專(zhuān)利名稱(chēng)：淀粉生物合成酶的熱穩(wěn)定突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是在國(guó)家科學(xué)基金項(xiàng)目號(hào)9316887的政府支持下進(jìn)行的。政府在本發(fā)明中享有一定權(quán)利。
相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考本申請(qǐng)是1999年5月14日提交的共同待決的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?9/312,433的部分繼續(xù)申請(qǐng)，而美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?9/312,433是1997年11月18日提交的共同待決的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?8/972,545，現(xiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,069,300的部分繼續(xù)申請(qǐng)。本申請(qǐng)也要求1998年5月14日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0,085,460和1996年11月18日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/031,045的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
植物生命的固著特性使其持續(xù)暴露于環(huán)境因素，所述環(huán)境因素對(duì)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育產(chǎn)生積極和消極作用。現(xiàn)代農(nóng)業(yè)面臨的一個(gè)主要障礙就是不利的環(huán)境條件。引起重大作物損失的一個(gè)重要因素是熱脅迫。溫度脅迫使許多谷類(lèi)作物如玉米、小麥和大麥的糧食產(chǎn)量大大減少。由于熱脅迫造成的產(chǎn)量下降在世界重要谷物中占7到35％。
許多研究已經(jīng)鑒定了熱脅迫的可能生理學(xué)后果。Hunter等人的早期工作(Hunter，R.B.，Tollenaar，M.和Breuer，C.M. 加拿大植物科學(xué)雜志(Can.J.Plant Sci.)571127-1133)利用生長(zhǎng)室條件證實(shí)溫度可減少玉米籽粒的灌漿持續(xù)時(shí)間。Tollenaar和Bruulsema(Tollenaar，M.和Bruulsema，T.W. 加拿大植物科學(xué)雜志(Can.J.Plant Sci.)68935-940)得到了相似結(jié)果，在他們的結(jié)果中籽粒灌漿時(shí)間受溫度升高的不利影響。Badu-Apraku等人(Badu-Apraku，B.，Hunter，R.B.和Tollenaar，M. 加拿大植物科學(xué)雜志(Can.J.Plant Sci.)63357-363)測(cè)定出，與生長(zhǎng)在晝/夜溫度為25/15℃的玉米相比，生長(zhǎng)在35/15℃條件下的玉米植物的產(chǎn)量顯著減少。由于溫度升高引起的產(chǎn)量減少也被歷史上和氣候?qū)W上的研究所支持(Thompson，L.M. Agrion.J 78649-653；Thompson，L.M. 科學(xué)(Science)188535-541；Chang，J. Agricul.Metero.24253-262；以及Conroy，J.P.，Seneweera，S.，Basra，A.S.，Rogers，G.和Nissen-Wooller，B. 澳大利亞植物生理學(xué)雜志(Aust.J.PlantPhysiol.)21741-758).
利用體外谷粒培養(yǎng)系統(tǒng)的研究已經(jīng)證明，熱脅迫對(duì)發(fā)育中的種子的生理學(xué)過(guò)程施以負(fù)面影響(Jones，R.J.，Gengenbach，B.G.和Cardwell，V.B. 作物科學(xué)(Crop Science)21761-766；Jones，R.J.，Ouattar，S.和Crookston，R.K. 作物科學(xué)(Crop Science)24133-137；以及Cheikh，N.和Jones，R.J. 植物生理學(xué)(Physiol.Plant.)9559-66)。在大于最適溫度的35℃下培養(yǎng)的玉米粒重量顯著減少。
在小麥中的工作已經(jīng)鑒定出，小麥胚乳對(duì)熱脅迫的反應(yīng)的一個(gè)特點(diǎn)是可溶性淀粉合成酶(SSS)活性的喪失。(Hawker，J.S.和Jenner，C.F. 澳大利亞植物生理學(xué)雜志(Aust.J.Plant Physiol.)20197-209；Denyer，K.，Hylton，C.M.和Smith，A.M. 澳大利亞植物生理學(xué)雜志(Aust.J.Plant Physiol.)21783-789；Jenner，C.F. 澳大利亞植物生理學(xué)雜志(Aust.J.Plant Physiol.)21791-806)。另外的研究顯示小麥胚乳SSS是熱不穩(wěn)定的(Rijven，A.H.G.C. 植物生理學(xué)(Plant Physiol.)81448-453；Keeling，P.L.，Bacon，P.J.，Holt，D.C. 植物(Planta.)191342-348；Jenner，C.F.，Denyer，K.和Guerin，J. 澳大利亞植物生理學(xué)雜志(Aust.J.Plant Physiol.)22703-709)。
玉米中SSS和ADP葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)在熱脅迫條件下的作用還不甚清楚。AGP催化ATP和α-葡萄糖-1-磷酸生成ADP-葡萄糖和焦磷酸。ADP-葡萄糖作為植物淀粉生物合成和細(xì)菌糖原生物合成中糖基的供體。對(duì)玉米(Zea mays)淀粉缺陷突變體胚乳的研究表明，作為關(guān)鍵酶，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶在淀粉生物合成的調(diào)節(jié)中具有重要作用(Tsai，C.Y.和Nelson，Jr.，O.E. 科學(xué)(Science)151341-343；Dickinson，D.B.，J.Preiss 植物生理學(xué)(Plant Physiol.)441058-1062)。
Ou-Lee和Setter(Ou-Lee，T.和Setter，T.L. 植物生理學(xué)(PlantPhysiol.)79852-855)檢測(cè)了溫度對(duì)玉米穗頂端區(qū)域的影響。在淀粉集中積累期，當(dāng)溫度升高時(shí)，與基部谷粒相比，頂端谷粒中的AGP活性較低。相反，在這一時(shí)期正常溫度下發(fā)育的谷粒中，頂端和基部谷粒中AGP活性相似。然而，溫度對(duì)這一時(shí)期頂端和基部谷粒中淀粉合成酶活性的影響并無(wú)差異。而且，熱處理的頂端谷粒的淀粉合成酶活性與對(duì)照相比有所增加。在AGP活性上沒(méi)有觀察到這種現(xiàn)象。Singletary等人(Singletary，G.W.，Banisadr，R.和Keeling，P.L. 植物生理學(xué)(Plant Physiol.)1026(增刊)；Singletary，G.W.，Banisadra，R.，Keeling，P.L. 澳大利亞植物生理學(xué)雜志(Aust.J.Plant Physiol.)21829-841)利用體外培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)籽粒灌漿期中不同溫度的影響進(jìn)行定量，隨溫度從22增加到36℃，種重穩(wěn)步下降。Duke和Doehlert的工作也支持了AGP在產(chǎn)量損失中的作用(Duke，E.R.和Doehlert，D.C. 環(huán)境實(shí)驗(yàn)植物學(xué)(Environ.Exp.Botany)36199-208)。
Keeling等人(1994，前述引文)的工作通過(guò)Q10分析法對(duì)玉米和小麥中的SSS活性進(jìn)行定量，并且證實(shí)SSS是碳流入淀粉的重要控制點(diǎn)。
AGP和SSS的體外生化研究清楚地顯示兩種酶都是熱不穩(wěn)定的。當(dāng)57℃加熱5分鐘時(shí)，玉米胚乳AGP喪失96％的活性(Hannah，L.C.，Tuschall，D.M.和Mans，R.J. 遺傳學(xué)(Genetics)95961-970)。這與馬鈴薯AGP不同，后者在70℃完全穩(wěn)定(Sowokinos，J.R.和Preiss，J. 植物生理學(xué)(Plant Physiol.)691459-1466；Okita，T.W.，Nakata，P.A.，Anderson，J.M.，Sowokinos，J.，Morell，J.和Preiss，J. 植物生理學(xué)(Plant Physiol.)93785-90)。SSS的熱失活研究顯示其在高溫下也是不穩(wěn)定的，并且動(dòng)力學(xué)研究確定當(dāng)溫度從25℃升高到45℃時(shí)，對(duì)支鏈淀粉的Km值呈指數(shù)升高(Jenner等人，1995，前述引文)。
生物化學(xué)和遺傳學(xué)證據(jù)已經(jīng)表明，AGP是高等植物淀粉生物合成和大腸桿菌糖原生物合成中的關(guān)鍵酶(Preiss，J.和Romeo，T. 核酸研究和分子生物學(xué)進(jìn)展(Progress in Nuc.Acid Res.And Mol Biol.)47299-329；Preiss，J.和Sivak，M. “庫(kù)和源中的淀粉合成”，見(jiàn)植物和作物中的光同化物分配源-庫(kù)關(guān)系(photoassimilate distribution in plants andcropssource-sink relationships)，Zamski，E.主編，Marcil Dekker公司，139-168頁(yè))。AGP催化的步驟據(jù)認(rèn)為是淀粉生物合成途徑的起始步驟，其反應(yīng)產(chǎn)物為活化的糖基供體——ADP葡萄糖。淀粉合成酶利用所述ADP葡萄糖延伸多糖多聚體(綜述見(jiàn)于Hannah，L.Curtis ″玉米胚乳中的淀粉合成″，見(jiàn)植物細(xì)胞和分子生物學(xué)進(jìn)展(Advances in Cellular andMolecular Biology of Plants)第4卷，B.A.Larkins和I.K.Vasil(主編)，植物種子發(fā)育的細(xì)胞和分子生物學(xué)(Cellular and Molecular Biology ofPlant Seed Development)，Kluwer學(xué)院出版社，Dordrecht，荷蘭)。
