也非常小，這也提示，可用更高頻率穩(wěn)定地進(jìn)行本發(fā)明用交流法的底物測(cè)定。
作為本發(fā)明的底物定量方法中使用的溶解干擾性物質(zhì)的試液，可用溶解底物和干擾性物質(zhì)的溶液，以及溶解底物和干擾性物質(zhì)的體液，如血液、血漿、血清、尿及間質(zhì)液等。作為干擾性物質(zhì)可列舉抗壞血酸(維生素C)、尿酸及對(duì)乙酰氨基酚等。
本發(fā)明的底物定量方法中使用的氧化還原酶，可根據(jù)溶解存在于試液中的作為測(cè)定對(duì)象的底物的種類選擇適當(dāng)?shù)拿?。例如作為測(cè)定對(duì)象的底物是葡萄糖場(chǎng)合，作為氧化還原酶，可列舉葡萄糖氧化酶、吡咯并喹啉酮依賴性葡萄糖脫氫酶、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性葡萄糖脫氫酶及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸依賴性葡萄糖脫氫酶等；底物為膽固醇的場(chǎng)合，可列舉膽固醇氧化酶、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性膽固醇脫氫酶及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸依賴性膽固醇脫氫酶等。在上述氧化還原酶以外，根據(jù)作為測(cè)定對(duì)象的底物的種類還可使用例如乙醇脫氫酶、乳酸氧化酶、黃嘌呤氧化酶、氨基酸氧化酶、抗壞血酸氧化酶、乙酰輔酶A氧化酶、尿酸酶、谷氨酸脫氫酶、果糖脫氫酶等。
本發(fā)明底物定量方法中使用的電子載體，可列舉二茂衍生物、鐵/亞鐵氰化物離子、六氰酸釕、鋨-三(聯(lián)吡啶鎓)、鋨-二(聯(lián)吡啶鎓)咪唑啉鎓等金屬絡(luò)合物、p-苯醌等醌衍生物、吩嗪硫酸二甲酯等吩嗪鎓衍生物、亞甲藍(lán)等吩噻嗪鎓衍生物、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸等。
可使用對(duì)所用的酶有高的電子轉(zhuǎn)換速度的電子載體作為上述酶的良好組合。這中間，更好是穩(wěn)定性高的電子載體二茂鐵衍生物、六氰酸釕、鋨-三(聯(lián)吡啶鎓)和鋨-二(聯(lián)吡啶鎓)咪唑。
其中，氧化還原電位較高的電子載體，在施加交流電位時(shí)得到的底物和干擾性物質(zhì)生成的電信號(hào)可更好地分離，因此特別適合本發(fā)明的實(shí)施。
這些電子載體也可以是與聚合物骨格結(jié)合的形式、或其本身的一部分或全體形成聚合物鏈的形式。且氧也可能用作電子載體。電子載體可使用其中的一種或兩以上。
以下用實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受這些實(shí)施例限制。
實(shí)施例1溶解0.2mM二茂鐵羧酸及4μm葡萄糖氧化酶作為試劑系統(tǒng)，得pH7的磷酸緩沖液10ml。將此磷酸緩沖液10ml放入高硬玻璃制的容器內(nèi)，用作電解液，用直徑3mm的鉑圓盤作工作電極，用2cm的方形鉑板作對(duì)電極，組成電化學(xué)池。添加溶解有抗壞血酸的葡萄糖水溶液作為試液，使?jié)舛确謩e為0.5mM及20mM(約400mg/dl)。
經(jīng)一定時(shí)間后在工作電極上施加振幅0.01V的交流電位，其中心電位相對(duì)于對(duì)電極為+0.1V。該工作電極上的中心電位，相對(duì)于二茂鐵羧酸的氧化還原電位在-0.1V～+0.1V的范圍內(nèi)，并且在抗壞血酸在工作電極上的反應(yīng)處于擴(kuò)散控速區(qū)域的電位區(qū)域內(nèi)，是比最負(fù)的電位(對(duì)Ag/AgCl為0.18V(pH7))負(fù)0.05V的電位(即對(duì)Ag/AgCl為0.13V(pH7))更正的電位。使交流電位的頻率在16mHz～10kHz范圍內(nèi)連續(xù)變化，具體用(1.6、2.5、4.0、6.3或10)×(10-2、10-1、1、10、102或103)Hz的值。
