專(zhuān)利名稱：具有cAMP生成活性的新肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的并且有用的肽、編碼這些肽的基因以及含有這些肽的藥物組合物。更具體地，本發(fā)明涉及具有(1)到(10)特性的肽；(1)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，(2)強(qiáng)烈地作用于降鈣素受體，(3)促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生cAMP，(4)以濃度-依賴的方式結(jié)合鈉離子，(5)抑制鈣離子的吸收，以及(6)抑制細(xì)胞增殖；編碼這些肽的基因；以及含有這些肽的藥物組合物。
背景技術(shù)：
降鈣素，一種已知的肽，是含有32個(gè)氨基酸的肽激素。在哺乳動(dòng)物中，其由甲狀腺的C細(xì)胞分泌且具有降低血液中鈣濃度的功能。其已被用作諸如血鈣過(guò)多和代謝性骨病的治療劑?，F(xiàn)在人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到降鈣素存在于外周系統(tǒng)諸如甲狀腺而并非存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。與上述相反，降鈣素受體存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。既然是這樣，人們期望能揭示降鈣素受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的存在以及功能的重要性。
降鈣素基因-相關(guān)肽(CGRF)是含有37個(gè)氨基酸的肽，所述氨基酸是通過(guò)如下的方式產(chǎn)生的其mRNA通過(guò)可變剪接機(jī)制獲自與降鈣素相同的基因。降鈣素基因-相關(guān)肽(CGRP)也具有與降鈣素相同的功能，即減少血液中的鈣濃度。此外，其激活鈣離子通道并增加乙酰膽堿受體的數(shù)量，表明了其為神經(jīng)遞質(zhì)的可能性?，F(xiàn)在已有報(bào)道OGRP主要位于向心感覺(jué)神經(jīng)和中樞神經(jīng)中(Goodman等，Life Sci.382169-2178(1986)；Poyner，D.R.Pharmac.Ther.5623-51(1992))，且主要具有激活腺苷酸環(huán)化酶的作用。已經(jīng)報(bào)道了CGRF的多種功能，包括擴(kuò)張外周和腦血管(Brain等，Nature31354-5681985))，增加心率(Sigrist等，Endocrinology 119381(1986))，調(diào)節(jié)鈣代謝作用(Grunditz等，Endocrinology 1192313-2324(1986))，導(dǎo)致較少的腸運(yùn)動(dòng)(Fargeas等，Peptides 61167-1171(1985))，調(diào)節(jié)葡萄糖代謝(降低胰島素分泌和胰島素敏感性)(Hermansen等，Peg.Peptides 27149-157(1990))，抑制食欲(Molina等，Diabetes 39260-265(1990))以及抑制生長(zhǎng)激素的釋放(Tannenbaum等，Endocrinology，1162685-2687(1985))。
CGRP受體也已被人們所知位于腦、心血管系統(tǒng)、內(nèi)皮的和平滑肌細(xì)胞中。
同樣已報(bào)道了關(guān)于合成的降鈣素受體-結(jié)合化合物的發(fā)明，所述的化合物的特征在于具有小于大約10,000道爾頓的分子量且形成與放射性強(qiáng)度金屬螯合劑共價(jià)連接的試劑，其中所述試劑與降鈣素受體具有的結(jié)合親合性高于放射性強(qiáng)度天然降鈣素與降鈣素受體結(jié)合親合性(PCT申請(qǐng)No.2001/523,257的公開(kāi)的日文譯文)；含有嘧啶衍生物的降鈣素受體活性物質(zhì)(未審查的專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No.2001/294,574)；人降鈣素基因-相關(guān)肽受體組分因子(OGRP-RCF)(的多核苷酸和多肽未審查的專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No.10/201,482)，等等。

發(fā)明內(nèi)容
目前仍沒(méi)有證實(shí)這些肽直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)降鈣素受體，所以需要直接并且更強(qiáng)烈地作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中降鈣素受體的肽。
本發(fā)明的目的是提供新的并且有用的肽，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)且作用于降鈣素受體，本發(fā)明還提供了編碼這些肽的基因以及含有所述肽的藥物組合物。
本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)通過(guò)利用中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生cAMP的能力作為指標(biāo)研究了新的生理活性肽，且因此分離和純化的新肽被認(rèn)為通過(guò)降鈣素受體作用于細(xì)胞。這種肽結(jié)構(gòu)的序列已通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)(Genbank，swissprot，DDBJ)檢索結(jié)果被證實(shí)是新的。因?yàn)樗鼈冏饔糜诮碘}素受體，本發(fā)明的發(fā)明人將該新肽命名為降鈣素受體-刺激肽(CRSP)。
因此，本發(fā)明涉及至少具有下述氨基酸序列的肽Ser-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Met-Thr-His-10Arg-Leu-Val-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-20Ser-Met-Val-Arg-Ser-Asn-Leu-Leu-Pro-Thr-30Lys-Met-Gly-Phe-Lys-Val-Phe-Gly 38或其部分氨基酸被缺失、取代或添加的氨基酸序列，并具有以下特性(1)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，(2)強(qiáng)烈地作用于降鈣素受體以及(3)促進(jìn)細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)能力，更優(yōu)選地，(4)以濃度-信賴的方式結(jié)合鈉離子，(5)抑制鈣離子的吸收，以及(6)抑制細(xì)胞增殖。
更具體地，本發(fā)明涉及上述的具有序列表SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO9，SEQ ID NO12，SEQ ID NO16或SEQ ID NO19所示氨基酸序列，或具有其中部分氨基酸被缺失，取代或添加的氨基酸序列，以及與所述氨基酸序列具有75％或更高同源性的氨基酸序列的肽。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽包括與降鈣素基因-相關(guān)的肽CGRP)具有同源性的肽。因此，它們被期望除了CRSP作用之外具有類(lèi)似于CGRP的生理活性。因此，除了上述(1)到(6)外，本發(fā)明的肽也預(yù)計(jì)具有下述類(lèi)似于CGRP的特性(7)強(qiáng)烈地作用于降鈣素-基因相關(guān)肽受體，(8)誘導(dǎo)血管的舒張，(9)利尿，以及(10)改變血管內(nèi)皮細(xì)胞，血管平滑肌和成纖維細(xì)胞的增殖能力。
本發(fā)明進(jìn)一步地涉及具有編碼上述本發(fā)明肽的堿基序列的基因。更具體的，本發(fā)明涉及具有序列表中SEQ ID NO3，SEQ ID NO7，SEQ ID NO10，SEQ ID NO13，SEQ ID NO17或SEQ SEQ IDNO20所示，堿基序列的上述基因。
本發(fā)明更進(jìn)一步地涉及含有至少一個(gè)上述本發(fā)明的肽和藥用載體的藥物組合物。尤其是，本發(fā)明涉及上述的藥物組合物，其中藥物組合物是用于骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防/治療藥物，用于癌癥的預(yù)防/治療藥物，利尿劑，食欲抑制劑，止痛劑，抗高血壓藥或用于預(yù)防PTCA(經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù))后再狹窄的藥物。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1圖示了本發(fā)明CRSP的結(jié)構(gòu)。
圖2顯示了本發(fā)明CRSP(pCRSP)的氨基酸序列與豬降鈣素基因-相關(guān)肽(pCGRP-I)、人降鈣素基因-相關(guān)肽I(hCGRP-I)、人降鈣素基因-相關(guān)肽II(hCGRP-II)、人糊精(hAmylin)、豬降鈣素(pCT)和人腎上腺髓質(zhì)素(hAM)氨基酸序列的比較。
圖3為顯示在尋找本發(fā)明CRSP的表達(dá)位點(diǎn)的Northern印跡結(jié)果的示圖。圖3中的箭頭顯示了CRSP mRNA的位置。
圖4顯示了利用LLC-PK1細(xì)胞，研究本發(fā)明的CRSP對(duì)cAMP生產(chǎn)率影響的結(jié)果。圖4中的縱坐標(biāo)顯示了cAMP產(chǎn)生的量(pmol/105細(xì)胞/30分鐘，而橫坐標(biāo)顯示了每一肽濃度的負(fù)對(duì)數(shù)(-log(肽濃度(M))。圖4中的實(shí)心圓(●)表示本發(fā)明的CRSP，空心圓(○)表示豬降鈣素基因-相關(guān)肽(豬CGRP)且空心菱形(◇)表示豬降鈣素(豬CT)。
圖5顯示了利用LLC-PK1細(xì)胞在缺乏5-(N-乙基-N-異丙基)-氨氯吡脒(EIPA)的情況下進(jìn)行的本發(fā)明CRSP與鈉離子的結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果。圖5中的縱坐標(biāo)表示每一離子的結(jié)合量(cpm)，而橫坐標(biāo)的左端顯示為對(duì)照(沒(méi)有加入的肽)且右邊顯示為每一濃度的CRSP。符號(hào)***表示當(dāng)p＜0.001時(shí)有顯著性差異。
圖6顯示了在EIPA存在下利用LLC-PK1細(xì)胞進(jìn)行的本發(fā)明CRSP的鈉離子結(jié)合的結(jié)果。圖6中的縱坐標(biāo)表示每一離子的加入量(cpm)，而橫坐標(biāo)的左端顯示為對(duì)照(沒(méi)有加入肽)且右邊顯示為每一濃度的CRSP和EIPA。符號(hào)***表示當(dāng)p＜0.001時(shí)有顯著性差異。
圖7顯示了利用LLC-PK1細(xì)胞進(jìn)行的本發(fā)明CRSP的鈣離子結(jié)合的結(jié)果。圖7中的縱坐標(biāo)表示每一離子的加入量(cpm)，橫坐標(biāo)的左端顯示為對(duì)照(沒(méi)有加入肽)且右邊顯示為sCT(鮭魚(yú)降鈣素)和CRSP。符號(hào)*和**分別表示當(dāng)p＜0.05和p＜0.01時(shí)有顯著性差異。
圖8顯示了LLC-PK1細(xì)胞中伴隨本發(fā)明的CRSP引起的細(xì)胞增殖而合成DNA量的測(cè)定結(jié)果。圖8中的縱坐標(biāo)表示125I-DU(×100cpm/孔)的加入量而橫坐標(biāo)表示每一肽的負(fù)對(duì)數(shù)(-log(肽濃度(M))。圖8中的實(shí)心圓(●)表示本發(fā)明的CRSP，空心圓(○)表示豬降鈣素(豬CT)且空心菱形(◇)表示鮭魚(yú)降鈣素(鮭魚(yú)CT)。
圖9顯示了利用計(jì)數(shù)板測(cè)定的在LLC-PK1細(xì)胞中通過(guò)本發(fā)明CRSP引起的細(xì)胞增殖產(chǎn)生的細(xì)胞數(shù)。圖9中的縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù)(×1,000細(xì)胞/孔)，橫坐標(biāo)的左端顯示為對(duì)照(沒(méi)有加入CRSP)且右邊顯示為每一濃度的CRSP。符號(hào)*表示當(dāng)p＜0.05時(shí)有顯著性差異。
圖10顯示了細(xì)胞(COS-7)中通過(guò)本發(fā)明肽CRSP刺激，測(cè)定cAMP生產(chǎn)率的結(jié)果，其中降鈣素受體以遺傳操作的方式表達(dá)。附圖10中的縱坐標(biāo)表示cAMP的產(chǎn)量(pmol/孔/30分鐘)而橫坐標(biāo)表示每一肽(配體)濃度(M)的負(fù)對(duì)數(shù)(-log(配體濃度(M))。圖10的實(shí)心圓(●)表示本發(fā)明的CRSP且空心菱形(◇)表示豬降鈣素(pCT)。
圖11顯示了負(fù)鼠的腎上皮細(xì)胞中通過(guò)本發(fā)明的肽CRSP刺激測(cè)定的cAMP生產(chǎn)率的結(jié)果，其中豬降鈣素受體(CTR)在腎上皮細(xì)胞中表達(dá)。附圖11中的縱坐標(biāo)表示cAMP的產(chǎn)量(fmol/孔/小時(shí))而橫坐標(biāo)表示CRSP濃度的負(fù)對(duì)數(shù)(-log(CRSP濃度(M))。圖11的實(shí)心圓(●)表示導(dǎo)入豬降鈣素受體(CTR)的負(fù)鼠腎上皮細(xì)胞的情況，且實(shí)心正方形(■)表示負(fù)鼠腎上皮細(xì)胞(OK細(xì)胞)的情況。
圖12顯示了在負(fù)鼠腎上皮細(xì)胞中通過(guò)本發(fā)明的肽CRSP刺激的鈉離子結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果，其中負(fù)鼠腎上皮細(xì)胞表達(dá)豬降鈣素受體(CTR)。圖12中的縱坐標(biāo)表示鈉離子加入量的比例(其中對(duì)照為100)而橫坐標(biāo)表示CRSP濃度的負(fù)對(duì)數(shù)(-log(CESP濃度(M)))。圖12中的實(shí)心圓(●)表示導(dǎo)入豬降鈣素受體(CTR)的負(fù)鼠腎上皮細(xì)胞的情況且實(shí)心正方形(■)表示負(fù)鼠腎上皮細(xì)胞(OK細(xì)胞)的情況。圖12中的符號(hào)***表示當(dāng)p＜0.001時(shí)有顯著性差異。
圖13顯示了通過(guò)將本發(fā)明的CRSP施用于大鼠，血液中鈣濃度改變的測(cè)定結(jié)果。圖13中的縱坐標(biāo)表示在血液中的鈣濃度(mM)而橫坐標(biāo)表示時(shí)間(分鐘)。附圖13中的符號(hào)**表示當(dāng)p＜0.01時(shí)有顯著性差異。
圖14顯示了通過(guò)施用本發(fā)明的CRSP，大鼠血壓變化的測(cè)定結(jié)果。圖14中的縱坐標(biāo)表示血壓(mmHg)而橫坐標(biāo)表示時(shí)間(分鐘)。
圖15顯示了通過(guò)CRSP或CRSP-Gly刺激細(xì)胞產(chǎn)生的cAMP量的放射性強(qiáng)度免疫測(cè)定結(jié)果，其中豬降鈣素受體(CTR)被導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pcDNA 3.1中并在恒河猴的腎細(xì)胞(COS-7)中表達(dá)?？v坐標(biāo)表示cAMP的產(chǎn)生量(pmol/孔/130分鐘)而橫坐標(biāo)表示CRSP濃度的負(fù)對(duì)數(shù)(-log(CRSP濃度(M))。
圖16顯示了利用LLC-PK1細(xì)胞研究由本發(fā)明肽豬CRSP、牛CRSP和犬CRSP的cAMP產(chǎn)生-促進(jìn)活性的結(jié)果?？v坐標(biāo)表示cAMP的產(chǎn)量(pmol/孔/10分鐘)而橫坐標(biāo)表示CRSP的負(fù)對(duì)數(shù)。在圖16中(■)表示豬CRSP，(●)表示牛CRSP以及(▲)表示犬CRSP。
圖17顯示了CRSP基因的核苷酸序列。下劃線部分表示外顯子。在下劃線部分下面，顯示了由CRSP基因編碼的氨基酸序列。
圖18顯示了CRSP-2基因的核苷酸序列的第一個(gè)半部分(從1到3840的堿基)。
圖19顯示了CRSP-2基因的核苷酸序列的第二個(gè)半部分(從3841到7673的堿基)。加下劃線部分表示外顯子。在下劃線部分下面，顯示了由CRSP-2基因編碼的氨基酸序列。
圖20顯示了CRSP-2的cDNA核苷酸序列。在圖20中，實(shí)線包圍的區(qū)域?yàn)槌墒祀那一疑牟糠直硎炯俣ū桓淖優(yōu)轷０返母拾彼帷?br> 圖21顯示了CRSP-3的cDNA核苷酸序列。在圖21中，實(shí)線包圍的區(qū)域?yàn)槌墒祀那一疑牟糠直硎炯俣ū桓淖優(yōu)轷０返母拾彼帷?br> 圖22顯示了CT-2的DNA核苷酸序列。在圖22中，實(shí)線包圍的區(qū)域?yàn)槌墒祀那一疑牟糠直硎炯俣ū桓淖優(yōu)轷０返母拾彼?。在圖22中，位于成熟物質(zhì)N-末端一側(cè)的谷氨酰胺被推測(cè)轉(zhuǎn)化為焦谷氨酸。
圖23顯示了比較CRSP、CGRP、AM、CT-2和CT的氨基酸的圖。
顯示了本發(fā)明的肽CRSP(pCRSP)、CRSP-2(pCRSP-2)、CRSP-3(pCRSP-3)和CT-2(pCT-2的氨基酸序列與豬降鈣素基因-相關(guān)肽(pCGRP)、豬降鈣素(pCT)和豬腎上腺髓質(zhì)素(pAM)的氨基酸序列的比較。
