專利名稱：：用于測(cè)量減重過程中脂肪損耗的方法和測(cè)試條的制作方法
背景技術(shù)：
：無論是在因?yàn)榉逝侄怨?jié)食和/或大量的鍛煉(exerciseregiment)開始的減重過程中，還是在為了治療某些疾病如糖尿病、心血管疾病或癲癇開始的減重過程中，體內(nèi)的過量脂肪代謝成小的化學(xué)單元，稱之為酮體，其包含三種組分β-羥丁酸、乙酰乙酸和丙酮。本發(fā)明涉及用于檢測(cè)生化標(biāo)記物即酮體的方法，所述酮體即(a)由三種組分也就是β-羥丁酸、乙酰乙酸和丙酮組成的總酮體；(b)β-羥丁酸與乙酰乙酸或(c)單獨(dú)的β-羥丁酸。本發(fā)明尤其涉及便于家庭使用的檢測(cè)減重過程中的脂防損耗。本發(fā)明包括用于固相或干式化學(xué)測(cè)試的一次性的、方便的測(cè)試條結(jié)構(gòu)，用于測(cè)試總酮體，所有三種組分即β-羥丁酸、乙酰乙酸和丙酮。另外，本發(fā)明涉及一步就可測(cè)試β-羥丁酸和乙酰乙酸的一次性測(cè)試條，和可單獨(dú)測(cè)試β-羥丁酸的測(cè)試條，當(dāng)將其浸入尿液中時(shí)，產(chǎn)生陽性信號(hào)，比如指示減重過程中脂肪損耗的顏色。測(cè)試條上的顏色強(qiáng)度用于指示樣品中存在的分析物的相對(duì)濃度，從而與脂肪的相對(duì)損耗有關(guān)。上述非侵入性工具對(duì)于需要減重的人來說，其用作心理激勵(lì)是非常有用的。目前有數(shù)以百萬計(jì)的肥胖者，他們采取了多種類型的節(jié)食方法，例如Weight-watcher_，Jenny-Craig，NutriSystem，Atkinsdiet，TheNewBeverlyHillDiet，Liquiddiet，thePritikinprinciplediet。然而，大多數(shù)節(jié)食的人在很短的時(shí)期內(nèi)又會(huì)恢復(fù)其所有減少的體重。僅僅在美國，估計(jì)有超過60％的人屬于肥胖。肥胖是導(dǎo)致多種嚴(yán)重疾病如糖尿病、高膽固醇血癥的主要病因，最終導(dǎo)致腎衰和肝臟衰竭。增強(qiáng)正在減重的人們所作的努力，同時(shí)保持其理想體重。眾所周知，當(dāng)體內(nèi)脂肪也就是作為體內(nèi)脂肪主要組分的脂肪酸被降解時(shí)，它最終降解成以酮體形式存在的小分子。酮體由三種化學(xué)物質(zhì)組成β-羥丁酸、乙酰乙酸和丙酮。β-羥丁酸是主要的酮體，其構(gòu)成大約75-80％的總酮體，乙酰乙酸構(gòu)成大約20-25％的總酮體，而丙酮僅僅以微量(不足2％)存在。由于丙酮的低濃度和其不穩(wěn)定性，很少檢測(cè)其本身。相反，在堿性條件下通過硝普鹽反應(yīng)來檢測(cè)乙酰乙酸和丙酮。一些專利公開了采用硝普鹽反應(yīng)來檢測(cè)乙酰乙酸的方法和裝置，比如Mast的美國專利3,212,855；Magers和Tabb的美國專利4,147,514；Tabb和Burrows的美國專利4,440,724。市場(chǎng)銷售乙酰乙酸測(cè)試條已經(jīng)有很多年，(Bayersdiagnostics，Rochediagnostics)，其用于檢測(cè)尿液中的乙酰乙酸和丙酮。它們產(chǎn)生紫色，顏色的深度接近尿液中或血清中的乙酰乙酸的濃度。通?；加刑悄虿〉幕颊呤褂眠@些測(cè)試條(尤其是I型糖尿病患者)。這些測(cè)試條被錯(cuò)誤地稱為“酮或酮體的測(cè)試”，但是，所述測(cè)試條僅僅測(cè)量酮體的少量組分，即占總酮體不足20-25％的乙酰乙酸和丙酮，所述測(cè)試條并不測(cè)量酮體的主要組分，也就是β-羥丁酸。盡管這些測(cè)試條對(duì)β-羥丁酸不靈敏，上述測(cè)試條還是被成功的用于一些飲食方案中，如含有高脂肪和低碳水化合物的Atkins’飲食。類似地，F(xiàn)ritz的美國專利#5,260,219中教導(dǎo)了測(cè)試條在節(jié)食計(jì)劃中檢測(cè)乙酰乙酸的應(yīng)用。令人驚奇的是，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)當(dāng)浸入那些攝入1000-1500熱卡/天“平衡”飲食而不是含有高脂肪和低碳水化合物含量的Atkins’飲食的個(gè)體的尿中時(shí)，這些測(cè)量乙酰乙酸/丙酮測(cè)試條在大多數(shù)情況下是不靈敏的，因此，在減重過程中的通?；虺Ｒ?guī)應(yīng)用中上述測(cè)試條作為生化標(biāo)記物是無效的。相反地，本發(fā)明是基于這樣一個(gè)發(fā)現(xiàn)，即測(cè)量(a)單獨(dú)的β-羥丁酸(其是乙酰乙酸濃度的3-4倍左右)或(b)β-羥丁酸和乙酰乙酸或(c)總酮體即所有三種組分的測(cè)試條是非常靈敏的，其能夠檢測(cè)尿中和其它生物液體中甚至很少量的上述化學(xué)物質(zhì)。這樣靈敏的測(cè)試條在任何減重過程中都可成功地應(yīng)用，產(chǎn)生的顏色能夠反映出液體中存在的這些化學(xué)物質(zhì)。