對(duì)馬鈴薯AGP的最初研究顯示，在大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)生的該酶與天然塊莖中的該酶在變構(gòu)和動(dòng)力學(xué)特性上非常相似(Iglesias，A.，Barry，G.F.，Meyer，C.，Bloksberg，L.，Nakata，P.，Greene，T.，Laughlin，M.J.，Okita，T.W.，Kishore，G.M.和Preiss，J. 生物化學(xué)雜志(J.Biol Chem.)2681081-86；Ballicora，M.A.，Laughlin，M.J.，F(xiàn)u，Y.，Okita，T.W.，Barry，G.F.和Preiss，J. 植物生理學(xué)(Plant Physiol.)109245-251)。Greene等人指出了在馬鈴薯AGP的結(jié)構(gòu)-功能研究中細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)的用途(Greene，T.W.，Chantler，S.E.，Kahn，M.L.，Barry，G.F.，Preiss，J.和Okita，T.W. 國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.)931509-1513；Greene，T.W.，Woodbury，R.L.和Okita，T.W. 植物生理學(xué)(PlantPhysiol.)1121315-1320)?，F(xiàn)已鑒定出在變構(gòu)和底物結(jié)合位點(diǎn)作圖時(shí)具有重要作用的多個(gè)突變(Okita，T.W.，Greene，T.W.，Laughlin，M.J.，Salamone，P.，Woodbury，R.，Choi，S.，Ito，H.，Kavakli，H.和Stephens，K. “通過(guò)生成修飾的植物生物合成酶改造植物淀粉”，見(jiàn)EngineeringCrops for Industrial End Uses，Shewry，P.R.，Napier，J.A.和Davis，P.主編，Portland出版有限公司，倫敦)。
AGP酶已經(jīng)從細(xì)菌和植物中分離出來(lái)。細(xì)菌AGP由同四聚體組成，而植物光合和非光合組織的植物AGP為異四聚體，由2種不同的亞基構(gòu)成。該植物酶由兩個(gè)不同的基因編碼，其中一個(gè)亞基比另一個(gè)大。這一特性在許多植物中得到證明。利用SDS-PAGE估計(jì)，菠菜葉中的AGP亞基的分子量為54kDa和51kDa。兩個(gè)亞基都可以與抗純化的菠菜葉AGP的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)(Copeland，L.，J.Preiss(1981)植物生理學(xué)(PlantPhysiol.)68996-1001；Morell，M.，M.Bloon，V.Knowles，J.Preiss 生物化學(xué)雜志(J Bio.Chem.)263633)。利用制備的抗菠菜葉大和小亞基的抗血清的免疫學(xué)分析顯示馬鈴薯塊莖AGP也由兩個(gè)基因編碼(Okita等人，1990，前述引文)。馬鈴薯塊莖的兩個(gè)亞基(50和51kDa)的cDNA克隆也已經(jīng)分離并測(cè)序(Muller-Rober，B.T.，J.Kossmann，L.C.Hannah，L.Willmitzer，U.Sounewald Mol.Gen.Genet.224136-146；Nakata，P.A.，T.W.Greene，J.M.Anderson，B.J.Smith-White，T.W.Okita，J.Preiss 植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol.)171089-1093)。馬鈴薯塊莖AGP大亞基是熱穩(wěn)定的(Nakata等人 ，前述引文)。
正如Hannah和Nelson(Hannah，L.C.，O.E.Nelson(1975)植物生理學(xué)(Plant Physiol.)55297-302；Hannah，L.C.和Nelson，Jr.，O.E. 生物化學(xué)遺傳學(xué)(Biochem.Genet.)14547-560)所推斷，Shrunken-2(Sh2)(Bhave，M.R.，S.Lawrence，C.Barton，L.C.Hannah 植物細(xì)胞(Plant Cell)2581-588)和Brittle-2(Bt2)(Bae，J.M.，M.Giroux，L.C.Hannah Maydica 35317-322)都是玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的結(jié)構(gòu)基因。Sh2和Bt2分別編碼該酶的大亞基和小亞基。通過(guò)cDNA測(cè)序推斷出Sh2和Bt2蛋白質(zhì)的分子量分別為57,179Da(Shaw，J.R.，L.C.Hannah 植物生理學(xué)(Plant Physiol.)981214-1216)和52,224Da。胚乳是玉米谷粒發(fā)育期間大部分淀粉沉積的位點(diǎn)。與AGP活性缺陷水平相對(duì)應(yīng)，Sh2和bt2玉米胚乳突變體的淀粉水平大大減少。已證實(shí)，任何一個(gè)基因的突變都將使AGP活性減少約95％(Tsai和Nelson，1966，前述引文；Dickinson和Preiss，1969，前述引文)。而且已經(jīng)觀察到，酶活性隨功能性野生型Sh2和Bt2等位基因的劑量而增加，而突變酶具有改變的動(dòng)力學(xué)特性。AGP是植物淀粉生物合成中的限速步驟。Stark等人將大腸桿菌AGP的突變形式導(dǎo)入馬鈴薯塊莖中，得到淀粉含量增加35％(Stark等人 科學(xué)(Science)258287)。
現(xiàn)已報(bào)道了對(duì)多種植物的編碼AGP酶亞基的基因的克隆和鑒定。這包括玉米的Sh2 cDNA(Bhave等人，1990，前述引文)、Sh2基因組DNA(Shaw和Hannah，1992，前述引文)以及Bt2 cDNA(Bae等人，1990，前述引文)；水稻的小亞基cDNA(Anderson，J.M.，J.Hnilo，R.Larson，T.W.Okita，M.Morell，J.Preiss 生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)26412238-12242)和基因組DNA(Anderson，J.M.，R.Larson，D.Landencia，W.T.Kim，D.Morrow，T.W.Okita，J.Preiss 基因(Gene)97199-205)；以及菠菜葉的大小亞基cDNA(Morell等人，1988，前述引文)和馬鈴薯塊莖的大小亞基cDNA(Muller-Rober等人，1990，前述引文；Nakata，P.A.，Greene，T.W.，Anderson，J.W.，Smith-White，B.J.，Okita，T.W.和Preiss，J. 植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol.)171089-1093)。另外，已經(jīng)從小麥胚乳和葉組織(Olive，M.R.，R.J.Ellis，W.W.Schuch 植物生理分子生物學(xué)(Plant Physiol.Mol.Biol.)12525-538)以及擬南芥葉(Lin，T.，Caspar，T.，Sommerville，C.R.和Preiss，J. 植物生理學(xué)(Plant Physiol.)881175-1181)中分離出cDNA克隆。
在迄今所研究的所有組織和生物體中AGP以變構(gòu)酶形式執(zhí)行功能。AGP的變構(gòu)特性最先在大腸桿菌中被證實(shí)是重要的。從大腸桿菌中分離了一個(gè)過(guò)度產(chǎn)生糖原的突變體，并且該突變定位于AGP結(jié)構(gòu)基因上，命名為glyC。已證實(shí)此大腸桿菌突變體(稱(chēng)作glyC-16)對(duì)激活劑果糖-1，6-二磷酸較敏感，而對(duì)抑制劑cAMP較不敏感(Preiss，J. 微生物學(xué)年評(píng)(Ann.Rev.Microbiol.)419-458)。盡管植物AGP也為變構(gòu)酶，但它們與大腸桿菌AGP響應(yīng)不同的效應(yīng)分子。在植物中，3-磷酸甘油酸(3-PGA)作為其激活劑而磷酸鹽(PO4)作為抑制劑(Dickinson和Preiss，1969，前述引文)。
利用體內(nèi)誘變系統(tǒng)，Giroux等人能夠在玉米胚乳AGP的功能重要區(qū)域產(chǎn)生點(diǎn)特異突變體(Giroux，M.J.，Shaw，J.，Barry，G.，Cobb，G.B.，Greene，T.，Okita，T.W.和Hannah，L.C. 國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.)935824-5829)，上述體內(nèi)誘變系統(tǒng)由Ac-介導(dǎo)切除偶然緊靠已知激活劑結(jié)合位點(diǎn)的Ds轉(zhuǎn)座因子而產(chǎn)生。突變體Rev6在AGP大亞基上含有酪氨酸-絲氨酸插入，并且所述突變體使種重增加了11-18％。另外，據(jù)已出版的國(guó)際申請(qǐng)WO 01/64928所講授，利用編碼含有Rev6突變的玉米AGP大亞基的多核苷酸轉(zhuǎn)化植物可以增強(qiáng)植物的多種特征，例如種子數(shù)目、植物生物量、收獲指數(shù)等等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及用于提高植物中作物產(chǎn)量的材料和方法，上述植物例如那些產(chǎn)生谷類(lèi)作物的植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供熱穩(wěn)定AGP酶以及編碼這些酶的核苷酸序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明熱穩(wěn)定酶可以用于提供對(duì)高溫具有更大耐受性的植物，并因此增加這些植物的作物產(chǎn)量。在特別優(yōu)選實(shí)施方案中，改進(jìn)的植物為谷類(lèi)植物?？蓱?yīng)用本發(fā)明的谷類(lèi)包括例如玉米、小麥、稻和大麥。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示熱穩(wěn)定玉米胚乳AGP大亞基突變體。所示的是在60℃熱處理5分鐘后保留的AGP活性百分?jǐn)?shù)。