圖24顯示了通過(guò)RT-PCR高靈敏度定量測(cè)定的CRSP、CRSP-2、CRSP-3、CT-2、CT和CGRP的基因表達(dá)量的結(jié)果。圖表中的縱坐標(biāo)表示不同的基因而橫坐標(biāo)表示被測(cè)定基因表達(dá)量的豬的組織。為了校正總的RNA量，也同樣測(cè)定了GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)的表達(dá)量。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式本發(fā)明人利用腎上皮細(xì)胞的cAMP產(chǎn)生作為指標(biāo)從豬腦提取物中純化了兩種新的生理活性肽。當(dāng)分析產(chǎn)生肽的氨基酸序列時(shí)，發(fā)現(xiàn)它們是一種含有下列38個(gè)氨基酸的肽(在下文中，稱為CRSP)Ser-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Met-Thr-His-10Arg-Leu-Val-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-20Ser-Met-Val-Arg-Ser-Asn-Leu-Leu-Pro-Thr-30Lys-Met-Gly-Phe-Lys-Val-Phe-Gly-NH238和一種(在下文中稱為CRSP-G)含有下列39個(gè)氨基酸的肽，其中甘氨酸被結(jié)合于上述肽的C-末端Ser-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Met-Thr-His-10Arg-Leu-Val-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-20Ser-Met-Val-Arg-Ser-Asn-Leu-Leu-Pro-Thr-30Lys-Met-Gly-Phe-Lys-Val-Phe-Gly-Gly-OH 39
當(dāng)那些肽的氨基酸序列通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)(Genbank，swissprot，DDBJ)檢索時(shí)這兩種肽被證實(shí)具有新的氨基酸序列。
這些氨基酸序列被分別顯示在序列表的SEQ ID NO1和SEQ IDNO2中。
基于產(chǎn)生肽的氨基酸序列制備合成引物并通過(guò)PCR利用豬基因作為模板進(jìn)行擴(kuò)增由此克隆了目的基因。
基于氨基酸序列，在N-末端一側(cè)所用的引物為T(mén)G(C/T)AA(C/T)AC(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)AC(A/C/G/T)TG(C/T)ATGAC且在C-末端一側(cè)為CC(A/G)AA(A/C/G/T)AC(C/T)TT(A/G)AA(A/C/G/T)CCCATA。
所得到的基因的堿基序列顯示于序列表的SEQ ID NO3中且由此編碼的氨基酸序列顯示如下。
Met-Gly-Phe-Trp-Lys-Phe-Pro-Pro-Phe-Leu-10Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Val-Leu-Tyr-Gln-Ala-20Gly-Met-Phe-His-Thr-Ala-Pro-Met-Arg-Ser-30Ala-Phe-Gly-Ser-Pro-Phe-Asp-Pro-Ala-Thr-40Leu-Ser-Glu-Glu-Glu-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-50Ala-Ala-Met-Val-Asn-Asp-Tyr-Glu-Gln-Met-60Lys-Ala-Arg-Glu-Met-Gln-Lys-Gln-Arg-Ala-70Gln-Gly-Ser-Gly-Ile-Ser-Val-Gln-Lys-Arg-80Ser-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Met-Thr-His-90Arg-Leu-Val-Gly-Leu-Leu-Ser-Arq-Ser-Gly-100Ser-Met-Val-Arg-Ser-Asn-Leu-Leu-Pro-Thr-110Lys-Met-Gly-Phe-Lys-Val-Phe-Gly-Gly-Arg- 120Arg-Arg-Asn-Phe-Trp-Ile 126
(在該結(jié)構(gòu)式中，加下劃線的從第81到第118為CRSP)。
氨基酸序列被顯示在序列表中的SEQ ID NO4。
利用豬CRSP cDNA作為探針，從牛和犬甲狀腺cDNA的文庫(kù)制備本發(fā)明的肽。
牛CRSP的氨基酸序列用單字母表示如下。
ACNTATCMTHRLAGWLSRSGSMVRSNLLPTKMGFKIFNGP-OH用三字母表示如下。
Ala-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Met-Thr-His-10Arg-Leu-Ala-Gly-Trp-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-20Ser-Met-Val-Arg-Ser-Asn-Leu-Leu-Pro-Thr-30Lys-Met-Gly-Phe-Lys-Ile-Phe-Asn-Gly-Pro-OH 40犬CRSP的氨基酸序列用單字母表示如下。
SCNSATCVAHWLGGLLSRAGSVANTNLLPTSMGFKVYN-OH用三字母表示如下。
Ser-Cys-Asn-Ser-Ala-Thr-Cys-Val-Ala-His-10Trp-Leu-Gly-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ala-Gly-20Ser-Val-Ala-Asn-Thr-Asn-Leu-Leu-Pro-Thr-30Ser-Met-Gly-Phe-Lys-Val-Tyr-Asn-OH 38
每一氨基酸序列、核苷酸序列和基因編碼的總的氨基酸序列顯示于序列表中。
牛的本發(fā)明肽的氨基酸序列顯示于序列表的SEQ ID NO6中，其基因的核苷酸序列顯示于序列表的SEQ ID NO7以及基于該基因的肽的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO8。
犬的本發(fā)明肽的氨基酸序列顯示于序列表的SEQ ID NO9中，該基因的核苷酸序列被顯示于序列表的SEQ ID NO10以及基于該基因的肽的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO11。
利用豬CRSP cDNA編碼區(qū)的全長(zhǎng)作為探針，從豬基因組文庫(kù)制備編碼與CRSP具有同源性的肽的基因。基因的產(chǎn)物肽被分別命名為CRSP-2和CRSP-3。
類(lèi)似地，鑒定了編碼與豬降鈣素(CT)具有同源性的肽的基因?；虻漠a(chǎn)物肽被命名為CT-2。
CRSP-2的氨基酸序列用氨基酸的三字母碼表示如下。
Ser-Cys-Asn-Thr-Ala-Ser-Cys-Val-Thr-His-10Lys-Met-Thr-Gly-Trp-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-20Ser-Val-Ala-Lys-Asn-Asn-Phe-Met-Pro-Thr-30Asn-Val-Asp-Ser-Lys-Ile-Leu-NH237CRSP-3的氨基酸序列用三字碼表示如下。
Ser-Cys-Asn-Thr-Ala-Ile-Cys-Val-Thr-His-10Lys-Met-Ala-Gly-Trp-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-20
Ser-Val-Val-Lys-Asn-Asn-Phe-Met-Pro-Ile-30Asn-Met-Gly-Ser-Lys-Val-Leu-NH237CT-2的氨基酸序列用三字碼表示如下。
Glu-Cys-Asn-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-10Gly-Thr-Tyr-Thr-Trp-Asp-Val-Asn-Lye-Phe-20Tyr-Ala-Phe-Pro-Leu-Thr-Thr-Thr-Gly-Ile-30Arg-Val-Ser-NH233CRSP-2的氨基酸序列顯示于序列表的SEQ ID NO12中，其cDNA的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO13且基于該cDNA的肽(一種前體肽)的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO14中。CRSP-2基因的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO15。
CRSP-3的氨基酸序列顯示于序列表的SEQ ID NO16中，其cDNA的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO17且基于該cDNA的肽(一種前體肽)的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO18。
CRSP-2的氨基酸序列顯示于序列表的SEQ ID NO19中，其cDNA的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO20且基于該cDNA的肽(一種前體肽)的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO21。CRSP-3基因和CT-2基因的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO22。
在圖1中，豬CRSP的結(jié)構(gòu)用示意圖顯示為本發(fā)明肽的實(shí)例。在這些實(shí)例的肽的情況中，第二個(gè)Cys和第七個(gè)Cys為-S-S-的結(jié)合方式。
圖2顯示了本發(fā)明的肽豬CRSP(pCRSP)的氨基酸序列與豬降鈣素基因-相關(guān)肽(pCGRP-I)、人降鈣素基因-相關(guān)肽I(hCGRP-I)、人降鈣素基因-相關(guān)肽II(hCGRP-II)、人糊精(hAmylin)、豬降鈣素(pCT)和人腎上腺髓質(zhì)素(hAM)氨基酸序列的比較。
本發(fā)明的CRSP與豬降鈣素基因-相關(guān)肽(PCGRP)、人CGRP-I和人CGRP-II分別具有71.1％、63.2％和71.1％的同源性。
CRSP、CRGP、AM、CT-2和CT與獲自豬的肽的氨基酸比較顯示于附圖23中。
用于研究CRSP表達(dá)位點(diǎn)的Northern印跡結(jié)果通過(guò)照片作為圖顯示于附圖3中。圖3中的箭頭表示CRSP mRNA的位置。此外，每一組織中肽的含量利用抗CRSP抗體通過(guò)放射免疫測(cè)定的方式測(cè)定。測(cè)定的結(jié)果顯示于下表1中。
表1通過(guò)放射性強(qiáng)度免疫測(cè)定的組織中CRSP的濃度


每一值表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(n＝3)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明CRSP基因的高水平表達(dá)存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，諸如中腦和下丘腦，以及在外圍系統(tǒng)諸如甲狀腺中。中度表達(dá)在橋腦/延髓中被檢測(cè)到。僅僅少量的表達(dá)被檢測(cè)存在于大腦和垂體中。另一方面，組織中CRSP的濃度在垂體后葉和甲狀腺中是最豐富的，且在中腦、下丘腦和垂體前葉中也是高含量的。
然后研究CRSP的生物活性。
首先，CRSP的cAMP生產(chǎn)能力利用LLC-PK1細(xì)胞進(jìn)行研究。
將溶于DMEM的CRSP加至LLC-PK1細(xì)胞的培養(yǎng)基中并利用cAMP-特異性抗體通過(guò)放射免疫測(cè)定測(cè)定cAMP的分泌量。結(jié)果顯示于圖4中。圖4中的縱坐標(biāo)表示cAMP的產(chǎn)量(pmol/105細(xì)胞/30分鐘)而橫坐標(biāo)表示每一肽濃度的負(fù)對(duì)數(shù)(-log(肽濃度(M))。圖8中的實(shí)心圓(●)表示本發(fā)明的CRSP，空心圓(○)表示豬降鈣素基因-相關(guān)肽(豬CT)且空心菱形(◇)表示豬降鈣素(豬CT)。結(jié)果，本發(fā)明的CRSP以濃度-依賴的方式非常強(qiáng)烈地增加了獲自豬腎上皮細(xì)胞的LLC-PK1細(xì)胞的胞內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶活性(ED50為大約1.5nM)。其活性比豬降鈣素(ED50大約8.7nM)和豬CGRP(ED50大約62nM)分別強(qiáng)大約6倍和大約40倍。
然后，研究本發(fā)明CRSP促進(jìn)鈉離子和鈣離子結(jié)合的功能。
用Hanks氯化膽堿溶液代替LLC-PK1細(xì)胞的培養(yǎng)液，在其中加入具有預(yù)先確定放射性強(qiáng)度(22Na)的CRSP和氯化鈉使得各終濃度為0M、10-8M、10-7M和10-6M，10分鐘后洗滌細(xì)胞來(lái)完全地除去細(xì)胞外溶液中的22Na并通過(guò)γ-計(jì)量器測(cè)定結(jié)合到細(xì)胞的放射性強(qiáng)度。類(lèi)似地，LLC-PK1細(xì)胞的培養(yǎng)液用Hanks氯化膽堿溶液代替，加入具有預(yù)測(cè)定的放射性強(qiáng)度(22Na)的氯化鈉以及CRSP和阿米洛利衍生物(5-(N-乙基-N-異丙基)-阿米洛利)(EIPA)使得終濃度分別為0M CRSP+0MEIPA，10-6M CRSP+0M EIPA，10-6M CRSP+10-8M EIPA，10-6MCRSP+10-7M EIPA，10-6M CRSP+10-6M EIPA以及0M CRSP+10-6MEIPA，其中的阿米洛利衍生物(5-(N-乙基-N-異丙基)-阿米洛利)是Na/H共-轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的抑制劑。10分鐘后沖洗細(xì)胞使得細(xì)胞外溶液中含有的22Na被完全去除且通過(guò)γ-計(jì)數(shù)器測(cè)定摻入細(xì)胞的放射性強(qiáng)度。
結(jié)果顯示于附圖5(在缺乏EIPA的情況下?lián)饺脞c離子)，附圖6(在EIPA存在下?lián)饺脞c離子)以及附圖7(摻入鈣離子)。圖5、圖6和圖7中的縱軸表示每一離子的加入量(cpm)，而橫坐標(biāo)的左端表示對(duì)照(沒(méi)有肽加入)；且右邊表示每一濃度的CRSP。圖6橫坐標(biāo)的對(duì)照的右邊表示CRSP單獨(dú)給藥的情況，其右側(cè)表示CRSP與EIPA共同給藥的各濃度且右端表示EIPA單獨(dú)給藥的情況。圖7中的sCT表示鮭魚(yú)降鈣素。在圖5、圖6和圖7中，標(biāo)記*、**和***分別表示當(dāng)p＜0.05，p＜0.01和p＜0.001時(shí)有顯著的差異。
結(jié)果，人們發(fā)現(xiàn)CRSP激活LLC-PK1細(xì)胞上的阿米洛利-敏感的Na/H共-轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，因此促進(jìn)了鈉吸收到細(xì)胞中并且抑制鈣吸收到細(xì)胞中。
然后研究CRSP對(duì)于細(xì)胞增殖的抑制作用。
各種濃度的每種肽的DMEM溶液添加于LLC-PK1細(xì)胞中，然后將含有用125I(125I-DU)標(biāo)記的溴脫氧尿苷的DMEM(含有0.1％BSA)添加到各孔中，5小時(shí)后，通過(guò)γ-測(cè)量器測(cè)定結(jié)合到核中的放射性強(qiáng)度來(lái)測(cè)定作為細(xì)胞增殖結(jié)果的DNA合成的量。結(jié)果顯示于圖8中。圖8中的縱坐標(biāo)表示125I-DU(×100cpm/孔)的加入量而橫坐標(biāo)表示每一種肽的負(fù)對(duì)數(shù)(-log(肽濃度(M)))。圖8中的實(shí)心圓(●)表示本發(fā)明的CRSP，空心圓(○)表示豬降鈣素(豬CT)且空心菱形(◇)表示鮭魚(yú)降鈣素(鮭魚(yú)CT)。
根據(jù)增殖細(xì)胞的數(shù)目，各種濃度的CRSP的DMEM溶液被添加給10000細(xì)胞/孔的LLC-PK1細(xì)胞，進(jìn)行溫育，通過(guò)胰蛋白酶-EDTA溶液取出在溫育平皿上的細(xì)胞并利用計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示于圖9中。圖9中的縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù)(×1,000細(xì)胞/孔)，而橫坐標(biāo)的左端表示對(duì)照(沒(méi)有加入CRSP)且右邊顯示為每一濃度的CRSP。符號(hào)*表示當(dāng)p＜0.05時(shí)有顯著性差異。
結(jié)果，人們發(fā)現(xiàn)CRSP具有抑制LLC-PK1細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。
研究了本發(fā)明CRSP對(duì)降鈣素受體的作用。
豬降鈣素受體(CTR)被導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pcDNA 3.1中，在恒河猴腎細(xì)胞(COS-7)中表達(dá)并利用放射免疫測(cè)定法測(cè)定通過(guò)CRSP刺激產(chǎn)生的cAMP量。類(lèi)似地，在負(fù)鼠腎細(xì)胞(OK細(xì)胞)中表達(dá)CTR并利用放射免疫測(cè)定法測(cè)定通過(guò)CRSP刺激產(chǎn)生的cAMP量，同時(shí)通過(guò)通過(guò)γ-測(cè)量器測(cè)定具有放射性強(qiáng)度的氯化鈉(22Na)的摻入來(lái)測(cè)定鈉離子的吸收。結(jié)果顯示于圖10中(細(xì)胞(COS-7)中通過(guò)CRSP刺激的cAMP生產(chǎn)率的變化，在所述細(xì)胞(COS-7)中以遺傳操作的方式表達(dá)降鈣素受體)，圖11(負(fù)鼠腎上皮細(xì)胞中cAMP生產(chǎn)率的改變，在所述負(fù)鼠腎上皮細(xì)胞中表達(dá)豬降鈣素受體(CTP))以及圖12(負(fù)鼠腎上皮細(xì)胞中那里子吸收的改變，在所述負(fù)鼠腎上皮細(xì)胞中表達(dá)豬降鈣素受體(CTP))。