本發(fā)明的簡(jiǎn)要描述因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種方便、靈敏的固相方法，通過非侵入性樣品如尿，檢測(cè)生物樣品中的(a)總酮體，也就是所有的三種組分β-羥丁酸、乙酰乙酸和丙酮；(b)一步檢測(cè)β-羥丁酸與乙酰乙酸；(c)單獨(dú)的β-羥丁酸，其產(chǎn)生的顏色可被用于檢測(cè)減重過程中人體內(nèi)脂肪(或脂肪酸)的降解。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種方便、靈敏的固相或干式化學(xué)裝置，通過非侵入性樣品如尿，檢測(cè)生物樣品中(a)總酮體，也就是所有的三種組分β-羥丁酸、乙酰乙酸和丙酮；(b)在一個(gè)步驟中的β-羥丁酸與乙酰乙酸；(c)單獨(dú)的β-羥丁酸，其產(chǎn)生的顏色可用于檢測(cè)減重過程中人體內(nèi)脂肪(或脂肪酸)的降解。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供測(cè)試條，用于檢測(cè)減重過程中以及每天攝入1000-1500熱卡或更少的低卡路里飲食的人體內(nèi)的脂肪(或脂肪酸)降解。當(dāng)將這些測(cè)試條浸入晨尿中顯示陽性顏色，而市售的用于檢測(cè)酮的測(cè)試條僅僅能檢測(cè)乙酰乙酸和丙酮，是不靈敏的。因而，本發(fā)明首次提供一種可作為處于減重過程中的人的心理激勵(lì)的生化標(biāo)記物。檢測(cè)處于減重過程中的患者脂肪損耗進(jìn)展的方法包括，用固體測(cè)試條接觸所述患者的體液樣品，獲得所述體液中存在的β-羥丁酸的顏色指示，可選擇地，還有乙酰乙酸和/或丙酮。檢測(cè)樣品中β-羥丁酸和乙酰乙酸的方法，包括a)用PH低于8.5的含有β-羥丁酸脫氫酶(β-HBD)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的組合物接觸樣品，其中(i)β-羥丁酸(β-HB)與NAD反應(yīng)，生成乙酰乙酸和還原的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，(ii)在β-HBD存在下，部分(i)中生成的NADH與乙酰乙酸反應(yīng)生成β-HB，和(iii)部分(i)中生成的NADH轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)；并且檢測(cè)存在的所述有色物質(zhì)。檢測(cè)樣品中的β-羥丁酸、乙酰乙酸和丙酮的測(cè)試條，其包括a)支撐層；和b)位于所述支撐層上的試劑層，所述試劑層包括i)β-羥丁酸脫氫酶(β-HBD)，ii)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，iii)四唑鎓染料前體，和電子介質(zhì)(electronmediator)。本發(fā)明的詳細(xì)描述為了用于減重過程，本文闡述了靈敏、方便的方法，具體地，一種方法是(a)同時(shí)檢測(cè)總酮體，即全部三種組分β-羥丁酸、乙酰乙酸和丙酮；(b)同時(shí)檢測(cè)β-羥丁酸和乙酰乙酸；和(c)僅僅檢測(cè)主要酮體，即β-羥丁酸，這些酮體存在于生物液體包括尿液、血液/血清、唾液中。另外，本發(fā)明描述了用于測(cè)量以下的固相裝置，例如測(cè)試條，(a)同時(shí)險(xiǎn)測(cè)總酮體，即所有三種組分β-羥丁酸、乙酰乙酸和丙酮；(b)同時(shí)檢測(cè)β-羥丁酸和乙酰乙酸；(c)僅僅檢測(cè)β-羥丁酸。這些測(cè)試條可經(jīng)常作為非侵入性器具和生化標(biāo)記物，用于確定在各種減重過程中脂肪被真正地代謝。這些測(cè)試條的每一個(gè)都是非常靈敏的，也就是說，當(dāng)經(jīng)?；蛎刻煸绯拷肽蛑袝r(shí)，如果當(dāng)天有一定量的脂肪被代謝，測(cè)試條將會(huì)顯示陽性顏色，從而對(duì)于進(jìn)行任意減重過程的人來說，上述測(cè)試條可作為一種心理激勵(lì)和工具。目前沒有一種干式化學(xué)方法或固相裝置用于檢測(cè)總酮體(TKB)。本發(fā)明首次提供了一種新的、方便的方法，以及一種固相或干式化學(xué)形式的浸漬測(cè)試條，所述測(cè)試條可供患者現(xiàn)場(chǎng)使用，尤其是在減重過程中。該方法和裝置利用β-羥丁酸脫氫酶將β-羥丁酸轉(zhuǎn)化成乙酰乙酸，同時(shí)采用已知的比色法檢測(cè)上述反應(yīng)生成的乙酰乙酸、內(nèi)源性乙酰乙酸和丙酮。Smith等的美國專利5,801,059中公開了在自動(dòng)化分析儀器中測(cè)量TKB的過程，其中沒有采用浸漬測(cè)試條。然而，由于這種方法需要昂貴的自動(dòng)化分析儀器和專業(yè)的人員來執(zhí)行該測(cè)試，它不適于并且也不能由患者在家中使用。Kojima等的美國專利5,618,686中公開了一種檢測(cè)被錯(cuò)誤的稱為總酮體(TKB)的β-羥丁酸和乙酰乙酸的方法。該方法分為兩個(gè)步驟。