圖2所示是玉米、小麥、大麥和馬鈴薯AGP大亞基中HS33突變的周?chē)鷧^(qū)域的一級(jí)序列聯(lián)配(alignment)。用盒子表示保守的區(qū)域。
圖3顯示玉米、小麥、大麥和馬鈴薯AGP大亞基中HS40突變的周?chē)鷧^(qū)域的一級(jí)序列聯(lián)配。用盒子標(biāo)出保守的區(qū)域。粗體天冬氨酸殘基對(duì)應(yīng)于馬鈴薯LS的D413A變構(gòu)突變體(Greene，T.W.，Woodbury，R.L.，和Okita，T.W. Plant Physiol.(1121315-1320)。菠菜葉AGP序列是在3-PGA類(lèi)似物研究中鑒定的激活劑位點(diǎn)2肽(Ball，K.和Preiss，J. J.Biol.chem.26924706-24711)。用粗體表示標(biāo)記的賴(lài)氨酸殘基。
圖4A和4B分別顯示TS48和TS60的分子特征。用粗體表示TS48基因損傷和相應(yīng)殘基。在TS48的Leu到Phe突變上方標(biāo)出了氨基酸編號(hào)。最后一行是共有序列。Leu殘基高度保守。用粗體表示TS60基因損傷和相應(yīng)殘基。在TS60的Glu到Lys和Ala到Val突變上方標(biāo)出了氨基酸編號(hào)。盒子內(nèi)的殘基對(duì)應(yīng)于以前鑒定的HS33突變，該突變被證實(shí)在玉米胚乳AGP的熱穩(wěn)定性中是重要的。最后一行是共有序列。
圖5A和5B分別顯示RTS48-2和RTS60-1的分子特征。用粗體表示RTS48-2基因損傷和相應(yīng)殘基。在RTS48-2的Ala到Val突變上方標(biāo)出了氨基酸編號(hào)。最后一行是共有序列。有意義的是，在RTS48-2中鑒定的此突變與熱穩(wěn)定變體HS13中發(fā)現(xiàn)的突變作圖定位于相同的殘基位置。HS13在位置177含有Ala到Pro突變。用粗體表示RTS60-1基因損傷和相應(yīng)殘基。在RTS60-1的Ala到Val突變上方標(biāo)出了氨基酸編號(hào)。最后一行是共有序列。
序列簡(jiǎn)述SEQ ID NO.1是含有圖2所示HS 33突變的玉米AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.2是圖2所示玉米AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.3是圖2中所示小麥AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.4是圖2中所示大麥AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.5是圖2中所示馬鈴薯AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.6是含有圖3中所示HS 40突變的玉米AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.7是圖3中所示玉米AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.8是圖3中所示小麥AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.9是圖3中所示大麥AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.10是圖3中所示馬鈴薯AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.11是圖3中所示菠菜AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.12是含有圖4A中所示TS48突變的玉米AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.13是圖4A中所示玉米AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.14是圖4A中所示小麥AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.15是圖4A中所示大麥AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.16是圖4A中所示稻AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列，。
SEQ ID NO.17是含有圖4B中所示TS60突變的玉米AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.18是圖4B中所示玉米AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.19是圖4B中所示小麥AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.20是圖4B中所示大麥AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.21是圖4B中所示稻AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.22是含有圖4B中所示TS60突變的玉米AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.23是圖4B中所示玉米AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.24是圖4B中所示小麥AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.25是圖4B中所示大麥AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.26是圖4B中所示稻AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.27是含有圖5A中所示RTS48-2突變的玉米AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.28是圖5A中所示玉米AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.29是圖5A中所示小麥AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.30是圖5A中所示大麥AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.31是圖5A中所示稻AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.32是含有圖5B中所示RTS60-1突變的玉米AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.33是圖5B中所示玉米AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.34是圖5B中所示小麥AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.35是圖5B中所示大麥AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
SEQ ID NO.36是圖5B中所示稻AGP大亞基區(qū)域的氨基酸序列。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及新的突變多核苷酸分子及其編碼的多肽，相對(duì)于具有野生型基因型的植物而言，其賦予在熱脅迫條件下生長(zhǎng)的植物增高的產(chǎn)量。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明多核苷酸分子編碼玉米胚乳ADP葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)和可溶性淀粉合成酶(SSS)酶活性。與野生型酶活性相比，該突變酶可以使表達(dá)此突變酶的種子和植物組織在種子和植物發(fā)育時(shí)期對(duì)熱脅迫條件表現(xiàn)出增強(qiáng)的穩(wěn)定性。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明多核苷酸編碼在多肽序列中含有組氨酸到酪氨酸置換的玉米AGP大亞基突變體。根據(jù)該蛋白質(zhì)中可接受的氨基酸編號(hào)(Shaw和Hannah，1992，前述引文)，該置換出現(xiàn)在氨基酸殘基333位。該置換的位置可以容易地被本領(lǐng)域技術(shù)人員鑒定。本發(fā)明中示例的第二突變是在玉米AGP蛋白質(zhì)大亞基的460位蘇氨酸到異亮氨酸的置換。
本發(fā)明也示例了用苯丙氨酸、甲硫氨酸或甘氨酸置換玉米AGP大亞基333位組氨酸的突變體。下面的表1中示出了可以賦予增加熱穩(wěn)定性的其它玉米AGP大亞基突變體例子。
表1突變體 氨基酸改變HS 13 在位置177，Ala到ProHS 14 在位置400，Asp到His和在位置454，Val到IleHS 16 在位置104，Arg到ThrHS 33 在位置333，His到TyrHS 33F 在位置333，His到PheHS 33M 在位置333，His到MetHS 33G 在位置333，His到GlyHS 39 在位置333，His到TyrHS 40 在位置333，His到Tyr，和在位置460，Thr到IleHS 47 在位置216，Arg到Pro，和在位置333，His到TyrRTS 48-2在位置177，Ala到ValRTS 60-1在位置396，Ala到Val由于植物不同種類(lèi)之間AGP多肽的同源性(Smith-White和Preiss 分子進(jìn)化雜志(J.Mol.Evol.)34449-464)，普通技術(shù)人員可以容易地確定玉米以外其它植物的AGP中與此處公開(kāi)的玉米AGP突變位置相對(duì)應(yīng)的突變位置。例如，圖2和3顯示了小麥、大麥和馬鈴薯中玉米HS 33和HS 40突變周?chē)鷧^(qū)域的一級(jí)序列聯(lián)配。因此，本發(fā)明包括編碼非玉米植物的突變AGP的多核苷酸，所述植物包括但并不限于小麥、大麥和稻，當(dāng)所述多核苷酸在植物中表達(dá)時(shí)其賦予增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。