施加交流電位后再經(jīng)過(guò)一定時(shí)間，測(cè)定阻抗Z，進(jìn)行復(fù)阻抗標(biāo)繪。如上所述，在較低頻率時(shí)電流-電位間幾乎不存在相位差，所以曲線出現(xiàn)在實(shí)數(shù)軸附近，當(dāng)逐漸增加頻率時(shí)，Z的大小減小，其標(biāo)繪的數(shù)據(jù)組大體形成圓弧。
然后，改變葡萄糖濃度配制與上述相同的電解液。使抗壞血酸濃度保持恒定，為0.5mM，葡萄糖濃度為2、3、4、5、10mM。用這些電解液，與上述同樣進(jìn)行測(cè)定和標(biāo)繪。隨著使用較低葡萄糖濃度的電解液，所得圓弧的直徑與葡萄糖濃度有一定的相關(guān)性，逐漸變大。在用不含抗壞血酸的葡萄糖水溶液作試液時(shí)，這種情況也相同。
因此，根據(jù)預(yù)先制作的表示所得的復(fù)阻抗標(biāo)繪中圓弧直徑的大小和葡萄糖濃度的關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可從葡萄糖濃度未知的水溶液所得的復(fù)阻抗標(biāo)繪的圓弧直徑，求出葡萄糖水溶液濃度，而不受抗壞血酸影響。這樣，通過(guò)使用本發(fā)明的底物定量方法，可用結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的測(cè)定系統(tǒng)正確地定量試液中所含的底物，而不會(huì)因干擾性物質(zhì)而產(chǎn)生測(cè)定誤差。
實(shí)施例2本實(shí)施例不用實(shí)施例1所用的電化學(xué)池，而用按以下步驟制作的生物傳感器，與實(shí)施例1同樣進(jìn)行測(cè)定。本實(shí)施例中制作圖1及圖2所示結(jié)構(gòu)的生物傳感器。
圖1是本實(shí)施例所用生物傳感器除去試劑系統(tǒng)后的分解立體圖。在玻璃制的電絕緣性基板1上設(shè)置樹脂制的電極圖案掩膜，通過(guò)濺金形成工作電極2和對(duì)電極3。在金和玻璃間形成鉻層作為粘合層，提高兩者之間的密合性。該工作電極2和對(duì)電極3分別經(jīng)導(dǎo)線4和5電連接至生物傳感器外部的測(cè)定用接頭。
工作電極2上形成含氧化還原酶及電子載體的試劑系統(tǒng)層之后，在基板1上按圖1點(diǎn)劃線所示的位置關(guān)系粘合有狹縫6的隔層7及附有空氣孔8的蓋板9，制作生物傳感器。隔層7的狹縫6這部分形成試液供給通道。傳感器端部的狹縫6這部分形成試液供給通道。傳感器端部的狹縫6的開口的端部，作為試料進(jìn)入試液供給通道的供給口。
圖2是本發(fā)明生物傳感器器的縱剖面圖。在基板1上形成的工作電極2上，形成含氧化還原酶及電子載體的試劑系統(tǒng)11。如圖2所示，在工作電極2和對(duì)電極3構(gòu)成的電極系統(tǒng)上形成試劑系統(tǒng)11。
如使試液與作為圖2所示結(jié)構(gòu)的傳感器的試液供給通道的狹縫6的開口端接觸，試液由于毛細(xì)現(xiàn)象被導(dǎo)入試液通道，溶解于試劑系統(tǒng)11而進(jìn)行酶反應(yīng)。這里，如預(yù)先用卵磷酯等兩親性試劑進(jìn)行試液供給通道的處理，試液的導(dǎo)入會(huì)更均勻、順利。
這樣，在設(shè)有電極系統(tǒng)的基板1上將由隔層7和蓋板9組成的蓋板部件組合，在與基板1形成的間隙中形成從試液供給口導(dǎo)入試液至電極系統(tǒng)的試液供給通道，就能使向傳感器供給的含有作為測(cè)定對(duì)象的底物的試液的量保持一定，從而提高測(cè)定的精度。
設(shè)有試液供給通道的傳感器中，只要試劑系統(tǒng)設(shè)置于露出在試液供給通道的部分能溶解于所供給的試液中即可，不限于電極系統(tǒng)上。例如，可設(shè)置在蓋板9露出在試液供給通道中的部分、不與基板1的電極系統(tǒng)接觸而設(shè)置于露出在試液供給通道中的部分。試劑系統(tǒng)可分成幾個(gè)，一個(gè)設(shè)在基板上，另一個(gè)設(shè)在蓋板部件的一側(cè)。這時(shí)，分開的各層，未必要求含有所有試劑。例如，氧化還原酶和電子載體可包含在各自的層中。