在第一步驟中，借助β-羥丁酸脫氫酶(HBD)和NADH(還原的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)，樣品中的乙酰乙酸轉(zhuǎn)化為β-羥丁酸，在第二步驟中檢測(cè)兩個(gè)來源的β-羥丁酸，即最初存在于樣品中的β-羥丁酸和在第一步驟中借助β-羥丁酸脫氫酶和NAD由乙酰乙酸轉(zhuǎn)化得到的β-羥丁酸。然而，該方法存在以下問題，(a)它僅能與自動(dòng)化分析儀一起使用，并且由于兩個(gè)步驟所需要的pH值不同，因此兩個(gè)步驟不能合并，從而該方法不能用作簡(jiǎn)便的一步法來操作，和(b)該方法在340nm波長(zhǎng)處檢測(cè)NADH，不能產(chǎn)生顏色。類似地，Ueda等的美國專利5,633,143中公開了另一種檢測(cè)β-羥丁酸和乙酰乙酸的方法，其也包括兩個(gè)步驟。在這種情況下，第一步驟中乙酰乙酸首先被轉(zhuǎn)化成β-羥丁酸，然后采用β-羥丁酸脫氫酶和一種NAD的硫衍生物(硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)檢測(cè)β-羥丁酸，其能在400nm波長(zhǎng)處檢測(cè)。盡管該方法是靈敏的，可是它具有以下缺點(diǎn)，(a)NADH和硫代NAD是不相容(Compitible)的，在一步法或裝置中不能混合在一起作為一個(gè)試劑，(b)由于硫代NAD不是天然的輔酶，且具有很高的Km，其很難作為β-羥丁酸脫氫酶的輔酶，因此需要非常高濃度的β-羥丁酸脫氫酶，從而很不經(jīng)濟(jì)，而且(c)在400nm出現(xiàn)的黃色很難憑視力辨別，容易受到溶血和存在的膽紅素的干擾。上述的兩步法盡管需要兩個(gè)獨(dú)立的步驟，但是可用于液體檢測(cè)，并且適合于大的臨床分析儀器，然而它不能發(fā)展成方便的只需要一步工序的固相裝置或干式化學(xué)方法或裝置。在本發(fā)明中，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，如果下述的反應(yīng)1A可在pH低于8.5下進(jìn)行，例如pH8.0，或7.75或7.5，反應(yīng)1B比反應(yīng)1A慢，其中反應(yīng)1A是在NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)存在下將β-羥丁酸轉(zhuǎn)化成乙酰乙酸和NADH(還原的NAD)，反應(yīng)1B是在黃遞酶的存在下用四唑鎓鹽轉(zhuǎn)化NADH。結(jié)果，部分并沒有被黃遞酶和四唑鎓鹽轉(zhuǎn)化顯色的NADH可用于下述反應(yīng)(2)中，用于檢測(cè)同樣存在于樣品中的乙酰乙酸，如下所示。反應(yīng)1反應(yīng)2用這種方法，該測(cè)試不僅可以檢測(cè)樣品中的β-羥丁酸，也可以在一步工序中同時(shí)檢測(cè)樣品中的乙酰乙酸(即內(nèi)源性的)。此外，在本反應(yīng)圖表中，它是反應(yīng)1和2之間的循環(huán)反應(yīng)，這樣可長(zhǎng)時(shí)間的持續(xù)產(chǎn)生顏色，從而靈敏度成倍地增加。此處的“循環(huán)”工藝由于持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間的顯色，其出人意料地得到一種非常靈敏的檢測(cè)樣品中β-羥丁酸和乙酰乙酸的方法。此外，該方法產(chǎn)生紫色和不同色度的紫色，其反映出樣品中β-羥丁酸和乙酰乙酸的相對(duì)濃度，并且很容易用視力辨別。也可以采用起其它已知的方法檢測(cè)NADH，比如電化學(xué)傳感器，但是產(chǎn)生可見顏色的方法易于供患者家庭使用。盡管很長(zhǎng)時(shí)間以來，人們就知道采用酶β-羥丁酸脫氫酶(HBD)在NAD存在的條件下檢測(cè)生物液體中β-羥丁酸的方法，上述NAD產(chǎn)生可在340nm波長(zhǎng)的UV區(qū)域測(cè)量的NADH，從而測(cè)定β-羥丁酸(參見Williamson等，1962，“EnzymaticDeterminationofD(-)-beta-HydroxybutyricAcidandacetoacetateacidinBlood”，Biochem.j.，8290-96)，但是，目前還沒有一種簡(jiǎn)易的比色法來檢測(cè)β-羥丁酸(參見Harano等，1984，“DevelopmentofPaper-StripTestfor3-hydroxybutyrateanditsClinicalApplication”，DiabeticCare，7，P.481-485；Harano等，1990，“DevelopmentofStableFilmTestforRapidEstimationofBloodorPlasma3-hydroxybutyrate”，Diabeticcare，13522-524；和Ketosite_測(cè)試，購自GDSTechnology，Inc，Elkhart，IN46514，日期12/19/93，產(chǎn)品內(nèi)插件(productinsert)(參見TietzTextbookofClinicalChemistry，第3版，Burtis和Ashwood編，1999，p786-787)。