玉米胚乳AGP亞基(SH2和BT2)的cDNA克隆和內(nèi)源細(xì)菌AGP缺陷型大腸桿菌(E.coli)株系(glg C-)(AC70R1-504)促進(jìn)了研究玉米胚乳AGP的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)的建立。單個(gè)亞基的表達(dá)不能補(bǔ)償glg C-突變，不產(chǎn)生糖原(Iglesias，A.，Barry，G.F.，Meyer，C.，Bloksberg，L.，Nakata，P.，Greene，T.，Laughlin，M.J.，Okita，T.W.，Kishore，G.M.，和Preiss，J. J.Biol Chem.2681081-86)。然而，如暴露于碘的菌落的暗紅棕色染色所證明的一樣，相容表達(dá)載體上大和小亞基的表達(dá)完全補(bǔ)償了glg C-突變，并且恢復(fù)了糖原產(chǎn)生。因此，通過(guò)簡(jiǎn)單的將菌落暴露于碘很容易鑒定互補(bǔ)性。
在一個(gè)實(shí)施方式中，使用了表達(dá)馬鈴薯或玉米胚乳AGP結(jié)構(gòu)基因的大腸桿菌(E.coli)glg C-細(xì)胞。當(dāng)在37℃或在42℃生長(zhǎng)時(shí)，含有馬鈴薯AGP基因的細(xì)胞可以合成充足的糖原。然而，表達(dá)玉米胚乳AGP的細(xì)胞只在37℃合成糖原。該結(jié)果證明了野生型玉米胚乳AGP的熱敏感性。馬鈴薯和玉米APG在這方面的差異為篩選具有玉米胚乳AGP熱穩(wěn)定變異體的突變細(xì)胞提供了有效系統(tǒng)。
本發(fā)明一方面涉及對(duì)熱穩(wěn)定AGP的有效鑒定。因此，如下所述，化學(xué)誘變含有編碼玉米AGP SH2亞基的多核苷酸的質(zhì)粒，將其導(dǎo)入表達(dá)BT2亞基的突變大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞中，在42℃生長(zhǎng)細(xì)胞以篩選可以在該溫度產(chǎn)生糖原的突變體。也可以利用本領(lǐng)域已知的其它誘變劑。分離了11個(gè)可遺傳的、碘染色的突變體，稱(chēng)為熱穩(wěn)定(HS)突變體。制備這些突變體的粗提取物，并監(jiān)測(cè)所獲得的AGP的熱穩(wěn)定性。在60℃溫育5分鐘后，突變體保留了活性的8-59％(圖1)。相比較，在該溫度，對(duì)于野生型AGP，常規(guī)觀察到1-4％活性。
結(jié)果表明可以根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)突變產(chǎn)生熱穩(wěn)定形式的酶。因此，本發(fā)明一個(gè)方面涉及產(chǎn)生和鑒定編碼突變淀粉生物合成酶的多核苷酸的方法，該突變淀粉生物合成酶與野生型酶比較具有增加的熱穩(wěn)定性。意外地，在大多數(shù)這些突變體中熱處理前玉米胚乳AGP的總活性升高約2到3倍。這種意外的結(jié)果使得這些突變體用在農(nóng)業(yè)中特別有利。可以根據(jù)本發(fā)明利用這里所述的誘變技術(shù)以鑒定編碼熱穩(wěn)定淀粉生物合成酶的其它基因。
完全測(cè)序了編碼這里所示例的幾種熱穩(wěn)定突變體的基因，其中包括兩個(gè)熱穩(wěn)定性最強(qiáng)的HS突變體，HS33和HS40。熱處理后保留59％活性的HS33包含在多肽氨基酸序列位置333從組氨酸殘基到酪氨酸改變的單堿基對(duì)突變(圖2)。與小麥和大麥AGP大亞基的一級(jí)序列聯(lián)配表明在類(lèi)似殘基位置也存在組氨酸(圖3)(Ainsworth，C.，Hosein，F(xiàn).，Tarvis，M.，Weir，F(xiàn).，Burrell，M.，Devos，K.M.，Gale，M.D. Planta 1971-10)。對(duì)處理后保留41％活性的HS40進(jìn)行序列分析，該序列也含有在位置333從組氨酸到酪氨酸的突變。此外，還鑒定了另一個(gè)點(diǎn)突變，其產(chǎn)生了蘇氨酸到異亮氨酸的置換。蘇氨酸殘基在AGP大亞基中高度保守，而在AGP小亞基中類(lèi)似的殘基是半胱氨酸或絲氨酸(Ainsworth等，1995，前述引文)。此蘇氨酸到異亮氨酸的置換緊靠大亞基的羧基末端，并且緊靠激活劑3-PGA的已知結(jié)合位點(diǎn)(圖3)。
本發(fā)明另一方面涉及淀粉生物合成酶，諸如AGP的突變體和編碼它們的多核苷酸，其中這些突變酶通過(guò)篩選溫度敏感型(TS)突變體，然后誘變并且篩選顯示增加穩(wěn)定性的回復(fù)體來(lái)分離。本發(fā)明另一方面涉及制備和鑒定這些多核苷酸和其編碼的突變酶的方法。
本發(fā)明也涉及酶小亞基中有突變的AGP熱穩(wěn)定突變體。本發(fā)明范圍中也包括編碼突變的AGP小亞基的多核苷酸。利用本發(fā)明方法也可以很容易地制備和鑒定能賦予酶熱穩(wěn)定性的AGP小亞基中的突變。
本發(fā)明也考慮經(jīng)培育含有本發(fā)明突變多核苷酸或用本發(fā)明突變多核苷酸轉(zhuǎn)化的、并表達(dá)多核苷酸所編碼的多肽的植物和植物組織。表達(dá)突變多核苷酸的植物和植物組織可以產(chǎn)生例如當(dāng)發(fā)育期間受到熱脅迫時(shí)，具有較低熱誘導(dǎo)的重量或產(chǎn)量損失的組織。本發(fā)明范圍內(nèi)的植物包括單子葉植物，諸如稻、小麥、大麥、燕麥、高梁、玉米、百合和粟，和雙子葉植物，諸如豌豆、紫花苜蓿、鷹嘴豆、菊苣、三葉草、羽衣甘藍(lán)、兵豆、北美雀麥、大豆、煙草、馬鈴薯、甘薯、蘿卜、甘藍(lán)、歐洲油菜、蘋(píng)果樹(shù)和萵苣。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，植物是谷類(lèi)。本發(fā)明應(yīng)用的谷類(lèi)包括，例如玉米、小麥、稻、大麥、燕麥、黑麥和粟。
具有本發(fā)明突變多核苷酸的植物可以從基因組中含有突變基因的種子生長(zhǎng)。此外，用基因轉(zhuǎn)化植物的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。
因?yàn)檫z傳密碼的簡(jiǎn)并性，對(duì)于這里所公開(kāi)的每一個(gè)變異體AGP多肽，可以由各種不同的多核苷酸序列來(lái)編碼。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以熟練地產(chǎn)生編碼相同或基本相同的本發(fā)明多肽的替代多核苷酸序列。這些變異體或替代多核苷酸序列在本發(fā)明范圍內(nèi)。這里所用提到的“基本相同”序列指編碼氨基酸置換、缺失、添加或插入的序列，該氨基酸置換、缺失、添加或插入不實(shí)質(zhì)上改變這里所述AGP多核苷酸突變體編碼的多肽的功能活性。
這里所用術(shù)語(yǔ)“核酸”和“多核苷酸序列”指單或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非有另外的限定，其也包括以與天然存在的核苷酸相同的方式起作用的天然核苷酸的已知類(lèi)似物。多核苷酸序列包括轉(zhuǎn)錄為RNA的DNA鏈序列和翻譯為蛋白質(zhì)的RNA序列。多核苷酸序列包括全長(zhǎng)序列及來(lái)源于全長(zhǎng)序列的較短序列。在特定的多核苷酸序列中包含天然序列的簡(jiǎn)并密碼子或包含可以被引入以提供特定宿主細(xì)胞中密碼子優(yōu)先使用的序列，這是可以理解的。示例序列的等位基因變異也落在本發(fā)明范圍內(nèi)。落入本發(fā)明范圍內(nèi)的多核苷酸序列還包括與示例的序列特異性雜交的序列。多核苷酸包括單鏈形式的或雙鏈體中的有義和反義鏈。
本發(fā)明范圍內(nèi)也考慮除了這里所公開(kāi)的突變體中具體示例的氨基酸置換以外的氨基酸置換?？梢詫被岱譃橄旅娴膸最?lèi)非極性、不帶電荷極性、堿性和酸性。將突變AGP多肽中的氨基酸置換成與該氨基酸相同類(lèi)的另一個(gè)氨基酸的保守性置換也落入本發(fā)明范圍內(nèi)，前提是具有置換的突變AGP多肽相對(duì)于野生型多肽仍舊保留了增加的熱穩(wěn)定性。下面的表2列出了屬于每一類(lèi)的氨基酸的例子。
表2氨基酸的分類(lèi) 氨基酸的例子非極性 Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Met，Phe，Trp不帶電荷極性 Gly，Ser，Thr，Cys，Tyr，Asn，Gln酸性 Asp，Glu堿性 Lys，Arg，His
例如，在HS 33，HS 39，HS 40和HS 47玉米胚乳AGP突變體中位置333，用其它氨基酸諸如甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺置換酪氨酸將包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。只要多肽相對(duì)于野生型多肽保留增加的熱穩(wěn)定性，本發(fā)明范圍內(nèi)也考慮在除了熱穩(wěn)定突變位點(diǎn)以外的位置的氨基酸置換。
本發(fā)明也涉及編碼全長(zhǎng)突變多肽的片段的多核苷酸，條件是這些片段保留與全長(zhǎng)多肽基本相同的功能活性。這些多核苷酸編碼的突變AGP多肽片段也在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明也考慮編碼淀粉生物合成酶的多核苷酸分子，所述分子具有與野生型序列足夠同源以致于允許在標(biāo)準(zhǔn)高嚴(yán)格條件下與該序列雜交的序列。這種雜交條件在本領(lǐng)域是常規(guī)的(參見(jiàn)，例如Maniatis，T.，E.F.Fritsch，J.Sambrook 分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南，第二版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，紐約)。
本發(fā)明多核苷酸分子可以用于轉(zhuǎn)化植物以在這些植物中表達(dá)突變熱穩(wěn)定酶。此外，本發(fā)明多核苷酸可以用于表達(dá)重組變異體酶。它們也可以用做檢測(cè)相關(guān)酶的探針。多核苷酸也可以用做測(cè)量DNA大小的標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明的多核苷酸分子也包括編碼含有突變的淀粉生物合成酶諸如AGP酶的多核苷酸，其中該突變可以使表達(dá)這些突變的植物具有增加的種子重量及增加的熱穩(wěn)定性。本發(fā)明尤其考慮在編碼玉米AGP大亞基的多核苷酸中熱穩(wěn)定性突變諸如HS33或HS40和提供增加的種子重量的突變，例如Rev 6的聯(lián)合。美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,589,618和5,650,557公開(kāi)了編碼AGP大亞基中突變的多核苷酸(例如，Rev6)，該突變?cè)诒磉_(dá)突變多肽的植物中賦予增加的種子重量。