也可不用蓋板9，而用對(duì)電極3或工作電極2中的某一個(gè)和與其對(duì)應(yīng)的導(dǎo)線5或4一起形成的絕緣性的第2基板。這時(shí)由于基板1、隔層7和第2基板形成試液供應(yīng)通道，可使供給傳感器的試液量保持一定，能提高測(cè)定的精度。
用二茂鐵羧酸和葡萄糖氧化酶制得試劑系統(tǒng)11，將溶有0.5mM抗壞血酸的20mM葡萄糖水溶液作為試液滴入如上制作的傳感器的試液供給通道的開口部即隔層7的狹縫6的開口端部，供給傳感器。經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后在工作電極2上施加交流電位，其中心電位相對(duì)于對(duì)電極3為+0.1V、振幅為0.01V。交流電位的頻率和實(shí)施例1所述的值相同。再經(jīng)一定時(shí)間后，測(cè)定阻抗Z，進(jìn)行復(fù)阻抗標(biāo)繪。結(jié)果和實(shí)施例1同樣，當(dāng)頻率較低時(shí)，曲線在實(shí)數(shù)軸附近出現(xiàn)，當(dāng)頻率緩慢升高時(shí)，Z的大小減少，而標(biāo)繪的數(shù)據(jù)組大體上形成圓弧。
然后，與實(shí)施例1所述的電解液同樣，配制葡萄糖濃度不同的一系列電解液，將它們分別供給傳感器，與上述同樣測(cè)定，進(jìn)行標(biāo)繪。隨著使用較低濃度葡萄糖的電解液，所得圓弧直徑與葡萄糖濃度有一定的相關(guān)性，慢慢變大。這種情況在使用含抗壞血酸的葡萄糖水溶液作試液時(shí)也相同。
因此，用與實(shí)施例1同樣的方法，能從所得的復(fù)阻抗標(biāo)繪的圓弧直徑求出葡萄糖水溶液的濃度而不受抗壞血酸影響。而且在某一頻率時(shí)進(jìn)行上述交流測(cè)定，也可能用所得Z的大小|Z|估計(jì)葡萄糖的濃度。這樣，通過(guò)使用本發(fā)明的底物定量方法，可用結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的測(cè)定體系正確定量試液中所含的底物，而不產(chǎn)生干擾性物質(zhì)引起的測(cè)量誤差。
實(shí)施例3本實(shí)施例采用與實(shí)施例1同樣組成的電解液(葡萄糖濃度20mM、抗壞血酸濃度0.5mM)及電化學(xué)池。經(jīng)一定時(shí)間后，在工作電極上施加交流電位，該電位有某一獨(dú)立頻率，其中心電位相對(duì)于對(duì)電極為+0.1V、振幅為0.01V。再經(jīng)一定時(shí)間后測(cè)定阻抗Z。然后，在工作電極上施加一定時(shí)間的直流電位，該直流電位相對(duì)于對(duì)電極為+0.3V，測(cè)定工作電極-對(duì)電極間所流過(guò)的直流電流I’。
與實(shí)施例1一樣，用一系列葡萄糖濃度不同的電解液，與上述同樣進(jìn)行測(cè)定和標(biāo)繪。隨著使用較低濃度葡萄糖的電解液，與實(shí)施例1的結(jié)果同樣，所得的Z與葡萄糖濃度有一定的相關(guān)性，逐漸變大，所以用Z值可估計(jì)葡萄糖濃度。
另外施加相對(duì)于對(duì)電極為+0.3V和直流電位，并在工作電極上施加一定時(shí)間時(shí)間，通過(guò)測(cè)定工作電極-對(duì)電極間流過(guò)的直流電流的方法，考察抗壞血酸不存在時(shí)的直流電流I和葡萄糖濃度的關(guān)系(I-G)以及葡萄糖不存在時(shí)的直流電流I與抗壞血酸濃度的關(guān)系(I-A)。可知I-G、I-A分別顯示大致良好的比例關(guān)系。另一方面，可知在存在一定濃度抗壞血酸時(shí)直流電流I與葡萄糖濃度的關(guān)系，以及在存在一定濃度葡萄糖時(shí)直流電流I與抗壞血酸濃度的關(guān)系，分別顯示大致良好的線性關(guān)系。可得出如下結(jié)論，即如上測(cè)定所得的直流電流I’為葡萄糖和抗壞血酸各自產(chǎn)生的電流和總和。
