一種基于酶固定化的酵母發(fā)酵生產(chǎn)低聚乳果糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及低聚乳果糖的生產(chǎn)方法。
技術(shù)背景
[0002]低聚乳果糖自1990年開(kāi)發(fā)以來(lái)，在日本被廣泛認(rèn)可并迅猛發(fā)展。2005年調(diào)查表明，低聚乳果糖已成為日本第三大功能性低聚糖消費(fèi)品。近年來(lái)許多研宄者發(fā)現(xiàn)低聚乳果糖具有許多特定的生理功能，有望成為繼低聚果糖、低聚半乳糖后又一種被全球認(rèn)可的功能性食品添加劑。但是由于大部分微生物的呋喃果糖苷酶產(chǎn)量較低以及合成過(guò)程中的一些技術(shù)壁皇，目前只有日本鹽水港精糖株式會(huì)社能夠規(guī)?；a(chǎn)。
[0003]低聚乳果糖在國(guó)內(nèi)尚未實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，主要原因是節(jié)桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶水平較低，發(fā)酵機(jī)制不清楚，β -呋喃果糖苷酶生產(chǎn)成本較高，以及酶促反應(yīng)合成產(chǎn)率低，低聚乳果糖純化較為困難等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種基于酶固定化的酵母發(fā)酵生產(chǎn)低聚乳果糖的方法，通過(guò)提高節(jié)桿菌產(chǎn)出的呋喃果糖苷酶的酶活和底物利用率，以及減少產(chǎn)低聚乳果糖過(guò)程中的副產(chǎn)物，來(lái)提高低聚乳果糖的濃度和純度。
[0005]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。
[0006](I)在260-280X 103U/L的酶液中加入甘露醇至甘露醇終濃度為l-2mmol/L ;然后按混合酶液:海藻酸鈉溶液體積比為1: 1-2的比例與濃度為2.4-2.8g/L的海藻酸鈉溶液混合，再按1:2-3的體積比滴入到濃度為0.5-0.8mol/L的氯化鈣溶液中，固定40_50min，過(guò)濾后放入質(zhì)量百分比為7-8%雙醛淀粉溶液中交聯(lián)，在25-30°C下進(jìn)行交聯(lián)15-20min，得到固定化酶。
[0007](2)將羅倫隱球酵母置于YPD培養(yǎng)基經(jīng)200 r/min,30 °C、pH7.0培養(yǎng)24 h，然后3000r/min離心lOmin，并用水洗滌2次，回收得到酵母菌。
[0008](3)將蔗糖和乳糖按1:1的質(zhì)量比，配成580-680 mmol/L溶液，按1:1.5-2的體積比與步驟(I)中的固定化酶混合，在PH6-7，溫度25-30°C條件下反應(yīng)，反應(yīng)至Il_12h時(shí)加入1-2%質(zhì)量比的步驟(2)得到的酵母菌，共反應(yīng)24 h，沸水浴滅酶20 min終止反應(yīng)。
[0009]本發(fā)明步驟(I)所述的酶為β -呋喃果糖苷酶。
[0010]本發(fā)明步驟(2)得到的酵母菌缺少分解蔗糖的酶。
[0011]本發(fā)明與不加酵母酶法合成低聚乳果糖相比，低聚乳果糖濃度提高到160_165g/L ;乳糖轉(zhuǎn)化率提高了 30-33%，提高原料利用率降低生產(chǎn)成本；低聚乳果糖最終含量提高到了 54-58%，減少了后續(xù)產(chǎn)品純化成本。同時(shí)該方法可以推廣到酶法合成低聚糖中副產(chǎn)物以葡萄糖(單糖)為主的反應(yīng)中使用，如低聚半乳糖、低聚果糖等。
【具體實(shí)施方式】
[0012]本發(fā)明將通過(guò)以下實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0013]本發(fā)明實(shí)施例涉及以下技術(shù)內(nèi)容。