在這些方法中，β-羥丁酸脫氫酶和NAD與β-羥丁酸反應(yīng)，反應(yīng)生成NADH，在過量黃遞酶存在下，NADH與四唑鎓鹽(比如NBT，即氮藍(lán)四唑鎓)反應(yīng)，檢測(cè)NADH，產(chǎn)生的顏色與其在血液中的濃度成比例。在這些系統(tǒng)中，必須使反應(yīng)的PH高于8.5，從而使反應(yīng)從左到右進(jìn)行，并使反應(yīng)的PH為7.0或更低，使反應(yīng)從右到左進(jìn)行，如下圖所示反應(yīng)1這些測(cè)試用于糖尿病患者由于嚴(yán)重的胰島素缺乏所引起的嚴(yán)重酮酸中毒，這些患者的血液中產(chǎn)生β-羥丁酸。令人驚奇的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)β-羥丁酸測(cè)試條或測(cè)試卡也可供攝入低卡路里飲食的人體使用，其中將血液作為樣品。所產(chǎn)生的顏色的強(qiáng)度反映了血液中β-羥丁酸的水平。然而，作為一種侵入性方法，血液的使用對(duì)攝入低卡路里飲食的普通人來說是不可行的。如果β-羥丁酸測(cè)試條能夠用于尿液的檢測(cè)，相對(duì)于血液檢測(cè)而言，顯然它將更加有用，這是因?yàn)槟驑邮欠乔秩胄缘?，而且可以很方便地供任何人在任何時(shí)間使用。同時(shí)還可以使用其它非侵入性的液體，如唾液或汗，例如乙醇的檢測(cè)。然而，本發(fā)明人令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，上述購自GDS技術(shù)有限公司(GDSTechnologyinc)的用于檢測(cè)β-羥丁酸的測(cè)試卡不能用于尿液，其有兩個(gè)原因，(a)反應(yīng)是在PH高于8.5的條件下進(jìn)行的，從而存在于尿中(也可以是血液)的其本身可以還原四唑鎓鹽的其它組分例如sulfahydryl藥物產(chǎn)生假陽性結(jié)果，以及(b)通常應(yīng)用于測(cè)試條的β-羥丁酸脫氫酶(HBD)可被大量存在于尿中的鹽酸鹽抑制，因而該測(cè)試條不能用于檢測(cè)尿中的β-羥丁酸，從而存在選擇樣品的問題。本發(fā)明中，令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，有可能克服這些困難并研究出一種采用大量β-羥丁酸脫氫酶(如超過常規(guī)需要?jiǎng)┝康?0到20倍)或β-羥丁酸脫氫酶來檢測(cè)尿中的β-羥丁酸的測(cè)試條，該測(cè)試條并不受氯離子抑制。在8.5或較小的PH下進(jìn)行反應(yīng)可克服尿液中存在的其它物質(zhì)如sulfahydryl藥物的干擾。因此，本發(fā)明研究的用于檢測(cè)通常比乙酰乙酸高3-4倍的β-羥丁酸的測(cè)試條能成功地對(duì)攝入低卡路里飲食的人體或患有糖尿病的患者的尿進(jìn)行檢測(cè)。所以，本發(fā)明的用于β-羥丁酸的測(cè)試條比市售的用于酮測(cè)量的測(cè)試條要靈敏的多，所述市售測(cè)試條僅僅測(cè)量少量組分，即乙酰乙酸和丙酮。其它的用于檢測(cè)β-羥丁酸的比色法采用混合于載體基質(zhì)中的ELLman’s試劑、β-羥丁酸脫氫酶、硫辛酰胺脫氫酶，D，L-硫辛酰胺脫氫酶和NAD檢測(cè)β-羥丁酸(Magers的美國專利5,190,863，，Magers的美國專利5,326,697，Magers的美國專利5,510,245)。這些方法需要一些復(fù)雜的系統(tǒng)，對(duì)于通常應(yīng)用來說不具備成本效益，并且對(duì)于減重過程沒有顯示出潛在的應(yīng)用。這些方法中產(chǎn)生的信號(hào)通常是一種顏色。以電流的改變檢測(cè)NADH的電化學(xué)傳感器可購自Aboott(Medisense)，AbbottPark，Chicago，III，其用于糖尿病患者的酮癥酸中毒的檢測(cè)。近來，人們嘗試將這種裝置采用全血用于減重過程中(Byrne等，2000，Diabetescare，23，500-503)。然而，這樣的裝置不能顯色，也不能基于儀器，因此，不便于家庭使用，尤其不能用于減重過程。另外，如前所述，非侵入性樣品將是優(yōu)選的樣品，當(dāng)尿液作為樣品時(shí)，上面的電化學(xué)裝置是不起作用的。因而，除了本發(fā)明之外，目前沒有一種靈敏的、易于使用的檢測(cè)顏色的固相裝置用于測(cè)量減重過程中的脂肪損耗。令人驚奇的是，經(jīng)發(fā)現(xiàn)，依照本發(fā)明的測(cè)試條——即檢測(cè)TKB的測(cè)試條，檢測(cè)β-羥丁酸和乙酰乙酸的測(cè)試條和僅僅檢測(cè)β-羥丁酸的測(cè)試條是非常靈敏的，顯示陽性顏色。當(dāng)人們攝入1000-1500熱卡平衡飲食時(shí)，將上述測(cè)試條浸入每天的尿中，它們能檢測(cè)微量或少量的脂肪代謝中的酮體，而市場(chǎng)上供應(yīng)的檢測(cè)乙酰乙酸的測(cè)試條是陰性的。實(shí)施例1用于一步檢測(cè)總酮體也就是所有三種組分(β-羥丁酸、乙酰乙酸和丙酮)的方法和測(cè)試裝置。