如上所述，可能用交流測(cè)定得到的Z值估計(jì)葡萄糖濃度。這樣求得的葡萄糖濃度如應(yīng)用于I-G關(guān)系，可從上述測(cè)定所得的I’中了解葡萄糖引起的分電流，減去它就可知道I’中起因于抗壞血酸的分電流。通過(guò)將該電流應(yīng)用于I-A關(guān)系，結(jié)果就可能估計(jì)抗壞血酸濃度。
如這樣按照本實(shí)施例的底物定量方法，就能同時(shí)進(jìn)行不受干擾性物質(zhì)影響的底物測(cè)定以及干擾性物質(zhì)的定量?？梢灶A(yù)先得出直流電流對(duì)葡萄糖及抗壞血酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，即I-G及I-A，而不用每次測(cè)定制作一次。
在本實(shí)施例中，在施加交流電位測(cè)定Z的步驟之后，實(shí)行施加直流電位測(cè)定I’的步驟，但也可把次序反過(guò)來(lái)實(shí)行這兩步。也可與實(shí)施例2同樣用生物傳感器進(jìn)行同樣的測(cè)定。
實(shí)施例4本實(shí)施例使用電極系統(tǒng)還包括參比電極的電化學(xué)池。使用與實(shí)施例1同樣的電解液、工作電極和對(duì)電極，用銀/氯化銀電極(Ag/AgCl電極)作參比電極，構(gòu)成電化學(xué)池。添加溶有抗壞血酸的葡萄糖水溶液作試液，使其濃度依次為0.5mM及20mM(約400mg/dl)。
經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，在工作電極上施加交流電位，其中心電位以參比電極為基準(zhǔn)為+0.36V、振幅0.01V。該工作電極的中心電位相對(duì)于二茂鐵羧酸的氧化還原電位在-0.1V～+0.1V的范圍內(nèi)，并且是比抗壞血酸在工作電極上的反應(yīng)處于擴(kuò)散控速區(qū)域的電位范圍中最負(fù)的電位(對(duì)Ag/AgCl為0.18V(pH7))負(fù)0.05V的電位(對(duì)Ag/AgCl為0.03V(pH7))更正的電位。交流電位的頻率與實(shí)施例1所用的值相同。
再經(jīng)一定時(shí)間后，測(cè)定阻抗Z，進(jìn)行復(fù)阻抗標(biāo)繪，與實(shí)施例1同樣，在頻率較低時(shí)，曲線出現(xiàn)在實(shí)數(shù)軸上。而當(dāng)頻率逐漸升高時(shí)，Z的大小減少，其標(biāo)繪的數(shù)據(jù)組大體形成圓弧。
然后，與實(shí)施例1所述的電解液同樣，配制一系列葡萄糖濃度不同的電解液，用這些電解液，同上述一樣進(jìn)行測(cè)定的標(biāo)繪。隨著使用較低濃度葡萄糖的電解液，所得圓弧直徑和葡萄糖濃度有一定的相關(guān)性，逐漸變大。在使用不含抗壞血酸的葡萄糖水溶液作試液時(shí)，情況也相同。
因此，按照和實(shí)施例1同樣的方法，可從所得的復(fù)阻抗標(biāo)繪的圓弧直徑求出葡萄糖水溶液濃度而不受抗壞血酸影響。而在某一頻率時(shí)進(jìn)行上述交流測(cè)定，用所得的Z的大小|Z|也可能估計(jì)葡萄糖濃度。
使用參比電極，由于工作電極的電位的變動(dòng)較穩(wěn)定，所得的Z值比實(shí)施例1及2的情況更加穩(wěn)定。這樣，采用本實(shí)施例的底物定量方法，可更穩(wěn)定地進(jìn)行底物測(cè)定而不受抑制性的質(zhì)的影響。
與實(shí)施例2同樣制作傳感器，向傳感器供給含抗壞血酸和葡萄糖的試液后，立即通過(guò)氯化鉀和球脂構(gòu)成的鹽橋，使銀/氯化銀電極與試液供給口附近的試液接觸。除了施加在工作電極上的交流電位，其中心電位相對(duì)于參比電極為0.36V、振幅為0.01V之外，與實(shí)施例2同樣進(jìn)行交流測(cè)定。結(jié)果可得與實(shí)施例2中上述結(jié)果幾乎同樣的結(jié)果，但所得的Z值更加穩(wěn)定。因此按照本實(shí)施例的底物定量方法，在與傳感器同時(shí)使用參比電極時(shí)，可能更穩(wěn)定地測(cè)定底物而不受干擾性物質(zhì)影響。