[0014](I) β-呋喃果糖苷酶酶活。
[0015]β -呋喃果糖苷酶酶液制備:節(jié)桿菌發(fā)酵結(jié)束后，將培養(yǎng)液以轉(zhuǎn)速4000 r/min離心20 min，將上清液至于-20 ° C冷藏；24 h后取出常溫解凍，部分未去除的菌體因細(xì)胞腫脹而死亡，再以轉(zhuǎn)速4000 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min后上清液即為β-呋喃果糖苷酶酶液。
[0016]β -呋喃果糖苷酶酶活定義:將2 mL的β -呋喃果糖苷酶酶液和5mL的糖液(含30%的蔗糖與30%的乳糖，pH 7.0)于37。C反應(yīng)，一個(gè)酶活力單位定義為每分鐘產(chǎn)生10_9mol低聚乳果糖的量來(lái)表示。
[0017](2)低聚乳果糖的測(cè)定。
[0018]低聚乳果糖的測(cè)定采用HPLC，HPLC色譜條件:色譜柱！Kromasil氨基柱(250mmX4.6 mmX5 mm);流動(dòng)相:乙腈-水(75:25);流速:1 mL/min ;漂移管溫度:70 ° C ;柱溫:30。Co標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的方程:濃度范圍為0.1281-4.1 mg/mL，InS = 1.0181nC+6.134 ;相關(guān)系數(shù) R2= 0.9997。
[0019](3)殘?zhí)堑臏y(cè)定。
[0020]采用蒽酮比色法，取測(cè)發(fā)酵液離心后上清液I mL，加入4 mL新配制的蒽酮試劑(2g/L)，混勻后蓋塞冰浴，后沸水浴10 min，冷卻后在620nm處測(cè)吸光值。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的方程為:y=0.0091X+0.0124 ;濃度范圍為 10-100 mg/L，相關(guān)系數(shù) R2= 0.9996。
[0021]實(shí)施例1。
[0022]a.在260 U/mL的β -呋喃果糖苷酶中加入甘露醇至甘露醇終濃度為lmmol/L ;然后按混合酶液:海藻酸鈉溶液體積比為1:1的比例與濃度為2.5g/L的海藻酸鈉溶液混合，再按1:2的體積比滴入到濃度為0.5 mo I/L的氯化鈣溶液中，固定40_50min，過(guò)濾后放入質(zhì)量百分比為8%雙醛淀粉溶液中交聯(lián)，在25-30°C下進(jìn)行交聯(lián)15-20min，得到固定化酶。
[0023]b.將羅倫隱球酵母置于Yro培養(yǎng)基經(jīng)200 r/min,30 °C、pH7.0培養(yǎng)24 h，然后3000r/min離心lOmin，并用水洗滌2次，回收得到酵母菌。
[0024]c.600 mmol/L的鹿糖和乳糖與a中的固定酶以1: 1.5的體積比混合，在pH6-7，溫度25-30°C條件下反應(yīng)，在反應(yīng)到11.5h時(shí)加入1.4%質(zhì)量比的b中得到的酵母菌，反應(yīng)24 h后經(jīng)沸水浴滅酶20 min終止反應(yīng)。
[0025]最終低聚乳果糖含量為158.75 g/L,產(chǎn)率50.67%，乳糖轉(zhuǎn)化率57.52%。加入酵母合成低聚乳果糖最終產(chǎn)物葡萄糖從60.48 g/L下降到1.88 g/L。
[0026]實(shí)施例2。
[0027]a.在280 U/mL的β -呋喃果糖苷酶加入甘露醇至甘露醇終濃度為2mmol/L ;然后按混合酶液:海藻酸鈉溶液體積比為1:1的比例與濃度為2.8g/L的海藻酸鈉溶液混合，再按1:2的體積比滴入到濃度為0.6 mol/L的氯化媽溶液中，固定40_50min，過(guò)濾后放入質(zhì)量百分比為7%雙醛淀粉溶液中交聯(lián)，在25-30°C下進(jìn)行交聯(lián)15-20min，得到固定化酶。