圖10中的縱坐標(biāo)表示cAMP的產(chǎn)生量(pmol/孔/30分鐘)而橫坐標(biāo)表示每一肽(配體)濃度的負(fù)對(duì)數(shù)(-log(配體濃度(M))。圖10的實(shí)心圓(●)表示本發(fā)明的CRSP且空心菱形(◇)表示豬降鈣素(pCT)。圖11中的縱坐標(biāo)表示cAMP的產(chǎn)生量(fmol/孔/小時(shí))而橫坐標(biāo)表示CRSP濃度的負(fù)對(duì)數(shù)(-log(CRSP濃度(M)。圖11的實(shí)心圓(●)表示導(dǎo)入豬降鈣素受體(CTR)的負(fù)鼠腎上皮細(xì)胞的情況且實(shí)心正方形(■)表示負(fù)鼠科腎上皮細(xì)胞(OK細(xì)胞)的情況。圖12中的縱坐標(biāo)表示鈉離子加入量的比例(其中對(duì)照為100)而橫坐標(biāo)表示CRSP濃度的負(fù)對(duì)數(shù)(-log(CESP濃度(M))。圖12中的實(shí)心圓(●)表示導(dǎo)入豬降鈣素受體-CTR)的負(fù)鼠腎上皮細(xì)胞的情況且實(shí)心正方形(■)表示負(fù)鼠腎上皮細(xì)胞(OK細(xì)胞)的情況。圖12中的符號(hào)***表示當(dāng)p＜0.001時(shí)有顯著性差異。
結(jié)果，人們注意到，當(dāng)CTR在COS-7中表達(dá)并通過(guò)CRSP刺激時(shí)，胞內(nèi)的腺苷酸環(huán)化酶活性增加(ED50大約0.2nM)。活性比豬降鈣素(ED50大約71nM)高大約350倍。CRSP的這種作用比豬降鈣素高大約350倍且在已知的生理活性肽中是最強(qiáng)的。類(lèi)似地，人們注意到，當(dāng)CTR在負(fù)鼠腎上皮細(xì)胞(OK細(xì)胞)中表達(dá)并通過(guò)CRSP進(jìn)行刺激時(shí)，胞內(nèi)的腺苷酸環(huán)化酶活性增加，且同時(shí)激活了阿米洛利-敏感的Na/H共轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)由此促進(jìn)了鈉吸收到細(xì)胞中。
也研究了由CRSP導(dǎo)致的大鼠血壓以及血漿中離子濃度的變化。
將16nmol/kg的溶于生理鹽溶液的CRSP在麻醉的情況下較短的時(shí)間內(nèi)從頸靜脈施用于大鼠并測(cè)定血漿中的鈣濃度以及血壓。結(jié)果顯示于圖13(通過(guò)施用CRSP導(dǎo)致的血液中鈣濃度的變化)以及圖14(通過(guò)施用CRSP導(dǎo)致的血壓的變化)中。圖13中的縱坐標(biāo)表示血液中鈣濃度且橫坐標(biāo)表示時(shí)間(分鐘)。圖14中的縱坐標(biāo)表示血壓(mmHg)且橫坐標(biāo)表示時(shí)間(分鐘)。圖13中的符號(hào)**表示當(dāng)p＜0.01時(shí)有顯著性差異。
結(jié)果，人們注意到，當(dāng)施用CRSP時(shí)，血漿中鈣濃度瞬時(shí)降低而血壓沒(méi)有明顯的變化。
然后，研究由CRSP和CRSP-Gly導(dǎo)致的cAMP產(chǎn)生-促進(jìn)活性的差異。
豬降鈣素受體(CTR)被導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pcDNA 3.1中然后在恒河猴腎細(xì)胞(COS-7)中表達(dá)，利用放射免疫測(cè)定法測(cè)定由CRSP刺激產(chǎn)生的cAMP量。結(jié)果顯示于圖15中。
結(jié)果，人們注意到CRSP和CRSP-Gly具有幾乎相同的cAMP生產(chǎn)率。
進(jìn)一步地，根據(jù)在母牛和狗中鑒定的本發(fā)明的肽(牛CRSP和狗CRSP)，通過(guò)與上述相同的方法利用LLC-PK1細(xì)胞研究CRSP產(chǎn)生cAMP的活性。結(jié)果顯示于圖16中。圖16中的縱坐標(biāo)表示cAMP的產(chǎn)量(pmol/孔/10分鐘)而橫坐標(biāo)表示加入CRSP的濃度。
結(jié)果，人們發(fā)現(xiàn)牛和狗CRSP獲得了與豬CRSP相同的結(jié)果。
利用RT-PCR進(jìn)行的高靈敏度定量測(cè)定，確定了本發(fā)明的各種肽，CRSP、CRSP-2、CRSP-3、CT-2、CTCGRP和GAPDH的基因表達(dá)量。結(jié)果顯示于圖24中。
中樞神經(jīng)系統(tǒng)，甲狀腺和卵巢中觀察到CRSP-2和CRSP-3的表達(dá)。相反地，在任何沒(méi)有觀察到表達(dá)的組織中CT-2條帶沒(méi)有擴(kuò)增。推測(cè)CT-2僅僅在除顯示于圖24的組織之外的其它區(qū)域表達(dá)。
如上所述，人們注意到本發(fā)明的肽以比降鈣素更強(qiáng)的方式刺激降鈣素受體，據(jù)此腺苷酸環(huán)化酶通過(guò)本發(fā)明的肽被激活。上述表明本發(fā)明的肽是降鈣素受體的天然內(nèi)源性配體。
因此，本發(fā)明的肽被認(rèn)為作用于外圍組織中的降鈣素受體并激發(fā)起下面的藥效。
降鈣素通過(guò)作為降鈣素的受體的降鈣素受體促進(jìn)鈣吸收到骨中?？梢酝茢?，類(lèi)似于降鈣素，本發(fā)明的肽作用于降鈣素受體并促進(jìn)鈣吸收到骨中。事實(shí)上，如圖13所示，通過(guò)將肽施用于大鼠，在血漿中檢測(cè)到鈣濃度的下降?？梢酝茢嘣摻Y(jié)果支持了促進(jìn)鈣吸收到骨中。通過(guò)利用這種作用，所述肽適用于作為恢復(fù)由于骨質(zhì)疏松癥而降低的骨密度到健康狀態(tài)的藥物，并可被用作骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療藥物。
此外，如圖13所示，本發(fā)明的肽具有降低血漿中鈣濃度的活性，由此其可適于作為將堿中毒等引起的血鈣過(guò)多癥中血漿鈣濃度降低到正常水平，且可被用作血鈣過(guò)多癥的治療和預(yù)防藥物。
本發(fā)明的肽激活腎上皮細(xì)胞的阿米洛利-敏感的Na/H共-轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的作用。也就是說(shuō)與維持鉀的利尿劑藥物阿米洛利活性相反，本發(fā)明的肽可用作抗利尿劑藥物。
如圖8和圖9所示，本發(fā)明的肽通過(guò)降鈣素受體強(qiáng)烈地抑制腎上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。已有報(bào)道稱降鈣素通過(guò)降鈣素受體強(qiáng)烈地抑制腺癌細(xì)胞等的生長(zhǎng)(Cancer Res.1985，45，4890-4894以及其它)。因此，人們期望本發(fā)明的肽能類(lèi)似地通過(guò)降鈣素受體以比降鈣素更強(qiáng)烈的方式抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)且希望它們能夠被用作治療和預(yù)防癌癥的藥物。
在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中檢測(cè)到大量的本發(fā)明的肽。已知降鈣素在現(xiàn)有技術(shù)中作為激動(dòng)劑，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中沒(méi)有檢測(cè)到其表達(dá)而降鈣素受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，此事實(shí)表明本發(fā)明的肽是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的天然內(nèi)源性配體。已經(jīng)有報(bào)道，當(dāng)降鈣素被施用于腦室中時(shí)，產(chǎn)生了食欲抑制和止痛的作用。因?yàn)榻碘}素在腦中不表達(dá)，可以確證本發(fā)明的肽在腦中具有這樣的作用。
因此，認(rèn)為本發(fā)明的肽作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的降鈣素受體并引發(fā)下列藥效。
已經(jīng)報(bào)道降鈣素作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制食欲(Science 1979，206，850-852；The Bone 1992，6，69-74；等)。本發(fā)明的肽，可以比降鈣素更強(qiáng)烈地激活降鈣素受體，其非常可能引起強(qiáng)烈的食欲-抑制作用。本發(fā)明的肽，通過(guò)給藥的方式，可被用作肥胖癥以及由此引起的疾病(諸如高血壓和高血脂)的治療和預(yù)防藥物。
進(jìn)一步地報(bào)道認(rèn)為降鈣素制劑顯示出對(duì)由于癌擴(kuò)散，骨質(zhì)疏松癥等引起的骨疼痛以及偏頭痛和胰腺炎等疼痛的止痛作用。(Am.J，Med.Sci.1997，313，13-16；等)。比降鈣素更強(qiáng)烈地激活降鈣素受體的本發(fā)明的肽非?？赡芫哂泻徒碘}素一樣強(qiáng)烈的止痛作用且它們可以有效地用作鎮(zhèn)痛藥。
本發(fā)明的肽具有下述特性(1)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，(2)強(qiáng)烈地作用于降鈣素受體，(3)促進(jìn)細(xì)胞的cAMP生產(chǎn)活性，且所涉及的肽至少具有下列的氨基酸序列Ser-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Met-Thr-His-10
Arg-Leu-Val-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-20Ser-Met-Val-Arg-Ser-Asn-Leu-Leu-Pro-Thr-30Lys-Met-Gly-Phe-Lys-Val-Phe-Gly 38或其中缺失、取代或增加部分氨基酸的氨基酸序列。如果本發(fā)明的肽含有上述氨基酸序列，則包括酰胺衍生物、酯衍生物和各氨基酸的側(cè)鏈官能團(tuán)的衍生物，諸如賴氨酸的氨基和絲氨酸的羥基。更優(yōu)選地，本發(fā)明的肽具有下列特性(4)以濃度-依賴的方式吸收鈉離子，(5)抑制鈣離子的吸收，(6)抑制細(xì)胞增殖。
本發(fā)明的肽不局限于上述的氨基酸序列，只需具有上述(1)到(3)的特性或，優(yōu)選地，(1)到(6)的特性，且它們可以是氨基酸序列中部分氨基酸缺失、取代和/或添加的肽。這種氨基酸序列雖然不局限于但優(yōu)選地具有50％或更高同源性，更優(yōu)選地可以為75％或更高，80％或更高，更優(yōu)選地最好為具有85％或更高的同源性。此外，本發(fā)明的優(yōu)選肽包括那些與降鈣素或降鈣素基因-相關(guān)肽具有50％或更高，優(yōu)選地60％或更高同源性的氨基酸序列的肽。
在上述實(shí)例中，已描述了本發(fā)明來(lái)源于豬的CRSPs，然而本發(fā)明的肽不局限于那些來(lái)源于豬的肽而是包括來(lái)源于哺乳動(dòng)物諸如人，大鼠，狗和牛以及魚(yú)諸如鮭魚(yú)等的肽。
本發(fā)明的肽可通過(guò)諸如提取的方式由天然產(chǎn)物分離或純化而來(lái)，或可通過(guò)常用的肽合成方法的合成。進(jìn)一步地可通過(guò)基因重組技術(shù)來(lái)產(chǎn)生肽，其中將本發(fā)明的基因?qū)氲胶线m的載體中，且利用原核細(xì)胞或真核細(xì)胞作為宿主。
本發(fā)明的藥物組合物含有本發(fā)明的肽和藥用載體。本發(fā)明的藥物組合物可通過(guò)口服或非腸道給藥，且優(yōu)選地通過(guò)諸如靜脈注射和肌內(nèi)注射的方式進(jìn)行非腸道給藥。
本發(fā)明的藥物組合物可制備成制劑諸如注射劑，冷凍干燥制劑和用于直腸給藥的制劑。也可被制備成外用制劑諸如粘合劑，膏劑和貼膏。進(jìn)一步地可被制備成諸如舌下片劑?？赏ㄟ^(guò)肽制劑的常規(guī)方法制備制劑。
本發(fā)明的藥物組合物可與除了本發(fā)明肽之外的其它有效成份一起使用。本發(fā)明的藥物組合物的施用劑量，通常在1μg/kg體重到1,000mg/kg體重的范圍內(nèi)，優(yōu)選地本發(fā)明的肽的每日劑量為從0.1mg/kg到500mg/kg體重，然而，可依據(jù)患者的特性和基礎(chǔ)病而有所改變。因?yàn)楸景l(fā)明的肽比降鈣素更強(qiáng)烈地作用于降鈣素受體，其可以以和常規(guī)的降鈣素制劑相同的方式應(yīng)用于疾病。
由于本發(fā)明的肽還包括與基因-相關(guān)肽(CGRP)具有同一性的肽，其不但可應(yīng)用于上述目的而且可以利用其類(lèi)似于CGRP的生理活性。
CGRP已知的生理活性包括諸如強(qiáng)烈地作用于CGRP受體和促進(jìn)細(xì)胞中cAMP的產(chǎn)生。也已經(jīng)報(bào)道CGRP誘導(dǎo)血管的舒張(ReguI.Pept.1986，15，1-23；等等)，促進(jìn)利尿(Proc.Soc.Exp.BioI.Med.1998，188，316-322；等等)以及改變血管內(nèi)皮細(xì)胞以及細(xì)胞諸如血管平滑肌和成纖維細(xì)胞的細(xì)胞增殖活性(Proc.NAT1.Acad.Sci.USA 1990，87，3299-3303；Regul.Pept.2001，101，169-178；等)。
因此，本發(fā)明的某些肽，尤其是與CGRP具有高度同源性的那些肽，預(yù)期具有下列功能(1)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，(2)強(qiáng)烈地作用于降鈣素受體，(3)促進(jìn)細(xì)胞的cAMP產(chǎn)生活性，(4)濃度-依賴性吸收鈉離子，(5)抑制鈣離子的吸收，和(6)抑制細(xì)胞增殖。除了上述外，本發(fā)明的肽也預(yù)期具有下述類(lèi)似于CGRP的特性諸如(7)強(qiáng)烈地作用于降鈣素-相關(guān)的肽受體，(8)誘導(dǎo)血管的舒張，(9)促進(jìn)利尿，以及(10)改變血管內(nèi)皮細(xì)胞，血管平滑肌和成纖維細(xì)胞的增殖活性，不過(guò)并非所有本發(fā)明的肽都具有(7)到(10)的功能。
根據(jù)CGRP具有的功能，含有本發(fā)明肽的藥物組合物可作為制劑用于除上述用途之外的下述目的。即，其可被用作諸如直接利用血管舒張功能的降血壓劑，通過(guò)中樞和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)利用血管舒張功能的降血壓劑，利尿劑，以及利用抑制血管平滑肌增生功能用于PTCA(經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù))后再狹窄的預(yù)防劑。
同時(shí)，日本專(zhuān)利申請(qǐng)2002/162,797說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)的內(nèi)容在此處引入作為參考。
實(shí)施例本發(fā)明將通過(guò)下列實(shí)施例的方式進(jìn)行更具體地說(shuō)明，雖然本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。
實(shí)施例1(CRSP肽的提取和分離)將豬腦(20kg)在4倍量的水中煮沸10分鐘，冷卻以及添加乙酸并攪勻使其終濃度為1M，通過(guò)離心除去不溶物質(zhì)來(lái)制備豬腦提取物。通過(guò)超濾(Pericon Cassette PLAC#000-05，Millipore生產(chǎn))進(jìn)行脫鹽和濃縮，并在用冰冷卻的條件下脫鹽后逐漸添加丙酮到提取物中使得終濃度為66％。通過(guò)離心分離去除沉淀物，利用蒸發(fā)器除去上清液中的丙酮并用反相柱(LC-SORB SPW-C-ODS；Chemc；1.51)吸附殘余物。用3倍量的0.5M乙酸沖洗柱后，用3倍量的洗脫緩沖液(水∶乙腈∶10％三氟乙酸＝40∶60∶1)洗脫肽組分。利用蒸發(fā)器從洗脫物中除去乙腈然后進(jìn)行冷凍干燥。
對(duì)冷凍干燥的樣品進(jìn)行稱重，溶于1M乙酸，通過(guò)用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(SP-Sephadex，Pharmacia，3×28cm)填充的空心柱吸附，并直接流過(guò)分餾為級(jí)分(SP-I)，用2M吡啶(pH8.0)洗脫得到級(jí)分(SP-II)以及用2M吡啶-乙酸(pH值5.0)洗脫得到級(jí)分(SP-III)來(lái)制備SP-III強(qiáng)離子級(jí)分。冷凍干燥級(jí)分，溶于1M乙酸中并通過(guò)凝膠過(guò)濾(Sephadex G-50，Pharmacia，7.5×145cm，1M乙酸，流速100ml/小時(shí))分餾為相應(yīng)分子量的級(jí)分，收集對(duì)應(yīng)于1kDa到5kDa分子量的部分。其再次進(jìn)行凝膠過(guò)濾(Sephadex G-25，Pharmacia，7.5×145cm，1M乙酸，流速100ml/小時(shí))來(lái)分離相應(yīng)分子量的級(jí)分，且收集從2kDa到4kDa分子量的部分并進(jìn)行冷凍干燥。
利用離子交換層析(CM52，Whatman，2.4×45cm；溶液A10mM甲酸銨(pH6.5)∶乙腈＝9∶1；溶液B1M甲酸銨(pH6.5)∶乙腈＝9∶1；流速35ml/小時(shí))由10mM到0.5M的甲酸銨對(duì)冷凍干燥樣品進(jìn)行濃度-梯度洗脫。
然后冷凍干燥1/1000的各級(jí)分，通過(guò)溶入冷凍干燥樣品的DMEM培養(yǎng)基(DMEM，含有0.05％的牛血清白蛋白(BSA))刺激LLC-PK1(獲自豬腎臟的上皮細(xì)胞)，在37℃溫育1小時(shí)并通過(guò)放射免疫測(cè)定法測(cè)定分泌到培養(yǎng)基中的cAMP的量。