作為例子，該制劑含有β-羥丁酸脫氫酶(HBD)和NAD，在pH8.0下將β-羥丁酸轉(zhuǎn)化成乙酰乙酸，并且“轉(zhuǎn)化的乙酰乙酸“和內(nèi)源性乙酰乙酸及丙酮采用硝普鹽反應(yīng)來檢測(cè)(轉(zhuǎn)化的+內(nèi)源性的)該制劑包括Tris-緩沖液，pH8.01Mβ-羥丁酸脫氫酶100U/mlNAD3％硝普鈉5％七水合硫酸鎂30％將濾紙如Whatman-54浸入到上述制劑中，然后在烘箱中于45℃干燥20分鐘。用雙面膠將”的上述紙粘合至12”長(zhǎng)且3”高的聚苯乙烯卡的底部從而得到所述測(cè)試條。所述卡被縱向切成48條”×3”高的測(cè)試條。用于檢測(cè)總酮體的測(cè)試條檢測(cè)生物液體。這些測(cè)試條被稱之為“TKB”。實(shí)施例6中顯示了在減重過程中TKB的應(yīng)用。代替硝普鹽，乙酰乙酸也能采用公知的重氮鹽檢測(cè)，其在645nm波長(zhǎng)處產(chǎn)生顏色。實(shí)施例2以循環(huán)形式同時(shí)檢測(cè)β-羥丁酸和乙酰乙酸的方法和裝置制劑中含有pH為8.0的β-羥丁酸脫氫酶、NAD、NBT和黃遞酶。Tris-鹽酸，pH8.00.1Mβ-羥丁酸脫氫酶200U/mlNAD3％NBT0.2％黃遞酶10U/ml鹽酸鎂0.1％surfonyl0.06％將濾紙如Whatman-54浸入到上述制劑中，然后在烘箱中于45℃干燥20分鐘。用雙面膠將”的上述紙粘合至12”長(zhǎng)且3”高的聚苯乙烯卡的底部從而得到所述測(cè)試條。所述卡被縱向切成48條”×3”高的測(cè)試條。測(cè)試條用于檢測(cè)生物液體。這些同時(shí)檢測(cè)β-羥丁酸和乙酰乙酸的測(cè)試條被稱之為“HB&AA”，它在減重過程中的應(yīng)用參見實(shí)施例6。實(shí)施例3單獨(dú)檢測(cè)從減重過程獲得的樣品的血清(血液)中的β-羥丁酸的方法和裝置，其采用正常濃度的HBD，與市售的GDSTechnologyInc.公司的Ketosite_似。該制劑含有pH為8.6的正常水平的β-羥丁酸脫氫酶(2-5U/ml)、NAD、NBT和黃遞酶。β-羥丁酸脫氫酶15U/ml-2U每測(cè)試條(假單胞菌屬)NAD3％NBT0.2％黃遞酶30U/ml鹽酸鎂0.1％surfonyl0.05％Tris-鹽酸，pH8.60.1M將濾紙如Whatman-54浸入到上述制劑中，然后在烘箱中于45℃干燥20分鐘。用雙面膠將”的上述紙粘合至12”長(zhǎng)且3”高的聚苯乙烯卡的底部從而得到所述測(cè)試條。所述卡被縱向切成48條”×3”高的測(cè)試條。測(cè)試條用于檢測(cè)生物液體。這些用正常濃度的β-羥丁酸脫氫酶來只檢測(cè)的β-羥丁酸的測(cè)試條被稱之為“HB-L”。如表1所示，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)HB-L測(cè)試條和Ketosite均可以對(duì)來自進(jìn)行減重過程的人體的樣品進(jìn)行一分鐘測(cè)試，檢測(cè)血清(血液)中的β-羥丁酸。紫色的相對(duì)亮度以“+”號(hào)表示，沒有顏色以“-”號(hào)表示。表1與表1中顯示的血清樣品不同，當(dāng)浸入尿液中時(shí)，含有類似濃度的β-羥丁酸的尿液不顯色(一分鐘后)，或者在高濃度的β-羥丁酸下顯示非常淡的顏色(表2)。紫色的相對(duì)亮度以“+”號(hào)表示，沒有顏色以“-”號(hào)表示。表2實(shí)施例4單獨(dú)檢測(cè)尿中β-羥丁酸的方法和裝置測(cè)試條中含有高含量的β-羥丁酸脫氫酶(200U/ml)，而制劑中的其它組分類似于實(shí)施例3中所示。β-羥丁酸脫氫酶200U/ml(假單胞菌屬)NAD3％NBT0.2％黃遞酶30U/ml鹽酸鎂0.1％surfonyl0.05％Tris-鹽酸，pH8.60.1M將濾紙如Whatman-54浸入到上述制劑中，然后在烘箱中于45℃干燥20分鐘。用雙面膠將”的上述紙粘合至12”長(zhǎng)且3”高的聚苯乙烯卡的底部從而得到所述測(cè)試條。所述卡被縱向切成48條”×3”高的測(cè)試條。測(cè)試條用于檢測(cè)生物液體。這些含有高濃度β-羥丁酸脫氫酶(即每條含一單位或更多，其中1單位為在pH為8.5且30℃下1U/ml基質(zhì)每分鐘被氧化的量)的用于單獨(dú)檢測(cè)β-羥丁酸的測(cè)試條被稱之為“HB-H”。如表3中所示，采用HB-H測(cè)試條超過了表2中所示的尿樣檢測(cè)的靈敏度。進(jìn)一步地，HB-H測(cè)試條在減重過程中的應(yīng)用參見實(shí)施例6。表3實(shí)施例5采用不受氯離子抑制的β-羥丁酸脫氫酶(產(chǎn)堿桿菌屬)檢測(cè)尿中β-羥丁酸的方法。β-羥丁酸脫氫酶15U/ml(來源于產(chǎn)堿桿菌屬)NAD3％NBT0.2％黃遞酶30U/ml鹽酸鎂0.1％surfonyl0.05％Tris-鹽酸，pH8.60.1M將濾紙如Whatman-54浸入到上述制劑中，然后在烘箱中于45℃干燥20分鐘。用雙面膠將”的上述紙粘合至12”長(zhǎng)且3”高的聚苯乙烯卡的底部從而得到所述測(cè)試條。所述卡被縱向切成48條”×3”高的測(cè)試條。