在本實(shí)施例中，通過(guò)鹽橋使銀/氯化銀電極與試液供給口附近的試液接觸，但經(jīng)絲網(wǎng)印刷在基板上制作，銀/氯化銀電極，使用時(shí)也可得到同樣效果。
實(shí)施例5本實(shí)施例中，首先將1mM的六氰酸釕及0.6kU/ml的吡咯并喹啉醌依賴性葡萄糖脫氫酶溶解制得pH7的磷酸緩沖液10ml作為試劑系統(tǒng)。將此磷酸緩沖液10mL置高硬玻璃制的容器內(nèi)用作電解液，用直徑3mm的鉑圓盤作工作電極、用2cm的方形鉑板作對(duì)電極、用Ag/AgCl(飽和KCl)作參比電極，構(gòu)成電化學(xué)池。
經(jīng)一定時(shí)間后，在工作電極上施加交流電位，其中心電位相對(duì)于參比電極為+0.9V、振幅為0.01。該工作電位的中心電位，相對(duì)于六氰酸釕的氧化還原電位在-0.4V～+0.4V的范圍內(nèi)，是比相對(duì)于抗壞血酸在工作電極上的反應(yīng)為擴(kuò)散控速區(qū)域的電位范圍中最負(fù)的電位(對(duì)Ag/AgCl為0.18V(pH7))負(fù)0.05V的電位(對(duì)Ag/AgCl為0.13V(pH7))更正的電位。交流電位的頻率連續(xù)地在16mHz～10kHz內(nèi)變化，具體用與實(shí)施例1所示值相同的值。
施加交流電位再經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，測(cè)定阻抗Z，進(jìn)行復(fù)阻抗標(biāo)繪。如圖3●中所示，在不存在葡萄糖時(shí)，標(biāo)繪幾乎形成直線。添加葡萄糖水溶液作為試液，使其濃度為10mM，如圖3的▲所示，標(biāo)繪的數(shù)據(jù)組出現(xiàn)在實(shí)數(shù)軸附近，當(dāng)頻率逐漸提高時(shí)，Z的大小減少，標(biāo)繪的數(shù)據(jù)組大體形成圓弧。
然后在上述電解液中添加抗壞血酸，使?jié)舛茸?.5mM。與上述相同，進(jìn)行測(cè)定及標(biāo)繪，如圖3的■所示，如加入10mM葡萄糖水溶液時(shí)，所得的標(biāo)繪的數(shù)據(jù)組大體顯示相同的半圓。
這樣在施加在工作電極上的交流電位的中心電位相對(duì)于電子載體的氧化還原電位在-0.4V～+0.4V的范圍內(nèi)，且比相對(duì)于干擾性物質(zhì)在工作電極上的反應(yīng)屬擴(kuò)散控速區(qū)域的電位范圍內(nèi)的最負(fù)的電位負(fù)0.05V的電位為正的電位時(shí)，也能從復(fù)阻抗數(shù)據(jù)組標(biāo)繪的圓弧直徑，求得葡萄糖水溶液的濃度而不受抗壞血酸影響。并且，在施加的交流電位其中心電位為0.8V，離六氰酸釕的氧化還原電位較近時(shí)，也同樣可能定量，而且，本實(shí)施例證實(shí)，六氰酸釕在本發(fā)明中能發(fā)揮非常有效的電子載體功能，而吡咯并喹啉醌依賴性葡萄糖脫氫酶在本發(fā)明中是非常有效的氧化還原酶。
實(shí)施例6本實(shí)施例中，除工作電極是鉑制的旋轉(zhuǎn)圓盤電極(RDE)這點(diǎn)之外，使用與實(shí)施例1相同的電化學(xué)池，用與實(shí)施例1相同的試液和測(cè)定條件，進(jìn)行測(cè)定。
所得結(jié)果實(shí)際上與實(shí)施例1大致相同，但與實(shí)施例1的結(jié)果比較，圓弧直徑減少，較高頻率時(shí)可得實(shí)數(shù)軸上的標(biāo)繪。這是因?yàn)槭褂肦DE時(shí)，與使用靜止電極時(shí)相比較，對(duì)于施加在工作電極上的電位的調(diào)制，電子載體引起的電流變化變大了。
然后與實(shí)施例1所述的電解液同樣，配制葡萄糖濃度不同的一系列電解液，用它們分別與上述同樣進(jìn)行測(cè)定及標(biāo)繪。隨著用較低濃度葡萄糖的電解液，所得圓弧直徑與葡萄糖濃度有一定的相關(guān)性，逐漸變大。這種情況在使用不含抗壞血酸的葡萄糖溶液作試液時(shí)，也是同樣。用RDE代替靜止電極對(duì)于電位調(diào)制引起的干擾性物質(zhì)的電流變化的大小，也幾乎未見影響。