方法如下。由此，將4％的相同量的二氧雜環(huán)乙烷-三乙胺(二氧雜環(huán)乙烷∶三乙胺＝4∶1)的混合溶液溶于琥珀酸酐，添加到含有未知量cAMP的100μl培養(yǎng)基中以及含有已知量cAMP的培養(yǎng)基中，混合物在室溫中靜置30分鐘使得cAMP被琥珀?；⒗秒x心蒸發(fā)器蒸干，殘余物溶于1ml的緩沖液置(50mM乙酸鈉(pH6.2)，1mM EDTA，0.025％的疊氮化鈉，0.5％血清白蛋白和0.01％的Triton×-100)中，分別取100μl到試管中且向每50μl中加入放射性標(biāo)記的琥珀?；痗AMP和抗體，然后在4℃靜置48小時(shí)。然后，加入100μl的1％γ-球蛋白和500μl的25％的聚乙二醇，充分混合混合物并離心，通過(guò)γ-測(cè)量器測(cè)定沉淀物的放射性強(qiáng)度并與根據(jù)已知濃度cAMP制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線的放射性強(qiáng)度進(jìn)行比較，由此測(cè)得cAMP的量。
利用陽(yáng)離子交換HPLC(TSK-gel CM-2SW，Tosoh，7.8×300mm；溶液A10mM甲酸銨(pH3.8)∶乙腈＝9∶1；溶液B1M甲酸銨(pH3.8)∶乙腈＝9∶1；流速2ml/min)對(duì)其中觀察到cAMP量增加的級(jí)分(大約0.3M甲酸銨(pH6.5))進(jìn)行甲酸銨濃度-梯度洗脫。同樣地，取出1/1000量活性已被測(cè)定的各組分，通過(guò)利用反相HPLC(C18218TP54，Vydac，4.6×250mm；溶液A水∶乙腈∶10％三氟乙酸＝90∶10∶1；溶液B水∶乙腈∶10％三氟乙酸＝40∶60∶1，流速1ml/分鐘)對(duì)已觀察活性的級(jí)分(大約0.36M的甲酸銨(pH3.8))進(jìn)一步進(jìn)行乙腈濃度-梯度洗脫，收集具有活性的級(jí)分(大約32％的乙腈)。通過(guò)反相HPLC(聯(lián)苯219TP5215，Vydac，2.1×150mm；溶液A水∶乙腈∶10％三氟乙酸＝90∶10∶1；溶液B水∶乙腈∶10％三氟乙酸＝40∶60∶1；流速0.2ml/min)再次分離制備最終的純樣品(大約29％的乙腈)。
制備肽(大約50pmol)。這種肽的分子量為4,099且理論上的等電點(diǎn)被計(jì)算為12.81。此外，如上所述所述肽具有能在Vydac的C18柱(4.6×250mm，218TP54)中用大約32％濃度的乙腈在0.1％三氟乙酸存在的情況下洗脫的疏水性。
實(shí)施例2(CRSP氨基酸序列的測(cè)定)通過(guò)Edman方法利用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列。首先，通過(guò)氨基酸測(cè)序儀分析5pmol的純樣品的N-末端，結(jié)果如下。
Ser-Xaa-Asn-Thr-Ala-Thr-Xaa-Met-Thr-His-Arg-Leu-Val-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-Ser-Met-Val之后，對(duì)10pmol的純樣品進(jìn)行胰蛋白酶降解并利用反相HPLC(C18218TP5215，Vydac，2.1×150mm；溶液A水∶乙腈∶10％三氟乙酸＝90∶10∶1；溶液B水∶乙腈∶10％三氟乙酸＝40∶60流速0.2ml/分鐘)進(jìn)行乙腈濃度-梯度洗脫。通過(guò)氨基酸測(cè)序儀分析產(chǎn)生的峰，能夠獲得下列的六個(gè)序列。
Ser-Xaa-Asn-Thr-Ala-Thr-Xaa-Met-Thr-His-Arg，
Leu-Val-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg，Ser-Gly-Ser-Met-Val-Arg，Ser-Asn-Leu-Leu-Pro-Thr-Lys，Met-Gly-Phe-Lys以及Val-Phe根據(jù)這些序列與數(shù)據(jù)庫(kù)比較的結(jié)果，斷定本發(fā)明的肽與降鈣素基因-相關(guān)肽具有同源性且具有下列序列。
Ser-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Met-Thr-His-Arg-Leu-Val-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-Ser-Met-Val-Arg-Ser-Asn-Leu-Leu-Pro-Thr-Lys-Met-Gly-Phe-Lys-Val-Phe-NH2與此同時(shí)，利用質(zhì)譜儀測(cè)定其分子量且結(jié)果為4,130.6±0.7Da。此結(jié)果與從氨基酸序列推測(cè)的4,042Da有大約89Da的差異，但該差異被推測(cè)是由于兩個(gè)甲硫氨酸的氧化(2×16Da)和C-末端甘氨酸的存在(57Da)，它們不能被氨基酸測(cè)序儀測(cè)得。最后，從下面的實(shí)施例3，可發(fā)現(xiàn)與這些推測(cè)相吻合。
Ser-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Met-Thr-His-Arg-Leu-Val-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-Ser-Met-Val-Arg-Ser-Asn-Leu-Leu-Pro-Thr-Lys-Met-Gly-Phe-Lys-Val-Phe-Gly-NH2(在第二半胱氨酸和第七半胱氨酸之間形成了一個(gè)二硫鍵)CRSP的氨基酸序列顯示于序列表的SEQ ID NO1中而CRSP-Gly的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO2中。
實(shí)施例3(互補(bǔ)DNA堿基序列和前體氨基酸序列)通過(guò)基于實(shí)施例2的氨基酸序列利用N-末端側(cè)的(TG(C/T)AA(C/T)AC(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)AC(A/C/G/T)TG(C/T)ATGAC)和C-末端側(cè)的(CC(A/G)AA(A/C/G/T)AC(C/T)TT(A/G)AA(A/C/G/T)CCCATA)形成合成引物并通過(guò)利用豬基因作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增來(lái)制備探針。
利用Pharmacia的Time Saver cDNA制備試劑盒和Stratagene的λZAPII由豬下丘腦mRNA(3μg)制備互補(bǔ)DNAλ噬菌體文庫(kù)。篩選方法如下。因此，大腸桿菌被侵染λ噬菌體(具有大約100,000個(gè)獨(dú)立的克隆)，與含有LB培養(yǎng)基的0.7％瓊脂糖混合，涂布在含有LB培養(yǎng)基的1.5％瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，并在37℃溫育大約8小時(shí)。在冰箱中冷卻大約2個(gè)小時(shí)后，由此成形的噬菌斑被轉(zhuǎn)到堿性(用0.5M氫氧化鈉和1.5M氯化鈉溶液處理2分鐘；用0.5M Tris-鹽酸(pH7.5)和1.5M的氯化鈉溶液處理2分鐘；以及用45mM檸檬酸鈉(pH7.0)和450mM氯化鈉溶液處理5分鐘)的的尼龍濾膜上然后在80℃干燥濾膜2小時(shí)。然后，干燥濾膜在預(yù)雜交液(50％的甲酰胺，0.09M的檸檬酸鈉(pH7.0)，0.9M的氯化鈉，0.5％的牛血清白蛋白，0.5％的Ficoll，0.5％的聚乙烯吡咯烷酮和0.5％的十二烷基硫酸鈉)中37℃浸漬兩小時(shí)，加入用32p標(biāo)記的探針且混合物于42℃雜交16小時(shí)。濾膜用洗滌液(30mM檸檬酸鈉的水溶液(PH7.0)，300mM的氯化鈉和0.1％的十二烷基硫酸鈉在室溫下5分鐘洗滌兩次并用3mM的檸檬酸鈉(pH7.0)，30mM的氯化鈉和0.1％的十二烷基硫酸鈉水溶液在65℃1小時(shí)洗滌兩次)沖洗后，暴露于X-光膠片，用放射性射線感光的區(qū)域與培養(yǎng)皿上的噬菌斑相比較并從噬菌斑分離陽(yáng)性克隆。
利用Stratagene的輔助噬菌體R408將分離的陽(yáng)性λ噬菌體克隆轉(zhuǎn)化到適合于DNA測(cè)序的載體-質(zhì)粒pBluescript，且通過(guò)Sanger法測(cè)定核苷酸序列。
測(cè)定的堿基序列顯示于序列表的SEQ ID NO3中而其氨基酸序列顯示于SEQ ID NO4中。
產(chǎn)生的CRSP與豬降鈣素(CT)基因-相關(guān)肽(CGRP)、人CGRP-I和人CGRP-II的氨基酸序列分別具有71.1％、63.2％和71.1％的同源性(參見(jiàn)圖2)。
實(shí)施例4(表達(dá)位點(diǎn))通過(guò)用酸性胍，苯酚和氯仿提取的方式制備基因表達(dá)量的RNA。大約1g的豬組織與5ml的變性溶液(4M硫氰酸胍，25mM的檸檬酸鈉(pH7.0)，0.1M的2-巰基乙醇和0.5％肌氨酸鈉)勻漿化，與1/10量的2M乙酸鈉，等量的水飽和的苯酚和1/5量的氯仿一起充分?jǐn)嚢枨一旌衔镞M(jìn)行離心分離。然后，分離水層，加入相同量的2-丙醇并充分?jǐn)嚢杌旌衔铮?20℃保持靜置1小時(shí)并離心來(lái)回收沉淀物(RNA)。利用甲醛-瓊脂糖改性的凝膠(1％的瓊脂糖，2.2M的甲醛，20mM的Mops(pH7)，8mM的乙酸鈉和1mM的EDTA)對(duì)30μg的這種RNA進(jìn)行電泳，電泳后用水充分沖洗凝膠來(lái)除去甲醛然后用0.05M的氫氧化鈉處理15分鐘，用0.3M檸檬酸鈉(pH7)和3M氯化鈉溶液處理45分鐘。然后，通過(guò)毛細(xì)管印跡法將含于凝膠中的RNA轉(zhuǎn)入尼龍濾膜，并將轉(zhuǎn)錄的RNA的濾膜在80℃干燥。然后，濾膜浸漬在Ambion的ULTRAhyb雜交液中37℃2小時(shí)，加入用32P標(biāo)記的探針，編碼CRSP(cDNA上第346到第488之間的堿基對(duì))并且在42℃進(jìn)行16小時(shí)的雜交。雜交后，用洗滌液(用30mM的檸檬酸鈉(pH7.0)，300mM的氯化鈉和0.1％的十二烷基硫酸鈉的溶液在室溫下5分鐘兩次，用1.5mM檸檬酸鈉(pH7.0)，15mM氯化鈉以及0.1％十二烷基硫酸鈉的水溶液在65℃1小時(shí)兩次)沖洗濾膜，然后于X-膠片上曝光，定量測(cè)定其上的RNA。
結(jié)果顯示在圖3中。
實(shí)施例5(表達(dá)量的測(cè)定)通過(guò)放射免疫測(cè)定法利用制備的該合成肽的抗體測(cè)定各組織中的肽的量。用10倍量的水煮沸該組織(大約1g)并用冰冷卻，加入乙酸將其制成1M，進(jìn)行勻漿化作用并通過(guò)離心分離除去不溶物質(zhì)來(lái)制備提取物。提取物被冷凍干燥并溶于緩沖液(50mM的磷酸鈉(pH7.4)，80mM的氯化鈉，25mM的EDTA，0.5％的TritonX-100，0.5％的牛血清白蛋白和0.05％的疊氮化鈉)中并各取出100μl于試管中。在這種含有CRSP的緩沖液和已知CRSP濃度的緩沖液中加入相同量的放射性標(biāo)記的CRSP和抗體，攪拌混合物并于4℃靜置48小時(shí)，加入100μl的γ-球蛋白和500μl的23％聚乙二醇，充分混合混合物并離心并將沉淀物的放射性強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)溶液的放射性強(qiáng)度比較，標(biāo)準(zhǔn)溶液由其中CRSP的量已被測(cè)定的已知濃度的CRSP來(lái)制備。
結(jié)果顯示在上述表1中。
實(shí)施例6(CPSP對(duì)于LLC-PK1細(xì)胞中cAMP產(chǎn)生的促進(jìn)作用)LLC-PK1細(xì)胞溫育在培養(yǎng)基(DMEM，含有10％的胎牛血清(FCS))中，兩天后用溶于含有0.05％牛血清蛋白的DMEM中的CRSP替換細(xì)胞培養(yǎng)基，溫育細(xì)胞30分鐘，回收培養(yǎng)基并通過(guò)放射免疫測(cè)定法利用cAMP-特異性抗體測(cè)定分泌的cAMP的量。
結(jié)果顯示于圖4中。
實(shí)施例7(在CRSP存在下對(duì)LC-PK1中細(xì)胞的鈉離子和鈣離子吸收的作用)在六孔培養(yǎng)皿上，LLC-PK1細(xì)胞在DMEM(含有10％FCS)中溫育兩天。鈉離子吸收的測(cè)定如下。
LLC-PK1細(xì)胞的溫育溶液用Hanks氯化膽堿溶液，具有已預(yù)測(cè)定放射性強(qiáng)度量的氯化鈉(22Na)替換，并加入CRSP使得最終濃度分別為0M，10-8M，10-7M和10-6M，10分鐘后洗滌細(xì)胞來(lái)完全地除去細(xì)胞外溶液中的22Na并通過(guò)γ-測(cè)量器測(cè)定細(xì)胞中的放射性強(qiáng)度。類(lèi)似地，LLC-PK1的溫育溶液用Hanks氯化膽堿溶液，具有預(yù)測(cè)定放射性強(qiáng)度的氯化鈉(22Na)替換并加入各CRSP和作為Na/H共-轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)抑制劑的阿米洛利衍生物(5-(N-乙基N-異丙基)-阿米洛利)(EIPA)使得終濃度為0M CRSP+0M EIPA，10-6M CRSP+0M EIPA，10-6M CRSP+10-8MEIPA，10-6M CRSP+10-7M EIPA，10-6M CRSP+10-6M EIPA和0MCRSP+10-6M EIPA，10分鐘后沖洗細(xì)胞來(lái)完全地除去細(xì)胞外溶液中含有的22Na，并通過(guò)γ-測(cè)量器測(cè)定細(xì)胞中的放射性強(qiáng)度。
不存在EIPA的結(jié)果顯示于圖5中而存在EIPA的結(jié)果顯示于圖6中。
鈣離子吸收的測(cè)定如下。因此，LLC-PK1細(xì)胞用Hanks溶液(不含鈣的Hanks溶液)洗滌其中氯化鈣的濃度被降低到0mM。氯化鈣(45Ca)被添加到細(xì)胞上不含鈣的Hanks溶液和CRSP中，10分鐘后沖洗細(xì)胞來(lái)完全洗掉細(xì)胞外溶液中的45Ca并通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定細(xì)胞中的放射性強(qiáng)度。
結(jié)果顯示于圖7中。
實(shí)施例8(通過(guò)CRSP抑制細(xì)胞增殖)LLC-PK1細(xì)胞在24-孔膠原平板上的DMEM(含有10％FCS)中溫育兩天，用DMEM沖洗一次并用含有0和10-12到10-6M的CRSP的DMEM(含有10％FCS)替換然后進(jìn)行溫育。兩個(gè)小時(shí)后，將含有125I-標(biāo)記的溴脫氧尿苷的DMEM(含有0.1％的BSA)加至各孔中，5個(gè)小時(shí)后，通過(guò)γ-測(cè)量器測(cè)定核中摻入的放射性強(qiáng)度，由此測(cè)得細(xì)胞增殖后合成的DNA的量。
結(jié)果顯示于圖8中。
類(lèi)似地，10000細(xì)胞/孔的LLC-PK1細(xì)胞被涂布在24-孔膠原平板上并用DMEM(含有10％FCS)溫育24小時(shí)。用DMEM沖洗各孔一次，用含有0M，10-8M和10-6M濃度的CRSP的DMEM(含有10％FCS)替換該培養(yǎng)基并進(jìn)行溫育。24小時(shí)后，用胰蛋白酶-EDTA溶液剝離培養(yǎng)皿中的細(xì)胞并通過(guò)計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
結(jié)果顯示于圖9中。
實(shí)施例9(CRSP對(duì)降鈣素受體的作用)豬降鈣素受體(CTR)被導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pcDNA 3.1中并在恒河猴腎細(xì)胞(COS-7)中表達(dá)，并利用放射免疫測(cè)定法測(cè)定由CRSP刺激產(chǎn)生的cAMP量。
結(jié)果顯示于圖10中。
類(lèi)似地，在負(fù)鼠腎細(xì)胞(OK細(xì)胞)中表達(dá)CTR并利用放射免疫測(cè)定法測(cè)定由CRSP刺激產(chǎn)生的cAMP量，同時(shí)通過(guò)摻入放射性氯化鈉(22Na)利用γ-測(cè)量器測(cè)定鈉離子的吸收。
結(jié)果分別顯示于圖11和圖12中。
實(shí)施例10(由CRSP引起的大鼠血壓和血漿中離子濃度的改變)溶于生理鹽溶液中的相當(dāng)于16nmol/kg的CRSP在短時(shí)間內(nèi)從大鼠的頸動(dòng)脈在麻醉?xiàng)l件下進(jìn)行給藥。
結(jié)果顯示于圖13和圖14中。
實(shí)施例11(CRSP-Gly肽的提取和分離)豬腦(20公斤)在4倍量的水中煮沸10分鐘，冷卻并添加乙酸勻漿化使得終濃度為1M以及通過(guò)離心除去不溶物質(zhì)來(lái)制備豬腦提取物。通過(guò)超濾(Pericon Cassette PLAC#000-05，Miliipore生產(chǎn))的方式脫鹽和濃縮，在用冰冷卻的條件下脫鹽后逐步添加丙酮到提取物中終濃度為66％。通過(guò)離心分離除去沉淀物，利用蒸發(fā)器除去上清液中的丙酮并用反相柱(LC-SORR SPW-C-ODS；Chemco；1.51)吸附殘余物。用3倍量的0.5M乙酸沖洗柱后，用3倍量的洗脫緩沖液(水∶乙腈∶10％三氟乙酸＝40∶60∶1)洗脫肽級(jí)分。利用蒸發(fā)器除去洗脫物中的乙腈，然后冷凍干燥。稱重冷凍干燥樣品，溶于1M乙酸，用填充陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(SP-Sephadex，Pharmacia，3×28cm)的空心柱吸附，并直接流過(guò)分餾為級(jí)分(SP-I)，用2M吡啶(pH8.0)洗脫得到級(jí)分(SP-II)以及用2M吡啶-乙酸(pH5.0)洗脫得到級(jí)分(SP-III)來(lái)制備SP-III強(qiáng)離子級(jí)分。冷凍干燥組分，溶于1M乙酸中并通過(guò)凝膠過(guò)濾(SephadexG-50，Pharmacia，7.5×145cm，1M乙酸，流速100ml/小時(shí))的方式分餾為各分子量所對(duì)應(yīng)的級(jí)分，收集其中的1kDa到5kDa分子量所對(duì)應(yīng)的部分。再次進(jìn)行凝膠過(guò)濾(Sephadex G-25，Pharmacia，7.5×145cm，1M乙酸，流速100ml/小時(shí))來(lái)分離各分子量所對(duì)應(yīng)的級(jí)分并收集其中從2kDa到4kDa分子量所對(duì)應(yīng)的部分并冷凍干燥。