測(cè)試條用于檢測(cè)生物液體。這些采用β-羥丁酸且對(duì)氯離子不靈敏的測(cè)試條被稱之為“HB-L-A”。含有正常濃度β-羥丁酸脫氫酶的HB-L-A測(cè)試條可用于檢測(cè)尿中的β-羥丁酸，與HB-H測(cè)試條類似，但不同于HB-L測(cè)試條或Ketosite測(cè)試條(表4)。在浸入尿中1分鐘后檢測(cè)顏色。表4實(shí)施例6測(cè)試條在減重過程中的應(yīng)用測(cè)試條TKB(實(shí)施例1描述的)檢測(cè)總酮體，HB&AA(實(shí)施例2描述的)用于在循環(huán)方法中一步同時(shí)檢測(cè)β-羥丁酸和乙酰乙酸，HB-H(如實(shí)施例4描述的)單獨(dú)檢測(cè)β-羥丁酸，及市售的檢測(cè)乙酰乙酸(AA)的測(cè)試條(來自BayerDiagnostics，Elkhart，Indiana公司的KetoStix_)都被用于減重過程中。這些測(cè)試條用于檢測(cè)來自攝入不同的1000-1500卡飲食的人體的每天的早晨樣品中，持續(xù)20天。將這些測(cè)試條浸入尿中，一分鐘后，以半定量方式視覺檢測(cè)顏色。飲食1含有大約30％的碳水化合物、40％的脂肪及30％的蛋白質(zhì)，結(jié)果顯示在表5中。飲食2含有大約40％的碳水化物、30％的脂肪和30％的蛋白質(zhì)，結(jié)果顯示在表6中。飲食3含有大約50％的碳水化物、20-25％的脂肪及20-25％的蛋白質(zhì)，結(jié)果顯示在表7中。飲食4，與Atkin’s飲食類似，為低碳水化合物和高蛋白質(zhì)，含有大約10％的碳水化合物、40-50％的脂肪及30-40％的蛋白質(zhì)，結(jié)果顯示在表8中。如表5、6、7和8所示，所有三種測(cè)試條(TKB，HB&AA，HB-H)都對(duì)低水平的酮體顯示出陽性顏色，而市售的測(cè)試條只能檢測(cè)乙酰乙酸和丙酮(AA)，且對(duì)飲食4以外的都顯示陰性。與AA測(cè)試條相比，對(duì)于高脂肪、低碳水化合物，所有的三種測(cè)試條均顯示較高的亮度(表8)。表5飲食1表6飲食2表7飲食3表8飲食4顯然，可在不脫離其精神和范圍的情況下，對(duì)上文中闡述的本發(fā)明進(jìn)行多種修改和變化，因此，所述限制僅僅如權(quán)利要求書所述。本文中所有引用的文獻(xiàn)在本文中結(jié)合并參考。權(quán)利要求1.檢測(cè)處于減重過程中患者脂肪損耗進(jìn)展的方法，其包括用固體測(cè)試條接觸所述患者的體液樣品，獲得所述體液中存在的β-羥丁酸的顏色指示，可任選包括乙酰乙酸和/或丙酮。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的體液為選自由尿液、血液、血清和唾液構(gòu)成的組中的一種。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述的固體測(cè)試條包括(a)支撐層；和(b)位于所述支撐層上的試劑層，所述試劑層包括i)β-羥丁酸脫氫酶(β-HBD)，ii)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，iii)四唑鎓染料前體，和iv)能轉(zhuǎn)運(yùn)電子到所述染色前體以引起顏色改變的電子介質(zhì)。4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述的β-HBD為不受氯離子抑制的酶。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述的β-HBD來源于假單胞菌屬或產(chǎn)堿桿菌屬。6.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述的電子介質(zhì)是選自由黃遞酶、二甲基吩嗪鎓甲基硫酸鹽(PMS)和1-甲氧基-5-甲基二甲基吩嗪鎓甲基硫酸鹽(1-甲氧基PMS)構(gòu)成的組中的一種。7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的四唑鎓染料前體是選自包括2-(2’苯并噻唑基)-5-苯乙烯基-3-(4’-鄰苯二甲酰肼基)四唑鎓(BSPT)、2’苯并噻唑基-(2)-3，5-二苯基四唑(BTDP)、2，3-二(4-硝基苯)四唑鎓(DNP)、2，5-二苯基-3-(4-苯乙烯基苯基)四唑鎓(DPSP)、二苯乙烯基氮藍(lán)四唑鎓(DS-NBT)、3，3’-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-二苯基)-4，4′-二基]-二[2-(4-硝基苯)-5-苯基(2H四唑鎓)(NBT)、3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓(MTT)、2-苯基-3-(4-羧苯基)-5-甲基-四唑鎓(PCPM)、四唑鎓藍(lán)(TB)、硫代氨基甲酰氮藍(lán)四唑鎓(TCNBT)、四氮藍(lán)四唑鎓(TNBT)、四唑鎓紫(TV)、2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)-5-[4-(2-硫代-乙基氨基甲酰基)苯基]2H-四唑鎓(WST-4)和2，2’-二苯并噻唑基5，5’-二[4，二(2-硫代乙基)氨基甲?