根據(jù)本發(fā)明提供熱穩(wěn)定性的AGP亞基中的突變可以與玉米的磷酸不敏感性突變諸如Rev6突變聯(lián)合以增強(qiáng)Rev6編碼的大亞基的穩(wěn)定性。
預(yù)期如同利用AGP時(shí)所觀察到的，高溫將損傷SSS酶活性。因此，根據(jù)這里所述的方法，可以在增加的熱條件(42℃)下表達(dá)誘變形式的SSS，以分離熱穩(wěn)定變異體。這些熱穩(wěn)定誘變形式的SSS和編碼它們的多核苷酸是本發(fā)明的另一方面。
本發(fā)明也涉及通過(guò)摻入本發(fā)明多核苷酸，在熱脅迫條件下增加植物產(chǎn)量特征的方法，所述多核苷酸包含提供對(duì)熱脅迫條件增加的穩(wěn)定性或抗性的淀粉生物合成酶中的突變和賦予植物增加的產(chǎn)量特征的突變。增加的產(chǎn)量特征包括，例如增加的種子數(shù)量、增加的種子重量、增加的植物生物量和增加的收獲指數(shù)。
本發(fā)明也涉及產(chǎn)生和鑒定本發(fā)明范圍內(nèi)所考慮的多核苷酸和多肽的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以通過(guò)基因突變、接著利用細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)篩選，分離編碼如下酶的多核苷酸分子，所述酶可以減輕植物在淀粉合成中的熱誘導(dǎo)損失。
這里參考或引用的所有專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)、臨時(shí)申請(qǐng)和公開(kāi)出版物，除了與本說(shuō)明書(shū)所清楚教導(dǎo)的內(nèi)容不一致的，特此整體并入作為參考文獻(xiàn)。
下面舉例說(shuō)明實(shí)踐本發(fā)明的方法的實(shí)施例。不應(yīng)該將這些實(shí)施例解釋為限制性的。除非另有指明，所有百分比按重量計(jì)，所有溶劑混合物的比例按體積計(jì)。
實(shí)施例1利用誘變獲得玉米胚乳AGP熱穩(wěn)定變異體首先，化學(xué)誘變劑羥胺-HCl用于大亞基表達(dá)質(zhì)粒的隨機(jī)誘變。羥胺優(yōu)先羥基化胞嘧啶C-4位置的氨基氮，產(chǎn)生了GC到AT的轉(zhuǎn)換(Suzuki，D.T.，Griffith，A.J.F.，Miller，J.H.，和Lewontin，R.C. ，《遺傳分析導(dǎo)論》(Introduction to genetic analysis)，F(xiàn)reeman，NY，第4版，475-499頁(yè))。選擇高突變頻率的化學(xué)誘變劑?；瘜W(xué)誘變劑的局限性是已知的，如果未分離到大量的各種遺傳變異體，那么可以進(jìn)行PCR隨機(jī)誘變。PCR誘變可以產(chǎn)生包括相似的轉(zhuǎn)換和顛換頻率的更廣泛的突變譜，提供了化學(xué)方法的優(yōu)良的可替代方案。可以按照Cadwell和Joyce(Cadwell，R.C.和Joyce，G.F. ，《PCR方法和應(yīng)用》，(PCR Methods and Applications)，228-33)概述的方法實(shí)施此PCR方法。
由于隨機(jī)誘變中利用了完整的表達(dá)質(zhì)粒，突變可能出現(xiàn)在編碼區(qū)的外面。盡管預(yù)期這種突變將不會(huì)對(duì)玉米胚乳AGP的熱穩(wěn)定性具有任何影響，但是在進(jìn)行酶水平的任何其它鑒定之前，可以將每個(gè)變異體亞克隆到未突變的表達(dá)質(zhì)粒中?？梢砸砸欢ǚ绞綐?gòu)建大和小亞基表達(dá)質(zhì)粒，以便使得可以通過(guò)NcoI/SacI消化釋放完整的編碼區(qū)。然后，該完整的編碼區(qū)可以容易地被克隆回未突變的NcoI/SacI消化的表達(dá)載體中。
實(shí)施例2熱穩(wěn)定AGP變異體的分子鑒定和分析最初，獲得11個(gè)玉米胚乳大亞基熱穩(wěn)定變異體。利用DuPont和ABI儀器進(jìn)行測(cè)序?？梢猿Ｒ?guī)地比較序列數(shù)據(jù)和祖先野生型等位基因。該分析表明可以調(diào)節(jié)熱穩(wěn)定性的變化式樣的多樣化程度。
幾種測(cè)序的HS突變體在大亞基氨基酸位置333含有相同的組氨酸到酪氨酸的改變。利用將酪氨酸改變回到組氨酸的引物，通過(guò)定點(diǎn)誘變，可以針對(duì)此組氨酸到酪氨酸的改變，快速篩選PCR來(lái)源的HS突變體。
實(shí)施例3遺傳變異體的表達(dá)、純化和動(dòng)力學(xué)分析已經(jīng)充分地表征了在大腸桿菌(E.coli)中野生型玉米胚乳AGP表達(dá)的條件。最適宜的生長(zhǎng)和誘導(dǎo)條件稍微不同于以前公開(kāi)的用于大腸桿菌中表達(dá)馬鈴薯AGP的條件(Iglesias等，1993，前述引文；Ballicora等，1995，前述引文)。在0.3mM IPTG和25μg/ml萘啶酮酸存在的情況下，在室溫誘導(dǎo)12-14小時(shí)一貫地得到高水平的表達(dá)和活性。向提取緩沖液添加30％硫酸銨和10mM KH2PO4-/K2HPO4-以穩(wěn)定粗提取物中玉米AGP。
利用Tentacle C3氨基丙基介質(zhì)(EM Separations)填充的PharmaciaHR 10/10柱子，通過(guò)疏水相互作用層析法進(jìn)一步純化硫酸銨濃縮的AGP。在含有1M硫酸銨的緩沖液中，蛋白質(zhì)結(jié)合柱子。通過(guò)連續(xù)步驟的含有0.75M，0.5M，0.25M和0M硫酸銨的緩沖液梯度沖洗，從柱子洗脫AGP。通常在0.25M洗脫物中洗脫野生型玉米胚乳AGP。利用填充Macro-PrepDEAE (BioRad)陰離子交換介質(zhì)的Pharmacia HR 10/10柱子，通過(guò)陰離子交換層析進(jìn)一步純化經(jīng)C3純化的玉米胚乳AGP。通過(guò)100-500mM KCl的線性梯度洗脫AGP，并且通常在約300mM鹽濃度時(shí)洗脫AGP。Pharmacia FPLC系統(tǒng)用于所有的層析步驟。充分地表征了各純化步驟的條件。通過(guò)焦磷酸解測(cè)定法監(jiān)測(cè)純化期間的AGP活性，通過(guò)SDS-PAGE、考馬斯染色和利用對(duì)玉米胚乳AGP大和小亞基特異的多克隆抗體的Western印跡監(jiān)測(cè)純化步驟。
實(shí)施例4增強(qiáng)的亞基相互作用HS玉米胚乳AGP突變體的完全意外的多效作用是熱處理前2到3倍活性的升高。對(duì)這種結(jié)果的一種可能的解釋是我們已經(jīng)通過(guò)突變轉(zhuǎn)變了大腸桿菌細(xì)胞中存在的SH2和BT2單體和聚合物的比率。可能，在野生型中，僅僅10％或更低的總蛋白質(zhì)以活性異四聚體形式存在，而在突變體中，該百分比高得多。如果聚合物比單體更具有熱抗性，那么突變體的表型將與觀察結(jié)果一致。動(dòng)力學(xué)分析可以用于確定對(duì)底物和/或變構(gòu)效應(yīng)物親和性的改變。
為了檢驗(yàn)這些突變體中單體/聚合物比率可能改變的想法，可以監(jiān)測(cè)熱處理前和后野生型中和選定突變體中的單體和聚合物數(shù)量。由于可獲得這兩個(gè)亞基的抗體(Giroux，M.J.和Hannah，L.C. Mol.Gen.Genetics243400-408)，使得該方法切實(shí)可行。這可以通過(guò)蔗糖梯度超離心和通過(guò)凝膠層析檢驗(yàn)，并且將很容易地確定哪種方法最有效和最明確。
因?yàn)楦叩戎参顰GP由2個(gè)相似但不同的亞基組成，所述亞基寡聚化形成天然異四聚體結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)該相互作用的突變可以為該酶提供額外的穩(wěn)定性?？梢岳媒湍鸽p雜交系統(tǒng)(CLONTECH Laboratories，Palo Alto，CA)估測(cè)亞基相互作用?？梢詷?gòu)建用于編碼區(qū)擴(kuò)增的特異性引物。這些引物在5’-和3’-末端添加唯一的限制位點(diǎn)，以便通過(guò)克隆有利于將各亞基與GAL4DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(pGBT9)或GAL4激活結(jié)構(gòu)域(pGAD424)形成翻譯融合。如果克隆到載體中的蛋白質(zhì)相互作用，那么DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和激活結(jié)構(gòu)域?qū)⑿纬晒δ苄赞D(zhuǎn)錄激活物。接著，這將激活克隆在GAL4啟動(dòng)子后面的報(bào)道基因lacZ的表達(dá)。
首先，可以利用野生型亞基鑒定條件?？梢詫⒁吧痛蠛托喕木幋a區(qū)克隆到pGBT9和pGAD424酵母表達(dá)載體中?？梢援a(chǎn)生所有可能的組合，并檢測(cè)這些組合。含有Sh2和Bt2的pGBT9和pGAD424載體可以共轉(zhuǎn)化到相同的酵母株系中，并且在缺乏色氨酸(pGBT9)和亮氨酸(pGAD424)的培養(yǎng)基上篩選生長(zhǎng)的菌株?？梢噪p向以lacZ的表達(dá)檢測(cè)亞基相互作用。通過(guò)β-半乳糖苷酶濾膜測(cè)定法可以可視地鑒定陽(yáng)性菌落。用該測(cè)定法，菌落與濾膜結(jié)合，裂解和與X-gal溶液溫育?？梢苑治鲲@示藍(lán)顏色的菌落。進(jìn)一步，可以通過(guò)對(duì)β-半乳糖苷酶特異的酶測(cè)定法分析亞基相互作用。這允許相互作用的定量分析。增強(qiáng)亞基相互作用的突變將在測(cè)定時(shí)給出更高水平的β-半乳糖苷酶活性。
實(shí)施例5穩(wěn)定性的進(jìn)一步增強(qiáng)分離的大亞基突變體在它們的熱穩(wěn)定特性方面不同，表明存在多種突變的可能性。盡管突變體HS 33和HS 40的序列分析表明突變體序列不同，但是兩個(gè)突變體都含有相同的組氨酸到酪氨酸的改變。如果鑒定到SH2蛋白質(zhì)中不同的HS改變，則可以在一個(gè)蛋白質(zhì)中有效地逐漸增加這些改變。而且，小亞基中任何HS突變都可以與HS SH2突變體共表達(dá)以進(jìn)一步增強(qiáng)玉米胚乳酶的穩(wěn)定性。