通過(guò)離子交換層析(CM52，Whatman，2.4×45cm；溶液A10mM甲酸銨(pH6.5)∶乙腈＝9∶1；溶液B1M甲酸銨(pH6.5)∶乙腈＝9∶1；流速35ml/小時(shí))利用10mM到0.5M甲酸銨對(duì)冷凍干燥樣品進(jìn)行濃度-梯度洗脫。
然后冷凍干燥1/1000量的各組分，通過(guò)培養(yǎng)基刺激LLC-PK1(獲自豬腎臟的上皮細(xì)胞)，其中冷凍干燥樣品溶于DMEM(含有0.05％牛血清白蛋白)，37℃溫育1小時(shí)并通過(guò)放射免疫測(cè)定法測(cè)定培養(yǎng)基中cAMP的分泌量。
方法如下。因此，溶于琥珀酸酐使得濃度為4％的相等量的二氧化雜環(huán)己烷-三乙胺(二氧雜環(huán)己烷∶三乙胺＝4∶1)的混合溶液添加到含有未知量cAMP和含有已知量cAMP的100μl培養(yǎng)基中，混合物在室溫下靜置30分鐘使得cAMP琥珀?；⒗秒x心蒸發(fā)器蒸干，殘余物溶于1ml的緩沖液(50mM的乙酸鈉(pH6.2)，1mM EDTA，0.025％疊氮化鈉，0.5％血清白蛋白和0.01％的Triton X-100)中，各取出100μl至試管中并且將放射性標(biāo)記的琥珀?；痗AMP和抗體分別添加到50μl中，然后4℃靜置48個(gè)小時(shí)。然后，加入100μl的1％γ-球蛋白和500μl的25％聚乙二醇，充分混合混合物并離心，利用γ-測(cè)量器測(cè)定沉淀物的放射性強(qiáng)度并與通過(guò)已知濃度的cAMP制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線的放射性強(qiáng)度進(jìn)行比較由此測(cè)定cAMP的量。
由CRSP-Gly所引起cAMP產(chǎn)量增加在由約0.27M的甲酸銨(pH6.5)洗脫的級(jí)分中觀察到。利用陽(yáng)離子交換HPLC(TSK-gel CM-2SW，Tosoh，7.8×300mm；溶液A10mM甲酸銨(pH3.8)∶乙腈＝9∶1；溶液B1M甲酸銨(pH3.8)∶乙腈＝9∶1；流速2ml/分鐘)進(jìn)行進(jìn)一步地甲酸銨濃度-梯度洗脫。再一次，取出活性已測(cè)定的1/1000量的各級(jí)分，已觀察到活性的級(jí)分(用大約0.36M的甲酸銨(pH3.8))通過(guò)反相HPLC(C18218TP54，Vydac，46×250mm，A溶液水∶乙腈∶10％三氟乙酸＝90∶10∶1；B溶液水∶乙腈∶10％三氟乙酸＝40∶60∶1；流速1ml/分鐘)由乙腈進(jìn)一步進(jìn)行濃度-梯度洗脫并收集具有活性的級(jí)分(大約32％乙腈)。通過(guò)反相HPLC(聯(lián)苯219TP5215，Vydac 2.1×150mm；溶液A水∶乙腈∶10％三氟乙酸＝90∶10∶1；溶液B水∶乙腈∶10％三氟乙酸＝40∶60∶1；流速0.2ml/分鐘)再次分離，由此制備最終的純樣品(用大約29％乙腈洗脫的)。
在實(shí)際的純化步驟中，大約制備了50pmol的肽。這種肽的分子量為4,157Da且理論上的等電點(diǎn)被計(jì)算為11.41。此外，所述肽的疏水性可滿足如上所述在Vydac的C18柱(4.6×250mm，218TP54)中在0.1％三氟乙酸存在的情況下用大約32％濃度的乙腈洗脫。
實(shí)施例12(通過(guò)CRSP-Gly對(duì)于cAMP產(chǎn)生的促進(jìn)作用)豬降鈣素受體(CTR)被導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pcDNA 3.1中，然后在恒河猴腎細(xì)胞(COS-7)中表達(dá)，并且利用放射免疫測(cè)定法測(cè)定其中通過(guò)CRSP或者CRSP-Gly刺激產(chǎn)生的cAMP量。
結(jié)果顯示于圖15中。
實(shí)施例13(狗和牛CRSP的cDNA克隆)通過(guò)利用酸性胍，苯酚和氯仿的方法從狗和牛的甲狀腺提取RNA。利用Takara Shuzo的Oligotex-dT30 mRNA純化試劑盒純化mRNA。利用Pharmacia公司的Time Saver cDNA制備試劑盒和Stratagene公司的λZAPII由狗和牛的甲狀腺mRNA(3μg)制備互補(bǔ)DNAλ噬菌體文庫(kù)。至于探針，使用具有全長(zhǎng)700bp的豬降鈣素受體-刺激肽cDNA。篩選方法如下。因此，用λ噬菌體(具有大約300,000個(gè)獨(dú)立克隆)侵染大腸桿菌，與含有LB培養(yǎng)基的0.7％瓊脂糖混合，涂布在鋪有含LB培養(yǎng)基的1.5％瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上并在37℃溫育大約8小時(shí)。在冰箱中冷卻大約兩小時(shí)后，將由此形成的噬菌斑被轉(zhuǎn)至堿性尼龍濾膜上(用0.5M氫氧化鈉和1.5M氯化鈉溶液處理兩分鐘；用0.5M Tris-鹽酸(pH7.5)和1.5M氯化鈉溶液處理兩分鐘；以及用45mM檸檬酸鈉(pH7.0)和450mM氯化鈉溶液處理5分鐘)然后在80℃處理濾膜兩小時(shí)。然后，濾膜在37℃浸漬在預(yù)雜交液(20％甲酰胺，0.09M檸檬酸鈉(pH7.0)，0.9M氯化鈉，0.5％的牛-血清白蛋白，0.5％的Ficoll，0.5％的聚乙烯吡咯烷酮和0.5％的十二烷基硫酸鈉)中兩小時(shí)，加入用32p標(biāo)記的探針并將混合物在42℃雜交16小時(shí)。濾膜用洗滌液(30mM檸檬酸鈉(pH7.0)，300mM的氯化鈉和0.1％十二烷基硫酸鈉在室溫下5分鐘洗滌兩次并且用15mM檸檬酸鈉(pH7.0)，150mM氯化鈉和0.1％十二烷基硫酸鈉的水溶液在60℃1小時(shí)洗滌兩次)沖洗后，曝光于X-光膠片，用放射性射線感光的區(qū)域與培養(yǎng)皿上的噬菌斑相比較，并分離陽(yáng)性克隆。利用Stratagene的輔助噬菌體R408將分離的陽(yáng)性λ噬菌體克隆轉(zhuǎn)化到適于DNA測(cè)序的質(zhì)粒pBluescript，并且通過(guò)Sanger法測(cè)定核苷酸序列。
編碼測(cè)定的牛CRSP的cDNA的核苷酸序列顯示于序列表的SEQID NO7中，編碼的牛CRSP的前體肽的氨基酸序列顯示于SEQ IDNO8。牛CRSP的氨基酸序列顯示于SEQ NO NO6。
編碼狗CRSP的cDNA的核苷酸序列顯示于序列表的SEQ IDNO10，編碼的狗CRSP的前體肽的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO11。狗CRSP的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO9。
實(shí)施例14(定量分析通過(guò)用牛CRSP或狗CRSP刺激產(chǎn)生的cAMP量)在培養(yǎng)基(DMEM(含有10％胎兒牛血清))中溫育LLC-PK1細(xì)胞。兩天后，用含有0.05％牛血清白蛋白的DMEM沖洗細(xì)胞兩次，培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基用含有0.5mM的3-異丁基-1-甲基黃嘌呤和0.05％牛血清白蛋白(DMEM/BSA/IBMX)的DMEM替換并在37℃溫育30分鐘。溫育后，培養(yǎng)基用溶解了CRSP使得濃度為0M和10-12到10-6M的DMEM/BSA/IBMX替換并在37℃溫育10分鐘。溫育后，除去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，加入乙醇并且將培養(yǎng)皿在冰箱中冷凍進(jìn)行細(xì)胞溶解。然后將乙醇轉(zhuǎn)入試管并且利用離心蒸發(fā)器蒸干樣品。干燥樣品溶于DMEM，各取出100μl，加入相同量的溶解了琥珀酸酐使得濃度為4％的二氧雜環(huán)己烷-三乙胺混合物(二氧雜環(huán)己烷∶三乙胺＝4∶1)并將混合物在室溫下靜置30分鐘使得cAMP被琥珀?；?。利用離心蒸發(fā)器再次蒸干，溶于1ml的緩沖液中(50mM的乙酸鈉(pH6.2)，1mM EDTA，0.025％的疊氮化鈉，0.5％的血清白蛋白以及0.01％的Triton X-100)中，各取出100μl到試管中，加入50μl的放射性標(biāo)記琥珀酰化的cAMP和50μl的抗體，混合物在4℃靜置48小時(shí)。然后，加入100μl的1％γ-球蛋白和500μl的25％聚乙二醇，充分混合混合物并離心，利用γ-測(cè)量器測(cè)定沉淀物的放射性強(qiáng)度并與通過(guò)已知濃度的cAMP制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線的放射性強(qiáng)度進(jìn)行比較由此測(cè)定cAMP的量。
結(jié)果顯示于圖16中。
實(shí)施例15(CRSP-2和CRSP-3/CT-2前體基因的克隆)豬基因組文庫(kù)購(gòu)自Clontech。至于探針，使用具有全長(zhǎng)700bp的豬降鈣素受體-刺激肽的前體cDNA。篩選方法為大腸桿菌被侵染插入了豬基因組的λ噬菌體(其具有約1,000,000個(gè)獨(dú)立的克隆且使用其中的大約300,000個(gè)克隆)，與含有LB培養(yǎng)基的0.7％瓊脂糖混合，鋪板在含有LB培養(yǎng)基的1.5％瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中并37℃溫育大約8小時(shí)。在冰箱中冷卻大約兩小時(shí)后，由此形成的噬菌斑被轉(zhuǎn)至尼龍濾膜上并進(jìn)行堿性修飾(用0.5M氫氧化鈉和1.5M氯化鈉溶液處理兩分鐘；用0.5M Tris-鹽酸(pH7.5)和1.5M氯化鈉溶液處理兩分鐘；以及用45mM檸檬酸鈉(pH7.0)和450mM氯化鈉溶液處理5分鐘)然后在80℃處理濾膜兩小時(shí)。然后，濾膜在37℃浸漬在預(yù)雜交液(20％甲酰胺，0.09M檸檬酸鈉(pH7.0)，0.9M氯化鈉，0.5％的胎牛白蛋白，0.5％的Ficoll，0.5％的聚乙烯吡咯烷酮和0.5％的十二烷基硫酸鈉)中兩小時(shí)，加入用32P標(biāo)記的探針并將混合物在42℃雜交16小時(shí)。濾膜用洗滌液(30mM檸檬酸鈉(pH7.0)，300mM的氯化鈉和0.1％十二烷基硫酸鈉在室溫下5分鐘洗滌兩次以及用7.5mM檸檬酸鈉(pH7.0)，75mM氯化鈉和0.1％十二烷基硫酸鈉的水溶液在55℃1小時(shí)洗滌兩次)沖洗后，曝光于X-光膠片，用放射性射線感光的區(qū)域與培養(yǎng)皿上的噬菌斑相比較，并由噬菌斑分離陽(yáng)性克隆。利用各種限制性酶裂解分離的陽(yáng)性λ噬菌體克隆，通過(guò)Southern印跡法進(jìn)行分析來(lái)制備限制性酶圖譜并利用合適的限制性酶將含有陽(yáng)性克隆的DNA亞克隆到pBluescript中。通過(guò)Sanger法測(cè)定核苷酸序列。篩選的結(jié)果為制備得到25個(gè)陽(yáng)性克隆。利用限制性酶分析和核苷酸序列測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)十個(gè)編碼CRSP基因的克隆(附圖17)。也發(fā)現(xiàn)其余15個(gè)克隆中的9個(gè)編碼其它基因(圖18和圖19)且6個(gè)編碼也其它的基因。9個(gè)克隆具有與CRSP同源的序列。基因被命名為CRSP-2。其它的6個(gè)克隆具有與CRSP和CT同源的序列。那些基因被命名為CRSP-3和CT-2。在圖17和圖19中，加下劃線部分表示外顯子。
CRSP基因的核苷酸序列顯示于后面所附序列表的SEQ ID NO5中。CRSP-2基因顯示于序列表的SEQ ID NO15中。含有CRSP-3基因和CT-2基因的DNA片段的核苷酸序列顯示于序列表的SEQ IDNO23中。
利用CRSP和CT/CGRP的基因序列作為參照推測(cè)的cDNA序列顯示于附圖20-22(附圖20CRSP-2；附圖21CRSP-3；以及附圖22CT-2)中。在圖20到圖22中，實(shí)線圍起的部分為成熟肽，灰色部分為甘氨酸，其被推測(cè)轉(zhuǎn)變?yōu)轷０罚倚斌w部分為信號(hào)肽，并且在圖22中，成熟物質(zhì)的N-末端側(cè)的谷氨酰胺被推測(cè)轉(zhuǎn)變?yōu)榻构劝彼?。圖23是各種CRSP與CGRP、AM和CT-2以及CT氨基酸的比較。
CRSP-2的cDNA的核苷酸序列顯示于序列表的SEQ ID NO13中，CRSP-3的cDNA的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO17中且CT-2的cDNA的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO21中。
CRSP-2，CRSP-3和CT-2的成熟氨基酸序列推測(cè)如下。
CRSP-2Ser-Cys-Asn-Thr-Ala-Ser-Cys-Val-Thr-His10Lys-Met-Thr-Gly-Trp-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly20Ser-Val-Ala-Lys-Asn-Asn-Phe-Met-Pro-Thr30Asn-Val-Asp-Ser-Lys-Ile-Leu-NH237CRSP-3Ser-Cys-Asn-Thr-Ala-Ile-Cys-Val-Thr-His10Lys-Met-Ala-Gly-Tro-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly20Ser-Val-Val-Lys-Asn-Asn-Phe-Met-Pro-Ile30Asn-Met-Gly-Ser-Lys-Val-Leu-NH237CT-2 pGlu-Cys-Asn-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu 10Gly-Thr-Tyr-Thr-Trp-Asp-Val-Asn-Lys-Phe20Tyr-Ala-Phe-Pro-Leu-Thr-Thr-Thr-Gly-Ile30Arg-Val-Ser-NH233CRSP-2的氨基酸序列顯示于序列表的SEQ ID NO12中，CRSP-3的氨基酸序列顯示于序列表的SEQ ID NO16中，CT-2的氨基酸序列顯示于序列表的SEQ ID NO19中。
實(shí)施例16(CRSP-2前體的cDNA克隆)至于cDNA文庫(kù)，使用插入豬下丘腦DNA的λ噬菌體文庫(kù)進(jìn)行CRSP的cDNA克隆。至于探針，使用具有全長(zhǎng)700bp的豬降鈣素受體-刺激肽。篩選方法為用插入豬下丘腦DNA的λ噬菌體侵染大腸桿菌，與含有LB培養(yǎng)基的0.7％瓊脂糖混合，涂布在鋪板含有LB培養(yǎng)基的1.5％瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上并于37℃溫育大約8小時(shí)。在冰箱中冷卻大約兩小時(shí)后，由此形成的噬菌斑被轉(zhuǎn)至尼龍濾膜上，并進(jìn)行堿變性(用0.5M的氫氧化鈉和1.5M的氯化鈉溶液處理兩分鐘；用0.5M Tris-鹽酸(pH7.5)和1.5M的氯化鈉溶液處理兩分鐘；并且用45mM檸檬酸鈉(pH7.0)和450mM的氯化鈉溶液處理5分鐘)然后在80℃處理濾膜兩小時(shí)。然后，濾膜于37℃在預(yù)雜交液(20％甲酰胺，0.09M檸檬酸鈉(pH7.0)，0.9M氯化鈉，0.5％的胎牛白蛋白，0.5％的Ficoll，0.5％聚乙烯吡咯烷酮和0.5％的十二烷基硫酸鈉)中浸漬兩小時(shí)，加入用32p標(biāo)記的探針并將混合物在42℃雜交16小時(shí)。濾膜用洗滌液(30mM檸檬酸鈉(pH7.0)，300mM的氯化鈉和0.1％的十二烷基硫酸鈉在室溫下5分鐘洗滌兩次以及用15mM檸檬酸鈉(pH7.0)，150mM氯化鈉和0.1％十二烷基硫酸鈉的水溶液在60℃1小時(shí)洗滌兩次)沖洗后，曝光于X-光膠片，用放射性射線感光的區(qū)域與培養(yǎng)皿上的噬菌斑相比較，并由噬菌斑分離陽(yáng)性克隆。利用Stratagene的輔助Phage R408將分離的陽(yáng)性λ相克隆轉(zhuǎn)化到適于DNA測(cè)序的載體質(zhì)粒pBluescript中，并通過(guò)Sanger法測(cè)定核苷酸序列。結(jié)果，制備13個(gè)陽(yáng)性克隆。上述其中六個(gè)全部是含有幾乎全長(zhǎng)CRSP前體cDNA的克隆而另外六個(gè)全部是含有幾乎全長(zhǎng)CRSP-2前體cDNA的克隆(附圖20)。剩下的一個(gè)是編碼CRSP-3的3’-非翻譯區(qū)的短克隆。
實(shí)施例17(CRSP-3和CT-2 cDNA的克隆)利用豬下丘腦cDNA(相當(dāng)于20ng的mRNA)作為模板，引物(CRSP-3GCCCAGCTTACGTCTCCTTT和TCAGGTAACTGCAATGATTTCT-2AGCAGCTTTGATTCTGCCAC和ACCTCCTCTCTGATATTCCA)以及Takara Shuzo的Pyrobest DNA聚合酶進(jìn)行PCR，共30個(gè)循環(huán)各包括在94℃15秒，在55℃15秒以及在72℃1分鐘。擴(kuò)增的DNA被用于瓊脂糖凝膠電泳，從瓊脂糖凝膠中回收用溴化乙錠染色的條帶并亞克隆到Stratagene的pBluescript II中，并且通過(guò)Sanger法測(cè)定核苷酸序列。
利用CRSP-3的引物分析擴(kuò)增的DNA的核苷酸序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)編碼CRSP-3(圖5)。此外，在利用CT-2引物進(jìn)行的PCR中，沒(méi)有觀察到DNA的擴(kuò)增。
