專利名稱：一種活性肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開(kāi)了一種活性肽，特別涉及一種具有促進(jìn)血小板生成功能的活性肽。
血小板生成素，簡(jiǎn)稱TPO，是一種作用于巨核細(xì)胞——血小板系統(tǒng)的細(xì)胞因子，它能夠誘導(dǎo)巨核細(xì)胞分化，最終使血循環(huán)中的血小板數(shù)量升高。血小板生成素對(duì)于提高血循環(huán)中血小板數(shù)量是相當(dāng)有效的，做為一個(gè)含332氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，它也存在著免疫原性強(qiáng)，制做成本高，不能口服等方面的不足。近年來(lái)，國(guó)外有單位報(bào)道得到了分別具有促進(jìn)血小板生成活性和促進(jìn)紅細(xì)胞生成作用的活性肽，如1997年美國(guó)的Steven E等人報(bào)道從肽庫(kù)中篩選出一種具有與TPO促血小板生成功能相似的活性肽，其結(jié)構(gòu)式為IEGPTLRQWLAARA，其單體作用于Ba/F3-mpl依賴株細(xì)胞的EC50為400nmol/L，二聚體為100pmol/L，用藥量為250μg/Kg/天時(shí)，能刺激小鼠血循環(huán)中血小板數(shù)升高；但這種結(jié)構(gòu)的活性肽的不足是活性偏低，難以滿足實(shí)際需要。
本發(fā)明的目的在于提供一種活性提高的具有促進(jìn)血小板生成功能的活性肽。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的采用多肽固相合成法設(shè)計(jì)合成的活性肽單體的序列為IEGPTLRQWLAARAC，在該活性肽的C端進(jìn)行酰胺化修飾后形成的肽鏈結(jié)構(gòu)為IEGPTLRQWLAARAC-NH2，利用單體肽鏈羧基端的半胱氨酸進(jìn)行分子間氧化形成的二聚體結(jié)構(gòu)為
采用了上述結(jié)構(gòu)的活性肽，具有以下優(yōu)點(diǎn)1.本活性肽單體與公知活性肽鏈IEGPTLRQWLAARA相比，由于在公知肽鏈單體結(jié)構(gòu)中加入了一個(gè)半胱氨酸，以支持Ba/F3-mpl細(xì)胞生長(zhǎng)的EC50值表示，活性提高了20倍，即EC50≤20nmol/L。
2.在本活性肽單體的C端進(jìn)行酰胺化修飾后形成的酰胺化肽鏈IEGPTLRQWLAARAC-NH2的活性比單體肽鏈提高了10倍，即EC50≤2nmol/L。
3.利用單體肽鏈羧基端的半胱氨酸進(jìn)行分子間氧化形成二聚體
其活性比單體提高了100倍，即EC50≤200pmol/L。
4.分別用本活性肽單體和酰胺化肽鏈進(jìn)行小鼠體內(nèi)試驗(yàn)，當(dāng)給藥量分別為≤230μg/Kg/天和≤140μg/Kg/天時(shí)，可以顯著提高小鼠血循環(huán)中的血小板數(shù)，活性較公知活性肽有所提高。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。
A.合成肽鏈(1)使用Perkin-Elmer公司的ABI 433A型多肽合成儀、選用Fmoc/HOBt/DCC0.10mmol模式，采用多肽固相合成法進(jìn)行活性肽單體和酰胺化肽鏈的合成，合成中所用氨基酸用Fmoc保護(hù)，合成用樹(shù)脂為HMP樹(shù)脂。合成結(jié)束后用含0.75g結(jié)晶酚，0.25ml二巰基乙醇，0.5ml硫代苯甲醚，0.5ml去離子水，10mlTFA三氟乙酸的切割試劑將肽從樹(shù)脂上切割下來(lái)。用反相高效液相色譜，在C18柱上進(jìn)行肽的純化。
(2)制備活性肽二聚體在合成的活性肽序列中有一個(gè)半胱氨酸(Cys)，利用兩條肽鏈中Cys上的-SH氧化形成二硫鍵-S-S-，從而得到活性肽的二聚體形式。
B.活性測(cè)定(1)四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)多肽支持TPO依賴株Ba/F3-mpl細(xì)胞生長(zhǎng)的活性
先將需要測(cè)活的多肽樣品用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基溶解后，進(jìn)行系列稀釋。取生長(zhǎng)旺盛的對(duì)數(shù)期Ba/F3-mpl細(xì)胞，用不含TPO和血清的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌2次，再用不含TPO的上述傳代培養(yǎng)用培養(yǎng)基將細(xì)胞配成1.2×106細(xì)胞/ml的懸液。按每孔80μl的量將上述單細(xì)胞懸液加到96孔培養(yǎng)板中，然后每孔中加入20μl待測(cè)樣品，每個(gè)稀釋度3個(gè)平行，以無(wú)TPO、含10％胎牛血清的培養(yǎng)基為對(duì)照。96孔培養(yǎng)板置37℃、5％CO2的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加入10μL5mg/ml的MTT溶液(溶于PBS中)，繼續(xù)置培養(yǎng)箱中。4小時(shí)后取出培養(yǎng)板，從每孔中吸出80μL上清液并棄去，然后加入100μL二甲亞砜，振蕩均勻后以630nm處吸光值作對(duì)照，檢測(cè)492nm處的吸光值。
(2)體內(nèi)活性測(cè)定將多肽樣品溶于2mg/ml人白蛋白/PBS中，進(jìn)行系列稀釋。根據(jù)體重將小鼠隨機(jī)分組，以2mg/ml人白蛋白/PBS為對(duì)照組，每種肽濃度作為一組，各組小鼠數(shù)均為8只，雌雄各半。采用皮下注射方式，每日上午830～930給藥一次，每次0.1ml/只，連續(xù)給藥5天。分別在給藥前、給藥3、5、7、9天由尾靜脈取血，檢測(cè)外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量及平均血小板體積。將原始數(shù)據(jù)按組別輸入Microsoft Excel中，各組結(jié)果以算術(shù)平均數(shù)(x)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，用Student t檢驗(yàn)進(jìn)行各用藥組均數(shù)與對(duì)照組之間差異顯著性檢驗(yàn)。
權(quán)利要求
1.一種活性肽，其特征在于肽序列為IEGPTLRQWLAARAC。
2.一種如權(quán)利要求1所述的活性肽，其特征在于酰胺化肽鏈結(jié)構(gòu)為IEGPTLRQWLAARAC-NH2。
3.一種如權(quán)利要求1所述的活性肽，其特征在于二聚體結(jié)構(gòu)為
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種活性肽,特別涉及一種具有促進(jìn)血小板生成功能的活性肽。解決了目前公知的活性肽中存在的活性偏低的不足。本發(fā)明采用多肽固相合成法設(shè)計(jì)合成了活性肽單體的序列為IEGPTLRQWLAARAC,酰胺化肽鏈結(jié)構(gòu)為IEGPTLRQWLAARAC－NH
文檔編號(hào)C07K14/49GK1254718SQ9812501
公開(kāi)日2000年5月31日 申請(qǐng)日期1998年11月20日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月20日
發(fā)明者程度勝, 李朝, 黃培堂, 周艷榮, 陳添彌 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所