；交鵠-3，3’-(3，3’-二甲氧基-4，4’)-二亞苯基]二四唑鎓及其二鈉鹽(WST-5)的組中的一種。8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述的黃遞酶為硫辛酸脫氫酶、鐵氧化還原蛋白-NADP還原酶或硫辛酰胺脫氫酶。9.檢測(cè)樣品中β-羥丁酸和乙酰乙酸的方法，其包括b)用含有β-羥丁酸脫氫酶(β-HBD)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的組合物在PH低于8.5的條件下接觸樣品，其中(iv)β-羥丁酸(β-HB)與NAD反應(yīng)生成乙酰乙酸和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，(v)在β-HBD存在下，(i)中生成的部分NADH與乙酰乙酸反應(yīng)生成β-HB，和(vi)(i)中生成的部分NADH轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)；并且c)檢測(cè)所述有色物質(zhì)的存在。10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述樣品是患者的體液。11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述體液選自由尿、血液、血清和唾液構(gòu)成的組中的一種。12.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述的β-HBD為不受氯離子抑制的酶。13.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述的β-HBD來源于假單胞菌屬或產(chǎn)堿桿菌屬。14.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述的組合物進(jìn)一步包括四唑鎓染料前體，以及選自由黃遞酶、二甲基吩嗪鎓甲基硫酸鹽(PMS)和1-甲氧基-5-甲基二甲基吩嗪鎓甲基硫酸鹽(1-甲氧基PMS)構(gòu)成的組中的電子介質(zhì)，其中在所述電子介質(zhì)存在下，所述NADH與四唑鎓染料前體反應(yīng)生產(chǎn)還原的四唑鎓染料，并轉(zhuǎn)化成有色物質(zhì)，所述被檢測(cè)的有色物質(zhì)就是所述的還原四唑鎓染料。15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述的四唑鎓染料前體是選自包括2-(2’苯并噻唑基)-5-苯乙烯基-3-(4’-鄰苯二甲酰肼基)四唑鎓(BSPT)、2’苯并噻唑基-(2)-3，5-二苯基四唑鎓(BTDP)、2，3-二(4-硝基苯)四唑鎓(DNP)、2，5-二苯基-3-(4-苯乙烯基苯基)四唑鎓(DPSP)、二苯乙烯基氮藍(lán)四唑鎓(DS-NBT)、3，3’-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-二苯基)-4，4′-二基]-二[2-(4-硝基苯)-5-苯基(2H四唑鎓)(NBT)、3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓(MTT)、2-苯基-3-(4-羧苯基)-5-甲基-四唑鎓(PCPM)、四唑鎓藍(lán)(TB)、硫代氨基甲酰氮藍(lán)四唑鎓(TCNBT)、四氮藍(lán)四唑鎓(TNBT)、四唑鎓紫(TV)、2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)-5-[4-(2-硫代-乙基氨基甲?；?苯基]2H-四唑鎓(WST-4)和2，2’-二苯并噻唑基-5，5’-二[4，二(2-硫代乙基)氨基甲?；交鵠-3，3’-(3，3’-二甲氧基-4，4’)-二亞苯基]二四唑鎓及其二鈉鹽(WST-5)的組中的一種。16.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述的黃遞酶為硫辛酸脫氫酶、鐵氧化還原蛋白-NADP還原酶或硫辛酰胺脫氫酶。17.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述的檢測(cè)用于監(jiān)測(cè)處于減重過程中患者的脂肪損耗。18.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述的檢測(cè)用于治療包括由糖尿病、心血管疾病和癲癇構(gòu)成的組中的一種疾病。19.檢測(cè)樣品中β-羥丁酸和任選的乙酰乙酸的測(cè)試條，所述測(cè)試條包括(c)支撐層；和(d)位于所述支撐層上的試劑層，所述試劑層包括iv)β-羥丁酸脫氫酶(β-HBD)，v)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，vi)四唑鎓染料前體，和vii)電子介質(zhì)。20.根據(jù)權(quán)利要求19的測(cè)試條，其中所述的β-HBD為不受氯離子抑制的酶。