可以很容易地在一個(gè)亞基中聯(lián)合多個(gè)HS突變。例如，可以利用將Sh2編碼區(qū)分成3個(gè)不同片段的不同單一限制位點(diǎn)。當(dāng)適合時(shí)，可以通過(guò)亞克隆含有所要添加的突變的相應(yīng)片段以達(dá)到突變的聯(lián)合。如果兩個(gè)突變緊鄰，那么可以利用定點(diǎn)誘變?cè)O(shè)計(jì)這種聯(lián)合。位點(diǎn)特異性誘變的一種方法涉及PCR、誘變引物和DpnI限制性?xún)?nèi)切核酸酶的應(yīng)用?？梢詷?gòu)建引物以在5’末端含有突變，并且利用校正聚合酶Vent，利用該引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后可以用DpnI消化擴(kuò)增的DNA。因?yàn)閺拇竽c桿菌分離的親代DNA是甲基化的，因此其對(duì)DpnI敏感。通過(guò)凝膠電泳大小分級(jí)消化的DNA，將其連接并且克隆到表達(dá)載體中。通過(guò)序列分析確認(rèn)突變并轉(zhuǎn)化到帶有野生型小亞基的AC70R1-504株系中。然后可以分析組合突變體。
實(shí)施例6在玉米AGP大亞基位置333的其它突變體的鑒定羥胺-HCl誘變劑僅產(chǎn)生胞嘧啶到胸腺嘧啶的改變，因此限制了可能置換的類(lèi)型。因?yàn)镈NA兩條鏈都受到了誘變，所以也出現(xiàn)胸腺嘧啶到胞嘧啶的改變；然而，合起來(lái)一起考慮總共僅出現(xiàn)12種可能的單堿基改變中的2種改變。因此，通過(guò)羥胺-HCl誘變將不能產(chǎn)生所有可能的氨基酸置換。
因此，為了制備突變體，利用2步法，在玉米胚乳AGP大亞基的位置333分別插入20種不同氨基酸的每種氨基酸。方法學(xué)基本來(lái)源于Stratagene的方法。首先，通過(guò)PCR位點(diǎn)特異性誘變除去編碼氨基酸333的密碼子加上氨基酸334密碼子的第一個(gè)堿基(Suzuki等，1989，前述引文)。隨后通過(guò)碘染色對(duì)失活作篩選，接著測(cè)序以證實(shí)缺失，利用在333密碼子含有隨機(jī)堿基加上在氨基酸334密碼子第一個(gè)堿基處含有置換堿基的引物PCR誘變所得到的質(zhì)粒。由此得到的質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化到含有Bt2的大腸桿菌突變細(xì)胞中，在37℃和在42℃，通過(guò)碘染色篩選活性，隨后測(cè)序。在后面的階段使用具有更少簡(jiǎn)并性的引物以更有效地產(chǎn)生在第一次循環(huán)中沒(méi)有獲得的密碼子。
誘變后，分離所有20種氨基酸置換，并且在37℃，所有置換都產(chǎn)生了染色。在升高的溫度42℃計(jì)數(shù)碘染色的突變體。編號(hào)的株系被用于篩選以除去觀察者方面的偏見(jiàn)。下面的表3中列出了在42℃生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生等于或大于野生型的染色的那些突變體。
如所預(yù)料的，此篩選鑒定到在蛋白質(zhì)位置333具有野生型氨基酸，即組氨酸，或HS 33突變體氨基酸，即酪氨酸的活性酶。還鑒定到苯丙氨酸，其僅由于缺少極性羥基而不同于酪氨酸。此篩選也鑒定到具有實(shí)質(zhì)上不同于酪氨酸和苯丙氨酸的氨基酸，諸如甘氨酸的活性酶。
也在65℃處理新提取的酶制備物5分鐘之前和之后，測(cè)定了AGP活性，結(jié)果如表3中所示。通過(guò)在42℃生長(zhǎng)陽(yáng)性染色的大腸桿菌板篩選到的8種氨基酸，在65℃熱處理后，其中三種突變體(HS 33，HS 33F，和HS 33M，在位置333分別具有酪氨酸、苯丙氨酸或甲硫氨酸)在酶測(cè)定中顯示了上佳活性。盡管含有苯丙氨酸和甲硫氨酸的AGP的AGP活性稍微高于酪氨酸置換介導(dǎo)的AGP活性，但是這三種制備物之間的活性差異小。

*在熱處理前，粗制備物中的AGP活性表示為HS 33活性的百分?jǐn)?shù)。
實(shí)施例7熱穩(wěn)定性突變和Rev6的聯(lián)合根據(jù)本發(fā)明，熱穩(wěn)定突變可以與和增加的種子重量有關(guān)的突變，諸如Rev6突變聯(lián)合。目的是維持Rev6期望的磷酸鹽不敏感性特征，而同時(shí)增強(qiáng)其穩(wěn)定性。如這里所述，可以構(gòu)建并且證實(shí)Rev6/HS雙突變體。雙突變體可以被轉(zhuǎn)化到帶有野生型小亞基的AC70R1-504中。通過(guò)在低葡萄糖培養(yǎng)基上的陽(yáng)性糖原染色可以容易地鑒定增加的熱穩(wěn)定性。當(dāng)在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，Rev6不染色。最初可以酶促篩選所有突變體組合的磷酸鹽不敏感性的維持，之后僅進(jìn)一步篩選維持磷酸鹽不敏感性的組合。
實(shí)施例8SSSI突變體的克隆可以從大腸桿菌原種中心(E.coli Stock Center)獲得內(nèi)源細(xì)菌糖原合酶缺陷的glg A-大腸桿菌株系。目前用于AGP表達(dá)的細(xì)菌表達(dá)載體可以用于SSS的表達(dá)。
如用于例如Sh2和Bt2的一個(gè)克隆策略(Giroux等，1996，前述引文)是一個(gè)引物含有一個(gè)單一限制位點(diǎn)加轉(zhuǎn)錄物5’末端，而另一個(gè)引物含有另一個(gè)單一限制位點(diǎn)和待研究基因的翻譯終止密碼子3’序列。隨后的克隆在質(zhì)粒內(nèi)產(chǎn)生翻譯融合。首先將這些基因特異性引物與來(lái)源于發(fā)育胚乳的polyA+RNA用在RT-PCR反應(yīng)中。
玉米胚乳SSS I的表達(dá)將補(bǔ)償glg A-株系中糖原合酶活性的缺乏。如同在glg C-株系中表達(dá)AGP一樣，用碘染色應(yīng)該容易觀察到互補(bǔ)?？梢栽诟鞣N溫度溫育粗提取物不同時(shí)間長(zhǎng)度以測(cè)定SSS I熱穩(wěn)定性。如同利用AGP細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)一樣，可以在各種溫度生長(zhǎng)表達(dá)玉米胚乳SSS I的glg A-株系以測(cè)定是否功能是溫度敏感性的。一旦確定限制性溫度，可以對(duì)SSS I克隆進(jìn)行隨機(jī)誘變。SSS I的突變體形式可以被轉(zhuǎn)化到glg A-株系中，在限制性溫度生長(zhǎng)，并且通過(guò)它們?cè)谙拗茰囟犬a(chǎn)生碘染色糖原的能力鑒定熱穩(wěn)定變異體。
實(shí)施例9玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的溫度敏感型突變體做為鑒定其它具有增加穩(wěn)定性的變異體的替代方法，利用反向遺傳學(xué)方法。已經(jīng)分離溫度敏感型突變體(TS)。在30℃，這些突變體顯示了陰性碘染色表型，表明玉米胚乳AGP功能的缺乏。相反，當(dāng)突變體在37℃生長(zhǎng)時(shí)，它們能完全互補(bǔ)細(xì)菌AGP中的突變。這清楚地表明突變APG是功能性的，并且功能喪失是溫度依賴(lài)型的。在30℃和37℃，野生型AGP顯示了陽(yáng)性糖原染色表型。然后，溫度敏感型突變體用于產(chǎn)生第二位點(diǎn)回復(fù)突變體，該第二位點(diǎn)回復(fù)體編碼具有增強(qiáng)穩(wěn)定性的突變AGP。
誘變對(duì)pSh2 DNA進(jìn)行羥胺誘變(Greene，T.W.，Chantler，S.E.，Kahn，M.L.，Barry，G.F.，Preiss，J.，和Okita，T.W. Proc.Natl.Acad.Sci.931509-1513)，并且將其轉(zhuǎn)化到帶有野生型pBt2小亞基質(zhì)粒的AC70R1-504大腸桿菌細(xì)胞中。細(xì)胞涂平板，并且在30℃生長(zhǎng)。在30℃，AGP溫度敏感型變異體通過(guò)陰性碘染色表型鑒定。在30℃和37℃再一次劃線培養(yǎng)推定的突變體和做為對(duì)照的野生型AGP。分離在30℃一致地產(chǎn)生陰性碘表型和在37℃一致地產(chǎn)生陽(yáng)性碘染色表型的6個(gè)突變體。野生型Sh2和Bt2的表達(dá)在這兩個(gè)溫度都產(chǎn)生了陽(yáng)性碘染色表型。
TS48和TS60的鑒定分離和測(cè)序來(lái)源于兩個(gè)溫度敏感型突變體TS48和TS60的質(zhì)粒DNA，以鑒定基因損傷。鑒定到在氨基酸位置426產(chǎn)生苯丙氨酸置換亮氨酸的單點(diǎn)突變(圖4A)。該殘基和周?chē)膮^(qū)域在谷類(lèi)胚乳大亞基(LS)中高度保守(Smith-White和Preiss，1992，前引文)。在TS60中，鑒定到在氨基酸324從谷氨酸到賴(lài)氨酸突變和在位置359從丙氨酸到纈氨酸突變的兩個(gè)點(diǎn)突變(圖4B)。Glu-324在AGP的LS和小(SS)亞基中高度保守(Smith-White和Preiss，1992，前引文)。Ala-359和周?chē)被嵩贏GP LS中也高度保守。更重要的是，TS60中鑒定的2個(gè)突變位于這里所述的HS 33突變的側(cè)翼。已證明在位置333具有組氨酸到酪氨酸置換的HS 33突變大大地增加了玉米胚乳AGP的熱穩(wěn)定性。TS60突變緊鄰HS 33突變是蛋白質(zhì)的該區(qū)域?qū)Ψ€(wěn)定性具有重要性的另外證據(jù)。
第二位點(diǎn)回復(fù)體的分離溫度敏感型突變體的分離為分離其它可以增強(qiáng)AGP穩(wěn)定性的變異體提供了可選擇表型。對(duì)TS48和TS60 DNA再進(jìn)行羥胺誘變以分離第二位點(diǎn)回復(fù)體，該回復(fù)體恢復(fù)了在30℃的陽(yáng)性糖原染色表型。使用羥胺是因?yàn)榇苏T變化學(xué)消除了TS48和TS60突變體中鑒定的最初突變直接恢復(fù)突變的可能性。這促進(jìn)了恢復(fù)這些溫度敏感型突變體穩(wěn)定性的第二位點(diǎn)突變的篩選。
分離TS48的3個(gè)回復(fù)體，并且示出了一個(gè)突變體RTS48-2的分子特征(圖5A)。RTS48-2除了含有TS48中鑒定的親本突變外，還在氨酸酸位置177含有丙氨酸到纈氨酸突變。該殘基和周?chē)鷧^(qū)域高度保守。RTS 48-2突變對(duì)應(yīng)于熱穩(wěn)定突變體HS 13中所鑒定的相同突變位點(diǎn)。在HS 13中，在位置177，丙氨酸殘基突變?yōu)楦彼帷＿@兩個(gè)突變作圖定位于相同位點(diǎn)是有意義的。利用完全不同的方法，根據(jù)增加的穩(wěn)定性篩選到RTS48-2和HS 13突變體，由此這兩個(gè)突變確定這個(gè)位點(diǎn)在AGP穩(wěn)定性中是重要的。