因此根據(jù)其直徑大小，可能測(cè)定葡萄糖濃度。特別是對(duì)于葡萄糖濃度的變化，Z值的變化比實(shí)施例1所得結(jié)果更大，Z值更加穩(wěn)定。而且用某一頻率進(jìn)行交流測(cè)定，由所得Z值也可能估計(jì)葡萄糖濃度。使用RDE的這一效果，在使用靜止電極并恒定地?cái)嚢韬噭┫到y(tǒng)及試液的液體時(shí)也同樣能得到。
用電極面積使電子載體向電極表面的側(cè)向擴(kuò)散對(duì)電化學(xué)反應(yīng)的影響小的微電極，代替RDE，與本實(shí)施例同樣進(jìn)行測(cè)定時(shí)，也得到大致相同的結(jié)果。
微電極的大小，在將電極形狀轉(zhuǎn)換成圓時(shí)，在半徑20μm～約50μm、電極面積1000～8000μm2的范圍內(nèi)，特別合適。作為電極，可使用將直徑非常小的碳纖維、鉑、金等封入玻璃毛細(xì)管并使電極表面露出而制得的電極，或市售的電極。并可使用利用光刻法或蝕刻法等半導(dǎo)體加工工藝在基板上制作的微電極。使用這樣的微電極，特別適合于如實(shí)施例2用生物傳感器進(jìn)行測(cè)定的場(chǎng)合。
在本發(fā)明的底物定量方法中，如上使用RDE或微電極作為工作電極，可能穩(wěn)定且高靈敏度地測(cè)定底物。
在以上實(shí)施例中，施加在工作電極上的交流電位的中心電位可根據(jù)所用電子載體的種類選擇適當(dāng)?shù)闹担詫?duì)電極為準(zhǔn)為+0.1V，或以參比電極為準(zhǔn)為+0.36V或+0.9V，但該值不受限制，只要在電子載體的氧化還原電位附近即可。根據(jù)是否用參比電極，該值發(fā)生變化，可選擇較好的值。
以上實(shí)施例中，電位振幅為0.01V，此值不受限制，只要是實(shí)際上可進(jìn)行交流測(cè)定的振幅即可?？墒褂玫恼穹蹈鶕?jù)測(cè)定裝置的性能決定，但較好為1～50mV。
以上實(shí)施例中交流電位的頻率為16mHz～10kHz，但它們的值及范圍不受限制。只要是由交流法得到的電信號(hào)隨底物濃度顯著變化的頻率即可。
以上實(shí)施例所用的直流電位，以對(duì)電極為準(zhǔn)為+0.3V，但此值不受限制，只要是可使電子載體和干擾性物質(zhì)充分氧化(或還原)的電位即可，且可根據(jù)所用的電子載體的種類選擇適當(dāng)?shù)闹?。并且使用參比電極的場(chǎng)合也可根據(jù)其種類變化，選擇相應(yīng)的適當(dāng)?shù)闹怠?br> 施加直流電位所得的電信號(hào)，并不限于以上實(shí)施例所述的直流電流。例如也可以是工作電極上的通電電荷量。
以上實(shí)施例中所用的進(jìn)行反應(yīng)的一定時(shí)間，在本發(fā)明的實(shí)施中，只要是可能得出大致穩(wěn)定的可能觀測(cè)的大小的輸出的時(shí)間即可。
電極材料在以上實(shí)施例中使用鉑或金，但并不限于它們。使用其他材料的電極的例子，可舉出鈀和碳的電極。還可使用以鉑、金、鈀和碳中某一種作主要材料的混合材料的電極。以上實(shí)施例中，工作電極和對(duì)電極使用同一材料，但也可以是分別用不同材料制作的電極。
以上實(shí)施例中，使用在掩膜范圍內(nèi)的濺射法作為生物傳感器中的電極及其圖案的制作方法，但并不受此限制，例如也可用濺射法、離子電鍍法、蒸鍍法、化學(xué)蒸鍍法中的某一種制作的金屬膜，用光刻法、蝕刻法或其組合制作圖案。圖案的形成可用激光進(jìn)行金屬修剪而進(jìn)行。也可用金屬糊在基板上進(jìn)行絲網(wǎng)印刷，形成電極圖案。此外，也可將已形成圖案的金屬箔本身粘合在絕緣性基板上。電極材料是以碳為主要物質(zhì)時(shí)，可在基板上進(jìn)行絲網(wǎng)印刷，形成電極圖案。
這些電極系統(tǒng)的形狀、配置、個(gè)數(shù)、大小等并不限于以上實(shí)施例所示的情況。例如，工作電極和對(duì)電極也可分別在不同的絕緣性基板上形成，也可分別形成多個(gè)工作電極和對(duì)電極。形狀也可以是梳型。而且導(dǎo)線和接頭的形狀、配置、個(gè)數(shù)、大小等也不限于上述實(shí)施例所示的情況。