21.根據(jù)權(quán)利要求19的測(cè)試條，其中所述的β-HBD來源于假單胞菌屬或產(chǎn)堿桿菌屬。22.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述的電子介質(zhì)是選自包括黃遞酶、二甲基吩嗪鎓甲基硫酸鹽(PMS)和1-甲氧基-5-甲基二甲基吩嗪鎓甲基硫酸鹽(1-甲氧基PMS)的組中的一種。23.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述的四唑鎓染料前體是選自包括2-(2’苯并噻唑基)-5-苯乙烯基-3-(4’-鄰苯二甲酰肼基)四唑鎓(BSPT)、2’苯并噻唑基-(2)-3，5-二苯基四唑鎓(BTDP)、2，3-二(4-硝基苯)四唑鎓(DNP)、2，5-二苯基-3-(4-苯乙烯基苯基)四唑鎓(DPSP)、二苯乙烯基氮藍(lán)四唑鎓(DS-NBT)、3，3’-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-二苯基)-4，4′-二基]-二[2-(4-硝基苯)-5-苯基(2H四唑鎓)(NBT)、3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓(MTT)、2-苯基-3-(4-羧苯基)-5-甲基-四唑鎓(PCPM)、四唑鎓藍(lán)(TB)、硫代氨基甲酰氮藍(lán)四唑鎓(TCNBT)、四氮藍(lán)四唑鎓(TNBT)、四唑鎓紫(TV)、2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)-5-[4-(2-硫代-乙基氨基甲?；?苯基]2H-四唑鎓(WST-4)和2，2’-二苯并噻唑基-5，5’-二[4，二(2-硫代乙基)氨基甲?；交鵠-3，3’-(3，3’-二甲氧基-4，4’)-二亞苯基]二四唑鎓及其二鈉鹽(WST-5)的組中的一種。24.根據(jù)權(quán)利要求22的測(cè)試條，其中所述的黃遞酶為硫辛酸脫氫酶、鐵氧化還原蛋白-NADP還原酶或硫辛酰胺脫氫酶。25.根據(jù)權(quán)利要求19的測(cè)試條，其中所述試劑層中含有的β-HBD的量為每測(cè)試條1單位和更多，其中1單位所述的酶等同于在30℃下以及PH為8.5時(shí)氧化1μmol基質(zhì)所需的量。26.根據(jù)權(quán)利要求19的測(cè)試條，其中所述試劑層進(jìn)一步含有緩沖劑，所述緩沖劑的量能使所述試劑層的pH為8.5或更低。27.檢測(cè)樣品中包括β-羥丁酸、乙酰乙酸和丙酮的總酮體的測(cè)試條的方法，其包括a)用固體測(cè)試條接觸樣品，所述固體測(cè)試條包括i)支撐層；和ii)位于所述支撐層上的試劑層，所述試劑層包括β-羥丁酸脫氫酶(β-HBD)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、和選自黃遞酶和重氮鹽的檢測(cè)物，從而β-HB與NAD反應(yīng)生成乙酰乙酸，所述乙酰乙酸與所述的檢測(cè)物反應(yīng)，發(fā)生顏色改變；以及b)檢測(cè)所述顏色改變的存在。28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述重氮鹽是4-硝基苯重氮四氟硼酸鹽。29.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述的樣品為患者的體液。30.權(quán)利要求29的方法，其中所述的體液為選自包括尿液、血液、血清和唾液的組中的一種。31.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述檢測(cè)用于監(jiān)測(cè)處于減重過程中的患者的脂肪損耗。32.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述檢測(cè)用于治療選自由糖尿病、心血管疾病和癲癇構(gòu)成組中的一種疾病。33.檢測(cè)樣品中包括β-羥丁酸、乙酰乙酸和丙酮的總酮體的測(cè)試條，其包括(a)支撐層；和(b)位于所述支撐層上的試劑層，所述試劑層包括i)β-羥丁酸脫氫酶(β-HBD)，ii)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，iii)硝普鹽或重氮鹽。34.根據(jù)權(quán)利要求33的測(cè)試條，其中所述β-HBD為不受氯離子抑制的酶。35.根據(jù)權(quán)利要求33的測(cè)試條，其中所述β-HBD來源于假單胞菌屬或產(chǎn)堿桿菌屬。全文摘要監(jiān)測(cè)處于減重過程中患者脂肪損耗進(jìn)展的方法，其包括用固體測(cè)試條接觸所述患者的體液樣品，獲得所述體液中存在的β－羥丁酸的顏色指示，可選擇地，還包括乙酰乙酸和/或丙酮。文檔編號(hào)C12N1/00GK1643160SQ03807223公開日2005年7月20日申請(qǐng)日期2003年2月3日優(yōu)先權(quán)日2002年2月4日發(fā)明者S·K·古普塔申請(qǐng)人:環(huán)球健康檢查股份有限公司