分離TS60的5個(gè)第二位點(diǎn)回復(fù)體，示出了一個(gè)回復(fù)體RTS60-1的序列分析(圖5B)。鑒定到在氨基酸396的丙氨酸到纈氨酸突變。該殘基在AGP LS中高度保守，并且其也作圖緊鄰HS 14中所鑒定的熱穩(wěn)定突變。
應(yīng)該理解這里所述的實(shí)施例和實(shí)施方式僅僅是示例性目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員鑒于此將得到各種變通或改變方案的啟示，該變通和改變方案包括在本申請(qǐng)的精神和范圍內(nèi)及所附權(quán)利要求的范圍中。
序列表<110>佛羅里達(dá)大學(xué)研究基金公司(University of Florida Research Foundation，Inc.)<120>淀粉生物合成酶的熱穩(wěn)定突變體<130>UF-178AXC2<150>US 09/312,433<151>1999-05-14<150>US 60/085,460<151>1998-05-14<150>US 08/972,545<151>1997-11-18<150>US 60/031,045<151>1996-11-18<160>36<210>1<211>33<212>PRT<213>玉米(zea mays)的HS 33突變體<400>1Leu His Asp Phe Gly Ser Glu Ile Leu Pro Arg Ala Val Leu Asp Tyr1 5 10 15Ser Val Gln Ala Cys Ile Phe Thr Gly Tyr Trp Glu Asp Val Gly Thr20 25 30Ile<210>2<211>33<212>PRT<213>玉米<400>2Leu His Asp Phe Gly Ser Glu Ile Leu Pro Arg Ala Val Leu Asp His1 5 10 15Ser Val Gln Ala Cys Ile Phe Thr Gly Tyr Trp Glu Asp Val Gly Thr20 25 30Ile<210>3<211>33<212>PRT<213>普通小麥(Triticum aestivum)<400>3
Leu His Asp Phe Gly Ser Glu Ile Leu Pro Arg Ala Leu His Asp His1 5 10 15Asn Val Gln Ala Tyr Val Phe Thr Asp Tyr Trp Glu Asp Ile Gly Thr20 25 30Ile<210>4<211>33<212>PRT<213>大麥(Hordeum vulgare)<400>4Leu His Asp Phe Gly Ser Glu Ile Leu Pro Arg Ala Leu His Asp His1 5 10 15Asn Val Gln Ala Tyr Val Phe Thr Asp Tyr Trp Glu Asp Ile Gly Thr20 25 30Ile<210>5<211>33<212>PRT<213>馬鈴薯(solanum tuberosum)<400>5Ser Asn Asp Phe Gly Ser Glu Ile Leu Pro Ala Ala Ile Asp Asp Tyr1 5 10 15Asn Val Gln Ala Tyr Ile Phe Lys Asp Tyr Trp Glu Asp Ile Gly Thr20 25 30Ile<210>6<211>26<212>PRT<213>玉米的HS40突變體<400>6Ala Gly Lys Val Pro Ile Gly Ile Gly Arg Asr Ile Lys Ile Arg Asn1 5 10 15Cys Ile Ile Asp Met Asn Ala Arg Ile Gly20 25<210>7<211>26<212>PRT<213>玉米
<400>7Ala Gly Lys Val Pro Ile Gly Ile Gly Arg Asr Thr Lys Ile Arg Asn1 5 10 15Cys Ile Ile Asp Met Asn Ala Arg Ile Gly20 25<210>8<211>26<212>PRT<213>普通小麥<400>8Glu Gly Lys Val Pro Ile Gly Val Gly Glu Asn Thr Lys Ile Ser Asn1 5 10 15Cys Ile Ile Asp Met Asn Ala Arg Ile Gly20 25<210>9<211>26<212>PRT<213>大麥<400>9Glu Gly Lys Val Pro Ile Gly Val Gly Glu Asn Thr Lys Ile Ser Asn1 5 10 15Cys Ile Ile Asp Met Asn Ala Arg Ile Gly20 25<210>10<211>26<212>PRT<213>馬鈴薯<400>10Glu Gly Lys Val Pro Ile Gly Ile Gly Glu Asn Thr Lys Ile Arg Lys1 5 10 15Cys Ile Ile Asp Lys Asn Ala Lys Ile Gly20 25<210>11<211>11<212>PRT<213>菠菜(Spinicia oleracea)<400>11Ile Lys Asp Ala Ile Ile Asp Lys Asn Ala Arg1 5 10
<210>12<211>20<212>PRT<213>玉米的TS48突變體<400>12Cys Ser Arg Val Ser Ser Gly Cys Glu Phe Lys Asp Ser Val Met Met1 5 10 15Gly Ala Asp Ile20<210>13<211>20<212>PRT<213>玉米<400>13Cys Ser Arg Val Ser Ser Gly Cys Glu Leu Lys Asp Ser Val Met Met1 5 10 15Gly Ala Asp Ile20<210>14<211>20<212>PRT<213>普通小麥<400>14Arg Ser Arg Leu Asn Ser Gly Ser Glu Leu Lys Asn Ala Met Met Met1 5 10 15Gly Ala Asp Ser20<210>15<211>20<212>PRT<213>大麥<400>15Arg Ser Arg Leu Asn Ser Gly Ser Glu Leu Lys Asn Ala Met Met Met1 5 10 15Gly Ala Asp Ser20<210>16<211>12<212>PRT
<213>稻(0ryza sativa)<400>16Ser Ser Arg Val Ser Ser Gly Cys Glu Leu Lys Ile1 5 10<210>17<211>24<212>PRT<213>玉米的TS60突變體<400>17Asp Phe Gly Ser Lys Ile Leu Pro Arg Ala Val Leu Asp His Ser Val1 5 10 15Gln Ala Cys Ile Phe Thr Gly Tyr20<210>18<211>24<212>PRT<213>玉米<400>18Asp Phe Gly Ser Glu Ile Leu Pro Arg Ala Val Leu Asp His Ser Val1 5 10 15Gln Ala Cys Ile Phe Thr Gly Tyr20<210>19<211>24<212>PRT<213>普通小麥<400>19Asp Phe Gly Ser Glu Ile Leu Pro Arg Ala Leu His Asp His Asn Val1 5 10 15Gln Ala Tyr Val Phe Thr Asp Tyr20<210>20<211>24<212>PRT<213>大麥<400>20Asp Phe Gly Ser Glu Ile Leu Pro Arg Ala Leu His Asp His Asn Val1 5 10 15Gln Ala Tyr Val Phe Thr Asp Tyr
20<210>21<211>25<212>PRT<213>稻<400>21Asp Phe Gly Ser Glu Ile Leu Pro Arg Ala Leu Leu Glu His Asn Val1 5 10 15Lys Val Ala Cys Val Phe Thr Glu Tyr20 25<210>22<211>25<212>PRT<213>玉米的TS60突變體<400>22Glu Asp Val Gly Thr Ile Lys Ser Phe Phe Asp Ala Asn Leu Val Leu1 5 10 15Thr Glu Gln Pro Ser Lys Phe Asp Phe20 25<210>23<211>25<212>PRT<213>玉米<400>23Glu Asp Val Gly Thr Ile Lys Ser Phe Phe Asp Ala Asn Leu Ala Leu1 5 10 15Thr Glu Gln Pro Ser Lys Phe Asp Phe20 25<210>24<211>25<212>PRT<213>普通小麥<400>24Glu Asp Ile Gly Thr Ile Arg Ser Phe Phe Asp Ala Asn Met Ala Leu1 5 10 15Cys Glu Gln Pro Pro Lys Phe Glu Phe20 25<210>25<211>25
<212>PRT<213>大麥<400>25Glu Asp Ile Gly Thr Ile Arg Ser Phe Phe Asp Ala Asn Met Ala Leu1 5 10 15Cys Glu Gln Pro Pro Lys Phe Glu Phe20 25<210>26<211>25<212>PRT<213>稻<400>26Glu Asp Ile Gly Thr Ile Lys Ser Phe Phe Asp Ala Asn Leu Ala Leu1 5 10 15Thr Glu Gln Pro Pro Lys Phe Glu Phe20 25<210>27<211>20<212>PRT<213>玉米的RTS48-2突變體<400>27Thr Gln Met Pro Glu Glu Pro Val Gly Trp Phe Gln Gly Thr Ala Asp1 5 10 15Ser Ile Arg Lys20<210>28<211>20<212>PRT<213>玉米<400>28Thr Gln Met Pro Glu Glu Pro Ala Gly Trp Phe Gln Gly Thr Ala Asp1 5 10 15Ser Ile Arg Lys20<210>29<211>20<212>PRT<213>普通小麥<400>29