實(shí)施例18(通過(guò)RT-PCR高靈敏度定量分析CRSP、CRSP-2、CRSP-3、CT-2、CT、CGRP和GAPDH的基因表達(dá)量)利用豬的各種組織的總RNA(4μg)制備模板cDNA，寡核苷酸dT引物和Toyobo的Revertra Ace逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒及模板的1/40用于RT-PCR。利用Toyobo的rTaq聚合酶進(jìn)行PCR來(lái)擴(kuò)增各種基因的cDNA，30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃15秒，60℃15秒以及72℃1分鐘，使用下列的序列作為引物。
CRSP CTCTCTGAGGAGGAATCACG和GAGTTCAGAGTCATAGTAACCCRSP-2CTCACAGAGGAGGAAGTCTC和TAGAGTTCAGTTCCTTGGTGCRSP-3AGCAGCTTTGATTCTGCCAC和TGCAGTGAAAGCAACTTGAGCT-2 AGCAGCTTTGATTCTGCCAC和ACCTCCTCTCTGATATTCCACTGCCACTCAGTGAGAAGGAAG和TGAGGCATGAGGGATGAAGCCGRP GCCACTCAGTGAGAAGGAAG和TCACCTTACATGTGTCCCCAGAPDH TCACTGCCACCCAGAAGACT和AGTGGTCGTTGAGGGCAATG利用3％瓊脂糖凝膠對(duì)擴(kuò)增的DNA進(jìn)行電泳并使用富士膠卷FLA2000進(jìn)行分析。結(jié)果，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、甲狀腺和卵巢中觀察到CRSP-2和CRSP-3的表達(dá)。此外，在任何組織中沒(méi)有CT-2擴(kuò)增條帶也沒(méi)有觀察到表達(dá)(附圖24)?？梢源_定CT-2在除顯示于圖24的組織之外的區(qū)域限制性表達(dá)。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了新的和有用的肽，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)并強(qiáng)烈地作用于降鈣素受體。本發(fā)明的肽與降鈣素基因-相關(guān)肽具有高度同源性并且比降鈣素具有更強(qiáng)烈的作用。它們同樣在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中大量地表達(dá)，并且非常適用于作為用于骨質(zhì)疏松癥的新的降鈣素類(lèi)肽以及用作止痛藥物等。
序列表<110>獨(dú)立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu)(Japan Science And Technology Agency)<110>日本國(guó)立循環(huán)器病中心(Japan as represented by President of the NationalCardiovascular Center)<120>具有cAMP生成活性的新肽(New Peptides Having cAMP Producing Activity)<130>SCT044131-47<140>PCT/JP03/O6641<141>2003-05-28<150>JP2002-162797<151>2002-06-04<160>22<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>38<212>PRT<213>豬(Swine)<220>
<221>modified amino acid<222>(38)<223>甘氨酰胺<220>
<223>CRSP<400>1Ser Cys Asn Thr Ala Thr Cys Met Thr His Arg Leu Val Gly Leu Leu1 5 10 15Ser Arg Ser Gly Ser Met Val Arg Ser Asn Leu Leu Pro Thr Lys Met20 25 30Gly Phe Lys Val Phe Gly35<210>2<211>39<212>PRT<213>豬(Swine)
<220>
<223>CRSP-Gly<400>2Ser Cys Asn Thr Ala Thr Cys Met Thr His Arg Leu Val Gly Leu Leu1 5 10 15Ser Arg Ser Gly Ser Met Val Arg Ser Asn Leu Leu Pro Thr Lys Met20 25 30Gly Phe Lys Val Phe Gly Gly35<210>3<211>679<212>DNA<213>豬(Swine)<220>
<223>CRSP cDNA<400>3tcaagtgtct ctgccgcttc ttccacagtg ccatcgcctg acgccaacgc tgctgcctct 60gctccctcct ctgctccagt ccacctggtt cctgctgccc gaggggcacc atgggcttct 120ggaaatttcc gcccttcctg gttctcagca tcctggtcct gtaccaggca ggcatgttcc 180acacagcacc aatgaggtct gcctttggga gcccttttga tcctgctacc ctctctgagg 240aggaatcacg cctccttttg gctgcaatgg tgaatgacta tgagcagatg aaggcccgtg 300agatgcagaa gcagagggca cagggctccg gcatcagtgt ccagaagaga tcctgcaaca 360ctgccacctg catgacccat cggctggtgg gcttgctcag cagatctggg agcatggtga 420ggagcaacct gttgcccacc aagatgggct tcaaagtctt tggtgggcgc cgcaggaact 480tttggatctg agcagtggga tgattccagg aggaaggtta ctatgactct gaactctatt 540cgtttaattt acaatgaaag caacctacta aaaaatagca tggaagacat ccatgtatgc 600atgcttctgg aaactgaaaa cactcttttc cttgaaataa actaaaacta aatgcaaaat 660aaaatcaatg catcaatgc 679<210>4<211>126<212>PRT<213>豬(Swine)<220>
<223>CRSP的前體肽<400>4Met Gly Phe Trp Lys Phe Pro Pro Phe Leu Val Leu Ser Ile Leu Val1 5 10 15Leu Tyr Gln Ala Gly Met Phe His Thr Ala Pro Met Arg Ser Ala Phe
20 25 30Gly Ser Pro Phe Asp Pro Ala Thr Leu Ser Glu Glu Glu Ser Arg Leu35 40 45Leu Leu Ala Ala Met Val Asn Asp Tyr Glu Gln Met Lys Ala Arg Glu50 55 60Met Gln Lys Gln Arg Ala Gln Gly Ser Gly Ile Ser Val Gln Lys Arg65 70 75 80Ser Cys Asn Thr Ala Thr Cys Met Thr His Arg Leu Val Gly Leu Leu85 90 95Ser Arg Ser Gly Ser Met Val Arg Ser Asn Leu Leu Pro Thr Lys Met100 105 110Gly Phe Lys Val Phe Gly Gly Arg Arg Arg Asn Phe Trp Ile115 120 125<210>5<211>3796<212>DNA<213>豬(Swine)<220>
<223>基因CRSP<400>5ctcgaggatc ctgcctcttg tttcccacaa atcctgcctt cctgtgcttg attccagctg 60cctgaatcag accccctgct tgggcacaga atcatcaacc tgctgcgcat taacctccca 120aaccgcactt ggacatggta gtcttagggg accggggatg ccttgtaatg ctggactctg 180ctctacaaag atcacatagc tggggatgga gagggatgtg agcctgcgaa accgaacagg 240taaagtttac catgacgtca aactgtcctt aaattcctgc tcactttgcg tgtgtttttc 300gttggtgccc accaacctcc ccaccccctc ccacccccgc catcaatgac ctcaatgcaa 360atacaagtgg ggtggtcctg ttggatgctc caggttctgg acgcaagtag tgacacaatc 420ctggggctca ggatctttcc tctcattggt tgcctggagc tctgggacca ccccagattc 480agagcggcgg gaataagagc agctgctggt gcggggaagg gttagaggca ctacccacct 540caagtgtctc tgccgcttct tccacagtgc catcgcctga cgccaacgct gctgcctctg 600ctccctcctc tgctccagtc cacctggttc ctgctgcccg gtaagcccgg agattcctgc 660taagctgtgg ttctgtttct ctctccctct cctcccttcc ctctctctcc attggatttt 720cttagctgat ctcttttccc gtctcaaagt tcctgtccac ttctctctgg gtctcttcat 780cctgtaatat gccttactgc gcaattcatt ctaggctcct ttcacaggta actctggatg 840gtctcagttc ggggattccc tgctctactc ttcctgagct gagctgggct ccagtcttgt 900ccccgcagca gacgtgctta ggtccgtgtt gggattttgg agctctccag gcacttcagg 960gagaggagga tgcaggaata gctttgagca gaagaaactt tcatggatcc catctcctct 1020tacctacaag gatcgctgga aatggggtcg ggacctggga cagtgcaaat gggtggcaaa 1080taggtgcaat gactgagggg aaagtagcta ttaaacgcaa gccccagttg aaggttctgg 1140gaactccccc tcccgcaccg ccaccccatt taatcttggg tcccaattta aggctgtacc 1200agcttgtttc ttacagggtg ctctttgcca gagtatggag cagctggaca gtaaaatttg 1260
gttcttcagt ttctcaggga ttccaactgc agagatatgt cctcccaact ccccttcccc 1320ccagccaggt ataagcaaaa atcaggcatc aggagagatg ctgatgggtt gcactatggg 1380aaaagctgtg gtgacaggta ctgcgagtct gtcctccagg agtcccggcc aacaggttga 1440aggtgagagt gtgggtgtgc tgggcagggg gctatggacg gagacctcct cacccagttg 1500tcctgctagg cttctttgct aaaccaaaca tgttgcaggc tcactggatc ttccagcagt 1560ccacttggct gaggaggaaa tgatggtgaa aggaaaggac acgagcagcc tgaagccagg 1620aagccaggga gttggaggca gaggcaggag cagagcccag gtctgtgggc tcaatgaact 1680tggaactgct acaggtggtg acattgttct tcccttgcag aggggcacca tgggcttctg 1740gaaatttccg cccttcctgg ttctcagcat cctggtcctg taccaggcag gcatgttcca 1800cacagcacca atgaggtaag acagccctgc caacaagcac actcacttga tgagaatgta 1860atataaacgt gtatataaat ttattataag gtggctctgt agaacaatgg atagtgcctt 1920gcgctcctat aagtttatca taagctttat gtgtacacaa agtttgtaaa tagacataag 1980atatacagta ctcatgattg taaattttat ataacttatc aaacctcaca gcatgctttt 2040ttgttttcat caaatatttg tacctttagc acacgtatat gctcatatta ccataattta 2100agaaatggat tgtatccaat ttgccaaata ctttgctagt aaatttgtta ttaaatctga 2160tatgggatct acacatctca tttttcacct tcattcaaac tgcattaagc taaaattatt 2220ttcccattca aactatcaga aaccaggcaa cctggctgtt tatcctgggg aggggcaggc 2280aggagatcag aacctgtttt taggcttgct tcccctcctt aggtctgcct ttgggagccc 2340ttttgatcct gctaccctct ctgaggagga atcacgcctc cttttggctg caatggtgaa 2400tgactatgag cagatgaagg cccgtgagat gcagaagcag agggcacagg gctccgggta 2460aggttccctg cccaaggaca acagggcatc cctttcttcc tctggtcagg cccaggaagg 2520catattttaa agtcactttt gagttttctg acccccctgg acatgtctgt gggatgatta 2580tggcatttcc cctgacggcc taggattttc tgctgtgatg accttttcta gcagaaatac 2640tcaaggttca ctggtcctct caaggcagta gtcttccatg acgattctgt cgtacagcac 2700ctgcactcaa cctctcactg acgggccttt tctttcttta tcccacaaat cagcatcagt 2760gtccagaaga gatcctgcaa cactgccacc tgcatgaccc atcggctggt gggcttgctc 2820agcagatctg ggagcatggt gaggagcaac ctgttgccca ccaagatggg cttcaaagtc 2880tttggtgggc gccgcaggaa cttttggatc tgagcagtgg gatgattcca ggaggaaggt 2940gactgccctt tttgtacctt cgggtgggag gacagaggac tgggtattgc aggggtgcat 3000tccacaccct aaccctctgt gagcgcatgg gggtaaaacc tccacatggc aaggtgccca 3060caccagtgtc tggagaaagg actgataatc cctataactg aaacattggg ctctttctct 3120ctgtttctcc agtctctccc tgtgacactg acatcatctg ccaggaaata tagaccctgt 3180ttacttaaaa cactgttccc tgggtattaa ttggggtcca gctctagcat tagaatttga 3240aaggtaatga ccctaccctt ttggagcata ccttacaatg ttatgaactt ggagcataga 3300ctcggattca aatactgtgt ctgtcttcca ctaactgtga ccataggcaa gtatgcctct 3360gagcctcagc ttctccttgt aacttgaagg caacaatagt atcctcaata taaaaattaa 3420ttagtataac atatgacaag agcctgttaa ctaagaatta ataacattct gttacttttt 3480tccctcctag gttactatga ctctgaactc tacttcgttt aatttacaat gaaagcaacc 3540tactaaaaaa tagcatggaa gacatccatg tatgcatgct tctggaaact gaaaacactc 3600ttttccttga aataaactaa aactaaatgc aaaataaaat caatgcatca atgcagttac 3660cttgtgtgca tcttttgtgt atatgattct ataatatgat gcatgtctca ttaggtttaa 3720tggtagcaaa tctggcccct gtcagccaac ctgttggtgg gggcagctct gctaaacctc 3780agggtcacat gaattc 3796<210>6<211>40<212>PRT<213>Bos sp.