對(duì)RDE的旋轉(zhuǎn)速度沒(méi)有限制。微電極的電極面積，只要在電子載體向電極表面的側(cè)向擴(kuò)散對(duì)電化學(xué)反應(yīng)的貢獻(xiàn)大小的范圍內(nèi)即可。
試液中底物和干擾性物質(zhì)的濃度并不特別限制以上實(shí)施例中所述的值。試液的量也沒(méi)有限制。
試劑系統(tǒng)中所含各試劑的量或濃度，不限于以上實(shí)施例所述的值。只要是酶反應(yīng)及電化學(xué)反應(yīng)可充分進(jìn)行的量即可。
以上實(shí)施例中的整個(gè)試劑系統(tǒng)或試劑中所含試劑中的一個(gè)或多個(gè)可固定于工作電極，使酶、電子載體不溶化或非溶出化。固定化時(shí)，較好采用共價(jià)結(jié)合法、交聯(lián)固定法或者利用配位結(jié)合或特異性結(jié)合的相互作用的固定化法?；蛘哂酶叻肿游镔|(zhì)包埋酶、電子載體、產(chǎn)生擬似的固定化狀態(tài)的方法，作為簡(jiǎn)易的試劑系統(tǒng)形成法也是有效的。所用的高分子可用疏水的，也可用親水的，但后者更好。例如，作為親水性高分子的例子，可列舉水溶性纖維素衍生物的羧甲基化纖維素、羥乙基纖維素、乙基纖維素等，或者聚乙烯醇、明膠、聚丙烯酸、淀粉及其衍生物，馬來(lái)酸酐聚合物、甲基丙烯酸酯衍生物等。
以上實(shí)施例中試劑系統(tǒng)中更好含有pH緩沖劑。由此，可調(diào)整反應(yīng)液的pH至適合酶活性的值，在測(cè)定時(shí)高效地發(fā)揮酶的功能，而且多數(shù)干擾性物質(zhì)發(fā)生的電化學(xué)反應(yīng)有質(zhì)子參與，因此其干擾反應(yīng)成為擴(kuò)散控速的電位范圍可隨電解液的pH而變化，通過(guò)使用pH緩沖液，可能使該電位范圍固定于一定的值。因此可更穩(wěn)定地進(jìn)行本發(fā)明的干擾性物質(zhì)的影響的排除。作為pH緩沖劑，可用例如含磷酸鹽、醋酸鹽，硼酸鹽、檸檬酸鹽、鄰苯二甲酸鹽或甘氨酸中的一種或多種的緩沖劑。也可用上述鹽的氫鹽的一種或多種。也可使用用于所謂“良好緩沖液”的試劑。這些pH緩沖劑含在傳感器中的場(chǎng)合的形態(tài)，可隨傳感器結(jié)構(gòu)而變，例如可為固體，可為溶液。
以上實(shí)施例所述的生物傳感器中，通過(guò)方便地規(guī)定一定量的含測(cè)定對(duì)象即底物的溶液，可提高測(cè)定精度，較好是包括隔層作為上述生物傳感器的結(jié)構(gòu)要素。然而與能采取一定體積試液的器具一起使用本發(fā)明所述的生物傳感器時(shí)，隔層和蓋板構(gòu)成的蓋板部件并不一定需要。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性根據(jù)上述的本發(fā)明，可提供能利用結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的測(cè)定體系，正確定量試液中所含的底物，而不因干擾性物質(zhì)而產(chǎn)生測(cè)定誤差。
權(quán)利要求
1.底物的定量方法，它是用電極系統(tǒng)及試劑系統(tǒng)定量含溶解的干擾性物質(zhì)及底物的試液的上述底物的方法，其特征在于，包括(a)在含有氧化還原酶及電子載體的試劑系統(tǒng)存在下，向包括工作電極和對(duì)電極的電極系統(tǒng)中供給含溶解的干擾性物質(zhì)和底物的試液的工序，(b)在上述工作電極上施加交流電位，使上述電子載體發(fā)生氧化還原反應(yīng)的工序，(c)用上述電極系統(tǒng)測(cè)定上述氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的電信號(hào)的工序，以及(d)根據(jù)上述電信號(hào)定量上述底物的工序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的底物定量方法，其特征在于，在上述工序(a)中將上述工作電極和上述對(duì)電極配置在同一平面上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的底物定量方法，其特征在于，在上述工序(a)中，將上述工作電極和上述對(duì)電極隔著空間相對(duì)配置。