[0028]b.將羅倫隱球酵母置于Yro培養(yǎng)基經(jīng)200 r/min,30 °C、pH7.0培養(yǎng)24 h，然后3000r/min離心lOmin，并用水洗滌2次，回收得到酵母菌。
[0029]c.650 mmol/L的鹿糖和乳糖與a中的固定酶以1: 1.5的體積比混合，在pH6-7，溫度25-30°C條件下反應(yīng)，在反應(yīng)到11.5h時(shí)加入1.6%質(zhì)量比的b中得到的酵母菌，反應(yīng)24 h后經(jīng)沸水浴滅酶20 min終止反應(yīng)。
[0030]最終低聚乳果糖含量為155.76 g/L，產(chǎn)率50.11%，乳糖轉(zhuǎn)化率55.35%。加入酵母合成低聚乳果糖最終產(chǎn)物葡萄糖從60.48 g/L下降到1.57 g/L。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種基于酶固定化的酵母發(fā)酵生產(chǎn)低聚乳果糖的方法，其特征是包括以下步驟: (1)在260-280X103U/L的酶液中加入甘露醇至甘露醇終濃度為l-2mmol/L ;然后按混合酶液:海藻酸鈉溶液體積比為1: 1-2的比例與濃度為2.4-2.8g/L的海藻酸鈉溶液混合，再按1:2-3的體積比滴入到濃度為0.5-0.8mol/L的氯化鈣溶液中，固定40_50min，過(guò)濾后放入質(zhì)量百分比為7-8%雙醛淀粉溶液中交聯(lián)，在25-30°C下進(jìn)行交聯(lián)15-20min，得到固定化酶； (2)將羅倫隱球酵母置于Yro培養(yǎng)基經(jīng)200r/min、30。C、ρΗ7.0培養(yǎng)24 h，然后3000r/min離心lOmin，并用水洗滌2次，回收得到酵母菌體； (3)將蔗糖和乳糖按1:1的質(zhì)量比，配成580-680 mmol/L溶液，按1: 1.5_2的體積比與步驟(I)中的固定化酶混合，在pH6-7，25-30°C條件下進(jìn)行反應(yīng)，在反應(yīng)至ll_12h時(shí)加入1-2%質(zhì)量比的步驟(2)得到的酵母菌體，共反應(yīng)24 h，經(jīng)沸水浴滅酶20 min終止反應(yīng)； 步驟(I)所述的酶為β-呋喃果糖苷酶。
【專(zhuān)利摘要】一種基于酶固定化的酵母發(fā)酵生產(chǎn)低聚乳果糖的方法，包括以下步驟：（1）260-280×103U/L的β-呋喃果糖苷酶液加甘露醇至甘露醇終濃度1-2mmol/L；按1:1-2體積比與2.4-2.8g/L海藻酸鈉混合，按1:2-3體積比滴入0.5-0.8mol/L氯化鈣，固定40-50min，過(guò)濾后放入質(zhì)量比7-8%的雙醛淀粉溶液中交聯(lián)15-20min，得固定化酶；（2）羅倫隱球酵母于YPD培養(yǎng)基，30℃，200r/min，pH7.0培養(yǎng)24h，離心，水洗回收酵母；（3）蔗糖和乳糖1:1質(zhì)量比配成580-680mmol/L溶液，按1:1.5-2體積比與（1）中的酶混合，pH6-7，25-30℃反應(yīng)24h，在11-12h時(shí)加入1-2%質(zhì)量比（2）中的酵母，沸水浴終止反應(yīng)。本發(fā)明低聚乳果糖含量54-58%，濃度160-165g/L，乳糖轉(zhuǎn)化率56-58%，可減少產(chǎn)品純化成本。
【IPC分類(lèi)】C12N11-10, C12P19-14, C12R1-645, C12N11-04
【公開(kāi)號(hào)】CN104630306
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410801899
【發(fā)明人】阮征, 米書(shū)梅, 印遇龍, 江波, 周艷, 鄧澤元
【申請(qǐng)人】南昌大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年5月20日
【申請(qǐng)日】2014年12月23日