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<223>BosCRSP cDNA<400>7tgtctctgcc acttctgcca gactgccact gcctgctgcc aaagctactg ctgctgctcc 60ttcctctgct cccagccacc tggtgccggc tgtcagagag gtgtcatggg cttctggaag 120ttccccccat tcttggtcct cagcatcctg gtcttgtacc aggcaggcat gtttcatgca 180gcaccattca ggtctgtctt tgatgggcgt tttgatcctg ctaccctgga tgaggaggaa 240tcgcgcctcc tactggctgc gatggtgaat gactacgagc agatgagggc ccgggagtcg 300gagaaggctc agaagaccga gggctcccgc atccagaaga gagcctgcaa cactgccacc 360tgcatgaccc atcgcctggc aggctggctg agcagatctg ggagtatggt gaggagcaac 420ttgctgccga ccaagatggg tttcaagatc ttcaatgggc cccgcaggaa ctcctggttt 480taaacagtga aatgacgctg ggaataaggt caccaggaag ctgaactcta cttttagttt 540gcatgaaggc accttacaaa aaaagaaaat agcatggaag atacccatgt atgcatgctt 600ctcgatattg aaaacattct tcttttccct gaaataaact aaatgcaga 649<210>8<211>125<212>PRT<213>Bos sp.
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<223>BosCRSP的前體肽<400>8Met Gly Phe Trp Lys Phe Pro Pro Phe Leu Val Leu Ser Ile Leu Val1 5 10 15Leu Tyr Gln Ala Gly Met Phe His Ala Ala Pro Phe Arg Ser Val Phe20 25 30Asp Gly Arg Phe Asp Pro Ala Thr Leu Asp Glu Glu Glu Ser Arg Leu
35 40 45Leu Leu Ala Ala Met Val Asn Asp Tyr Glu Gln Met Arg Ala Arg Glu50 55 60Ser Glu Lys Ala Gln Lys Thr Glu Gly Ser Arg Ile Gln Lys Arg Ala65 70 75 80Cys Asn Thr Ala Thr Cys Met Thr His Arg Leu Ala Gly Trp Leu Ser85 90 95Arg Ser Gly Ser Met Val Arg Ser Asn Leu Leu Pro Thr Lys Met Gly100 105 110Phe Lys Ile Phe Asn Gly Pro Arg Arg Asn Ser Trp Phe115 120 125<210>9<211>38<212>PRT<213>Canis sp.
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<223>CanisCRSP<400>9Ser Cys Asn Ser Ala Thr Cys Val Ala His Trp Leu Gly Gly Leu Leu1 5 10 15Ser Arg Ala Gly Ser Val Ala Asn Thr Asn Leu Leu Pro Thr Ser Met20 25 30Gly Phe Lys Val Tyr Asn35<210>10<211>686<212>DNA<213>Canis sp.
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<223>CanisCRSP cDNA<400>10tctgccacat ccacggtgcc atcgcctgac atcggacgcc aacactgcca cagctgccgc 60cgcctgtgct ccgagccacc ggctgcctgc agacagagaa gcgtcatggg cttctggaag 120ttctcccctt tcctggttct cggcatcctg gcgctgtacc aggtgggctt cctccaggca 180gcaccattca ggtctgcttt ggaaaatcct ccagactctg gtgtgcgcaa tgaggaggaa 240ttgcgcctcc tcctggctgc agtgatgaag gactatatgc agatgaagac tcatgagctg 300
gagcaggagc aggagactga gggctccagg gttgctgtcc agaagagatc ctgcaactct 360gccacctgtg tggcccattg gctgggaggc ttgctgagca gagccggaag tgtggcaaac 420accaacttgc tgcccaccag catgggcttc aaggtctaca atcgacgccg cagggaactt 480aaggcttaag cagtgacatg accccaggaa gaaggtcacc atgaagtgaa ctctacttct 540cttaacttct aatgaaaaca acttatagaa tgcagagcat ggaagacaca tacatatgca 600tgcttactat taaaacattg tgtcttgttt gaaataaagt aaaactaaat aaagagaata 660aaatcataaa aaaaaaaaaa aaaaaa 686<210>11<211>127<212>PRT<213>Canis sp.
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<223>CRSP-2的前體肽<400>14Met Gly Phe Trp Lys Phe Pro Pro Phe Leu Val Leu Ser Ile Leu Val1 5 10 15
Leu Tyr Gln Ala Gly Met Phe His Thr Ala Pro Val Arg Leu Pro Leu20 25 30Glu Ser Ser Phe Asp Ser Ala Thr Leu Thr Glu Glu Glu Val Ser Leu35 40 45Leu Leu Val Ala Met Val Lys Asp Tyr Val Gln Met Lys Ala Thr Val50 55 60Leu Glu Gln Glu Ser Glu Asp Phe Ser Ile Thr Ala Gln Glu Lys Ser65 70 75 80Cys Asn Thr Ala Ser Cys Val Thr His Lys Met Thr Gly Trp Leu Ser85 90 95Arg Ser Gly Ser Val Ala Lys Asn Asn Phe Met Pro Thr Asn Val Asp100 105 110Ser Lys Ile Leu Gly115<210>15<211>7673<212>DNA<213>豬(Swine)<220>
<223>gene CRSP-2<400>15ggatccacta gttctagata aaatggacaa atacctagaa acagaagacc taccaagatg 60gaaggatgaa gaaatagaaa attcaaatac acctatgact aggaaggaga atgaagcatt 120aatccaaaat cttccaacaa agaaaagccc tggatacgat ggcctcattg gtgaatagta 180ccagacattt aaagaaaacg aataccaatc cttgtcaaac ttttccaaaa acctgaagag 240aaaggacaca ccctaaccta ttctatgagg caggccaaca ttactctgat accaaagatg 300gagaaagatt ctgcaaggag aaaaccccta cagacaaaat cctttatgac atggatgtgg 360aaaccctcaa cagtatgcta gggaattgaa ttcagaagcg tattaaaagg atcctacaac 420atgaccaagt gggatgaatt tctggaatgc aaggatgatt caaaatatga aaattgatca 480aagtgttata tcacaataat ggaatgtagg gaaaaacaca cctgattatt tccactgata 540cagaaaatta tttagtaaaa ttcaatacct tttcaggatt aaaaacaaaa actaggtata 600gaaggagact gcctcagcac aatacaacta tatatgaaaa accaacacca acaccataat 660ccagggtgga aaactgaaag cttttcccct aagatctgga agaaaatgga aaaaaatttt 720taagaatttt cagacagatt tgggtctctg gtacactctg agaaatcatc ttttagaatt 780tttttttttt aaaaataagc acaagaattt catttaaaag aagggaaata acatagcctt 840cagagtttat caggaggtgt aatttttttt tccacactag attgtggcta cctgatgcta 900attttgaggt ttaaacataa tgaaataaga ttgtacagcc aagtgccagc tagtcatgga 960acttttacct cagtactgtt tagtgcttca gtcctaagaa gtttcaggga gggctgcgtg 1020caatacaagt aatcggtact tgctgaaggt ctaaaatttc gagtgcactt ggtaaatcag 1080ggatgggcgc agaggagact ggttctgtaa ctcagactag tgaaccctag aatttagaaa 1140gggtactttt gtgctccaag caaatcctgt tctacctaac taggtccaaa tgctctgcag 1200
gctgtagtta gagccctctc atagcaggga gactgccttg gtgaatctgc cagaggaaat 1260gaatttccat tcacattcat tcaacaaaca ttgggcgagt gccacctcat gtgcaaaaca 1320tggtgctaag tgctaaagaa aagatgttgt tttgtaaact tacccgcagc tcagagccag 1380gacttcttgg aaagtcagag gacttgagga aggagttcat ctcagcccct ccctcactgg 1440agagactggc ttttctttcc aagtaaagct taaaactgct ggaggctaag ttagcaccct 1500ctgggggcag accctgattc ctgcctctca tccccagccc tttgtgtgtg ggcgccaaag 1560atttctgagt gaggaatgaa tgttggcttt gaacaggaaa ggcacaagtg gcagccaagg 1620gtagaatgct gagcctacaa attaacatag ttacaaattt gtcttctaaa ggagtcgttt 1680cttagccata gtgcagccac ctttgcattg atcaaaactg tggttcttcc aatgaaaaaa 1740gacatcccca gacacacata cttacaaatg atttcagaag attgataggt cggaaatctc 1800aggttttgga ttttatttgc aaaagcgttt tgcgcctgag ttttaaactt tttttttttt 1860tttttttttt tgtatttttt cacttctagg gcggcttcgg cggcatatgg aaattcccag 1920gctaggggtc taataggcgc catagccacc ggcctacgcc agagctactg caacgctgga 1980tccgagccgc atctgcaacc tacaccacaa ctcacggcaa tgccggatcg ttaacccact 2040gagcaaggcc agggatcgaa cccgcaacct catggttctt actcagattc gttaaccact 2100gcgccacgac ggccactcca acctaccaga ctcttaatta agtagcagag tccaatttac 2160atgccgcacc acatctgtta ccccgagtta gcgaacttgg tcttggaact aactcctcac 2220ggaaagccaa gccgagtact cataattata gtgctgaacc cccaaaccct ggtctggcct 2280gtgcacccaa tttttgcttg tagtagaaac caggatttac ggagcccgag cagtccgcca 2340tcctgaactc ttctctttct caccttgcct tcatcctgga gtgcacctgc cctctatgaa 2400ccagtttttc cgttcccttg gtctcccgat ccgttgtcta tcctgaggag agcgagatgc 2460aagcacccga ttccctagcc ccaatatttt attctcttgc gaaggagaaa agttgaataa 2520gggtatcttg taaatgagat gttccgagtc cagagagcac aaaccggcaa ggggaacaga 2580tgtgccgcga ggcaggtgtg cggaaagata tagagaaggc tcaggttcgg acctgtggct 2640caggtcacac tcatggcaga gttcggttta atttcggctc tgcctggggg aaccacttaa 2700ctggggtcct tgctgccctc caccggcccc cgatgctgtt gcagcgtttg ccgcgctgga 2760gggtctgtac aggctgctgc ggtttatcgc tgtgtgctca gacacggtga tcctgagcag 2820catccgaact ggattggggt agatgtgggc acagggctgg aatcacaggt cactggaaca 2880tcttggcaaa cagcagccgg aagcaagggg cagctgggca aatggttctg ggacattgat 2940gggcttagat gatgaatggt ggggctggag gtcggcttgg cggcttggga agcatctatg 3000ccgtgcacgt ccctgcccaa gcccagtagg gcaccatctt tccccatatg gtggaccgac 3060cacccagcgc gactccagac atccgcacag aggtggggat tgggcaaatg gatcgcgatc 3120gcacagaatc ccctctgcac ttccctggta agctcttctc gatccctccc tgggtggaga 3180gcaggtacat ggctactaat gataccactc cttgaagacg ggaatatgat gccccgttcc 3240aaaaattaat atattgaggt gctagaagac actagcccga tgatcttact acctagaaaa 3300ggcacagctg gaacaaagtt tccgtgtgac aaagactgtg atcctgcctc ttgtttccca 3360caaatcctgc cttcctgtgc ttgattccag ctgcctgaat cagaccccct gcttgggcac 3420agaatcatca acctgctgcg cattaacctc ccaaaccgca cttggacatg gtagtcttag 3480gggaccgggg atgccttgta acgctggact ctgctctaca aagatcacat agctggggat 3540ggagagggat gtgagcctgc gaaaccgaac aggtaaagtt taccatgacg tcaaactgtc 3600cttaaattcc tgctcacttt gcgtgtgttt ttcgttggtg cccaccaacc tccccacccc 3660ctcccacccc cgccatcaat gacctcaatg caaatacaag tggggtggtc ctgttggatg 3720ctccaggttc tggacgcaag tagtgacaca atcctggggc tcaggatctt tcctctcatt 3780ggttgcctgg agctctggga ccaccccaga ttcagagcgg cgggaataag agcagctgct 3840ggtgcgggga agggttagag gcactaccca cctcaagtgt ctctgccgct tcttccacag 3900tgccatcgcc tgacgccaac gctgctgcct ctgctccctc ctctgctcca gtccacctgg 3960ttcctgctgc ccggtaagcc cggagattcc tgctaagctg tggttctgtt tctctctccc 4020tctcctccct tccctctctc tccattggat tttcttagct gatctctttt cccgtctcaa 4080agttcctgtc cacttctctc tgggtctctt catcctgtaa tatgccttac tgcgcaattc 4140attctaggct cctttcacag gtaactctgg atggtctcag ttcggggatt ccctgctcta 4200ctcttcctga gctgagctgg gctccagtct tgtccccgca gcagacgtgc ttaggtccgt 4260
gttgggattt tggagctctc caggcacttc agggagagga ggatgcagga atagctttga 4320gcagaagaaa ctttcatgga tcccatctcc tcttacctac aaggatcgct ggaaatgggg 4380tcgggacctg ggacagtgca aatgggtggc aaataggtgc aatgactgag gggaaagtag 4440ctattaaacg caagccccag ttgaaggttc tgggaactcc ccctcccgca ccgccacccc 4500atttaatctt gggtcccaat ttaaggctgt accggcttgt ttcttacagg gtgctctttg 4560ccagagtatg gagcagctgg acagtaaaat ttggttcttc agtttctcag ggattccaac 4620tgcagagata tgtcctccca actccccttc cccccagcca ggtataagca aaaatcaggc 4680atcaggagag atgctgatgg gttgcactat gggaaaagct gtggtgacag gtactgtgag 4740tctgtcctcc aggagtcccg gccaacaggt tgaaggtgag agtgtgggtg tgctgggcag 4800ggggctatgg acggagacct tctcacccag ttgtcctgct aggcttcttt gctaaaccaa 4860gcatgttgca ggctcactgg atcttccagc agtccacttg gctgaggagg aaatgatggt 4920gaaaggaaag gacacgagca gcctgaagcc aggaagccag ggagttggag gcagaggcag 4980gagcagagcc caggtctgtg ggctcaatga acttggaact gctacaggtg gtgacattgt 5040tcttcccttg cagaggggca ccatgggctt ctggaaattt ccgcccttcc tggttctcag 5100catcctggtc ctgtaccagg caggcatgtt ccacacagca cccgtgaggt aagacagcac 5160tggtggcagt gctctcgctt cccacggccc ccggaatcat atagttctgt attgtgagtt 5220gtgctgtggt gagtctggct cttggtgggc ttctgtgtat agggggtgtg gggtcctaat 5280gtatgaatat agtcatgtat ataagtttat tataaatatt ttgtgatcca agataatatc 5340acaaagttta caaataaata gaagatatac agtattcact ataaatttct aaactcactg 5400aaccttacag catgtttttg ttgcttttta tgaaatgttt ataactttag caaacctata 5460tagtaattta gccataattt gagcaatgaa ttgcattcta attaagtaat ttgtcaataa 5520atttgttatt aaatctgaaa ggtaatctat acaatttctc accctctttc aaattatatt 5580aatatgaaac cattttcata ttcaaactat catttaattt ttaataatgg ctgtatttaa 5640cactaagctc atacaattcc tgaagatcta accatcagct ttcaaaagcc tacatgatgc 5700actttcagca gaactacttt gtggacaccc cagagcctaa ctcatggtga agcagcattt 5760ttggatgaac actagcctta tgtcctgacc gttgagaatt tcatcagcct tattctcaga 5820ggaagtggca gaaaccagga aatctggctg cttatcctag ggctgtggta ggctcagagc 5880gcatgttggg cttgctttcc cttcccagat tgcctttgga gagcagcttt gattctgcca 5940ctctcacaga ggaggaagtg tcccttctac tggttgcaat ggtgaaggat tatgtgcaga 6000tgaaggccac tgtgctggag caggagtcag aggacttcag gtcagtcttt gcacccctcc 6060cagaatatgg cttaccctct ccctagagta ccaggaaggc atatccttaa gaatgagatt 6120tgttatagtg ccataagcct tgatgtccag tctcataagc cttggtttat ttttagttta 6180ttacacagga gagattgtct attacagttc tgatttccag gtccagtaat gcagagccac 6240ctttgggttt tctgacaccc ctgaaaatgt ctatggggag tgatgatgca ttttcccaaa 6300agccctatgg ttttctgttg ggattttgtg tttagcagaa acatttcagg ttcactggtc 6360cctctcagag ctgtaatttt ccactgatgg tcagtcctgg ggggaatcac ttgccctcaa 6420gctgtcattg gcaggccttc tctttgtctc catcctgaaa atcagcatca ctgcccagga 6480gaaatcctgc aacactgcta gctgtgtgac ccacaagatg acaggctggc tgagcagatc 6540tgggagcgtg gctaagaaca acttcatgcc caccaatgtg gactccaaaa tcttgggctg 6600acgccgcaga gagcctcagg cctgagctgt gaaatgactc cacaaagaag gtgactgctc 6660tagaacatgg gatagcaggg caaatggctg ggtatttcag gggtgttggc tacactctaa 6720ccctccctga gcctgtactg taaaaaaaaa tccataatga agttgctgac cccattatcc 6780tcagaaagaa aagagaatcc taatagccaa aacccctata acttaggttc atttctattt 6840ttttccagtg tctcccagtg actctgaggt catctgtcag gaaacataga ttctattctt 6900ttttcttttc tttttggcta cacccaaggc atgtgaaagt ttttgggcca gggattgaat 6960ctgaaccata gctgtgacct atgcagtacc tgtggcaaca ctggatcctt aacccaatgt 7020accacatcag gaactcctag gtcctattat ttaaaacact gttccctgca gttataattg 7080tgattattct agtttttgag tttgaaaggt aatgatctta tccagtgagt ttgaagtata 7140actacaatgt cacatatatc tgaattcaga gcattgactt ggtttcaaat gcgatgtctg 7200tcttccacta actatacaac catgggccag accctctctg aacctcagtt ctacatgaaa 7260ctttaaggca acaataatat ttacctgtta tcattaatat aaaaagtaac tgagataatt 7320