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的底物定量方法，其特征在于，還包括在上述工作電極上施加直流電位的工序(e)，以及測(cè)定上述工序(e)中產(chǎn)生的電信號(hào)的工序(f)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的底物定量方法，其特征在于，上述工序(b)中，上述交流電位的中心電位，相對(duì)于上述電子載體的氧化還原電位，在-0.4V～+0.4V的范圍內(nèi)，并且在上述干擾性物質(zhì)的在上述工作電極上的反應(yīng)處于擴(kuò)散控速區(qū)域的電位范圍中，是比最負(fù)的電位負(fù)0.05V的電位更正的電位。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的底物定量方法，其特征在于，上述工序(b)中，上述交流電位的中心電位，相對(duì)于上述電子載體的氧化還原電位，在-0.1V～+0.1V的范圍內(nèi)，并且在上述干擾性物質(zhì)的上述工作電極上的反應(yīng)處于擴(kuò)散控速區(qū)域的電位范圍中，是比最負(fù)的電位負(fù)0.05V的電位更正的電位。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的底物定量方法，其特征在于，上述電信號(hào)為阻抗。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的底物定量方法，其特征在于，上述電極系統(tǒng)還包括參比電極。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的底物定量方法，其特征在于，上述工作電極是旋轉(zhuǎn)圓盤電極或微電極。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的底物定量方法，其特征在于，上述氧化還原酶是葡萄糖氧化酶或吡咯并喹啉醌依賴性葡萄糖脫氫酶；上述電子載體是二茂鐵羧酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的底物定量方法，其特征在于，上述氧化還原酶是吡咯并喹啉醌依賴性葡萄糖脫氫酶；上述電子載體是六氰酸釕。
全文摘要
提供用結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)易的測(cè)定體系，使干擾性物質(zhì)不產(chǎn)生測(cè)定誤差，正確定量試液中所含底物的方法。在使用電極系統(tǒng)和試劑系統(tǒng)，對(duì)含有溶解的干擾性物質(zhì)和底物的試液的上述底物進(jìn)行定量的方法中，(a)在含有氧化還原酶和電子載體的試劑系統(tǒng)存在下，向包括工作電極和對(duì)電極的電極系統(tǒng)供給含有溶解的干擾性物質(zhì)和底物的試液，(b)在上述工作電極上加上交流電位，使上述電子載體發(fā)生氧化還原反應(yīng)，(c)用上述電極系統(tǒng)測(cè)定上述氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的電信號(hào)，然后(d)根據(jù)上述電信號(hào)定量上述底物。
文檔編號(hào)C12Q1/26GK1639563SQ03805518
公開日2005年7月13日 申請(qǐng)日期2003年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月8日
發(fā)明者桑畑進(jìn), 中南貴裕 申請(qǐng)人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社