Thr Gln Met Pro Gly Glu Ala Ala Gly Trp Phe Arg Gly Thr Ala Asp1 5 10 15Ala Val Arg Lys20<210>30<211>20<212>PRT<213>大麥<400>30Thr Gln Met Pro Gly Glu Ala Ala Gly Trp Phe Arg Gly Thr Ala Asp1 5 10 15Ala Val Arg Lys20<210>31<211>20<212>PRT<213>稻<400>31Thr Gln Met Pro Asp Glu Pro Ala Gly Trp Phe Gln Gly Thr Ala Asp1 5 10 15Ala Ile Arg Lys20<210>32<211>18<212>PRT<213>玉米的RTS60-1突變體<400>32Asp Lys Cys Lys Met Lys Tyr Val Phe Ile Ser Asp Gly Cys Leu Leu1 5 10 15Arg Glu<210>33<211>18<212>PRT<213>玉米<400>33Asp Lys Cys Lys Met Lys Tyr Ala Phe Ile Ser Asp Gly Cys Leu Leu1 5 10 15Arg Glu
<210>34<211>18<212>PRT<213>普通小麥<400>34Asp Lys Cys Arg Ile Lys Glu Ala Ile Ile Ser His Gly Cys Phe Leu1 5 10 15Arg Glu<210>35<211>18<212>PRT<213>大麥<400>35Asp Lys Cys Arg Ile Lys Glu Ala Ile Ile Ser His Gly Cys Phe Leu1 5 10 15Arg Glu<210>36<211>20<212>PRT<213>稻<400>36Asp Lys Cys Lys Cys Lys Ile Lys Asp Ala Ile Ile Ser Asp Gly Cys1 5 10 15Ser Phe Ser Glu20
權(quán)利要求
1.編碼植物淀粉生物合成蛋白質(zhì)突變體或所述蛋白質(zhì)突變體的生物學(xué)活性片段或變異體的多核苷酸，其中所述蛋白質(zhì)突變體相對(duì)于野生型蛋白質(zhì)顯示增加的熱穩(wěn)定性。
2.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼的所述蛋白質(zhì)突變體是植物ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的亞基。
3.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼的所述蛋白質(zhì)突變體是植物ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的大亞基，并且在所述大亞基中包含氨基酸突變。
4.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼的所述蛋白質(zhì)突變體是植物ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的小亞基，并且在所述小亞基中包含氨基酸突變。
5.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼的所述蛋白質(zhì)突變體包含氨基酸突變，其中用能賦予蛋白質(zhì)突變體增加的熱穩(wěn)定性的氨基酸置換對(duì)應(yīng)于玉米ADP-葡萄糖焦磷酸化酶野生型大亞基氨基酸序列中位置333的組氨酸。
6.如權(quán)利要求5所述的多核苷酸，其中在位置333置換組氨酸的氨基酸是甘氨酸。
7.如權(quán)利要求5所述的多核苷酸，其中在位置333置換組氨酸的所述氨基酸是苯丙氨酸。
8.如權(quán)利要求5所述的多核苷酸，其中在位置333置換組氨酸的所述氨基酸是甲硫氨酸。
9.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼的所述蛋白質(zhì)突變體還包含能使表達(dá)所述多核苷酸的植物增加種子重量的氨基酸突變。
10.如權(quán)利要求9所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含Rev6突變。
11.如權(quán)利要求9所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼植物ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亞基，其中在對(duì)應(yīng)于玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亞基氨基酸序列之494和495位的氨基酸之間插入至少一個(gè)絲氨酸殘基。
12.如權(quán)利要求9所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼植物ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亞基，其中在對(duì)應(yīng)于玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亞基氨基酸序列之494和495位的氨基酸之間插入氨基酸對(duì)酪氨酸絲氨酸。
13.如權(quán)利要求9所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼植物ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亞基，其中在對(duì)應(yīng)于玉米野生型ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亞基氨基酸序列之495和496位的氨基酸之間插入氨基酸對(duì)絲氨酸酪氨酸。
14.增加植物對(duì)熱脅迫條件的抗性的方法，所述方法包括將權(quán)利要求1所述多核苷酸摻入所述植物的基因組中，并且表達(dá)所述多核苷酸分子編碼的蛋白質(zhì)。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述植物是單子葉植物。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述單子葉植物選自稻、小麥、大麥、燕麥、高梁、玉米、百合和粟。
17.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述植物是玉米(Zea mays)或所述植物組織來(lái)源于玉米(Zea mays)。
18.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述植物是雙子葉植物。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述雙子葉植物選自豌豆、紫花苜蓿、鷹嘴豆、菊苣、三葉草、羽衣甘藍(lán)、兵豆、北美雀、大豆、煙草、馬鈴薯、甘薯、蘿卜、甘藍(lán)、歐洲油菜、蘋(píng)果樹(shù)和萵苣。
20.含有權(quán)利要求1所述多核苷酸分子的植物或植物組織。
21.如權(quán)利要求20所述的植物或植物組織，其中所述植物或植物組織是單子葉的。
22.如權(quán)利要求21所述的植物或植物組織，其中所述單子葉植物或植物組織選自稻、小麥、大麥、燕麥、高梁、玉米、百合和粟。
23.如權(quán)利要求20所述的植物或植物組織，其中所述植物是玉米(Zea mays)或所述植物組織來(lái)源于玉米(Zea mays)。
24.如權(quán)利要求20所述的植物或植物組織，其中所述植物或植物組織是雙子葉的。
25.如權(quán)利要求24所述的植物或植物組織，其中所述雙子葉植物或植物組織選自豌豆、紫花苜蓿、鷹嘴豆、菊苣、三葉草、羽衣甘藍(lán)、兵豆、北美雀麥、大豆、煙草、馬鈴薯、甘薯、蘿卜、甘藍(lán)、歐洲油菜、蘋(píng)果樹(shù)和萵苣。
26.如權(quán)利要求20所述的植物組織，其中所述植物組織是種子。
27.權(quán)利要求1所述多核苷酸編碼的淀粉生物合成蛋白質(zhì)突變體。
28.鑒定編碼淀粉生物合成蛋白質(zhì)突變體的多核苷酸的方法，其中所述淀粉生物合成蛋白質(zhì)突變體相對(duì)于野生型蛋白質(zhì)顯示增加的熱穩(wěn)定性，所述方法包括突變編碼淀粉生物合成蛋白質(zhì)的多核苷酸，在細(xì)胞中表達(dá)所述突變的多核苷酸以產(chǎn)生淀粉生物合成蛋白質(zhì)突變體，并且測(cè)定是否所述淀粉生物合成蛋白質(zhì)突變體相對(duì)于野生型淀粉生物合成蛋白質(zhì)顯示增加的熱穩(wěn)定性。
29.增強(qiáng)植物特征的方法，其中所述植物特征選自種子數(shù)目、植物生物量、收獲指數(shù)、旗葉重、結(jié)種花序以及總種重，所述方法包括向所述植物的基因組中摻入權(quán)利要求10所述的多核苷酸，并表達(dá)由所述多核苷酸分子編碼的蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的突變多核苷酸分子，其編碼具有增加的熱穩(wěn)定性的酶，當(dāng)這些多核苷酸在植物中表達(dá)時(shí)，引起在熱脅迫條件下生長(zhǎng)的植物增加的產(chǎn)量。本發(fā)明多核苷酸分子編碼玉米胚乳ADP葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)和可溶性淀粉合酶(SSS)酶活性。本發(fā)明也考慮經(jīng)培育含有突變多核苷酸或用突變體多核苷酸轉(zhuǎn)化的、并表達(dá)多核苷酸編碼的多肽的植物和植物組織。本發(fā)明也涉及分離本發(fā)明范圍內(nèi)所考慮的多核苷酸和多肽的方法。也提供了增加熱脅迫條件下生長(zhǎng)的植物的產(chǎn)量的方法。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1638622SQ03805735
公開(kāi)日2005年7月13日 申請(qǐng)日期2003年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月19日
發(fā)明者L·C·哈拿, T·W·格林 申請(qǐng)人:佛羅里達(dá)大學(xué)研究基金公司