catggtaaga gcctcactat taataagtaa taatattcta gctcttattt ttttttctcc 7380taggtcacca aggaactgaa ctctatttct tttaatctgc aatgaaagca atttatttga 7440aaaatagcat ggaaaacaca catatatgca tgcttcttgc ttgaaataca gcttttagct 7500tgaaataaac taaaactaaa tgcagaataa aatcattgca gctacctgat atgtatcatt 7560ttaatatttg attctgtatt ctataagtat gactcatgtc tcgctggctt atctggtagc 7620aaatctggac cctgtcagcc aacctgttgg tggtggcagc tctgctaaac ctc7673<210>16<211>37<212>PRT<213>豬(Swine)<220>
<221>modified amino acid<222>(37)<223>亮氨酰胺<220>
<223>CRSP-3<400>16Ser Cys Asn Thr Ala Ile Cys Val Thr His Lys Met Ala Gly Trp Leu1 5 10 15Ser Arg Ser Gly Ser Val Val Lys Asn Asn Phe Met Pro Ile Asn Met20 25 30Gly Ser Lys Val Leu35<210>17<211>685<212>DNA<213>豬(Swine)<220>
<223>CRSP-3 cDNA<400>17gcccagctta cgtctccttt ctccgccagt gccatcacct gccaccagcg cggttgttgc 60ttctcccact tgggctccaa gctacctggt tcctgcatcc agaggggcac catgggcttc 120tggaagttcc cccccttcct gatcctcagc atcctggtcc tgtaccaagc aggaatgctc 180catgccgcgc cattcaggat ggctttggga agcagctttg attctgccac actcacggaa 240gaggaaatgt ccctcctact ggttgcaatg gtgaaggatt atgtgcagat gaaggccact 300gtgctggagc aggagacaga ggacttcagc atcaccaccc aggagagatc ctgcaacact 360gccatctgtg tgacccacaa gatggcaggc tggctgagca gatctgggag cgtggttaag 420aacaacttca tgcccatcaa catgggctcc aaagtcttgg gccggcgccg cagacagcct 480caggcctgag ctgtgaaatg actctaaaaa gaagttgaac tcaagttgct ttcactgcaa 540agttgctttc cctgcaaatt aaaagaacca atttgaaaaa tagcatggaa gacacacata 600
tatgcatgct tcttgcttga aatacaactt tttgcttgaa acaaactaaa cctaaatgca 660gaataaaatc attgcagtta cctga 685<210>18<211>125<212>PRT<213>豬(Swine)<220>
<223>CRSP-3的前體肽<400>18Met Gly Phe Trp Lys Phe Pro Pro Phe Leu Ile Leu Ser Ile Leu Val1 5 10 15Leu Tyr Gln Ala Gly Met Leu His Ala Ala Pro Phe Arg Met Ala Leu20 25 30Gly Ser Ser Phe Asp Ser Ala Thr Leu Thr Glu Glu Glu Met Ser Leu35 40 45Leu Leu Val Ala Met Val Lys Asp Tyr Val Gln Met Lys Ala Thr Val50 55 60Leu Glu Gln Glu Thr Glu Asp Phe Ser Ile Thr Thr Gln Glu Arg Ser65 70 75 80Cys Asn Thr Ala Ile Cys Val Thr His Lys Met Ala Gly Trp Leu Ser85 90 95Arg Ser Gly Ser Val Val Lys Asn Asn Phe Met Pro Ile Asn Met Gly100 105 110Ser Lys Val Leu Gly Arg Arg Arg Arg Gln Pro Gln Ala115 120 125<210>19<211>33<212>PRT<213>豬(Swine)<220>
<221>modified amino acid<222>(33)<223>絲氮酰胺<220>
<221>modified amino acid<222>(1)
<223>pyroglutamic acid<220>
<223>CT-2<400>19Glu Cys Asn Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Thr Tyr Thr Trp Asp1 5 10 15Val Asn Lys Phe Tyr Ala Phe Pro Leu Thr Thr Thr Gly Ile Arg Val20 25 30Ser<210>20<211>802<212>DNA<213>豬(Swine)<220>
<223>CT-2 cDNA<400>20gcccagctta cgtctccttt ctccgccagt gccatcacct gccaccagcg cggttgttgc 60ttctcccact tgggctccaa gctacctggt tcctgcatcc agaggggcac catgggcttc 120tggaagttcc cccccttcct gatcctcagc atcctggtcc tgtaccaagc aggaatgctc 180catgccgcgc cattcaggat ggctttggga agcagctttg attctgccac actcacggaa 240gaggaaatgt ccctcctact ggttgcaatg gtgaaggatt atgtgcagat gaaggccact 300gtgctggagc aggagacaga ggacttcagc ctggacagct ccagagctaa gcagtgcaat 360aatctgagta cctgtgtgct gggaacatat acatgggacg tcaacaagtt ttatgcattc 420cccttaacta caactgggat tagagtatct ggcaagaaat gggtcagggc cagagtctca 480gagaaagtcc attatccctc aaggcagcat accctaaggt gcttaagaag gcccccaccc 540ctcctccttt ctagttcctc tcctagaatt tgcatgtgtt cttctctggt tgctctctga 600gctgctatca gcagctttcc ttgtggccat ggatgtctgg aatatcagag aggaggtggg 660gggtgggggc aggcaggcca gaagaaaatc actcaggaat agattaggag agaatgggca 720gccctgtgag tgcctgtgga tttcacagca gagcttctca gtcctgcttc tgaacatgct 780tttcactagg gaataaaagt at 802<210>21<211>162<212>PRT<213>豬(Swine)<220>
<223>CT-2的前體肽<400>21Met Gly Phe Trp Lys Phe Pro Pro Phe Leu Ile Leu Ser Ile Leu Val
1 5 10 15Leu Tyr Gln Ala Gly Met Leu His Ala Ala Pro Phe Arg Met Ala Leu20 25 30Gly Ser Ser Phe Asp Ser Ala Thr Leu Thr Glu Glu Glu Met Ser Leu35 40 45Leu Leu Val Ala Met Val Lys Asp Tyr Val Gln Met Lys Ala Thr Val50 55 60Leu Glu Gln Glu Thr Glu Asp Phe Ser Leu Asp Ser Ser Arg Ala Lys65 70 75 80Gln Cys Asn Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Thr Tyr Thr Trp Asp85 90 95Val Asn Lys Phe Tyr Ala Phe Pro Leu Thr Thr Thr Gly Ile Arg Val100 105 110Ser Gly Lys Lys Trp Val Arg Ala Arg Val Ser Glu Lys Val His Tyr115 120 125Pro Ser Arg Gln His Thr Leu Arg Cys Leu Arg Arg Pro Pro Pro Leu130 135 140Leu Leu Ser Ser Ser Ser Pro Arg Ile Cys Met Cys Ser Ser Leu Val145 150 155 160Ala Leu<210>22<211>7142<212>DNA<213>豬(Swine)<220>
<223>CRSP-3和CT-2的基因<400>22taccgggccc cccctcgagg tcgacggtat cgataagctt gatatcgaat tcctgcagcc 60cgggggatcc ttaaccaact gagggaggcc agggattgaa ctgcgccctc atggatacta 120gtccggtttg ttacacctca gcaacgggaa cccccctggt cactttgaag agggttttca 180tacagatcct cccacctccg ctatcagtga cctcaatgcg aatacaagtg cggtggttct 240gttaaattct ccaggttccg gaagcaagta ccgacataat cctcttgggg ctcaggattt 300ttcccctcat tggttgcctg gagttccagg accaccctgg attcacagca gcgggaataa 360gagcagctgc tggtgctgag aggcattaga agcactgccc agcttacgtc tcctttctcc 420gccagtgcca tcacctgcca ccagcgcggt tgttgcttct cccacttggg ctccaagcta 480cctggttcct gcatccaggt aagtccaaag attctgctta gctgtgattc tatttcttct 540ctccctctcc tcccctccat ttctctccca ttacttttcc ttgccggtct cagaggctct 600
atccatttcc ctcggagttc cttcatcact caatctatta cgcgatttat ctcggggtcc 660tttaacaggt aacactaaac ggtctcagtt ccagacactg agtctggctc cagttttgcg 720gtctcctgcc gcatatgtgc ttaggttaat ctcaggaagc tggagcttcc tcaagcaatg 780cgggctgagc agaacgcaga atatctttgt gtagaccgtg agctcaggga aaccctcttg 840tgcctagctg tctgcgggaa atagactcat tttggaatgg attcggaact tagaccaggg 900gaagcgggtg gcaaatagat gcaaagactg aggggcaggg agccattcaa ctgcaagtcc 960tagctgccag tttggggagt tttttggttg tttttttctc cccagtttaa gtcctgtgtc 1020ctaatttaag attccaccag cttgtttttt acagggtact ctttgccaaa gtttgaagca 1080gctgagcagt agaatttggt tcttcagttt ctcagtgatt ctaaccacag agatatgtcc 1140tcccaatccc cctcccctgc cagctatgag caaaagcctg gttcctggaa gacaactctg 1200ggttgcatta tgtgaaaagc tgtggtggct tactccgagt ttgtcctcca ggagtcttgg 1260ccaagaggtt gcaggtgaga gagtgtgtgg tactggggag ggggcaatgg actgagacca 1320cctcacccag atgttctggt aggtttcttt gctaaaccaa gcatgctgca agcgcactgg 1380atatttcagc agtgcacttg gctgaggaga aaatgatggt gaactgaaat gatatgacca 1440gcctgaagcc aagaaaccag ggagttagag gcagaggcag gagcagaatc cagggtctgt 1500aggctcatag aacttggaac tcctacaggt ggtgacatta ttcttccctt gcagaggggc 1560accatgggct tctggaagtt cccccccttc ctgatcctca gcatcctggt cctgtaccaa 1620gcaggaatgc tccatgccgc gccattcagg taagccagcc ctgccaggag ccctctcacc 1680tccctcaacc cctgaaatct tagagttctg tgttgagtgg tactatgctg aatatggctc 1740tctgtggggt tgtgggggtg tggggtcctg atgtacgaat gtaaacttgt atacaagtta 1800atcagaaatg ttttaggagg ctatgtatca caaagtttac aaataaacaa aatatatagt 1860acttgttatt tcatataacg cactgaacct cacagcatgc tgctattgct ttttctcaaa 1920catttgtacc tttagcaaac ctatttacta atttcaccat actttgagca gtgggttaca 1980tcctaatctg ctaattactt taccaataaa tttgttatta aatgtgatat gtggtccata 2040catctaattt cttaccctca ttcaaattat attaagataa atattttcat attcaaacta 2100tcattatcat ttattgttta ataatggctg tatttaacac taagctcata cagttcctga 2160aaattaccat cagctttcaa aagcctatat gatccacctc cagcaaacct cttcttttag 2220gtcaccctag agcctaactc gtggtgaagc agcatttttg catgaatact ggcctcatgt 2280cctgtctgtt gagtttggtt ggccacatcc tcagtggaag tggcagaaat gaggagtagg 2340ggttggggta ggctcagcac atgttgggtt tgcttccctt ccccaggatg gctttgggaa 2400gcagctttga ttctgccaca ctcacggaag aggaaatgtc cctcctactg gttgcaatgg 2460tgaaggatta tgtgcagatg aaggccactg tgctggagca ggagacagag gacttcaggt 2520cagtctctgc acccctccca gaatatggct taccctctcc cctggagtac caggaaggca 2580tgcgcgtgtg catgcacatg cacactcaca cacacaggta ggagagagca cagctagaca 2640ggcagcctgg ggcacaactc ttctacaggc tccactaaaa tcataggtca tgtggaagaa 2700ccacagataa aaacattcct ttctgaaagc agtaggggaa gccgtgagat cacctacagt 2760ggaaattttg tagcagtact tgggagacct cccagcactg gagtttagcc ttgtaaggta 2820aagccaggga atgaatctca tgtatctcag gagattttag aaatttggct ccttctcgtt 2880aacctgccca tgatattctt tcacacctgc aaggcatctt cattgcacat ttgcaaggtg 2940aagccagagc acttagaaaa gatgagtcag gtagagcagt ttctgaaata ggtctgaggc 3000ctttagatgt gtagaatctg tggagatgtg catgttctca tggggccaga cacctttctc 3060cagtcccaac tctctgtgca ctgagtttac tgttcatacc agctcctgac cgagctgtac 3120ctgggcagag gcatgtgctg cacctttatc cgctctaaga acctctgtgc agagcataaa 3180ggtctgagca gcatgtggaa tgccagaaaa ggtcgtccct ccccaccaca gcccttcccc 3240acatcgccct ggctcagtga acctctgcat cctcctaatg gaggatgcat gagccgccct 3300cctgcttgcc ccctcctgcc tctgttccag gtcccccttc cctggtctaa ccttctgcat 3360gactgccctt gggggcagcc ctggtgcatg gtattgtctg gcatgtcttt tccctgcagc 3420ctggacagct ccagagctaa gcagtgcaat aatctgagta cctgtgtgct gggaacatat 3480acatgggacg tcaacaagtt ttatgcattc cccttaacta caactgggat tagagtatct 3540ggcaagaaat gggtcagggc cagagtctca gagaaagtcc attatccctc aaggcagcat 3600accctaaggt gcttaagaag gcccccaccc ctcctccttt ctagttcctc tcctagaatt 3660
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1.一種肽，至少具有如下的氨基酸序列Ser-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Met-Thr-His- 10Arg-Leu-Val-Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly- 20Ser-Met-Val-Arg-Ser-Asn-Leu-Leu-Pro-Thr- 30Lys-Met-Gly-Phe-Lys-Val-Phe-Gly 38或其中有部分氨基酸被缺失、取代或添加的氨基酸序列，并具有如下特性(1)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，(2)強(qiáng)烈地作用于降鈣素受體以及(3)促進(jìn)細(xì)胞的cAMP產(chǎn)生活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，其中所述肽進(jìn)一步具有如下特性(4)濃度-依賴性吸收鈉離子，(5)抑制鈣離子吸收以及(6)抑制細(xì)胞增殖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的肽，其中所述肽至少具有序列表中的SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO9，SEQ IDNO12，SEQ ID NO16或SEQ ID NO19所示的氨基酸序列或者其中有部分氨基酸被缺失、取代或添加的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3任一項(xiàng)所述的肽，其中的肽獲自哺乳動(dòng)物。
5.編碼權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)所述的肽的基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的基因，其中所述基因具有序列表中SEQ IDNO3，SEQ ID NO7，SEQ ID NO10，SEQ ID NO13，SEQ ID NO17或SEQ ID NO20所示的核苷酸序列。
7.一種包括權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的肽以及藥用載體的藥物組合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的藥物組合物，其中的藥物組合物是骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防/治療劑，癌癥的預(yù)防/治療劑，利尿劑，食欲抑制劑或止痛劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的藥物組合物，其中的藥物組合物是降血壓劑或預(yù)防PTCA(經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù))后再狹窄的藥物。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)并作用于降鈣素受體的新并且有用的蛋白質(zhì)，其基因以及含有所述蛋白質(zhì)的藥物組合物。本發(fā)明公開(kāi)了肽，至少具有下列氨基酸序列Ser－Cys－Asn－Thr－Ala－Thr－Cys－Met－Thr－His－ 10；Arg－Leu－Val－Gly－Leu－Leu－Ser－Arg－Ser－Gly－ 20；Ser－Met－Val－Arg－Ser－Asn－Leu－Leu－Pro－Thr－ 30；Lys－Met－Gly－Phe－Lys－Val－Phe－Gly 38；或通過(guò)這些氨基酸的部分缺失、取代或添加的氨基酸序列衍生的氨基酸序列，并且所述肽具有下列特性(1)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，(2)強(qiáng)烈地作用于降鈣素受體，以及(3)促進(jìn)細(xì)胞的cAMP－產(chǎn)生活性，以及，進(jìn)一步優(yōu)選地(4)濃度－依賴性吸收鈉離子，(5)抑制鈣離子吸收，以及(6)抑制細(xì)胞增殖；本發(fā)明還公開(kāi)了編碼這些肽的基因；以及含有這些肽的藥物組合物。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1697878SQ03818749
公開(kāi)日2005年11月16日 申請(qǐng)日期2003年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月4日
發(fā)明者南野直人, 片淵剛 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu), 日本國(guó)立循環(huán)器病中心